本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯衍生物作為抗肝纖維化藥物的應(yīng)用，具體涉及15-芐亞基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內(nèi)酯衍生物，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

全球范圍內(nèi)，肝纖維化(hepaticfibrosis，hf)的發(fā)病率約為100/10萬人，多見于35-50歲的成年人，其中男性多于女性，農(nóng)村高于城市。hf是指肝細(xì)胞受到損害后，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)與結(jié)締組織異常增生的現(xiàn)象。hf會導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，當(dāng)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生長時間的持續(xù)性累積，纖維增生形成網(wǎng)狀間隔阻礙了肝細(xì)胞與血液之間正常的物質(zhì)與能量交換，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死，形成肝硬化(livercirrhosis，lc)。據(jù)世界衛(wèi)生組織的定義，lc指彌漫性肝臟纖維化并伴有異常結(jié)節(jié)增生，最終引發(fā)肝衰竭和肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)。臨床研究認(rèn)為hf是一種可逆性的病變，而lc和hcc則是不可逆的高死亡率病變。因此，控制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，可有效控制肝硬化、乃至肝癌的發(fā)生，對于延長慢性肝炎患者壽命，提高生活質(zhì)量具有重大的意義。

臨床上酒精肝、脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性疾病和代謝紊亂等都可引發(fā)肝纖維化。正常肝臟的ecm處于動態(tài)平衡狀態(tài)。慢性肝損傷發(fā)生時，ecm的合成速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于降解速度，大量膠原蛋白交聯(lián)成網(wǎng)形成纖維膈膜，進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，刺激纖維組織生成。當(dāng)有病毒侵入、有毒物質(zhì)進(jìn)入和發(fā)生代謝紊亂時，受損肝細(xì)胞周圍聚集大量炎癥細(xì)胞，部分肝細(xì)胞由于受到損傷導(dǎo)致膜的通透性增大，釋放出的代謝產(chǎn)物、活性氧和細(xì)胞因子能夠激活枯否細(xì)胞，進(jìn)一步分泌大量細(xì)胞因子，多種細(xì)胞因子共同作用并激活hsc轉(zhuǎn)化成為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，mfs)，在快速增殖的同時分泌炎癥介質(zhì)、粘附分子和大量的膠原物質(zhì)，同時會抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，mmp)的表達(dá)，促進(jìn)金屬蛋白酶抑制劑(tissueinhibitorofmetalloproteinase，timp)的分泌，迫使大量的emc堆積在肝臟中。mfs主要來自活化的hsc，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)或受到機(jī)械損傷時，hsc受旁分泌影響迅速發(fā)生活化，細(xì)胞體積變大，分裂能力和收縮能力增強(qiáng)，釋放大量的促炎因子、促纖維化因子和細(xì)胞分裂因子，并上調(diào)α-sma的表達(dá)，使ecm的分泌量增加。

目前，臨床上尚無針對肝纖維化的特效藥物，大多僅起到輔助治療作用，長期使用甚至?xí)又馗闻K負(fù)擔(dān)。研究顯示，干擾素通過阻止肝細(xì)胞變性和程序性死亡來控制肝纖維化，抑制膠原形成，促進(jìn)膠原降解來阻礙肝纖維化的進(jìn)展。核苷類似物如拉米夫定、阿德福韋酯等可以通過抑制病毒dna的復(fù)制來降低血清中病毒的載量，從而起到控制致病因素、降低炎癥反應(yīng)和恢復(fù)肝臟功能的療效。但干擾素的治愈率不高，治療期間副作用較多，長期使用耐藥率高且在纖維化后期治療效果不顯著。核苷類似物并不能對肝纖維化有直接的治療作用。免疫異常是肝病中普遍存在的問題，常使用環(huán)孢菌素a、潑尼松、硫唑嘌呤等強(qiáng)免疫抑制劑來緩解過度的炎癥反應(yīng)，但是在用藥過程中免疫抑制劑會對肝臟帶來沉重的負(fù)擔(dān)，故肝功能不全的患者禁忌使用。絕大多數(shù)肝硬化患者的肝功能已經(jīng)受到嚴(yán)重的損害，加之單獨(dú)使用免疫抑制劑后治療效果一般，所以并未廣泛使用。臨床上常使用抗炎、抗氧化的細(xì)胞保護(hù)類藥物，通過減輕肝臟組織炎癥反應(yīng)，清除肝臟內(nèi)的活性氧自由基，對抗脂質(zhì)過氧化、維持肝細(xì)胞膜的流動性來保護(hù)肝細(xì)胞，使其避免受到損傷，如水飛薊素、馬洛替酯等。

然而，由于hf發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及多種細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)信號分子網(wǎng)絡(luò)，所以抗肝纖維化藥物需針對多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑發(fā)揮作用，所以基于中草藥有效成分開發(fā)抗肝纖維化藥物具有顯著優(yōu)勢。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮andrographispaniculata(burm.f.)nees中提取的二萜內(nèi)酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成份之一。臨床上主要用于治療上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾等。近年來，穿心蓮內(nèi)酯在抗腫瘤、保肝利膽、抗病毒等方面的應(yīng)用研究不斷深入。穿心蓮內(nèi)酯對多種動物實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有良好的保護(hù)作用。姚青等發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯對可卡因引起的急性肝臟損害有一定的保護(hù)作用，其保肝機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低組織中氧自由基的生成有關(guān)。visenpk[jethnopharmacol,1993,40(2),131-136]與handas[indianjmedres,1990,92:284-292]皆證明穿心蓮內(nèi)酯對撲熱息痛誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，其中handas的研究還顯示穿心蓮內(nèi)酯對半乳糖胺引起的肝中毒具有保護(hù)作用。kapila[biochempharmacol,1993,46(1):182-185]等證明了穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯甙和新穿心蓮內(nèi)酯對四氯化碳和叔丁基過氧化氫引起的肝中毒具有保護(hù)作用。singhap[jethnopharmacol,2007,111(1):13-21]等的研究顯示穿心蓮內(nèi)酯對乙醇引起的小鼠肝腎損傷具有一定的保護(hù)作用。roydn[toxicolapplpharmacol,2011；250(1):54-68]等的研究證明穿心蓮內(nèi)酯與d-青霉胺聯(lián)合治療銅中毒比單一d-青霉胺在抗纖維化及細(xì)胞壞死方面效果更佳。寧光等在其申請的專利(cn201010266185.2)中公開了穿心蓮內(nèi)酯作為制備治療急性肝損傷藥物的應(yīng)用，穿心蓮內(nèi)酯可以顯著抑制刀豆素a誘發(fā)的肝損傷，抑制刀豆素a引起的肝細(xì)胞的凋亡，抑制肝臟的炎癥反應(yīng)。因此，可以用來治療刀豆素a誘發(fā)的肝損傷。

本發(fā)明人在前期研究中(cn1978437；cn100999520；cn100999535；cn101003527)獲得了大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物。本發(fā)明人已對該類化合物在抗腫瘤、抗炎、抗hbv、hcv及急性肝損傷保護(hù)作用等應(yīng)用申請了專利保護(hù)，進(jìn)一步通過對15-芐亞基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內(nèi)酯衍生物及其3,19酯化物在抗肝纖維化方面進(jìn)行活性試驗(yàn)研究。目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人在前期研究成果的基礎(chǔ)上，通過對合成的化合物進(jìn)行抗肝纖維化活性篩選，發(fā)現(xiàn)通式1結(jié)構(gòu)的穿心蓮內(nèi)酯衍生物具有顯著的預(yù)防和治療肝纖維化作用，高效低毒，具有開發(fā)為抗肝纖維化藥物的潛力。本發(fā)明目的在于提供15-芐亞基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內(nèi)酯衍生物及其3,19酯化物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

所述穿心蓮內(nèi)酯衍生物及其3,19酯化物具有通式1所示結(jié)構(gòu)。

其中：r1、r2分別為氫、甲基或者苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基等芳香環(huán)、雜芳香環(huán)和它們的單取代、多取代物中的一種；r1、r2分別為環(huán)己基、環(huán)戊基等環(huán)狀取代基團(tuán)中的一種；r1、r2可以是相同的取代基團(tuán)或者不同的取代基團(tuán)。r3、r4分別為氫、3-吡啶基或ch2ch2cooh、ch2ch2ch2ch2cooh、ch2chchch2cooh、ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch2cooh等中的一種或cor5，r5為取代或者未取代的苯基，吡啶基、吡咯基、呋喃基等芳香雜環(huán)或環(huán)己基、環(huán)戊基、環(huán)丙基、嗎啉基、哌啶基等碳環(huán)或者雜環(huán)結(jié)構(gòu)以及飽和或者不飽和的c1-c18長度的碳鏈等。r3、r4可以是相同的取代基團(tuán)或者不同的取代基團(tuán)。

優(yōu)選15-芐亞基-14-脫氧-11,12-脫氫穿心蓮內(nèi)酯衍生物及其3,19酯化物，其為如下化合物：r1，r2各自為氫或苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，3，5-三甲氧基苯基、2-羥基苯基、3-羥基苯基、4-羥基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羥基-4-氯苯基、2-羥基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基，2-硝基-4-氟苯基，2-硝基-4-氯苯基，r1，r2相同或不同但不同時為氫；r3、r4各自為氫；或r3、r4分別為3-吡啶基或ch2ch2cooh、ch2ch2ch2ch2cooh、ch2chchch2cooh、ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch2cooh中的一種，或者r3、r4各自為cor5；r5為3-吡啶基或ch2ch2cooh、ch2ch2ch2ch2cooh、ch2chchch2cooh、ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch2cooh中的一種，r3、r4選相同或不同的取代基團(tuán)。

優(yōu)選化合物為：r1，r2各自為氫或苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2，3，5-三甲氧基苯基、2-羥基苯基、3-羥基苯基、4-羥基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2，3，4-三氯苯基、2-甲氧基-4-氯苯基、2-羥基-4-氯苯基、2-羥基-4-甲氧基苯基、3-氨基-4-氯苯基、2-氨基-4-氯苯基，2-硝基-4-氟苯基，2-硝基-4-氯苯基，但r1，r2不同；r3、r4各自為氫；或r3、r4分別為ch2ch2cooh、ch2ch2ch2ch2cooh、ch2chchch2cooh、ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch2cooh中的一種，或者r3、r4各自為cor5，r5為3-吡啶基或ch2ch2cooh，r3、r4選相同取代基團(tuán)。

更優(yōu)選化合物為：當(dāng)r1，r2其中之一為氫時，r1，r2其中之一選如下基團(tuán)：苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-氟苯基、2-氯苯基、2-溴苯基、3-氟苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-氟-3-甲氧基苯基、3-甲氧基-4-氯苯基、2，4-二氟苯基、2，4-二氯苯基、2，4-二溴苯基、2-氟-4-氯苯基、2-溴-4-氯苯基、3-氟-4-氯苯基、3-溴-4-氯苯基、3，4-二氟苯基、3，4-二氯苯基、3，4二溴苯基、2-氯-4-氟苯基、2-溴-4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3-溴-4-氟苯基、2-氟-4-溴苯基、2-氯-4-溴苯基、3-氟-4-溴苯基、3-氯-4-溴苯基、2-甲氧基-4-氯苯基；r3、r4各自為氫；或r3、r4分別為ch2ch2cooh、ch2ch2ch2ch2cooh、ch2chchch2cooh、ch2ch2ch2ch2ch2ch2ch2cooh中的一種，或者r3、r4各自為cor5，r5為3-吡啶基或ch2ch2cooh，r3、r4選相同取代基團(tuán)。

更優(yōu)選化合物為：

a：r1＝h，r2＝c6h5，r3＝r4＝h；

b：r1＝h，r2＝2-f-c6h4，r3＝r4＝h；

c：r1＝h，r2＝2-cl-c6h4，r3＝r4＝h；

d：r1＝h，r2＝2-br-c6h4，r3＝r4＝h；

e：r1＝h，r2＝3-f-c6h4，r3＝r4＝h；

f：r1＝h，r2＝3-cl-c6h4，r3＝r4＝h；

g：r1＝h，r2＝3-br-c6h4，r3＝r4＝h；

h：r1＝h，r2＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝h；

i：r1＝h，r2＝4-f-c6h4，r3＝r4＝h；

j：r1＝h，r2＝4-br-c6h4，r3＝r4＝h；

k：r1＝h，r2＝4-ch3o-c6h4，r3＝r4＝h；

l：r1＝h，r2＝2-ch3o-4-cl-c6h3，r3＝r4＝h；

m：r2＝h，r1＝2-br-c6h4，r3＝r4＝h；

n：r2＝h，r1＝3-cl-c6h4，r3＝r4＝h；

o：r2＝h，r1＝2-f-4-cl-c6h3，r3＝r4＝h；

p：r2＝h，r1＝2,4-dicl-c6h3，r3＝r4＝h；

q：r2＝h，r1＝4-f-c6h4，r3＝r4＝h；

r：r2＝h，r1＝c6h5，r3＝r4＝h；

s：r1＝h，r2＝3-f-4-cl-c6h3，r3＝r4＝h；

t：r1＝h，r2＝2,4-dif-c6h3，r3＝r4＝h；

u：r1＝h，r2＝3,4-dicl-c6h3，r3＝r4＝h；

v：r1＝h，r2＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝cor5，r5＝3-吡啶基；

w：r1＝h，r2＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝ch2ch2cooh；

x：r1＝h，r2＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝cor5，r5＝ch2ch2cooh；

y：r2＝h，r1＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝h；

z：r2＝h，r1＝4-cl-c6h4，r3＝r4＝cor5，r5＝3-吡啶基。

本發(fā)明提出的上述化合物其制備方法已在發(fā)明專利cn:200510107247.4中公開。為研究所述化合物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用效果，本發(fā)明利用人肝星狀細(xì)胞lx-2，測定本發(fā)明化合物對細(xì)胞遷移和活化的抑制活性，評價化合物的抗肝纖維化活性；進(jìn)一步以ccl4誘導(dǎo)的sd大鼠肝纖維化模型、豬血清誘導(dǎo)的wistar大鼠肝纖維化模型和膽管結(jié)扎(bdl)致sd大鼠肝纖維化模型為代表，通過測定肝組織膠原含量(masson染色)、hsc活化標(biāo)志分子α-sma表達(dá)水平，評價化合物的抗肝纖維化活性。進(jìn)一步，通過ccl4模型，系統(tǒng)研究說明了代表性化合物發(fā)揮抗肝纖維化作用的主要相關(guān)作用環(huán)節(jié)和機(jī)制。

該類化合物的順、反結(jié)構(gòu)均具有抗肝纖維化活性，以該類化合物為有效藥用成份，或該類化合物的各類前藥形式，單獨(dú)或與其它藥物組合，按目前各種常規(guī)的制藥方法和工藝要求，與制藥中可以接受的輔助和/或添加成份混合后，制成用于抗肝纖維化的口服型制劑、注射型制劑等各類藥物劑型。優(yōu)選將其制備治療或預(yù)防由毒物、病毒、代謝、免疫、酒精等各類因素導(dǎo)致的肝纖維化藥物。

口服型制劑為片劑、丸劑、膠囊、沖劑或糖漿等；注射型制劑包括注射液或凍干粉針劑型等。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)及創(chuàng)新點(diǎn)：通過活性篩選，確定上述化合物具有明確的抗肝纖維化活性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該類化合物顯著抑制肝星狀細(xì)胞遷移、活化，降低細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)相關(guān)組分含量，降低肝纖維化大鼠肝組織纖維化水平；顯著降低免疫炎癥相關(guān)因子的水平，并有效抑制免疫炎癥反應(yīng)。抑制肝組織肝星狀細(xì)胞活化，促進(jìn)膠原降解，效果顯著且優(yōu)于母體化合物穿心蓮內(nèi)酯(ad)，高效低毒。將該類化合物作為活性成份用于制備抗肝纖維化藥物，為肝纖維化的治療和預(yù)防提供了新的藥物途徑，從而擴(kuò)大了臨床用藥的可選擇范圍，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。填補(bǔ)肝纖維化無理想治療藥物的空白。

附圖說明

圖1為ad和本發(fā)明化合物(15μm)對人肝星狀細(xì)胞lx-2活力的影響，與ad組比，^#p＜0.05；

圖2為ad和本發(fā)明化合物(5μm)抑制人肝星狀細(xì)胞lx-2遷移的結(jié)果(統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，與ad組比，^#p＜0.05；

圖3為ad和本發(fā)明化合物(5μm)抑制人肝星狀細(xì)胞lx-2遷移的結(jié)果(部分顯微圖片；×100倍)；

圖4為本發(fā)明部分代表性化合物對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織纖維化程度的影響(相對膠原面積/％)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與水飛薊賓組比，^&p＜0.05；

圖5為本發(fā)明部分代表性化合物對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織纖維化程度的影響(部分masson染色圖片；×100倍)；

圖6為本發(fā)明部分代表性化合物對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白(α-sma)表達(dá)水平的影響(統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與水飛薊賓組比，^&p＜0.05；

圖7為本發(fā)明部分代表性化合物對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織α-sma表達(dá)水平的影響(部分免疫組化圖片；×100倍)；

圖8為本發(fā)明部分代表性化合物對豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化wistar大鼠肝組織纖維化程度的影響(相對膠原面積/％)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與水飛薊賓組比，^&p＜0.05；

圖9為本發(fā)明部分代表性化合物對豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化wistar大鼠肝組織纖維化程度的影響(部分masson染色圖片；×100倍)；

圖10為本發(fā)明部分代表性化合物對豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化wistar大鼠肝組織α-sma表達(dá)水平的影響(統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與水飛薊賓組比，^&p＜0.05；

圖11為本發(fā)明部分代表性化合物對豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化wistar大鼠肝組織α-sma表達(dá)水平的影響(部分免疫組化圖片；×100倍)；

圖12為本發(fā)明部分代表性化合物對總膽管結(jié)扎致sd大鼠肝組織纖維化程度的影響(相對膠原面積/％)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與熊去氧膽酸組比，^&p＜0.05；

圖13為本發(fā)明部分代表性化合物對總膽管結(jié)扎致sd大鼠肝組織纖維化程度的影響(部分masson染色圖片；×100倍)；

圖14為本發(fā)明部分代表性化合物對總膽管結(jié)扎致sd大鼠肝組織α-sma表達(dá)水平的影響(統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與熊去氧膽酸組比，^&p＜0.05；

圖15為本發(fā)明部分代表性化合物對總膽管結(jié)扎致sd大鼠肝組織α-sma表達(dá)水平的影響(部分免疫組化圖片；×100倍)；

圖16為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中層粘連蛋白(laminin，ln)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖17為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中i型膠原(c-ⅰ)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖18為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中前iii型膠原(pc-ⅲ)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖19為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中ⅳ型膠原(c-ⅳ)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖20為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中白介素-6(il-6)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖21為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tnf-α)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖22為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織中超氧化物歧化酶(sod)水平的影響，與模型組比，^*p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖23為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織中丙二醛(mda)水平的影響,與模型組比，^*p＜0.05；

圖24為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織病理切片炎癥級別的影響(統(tǒng)計(jì)結(jié)果)，與模型組比，^*p＜0.05；與ad組比，^#p＜0.05；與苦參素組比，^&p＜0.05；

圖25為本發(fā)明代表化合物h對ccl4誘導(dǎo)的肝纖維化sd大鼠肝組織病理切片炎癥級別的影響(h&e染色；×100倍)。

具體實(shí)施方案

下面結(jié)合具體實(shí)施方案來詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實(shí)施方案僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明涉及的化合物不限于實(shí)施例中使用的代表性結(jié)構(gòu)，可以更換15位的不同取代基，獲得具有抗肝纖維化活性的化合物；還可以用各種導(dǎo)致肝纖維化的原因作為研究對象來得出本發(fā)明物具有抗肝纖維化作用。

實(shí)施例1本發(fā)明化合物抑制人肝星狀細(xì)胞lx-2遷移作用。

在各種炎癥介質(zhì)、生長因子等細(xì)胞因子的刺激下，肝星狀細(xì)胞遷移到受損肝組織的炎癥部位，進(jìn)而增殖、活化，合成膠原等ecm成分是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。因此，采用劃痕損傷法評價本發(fā)明化合物抗肝纖維化作用。

1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

采用人肝星狀細(xì)胞lx-2(由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供)，與穿心蓮內(nèi)酯比較，研究本發(fā)明化合物的體外抗肝纖維化作用。將lx-2細(xì)胞培養(yǎng)在含rpmi1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液中含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：100524)、100μg/ml鏈霉素、100iu/ml青霉素，置體積分?jǐn)?shù)5％co2培養(yǎng)箱(德國binder公司)中于飽和濕度、37℃培養(yǎng)。

2mtt法測定細(xì)胞毒

將生長對數(shù)期的lx-2細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基稀釋成3.5×10⁵/ml細(xì)胞懸液，鋪于96孔板(美國costar公司)內(nèi)，200μl/孔，于37℃，體積分?jǐn)?shù)5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，加入含藥培養(yǎng)基，藥物終濃度為15μm，繼續(xù)培養(yǎng)48h，加入mtt(5mg/ml)，20μl/孔，培養(yǎng)4h，棄上清，加入150μldmso，震蕩l0min，用酶標(biāo)儀測定吸光值。測定波長為570nm，參考波長為450nm。計(jì)算化合物作用后的細(xì)胞存活率，存活率(％)＝藥物組a值/細(xì)胞對照組a值×100％，結(jié)果見附圖1。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

3劃痕損傷法觀察藥物對lx-2細(xì)胞遷移的影響

將生長對數(shù)期的lx-2細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化后，用含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基稀釋成1.0×10⁶/ml細(xì)胞懸液，鋪于96孔板內(nèi)，每孔200μl。培養(yǎng)12h之后細(xì)胞長成融合狀態(tài)，棄去原培養(yǎng)基，加入血清量為0.5％的培養(yǎng)基再同步化培養(yǎng)12h之后劃線，用pbs洗兩遍，加入200μl含待測化合物(5μm)的rpmi1640培養(yǎng)基后立即在顯微鏡下拍照。設(shè)3孔重復(fù)并且設(shè)置對照。培養(yǎng)24h后分別在顯微鏡下拍照測量。遷移抑制率＝1－(給藥組0h劃痕距離－24h劃痕距離)/(空白組0h劃痕距離－24h劃痕距離)×100％。結(jié)果見附圖2、3。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1結(jié)果表明，本發(fā)明化合物在15μm濃度下，對人肝星狀細(xì)胞增殖未表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且存活率均顯著高于母體化合物穿心蓮內(nèi)酯。

結(jié)合圖1、2、3，結(jié)果表明：與ad比，本發(fā)明化合物在無毒濃度下，可顯著抑制lx-2細(xì)胞的遷移，且與ad比，對人肝星狀細(xì)胞遷移的抑制作用更強(qiáng)，安全指數(shù)更高。

實(shí)施例2本發(fā)明化合物顯著降低四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)sd大鼠的肝纖維化程度

ccl4誘導(dǎo)肝纖維化模型是一種傳統(tǒng)的經(jīng)典動物模型，因其在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等諸多方面，都與人體肝纖維化有極大的相似性，不僅具有毒物誘導(dǎo)的肝纖維化特征，而且還與乙肝病毒感染后的病理特征相似，能很好地模擬人類肝纖維化的病理變化。受低劑量的ccl4長期刺激后，不但動物表現(xiàn)出的肝功異常與人肝硬化體征十分相似，而且纖維化發(fā)生分子機(jī)制、損傷后血清標(biāo)志物、肝組織病理改變與人也非常相似。因此，ccl4誘導(dǎo)肝纖維化模型現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于研究肝纖維化發(fā)病機(jī)制、抗肝纖維化藥物篩選、抗肝纖維化藥物的作用機(jī)制等。

1材料與方法

1)試驗(yàn)動物

清潔級sd大鼠，雄性，體重200±20g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。其許可證號是scxk(湘)2011-0003。

2)藥品、試劑及其配制

穿心蓮內(nèi)酯由四川什邡市金鑫生物科技有限公司生產(chǎn)(批號：120822)，純度大于99％；本發(fā)明化合物由本發(fā)明人所在實(shí)驗(yàn)室合成，純度大于99％；藥用級低聚羧甲基纖維素鈉(cmc-na)由安徽山河藥用輔料有限公司生產(chǎn)(批號：131114)；苦參素膠囊，產(chǎn)自正大天晴藥業(yè)公司(批號：國藥準(zhǔn)字h20010763)。水飛薊賓膠囊由天津天士力圣特制藥有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字h20040299)生產(chǎn)，藥物用0.5％cmc-na配成混懸液。ccl4由天津凱基化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，其它試劑均為市售分析純。

3)試驗(yàn)方法

sd大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，按體重隨機(jī)分組，分出正常組后，其余大鼠進(jìn)行背部皮下注射含40％ccl4的大豆油造模，首次劑量為4ml/kg，其余劑量為2ml/kg，2次/w。造模4w后，除正常組外，其余大鼠按體重進(jìn)行分組，8只/組。穿心蓮內(nèi)酯、苦參素、水飛薊賓和本發(fā)明化合物a劑量均為20mg/kg，其他化合物劑量為與a相同的摩爾物質(zhì)量；模型組和正常組動物給予等量的0.5％cmc-na。第5w、6w造模和給藥同時進(jìn)行，第7w、8w停止造模，只給藥。每次灌胃均在早上空腹時進(jìn)行，每給藥10d停藥一天。大鼠在末次灌胃前8h更換墊料，嚴(yán)格禁食不禁水。給藥后1h腹腔注射3％的戊巴比妥鈉(2ml/kg)麻醉劑，采血后迅速完整地剖離肝臟。采集的血液在37℃孵育箱中靜置45min后，4℃下3500rpm離心15min，取上層血清，分裝備用。取大鼠左葉下半部分肝臟于10倍體積4％多聚甲醛固定液中固定，24h后更新固定液。固定充分后進(jìn)行病理切片，經(jīng)masson三色染觀察肝臟纖維化程度，image-proplus軟件對masson染色切片的拍照結(jié)果進(jìn)行纖維化組織學(xué)半定量分析。計(jì)算相對膠原面積：(給藥組平均面積－正常組平均面積)/(模型組平均面積－正常組平均面積)×100％，結(jié)果見附圖4、5。利用免疫組織化學(xué)法評價肝組織α-sma(hsc活化程度的標(biāo)志物)表達(dá)情況，使用image-proplus對陽性表達(dá)進(jìn)行量化分析，結(jié)果見附圖6、7。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖4、5、6、7，結(jié)果表明：本發(fā)明化合物能顯著降低動物肝組織的纖維化程度。與ad比，本發(fā)明化合物治療組肝組織的膠原面積顯著減少。與陽性參照水飛薊賓和苦參素比，療效更突出。同時觀察到本發(fā)明化合物顯著下調(diào)肝組織中α-sma的表達(dá)水平，與ad比，差異顯著，且效果優(yōu)于陽性藥。說明其發(fā)揮抗肝纖維化作用與抑制肝星狀細(xì)胞hsc活化有關(guān)。

實(shí)施例3本發(fā)明化合物顯著降低豬血清誘導(dǎo)wistar大鼠的肝纖維化程度

免疫性肝纖維化主要是由肝臟自身出現(xiàn)免疫反應(yīng)所引起的疾病，而且其他因素(病毒、酒精、血吸蟲及某些化學(xué)物質(zhì)等)所致肝纖維化也常伴隨不同程度的免疫反應(yīng)。對實(shí)驗(yàn)動物反復(fù)腹腔注射異種血清或蛋白(豬血清g、血吸蟲血清、人或牛血清白蛋白等)是目前主要的造模方法。該法的獨(dú)特之處在于異種血清主要通過mhcⅱ分子和炎癥因子激活肝干細(xì)胞hsc產(chǎn)生免疫應(yīng)答導(dǎo)致的肝臟損傷，在這個過程中肝纖維化與免疫反應(yīng)持續(xù)存在，能很好地重現(xiàn)其他模型所不能呈現(xiàn)的人類自身免疫性肝損傷所致肝纖維可能的過程和機(jī)制，使該模型在抗肝纖維化的免疫性藥物的篩選和評估方面具有很大優(yōu)勢。

1材料與方法

1)試驗(yàn)動物

清潔級wistar大鼠，雄性，體重140±20g，購于南疆君科生物工程有限公司，合格證號scxk(遼)2015-0001。

2)藥品、試劑及其配制

水飛薊賓膠囊由天津天士力圣特制藥有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字h20040299)生產(chǎn)；豬血清由廣州蕊特生物科技有限公司生產(chǎn)(批號：160608)。其他供試藥物、化合物同實(shí)施例1、2，其它試劑均為市售分析純；藥物配成0.5％的羧甲基纖維素鈉(cmc-na)混懸液。

3)試驗(yàn)方法

wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按照體重隨機(jī)分組，每組6只。除正常組動物外，全部大鼠均進(jìn)行腹腔注射豬血清，1ml/只，2次/w，持續(xù)6w。實(shí)驗(yàn)至第8w末結(jié)束。灌胃給藥，1次/d。每次灌胃均在早上空腹時進(jìn)行，每給藥10d停藥一天。預(yù)防給藥組(h：2.5mg/kg)動物從造模當(dāng)天開始給藥，水飛薊賓(50mg/kg)、穿心蓮內(nèi)酯(20mg/kg)和本發(fā)明化合物h的5mg/kg和10mg/kg劑量組動物均從第5w開始給藥，而20mg/kg劑量組動物從第7w開始給藥；對照組和模型組灌胃給予0.5％cmc-na。大鼠在末次灌胃前8h更換墊料，嚴(yán)格禁食不禁水。給藥后1h腹腔注射3％的戊巴比妥鈉(2ml/kg)麻醉劑，采血后迅速完整地剖離肝臟并拍照。采集的血液在37℃孵育箱中靜置45min后，4℃下3500rpm離心15min，取上層血清，保存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笞笕~下半部分肝臟于10倍體積4％多聚甲醛固定液中固定，24h后更新固定液。固定充分后進(jìn)行病理切片，經(jīng)masson三色染觀察肝臟纖維化程度，image-proplus軟件對masson染色切片的拍照結(jié)果進(jìn)行纖維化組織學(xué)半定量分析。計(jì)算相對膠原面積：(給藥組平均面積－正常組平均面積)/(模型組平均面積－正常組平均面積)×100％，結(jié)果見附圖8、9。利用免疫組織化學(xué)法評價肝組織α-sma(hsc活化程度的標(biāo)志物)表達(dá)情況，使用image-proplus對陽性表達(dá)進(jìn)行量化分析，結(jié)果見附圖10、11。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖8、9、10、11，結(jié)果表明：在豬血清誘導(dǎo)的肝纖維化模型上，本發(fā)明化合物表現(xiàn)出良好的抗肝纖維化作用。無論預(yù)防給藥還是治療給藥均顯著減輕了大鼠的肝纖維化程度。效果優(yōu)于ad和水飛薊賓(50mg/kg)處理組，即使造模6w后給藥，僅給藥2w也取得了良好的治療效果。同時觀察到本發(fā)明化合物顯著下調(diào)肝組織中α-sma的表達(dá)水平，與ad比，差異顯著，且效果優(yōu)于陽性藥。說明其發(fā)揮抗肝纖維化作用與抑制肝星狀細(xì)胞hsc活化有關(guān)。

實(shí)施例4本發(fā)明化合物顯著減輕總膽管結(jié)扎的sd大鼠肝纖維化程度

1材料與方法

1)試驗(yàn)動物

清潔級sd大鼠，雄性，體重200±20g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。其許可證號是scxk(湘)2016-0002。

2)藥品、試劑及其配制

熊去氧膽酸由上海信誼藥廠有限公司(批號：國藥準(zhǔn)字h31021875)生產(chǎn)；其他供試藥物、化合物同實(shí)施例1、2，其它試劑均為市售分析純；藥物配成0.5％的羧甲基纖維素鈉(cmc-na)混懸液。

3)試驗(yàn)方法

sd大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按照體重隨機(jī)分組：假手術(shù)對照組、模型組、ad對照組(20mg/kg)、熊去氧膽酸對照組(25mg/kg)和各本發(fā)明化合物組，每組4只。假手術(shù)組和模型組灌胃給予0.5％cmc-na，其余各給藥組給予0.5％cmc-na混懸的相應(yīng)藥物，給藥4w結(jié)束。術(shù)前12h更換墊料，嚴(yán)格禁食不禁水，灌胃前2h肌肉注射青霉素8萬u/只，灌胃后1h腹腔注射3％的戊巴比妥鈉(2ml/kg)，麻醉生效后，仰位固定大鼠四肢，剪毛，碘酒消毒皮膚，鋪洞巾，沿腹中線開腹，沿胃向下找到并向上牽引十二指腸，游離膽總管，距近肝門部0.5cm處，以4/0號絲線雙重結(jié)扎并離斷膽總管，檢查無出血及膽漏情況后，以3/0號絲線連續(xù)縫針法逐層關(guān)腹，碘酒消毒傷口，術(shù)后保暖至清醒，假手術(shù)組只進(jìn)行麻醉、開腹、游離膽總管，不結(jié)扎、不離斷膽總管。每次灌胃均在早上空腹時進(jìn)行，每給藥10d停藥一天。大鼠在末次灌胃前12h更換墊料，嚴(yán)格禁食不禁水。給藥后1h腹腔注射3％的戊巴比妥鈉(2ml/kg)麻醉劑，采血后迅速完整地剖離肝臟并拍照。血液離心后，取上清，保存?zhèn)溆?。取大鼠左葉下半部分肝臟于10倍體積4％多聚甲醛固定液中固定，24h后更新固定液。固定充分后進(jìn)行病理切片，經(jīng)masson三色染觀察肝臟纖維化程度，image-proplus軟件對masson染色切片的拍照結(jié)果進(jìn)行纖維化組織學(xué)半定量分析。計(jì)算相對膠原面積：(給藥組平均面積－正常組平均面積)/(模型組平均面積－正常組平均面積)×100％，結(jié)果見附圖12、13。利用免疫組織化學(xué)法評價肝組織α-sma(hsc活化程度的標(biāo)志物)表達(dá)情況，使用image-proplus對陽性表達(dá)進(jìn)行量化分析，結(jié)果見附圖14、15。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖12、13、14、15，結(jié)果表明：在膽管阻塞型肝纖維化模型上，本發(fā)明化合物抗肝纖維化作用均顯著強(qiáng)于ad和陽性藥處理。同時觀察到本發(fā)明化合物顯著下調(diào)肝組織中α-sma的表達(dá)水平，與ad比，差異顯著，且效果優(yōu)于陽性藥。說明其發(fā)揮抗肝纖維化作用與抑制肝星狀細(xì)胞hsc活化有關(guān)。

實(shí)施例5本發(fā)明化合物對四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)sd大鼠肝纖維化動物血清膠原指標(biāo)的影響

正常肝組織中，膠原物質(zhì)是竇間隙基質(zhì)膜的重要組成成分，以c-ⅰ和c-ⅳ為主。當(dāng)肝臟受到損傷后，大量膠原物質(zhì)和糖蛋白被轉(zhuǎn)錄、翻譯和組裝，以ln、c-ⅰ和c-ⅲ為主。臨床上，血清ln、c-ⅰ、pc-ⅲ和c-ⅳ水平是纖維化患者診斷的重要指標(biāo)。

1材料與方法

同實(shí)施例2。

以本發(fā)明化合物h為代表，采用elisa方法測定動物血清中l(wèi)n、c-ⅰ、pc-ⅲ和c-ⅳ水平。血清中膠原指標(biāo)變化見附圖16-19。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組中l(wèi)n與三種膠原含量均大幅提高；各治療組顯著降低肝組織中l(wèi)n含量，本發(fā)明化合物h高劑量組和陽性藥苦參組相比有顯著性差異；苦參、ad和本發(fā)明化合物均顯著降低了c-ⅰ含量，h呈劑量依賴性降低c-ⅰ水平；h低、高劑量顯著降低組織內(nèi)pc-ⅲ水平，給藥濃度為20mg/kg時，與苦參組和ad組相比有顯著性意義；苦參、ad和化合物h顯著降低肝組織中c-ⅳ的含量，h呈劑量依賴性降低血清c-ⅳ水平。

結(jié)合圖16、17、18、19，結(jié)果表明：本發(fā)明化合物在保持了母體化合物ad的大幅降低ln、c-ⅰ和c-ⅳ水平的基礎(chǔ)上，顯著提高了對pc-iii的抑制活性。其中本發(fā)明化合物在20mg/kg劑量使ln、pc-ⅲ、c-ⅳ降低到正常水平。并且化合物h在5mg/kg劑量對pc-ⅲ、c-ⅳ的下調(diào)程度與ad在20mg/kg劑量時的相當(dāng)。

實(shí)施例6本發(fā)明化合物對四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)sd大鼠肝纖維化動物血清il-6和tnf-α水平的影響

活化的hsc可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的tnf-α，繼續(xù)參與hsc的分化，同時還會擴(kuò)大肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)。il-6是促纖維化因子之一，參與肝組織內(nèi)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡與再生等復(fù)雜的生理過程，也是nf-κb下游的效應(yīng)分子。1材料與方法

同實(shí)施例2。

以本發(fā)明化合物h為代表，采用elisa方法測定動物血清中il-6和tnf-α水平。結(jié)果見附圖20、21。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖20、21，結(jié)果表明：三個劑量的化合物h都使肝纖維化大鼠血清中tnf-α和il-6水平大幅降低，高劑量組效果最為顯著，在給藥劑量為20mg/kg時血清中il-6和tnf-α的含量與正常組動物水平相當(dāng)。結(jié)果提示：本發(fā)明化合物的抗肝纖維化作用與抑制tnf-α、il-6的表達(dá)密切相關(guān)，通過降低tnf-α和il-6的含量，阻礙hsc分化成為mfc，并通過抑制nf-κb信號通路激活降低了炎癥反應(yīng)。

實(shí)施例7本發(fā)明化合物對四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)sd大鼠肝纖維化動物肝組織中sod和mda水平的影響

sod和mda是評價脂質(zhì)過氧化的重要指標(biāo)。sod是抗氧化劑，不僅可以抑制因自由基啟動導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化，還可以清除自由基以保護(hù)生物膜的完整性，是機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的敏感指標(biāo)。脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生大量的mda，它的含量與組織內(nèi)過氧化的損傷程度成正比。

1材料與方法

同實(shí)施例2。

以本發(fā)明化合物h為代表，測定動物肝組織中sod、mda水平。結(jié)果見附圖22，23。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖22、23，結(jié)果表明：本發(fā)明化合物5、10、20mg/kg三個劑量組sod水平均大幅升高，并接近正常水平，10、20mg/kg兩個劑量組mda水平均大幅降低，并接近正常值。說明本發(fā)明化合物保持了ad的強(qiáng)抗脂質(zhì)過氧化能力。

實(shí)施例8本發(fā)明化合物大幅改善四氯化碳(ccl4)誘導(dǎo)sd大鼠肝纖維化動物肝組織炎癥狀態(tài)

1材料與方法

同實(shí)施例2。

以本發(fā)明化合物h為代表，通過h&e染色觀察分析本發(fā)明化合物對肝組織免疫炎癥狀態(tài)的改善情況，結(jié)果見附圖24、25。數(shù)據(jù)利用spss17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示；p﹤0.05組間差異有顯著性意義。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖24、25，結(jié)果表明：正常組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整、肝細(xì)胞索排列整齊，沒有異變發(fā)生且維管區(qū)正常；肝細(xì)胞未見變形、壞死，無纖維結(jié)締產(chǎn)生。模型組大鼠肝細(xì)胞索排列混亂，核質(zhì)比明顯增大并伴隨可見點(diǎn)、片狀及灶狀壞死區(qū)，淋巴細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損無法辨別。與模型組相比，給藥組動物肝損傷均得到不同程度的改善，尤其是本發(fā)明化合物h的中、高劑量治療組最為顯著，肝細(xì)胞僅有輕微腫大，肝細(xì)胞索的結(jié)構(gòu)正常，明顯優(yōu)于陽性藥苦參治療組和ad治療組。