1.一種Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法，其特征在于，包括構(gòu)建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通過添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)FLP酶表達(dá)，以切除FRT位點(diǎn)之間的FLP表達(dá)盒和潮霉素抗性基因表達(dá)盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(1)構(gòu)建基因敲除盒，敲除盒從5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位點(diǎn)、嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重組酶基因、SpCyC1t終止子、潮霉素抗性基因hphm表達(dá)盒、FRT位點(diǎn)、靶基因下游同源臂；
(2)用基因敲除盒轉(zhuǎn)化Candida amazonensis，得到靶基因敲除的陽性克隆；
(3)將陽性克隆接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)FLP重組酶基因表達(dá)，切除同向FRT位點(diǎn)之間的DNA片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：
所述靶基因為PDC基因，編碼丙酮酸脫羧酶，該基因編碼序列如SEQ ID NO:1所示；
所述的FRT位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO:2所示；
所述的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpGAL1p為Spathaspora passalidarum來源的β-半乳糖苷酶基因GAL1啟動子，受半乳糖誘導(dǎo)，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
所述的嚴(yán)格誘導(dǎo)型啟動子SpMAL1p為Spathaspora passalidarum來源的α-麥芽糖苷酶基因MAL1啟動子，受麥芽糖誘導(dǎo)，該啟動子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
所述的caFLP為適用于Candida amazonensis的重組酶基因，該基因的編碼序列如SEQ ID NO:5所示；
所述的SpCyC1t終止子為Spathaspora passalidarum來源的細(xì)胞色素C基因CYC1終止子，該終止子的DNA序列如SEQ ID NO:6所示；
所述的潮霉素抗性基因hphm表達(dá)盒，其DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述caFLP是指將釀酒酵母來源的FLP重組酶基因內(nèi)含有的3個CTG密碼子突變?yōu)門TG，使得在Candida amazonensis內(nèi)編碼的是亮氨酸，而非絲氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述構(gòu)建基因敲除盒由以下具體步驟得到：
(1)以Candida amazonensis基因組為模板，用序列為SEQ ID NO:8的引物PDC-1和序列為SEQ ID NO:9的引物PDC-2擴(kuò)增PDC基因5’端360bp的上游序列PDC-L，在片段上游引入酶切位點(diǎn)Stu I，片段下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；利用序列為SEQ ID NO:10的引物PDC-3和序列為SEQ ID NO:11的引物PDC-4擴(kuò)增PDC 3’端400bp的下游序列PDC-R，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，片段下游引入酶切位點(diǎn)Stu I；用重疊延伸PCR法將PDC-L和PDC-R序列拼接獲得PDC基因同源重組片段PDCL-R；
(2)將PDCL-R連接至PMD19-T simple載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆，命名為Ts-PDCLR；提取質(zhì)粒Ts-PDCLR，用Kpn I酶切，去磷酸化后備用；
(3)以Spathaspora passalidarum基因組DNA為模板，用序列為SEQ ID NO:12的引物SpGAL1p-F和序列為SEQ ID NO:13的引物SpGAL1p-R PCR擴(kuò)增啟動子SpGAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)Kpn I，下游引入Sal I；以序列為SEQ ID NO:14的引物SpMAL1p-F和序列為SEQ ID NO:15的引物SpMAL1p-R PCR擴(kuò)增啟動子SpMAL1p，片段上游引入酶切位點(diǎn)BamH I，下游引入Sal I；
(4)將純化的片段SpGAL1p和重組質(zhì)粒PRACTH-gfpm分別用Bgl II和Sal I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpGAL1p-gfpm；將純化的片段SpMAL1p用BamH I和Sal I雙酶切，質(zhì)粒PRACTH-gfpm用Bgl II和Sal I雙酶切，二者的酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，其中BamH I和Bgl II是同尾酶，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒命名為SpMAL1p-gfpm；
(5)對重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-gfpm和Ts-caFLP分別用Sal I和Not I雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別純化后過夜連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落，獲得重組質(zhì)粒SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP；
(6)以質(zhì)粒SpGAL1p-caFLP為模板，用序列為SEQ ID NO:16的引物FRT-1和序列為SEQ ID NO:17的引物FRT-2擴(kuò)增帶有FRT位點(diǎn)的片段FRT-SpGAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；以質(zhì)粒SpMAL1p-caFLP為模板，用序列為SEQ ID NO:18的FRT-3和序列為SEQ ID NO:17的FRT-2擴(kuò)增帶有FRT的片段FRT-SpMAL1p-caFLP-SpCyC1t-hphm-FRT，片段上、下游引入酶切位點(diǎn)Kpn I；
(7)上述帶有FRT的片段經(jīng)Kpn I酶切并純化后，分別與步驟(2)中備用的Ts-PDCLR經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，獲得陽性克隆Ts-PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR，簡稱為Ts-PRFgHRP或Ts-PRFmHRP，該同源重組載體通過Stu I酶切后割膠回收同源重組片段PDCL-FRT-SpGAL1p/SpMAL1p-caFLP-hphm-FRT-PDCR即PRFgHRP/PRFmHRP備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)的具體操作方法為：將基因敲除盒經(jīng)醋酸鋰介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入Candida amazonensis中，涂布含900μg/mL潮霉素即Hygromycin B的平板篩選得到轉(zhuǎn)化子；在通過更高濃度的潮霉素抗性平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選后，進(jìn)一步獲取陽性轉(zhuǎn)化子。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為兩種：
當(dāng)選擇用SpGAL1p啟動子來誘導(dǎo)FLP的表達(dá)時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPG；
當(dāng)選擇用SpMAL1p來誘導(dǎo)FLP的表達(dá)時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基則為麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPM。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成為：
半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPG：蛋白胨20，酵母提取物10，半乳糖20，單位為g/L；用于固體培養(yǎng)基時添加1.6％的瓊脂粉；
麥芽糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPM：蛋白胨20，酵母提取物10，麥芽糖20，單位為g/L；用于固體培養(yǎng)基時添加1.6％的瓊脂粉。
9.根據(jù)權(quán)利要求2～8任一項所述的方法，其特征在于，所述的宿主酵母Candida amazonensiss保藏于荷蘭真菌菌種保藏中心，保藏編號為CBS 12363。