本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種乳腺癌篩查試劑盒。

背景技術(shù)：

乳腺癌(breast cancer，BC)是最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％，是全球女性中發(fā)病率及致死率最高的惡性腫瘤，內(nèi)分泌激素失調(diào)、遺傳因素、飲食習(xí)慣、環(huán)境致癌物等均是誘發(fā)乳腺癌的關(guān)鍵因素。

目前對(duì)乳腺癌仍缺乏有效的治療手段，乳腺癌篩查是公認(rèn)的能夠有效提高女性乳腺癌生存率的主要方法，乳腺癌已被WHO列為應(yīng)開(kāi)展人群篩查的癌癥類別之一。合理的篩查能夠早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌，提高治愈率，增加“保乳”手術(shù)的機(jī)會(huì)，減少術(shù)后輔助治療，節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用，提高患者生活質(zhì)量。

目前國(guó)內(nèi)外常用的乳腺癌篩查手段包括乳房X線攝影術(shù)(鉬靶X線攝影)、超聲成像、臨床乳腺檢查和磁共振成像等，但篩查效果均不理想，尋找新的、可靠的篩查手段對(duì)于發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌具有非常重要的意義。

生物標(biāo)記物是生理或病理過(guò)程中可供客觀測(cè)定和評(píng)價(jià)的某種特征性的生化指標(biāo)，在疾病的鑒定、早期診斷和治療的監(jiān)控中起幫助作用。如果可以找到乳腺癌分子標(biāo)志物，用于提示臨床醫(yī)生早期對(duì)患者采取相關(guān)的治療措施或者決策具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種乳腺癌篩查試劑盒。

本發(fā)明提供了SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了檢測(cè)SEQ ID NO.1或2所示核苷酸序列的試劑在制備乳腺癌篩查用試劑中的用途。

其中，所述檢測(cè)的試劑包括擴(kuò)增乳腺組織SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列的試劑；

和/或，所述檢測(cè)的試劑為定量PCR、半定量PCR、Western Blot或ELISA檢測(cè)方法用試劑。

本發(fā)明還提供了檢測(cè)DPEP1基因或HPKG2基因表達(dá)水平的試劑在制備乳腺癌篩查用試劑中的用途。

其中，所述檢測(cè)的試劑包括擴(kuò)增乳腺組織DPEP1基因和/或HPKG2基因的試劑；

和/或，所述檢測(cè)的試劑為定量PCR、半定量PCR、Western Blot或ELISA檢測(cè)方法用試劑。

其中，所述檢測(cè)的試劑包括SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種乳腺癌篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測(cè)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、DPEP1基因和/或HPKG2基因表達(dá)水平的試劑。

其中，所述檢測(cè)的試劑包括擴(kuò)增乳腺組織SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、DPEP1基因和/或HPKG2基因的試劑。

其中，所述檢測(cè)擴(kuò)增試劑為定量PCR、半定量PCR、Western Blot或ELISA檢測(cè)方法用試劑。

進(jìn)一步的，所述擴(kuò)增的試劑包括SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.11-12或SEQ ID NO.13-14所示的核苷酸序列。

本發(fā)明試劑盒，通過(guò)檢測(cè)乳腺異常者的乳腺異常部位與正常部位的基因組BC10-1或BC13-4片段、DPEP1、或PHKG2基因表達(dá)水平，可以判斷二者表達(dá)水平差異，進(jìn)而判斷待檢者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)：若異常部位基因組BC10-1或BC13-4片段、DPEP1、或PHKG2的表達(dá)水平高，則患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)高，反之，則患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)低，可用于臨床乳腺癌的輔助診斷，臨床應(yīng)用前景良好。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1.為改良RAPD PCR擴(kuò)增乳腺癌組織及其附近的正常組織圖；

a.高GC引物FY-10.b.高GC引物FY-13.c.高GC引物FY-31.5對(duì)擴(kuò)增乳腺癌組織及其附近的正常組織的基因組DNA用于RAPD擴(kuò)增.藍(lán)色箭頭指示從膠中切割下來(lái)用于DNA克隆.通道“M”顯示有分子重量(bp)的DL2000 DNA標(biāo)記。通道1,3,5,7和9是擴(kuò)增表1的乳腺癌組織DNA，而通道2,4,6,8和10是擴(kuò)增癌旁的正常組織DNA。

圖2.為RAPD片段的分子克隆圖；

a.從高GC引物FY-10,FY-13和FY-31獲得的純化的RAPD DNA片段10,13和31的瓊脂糖電泳檢測(cè),T為T載體0.5μl。b.RAPD片段10的陽(yáng)性克隆酶切鑒定。c.RAPD片段13的陽(yáng)性克隆酶切鑒定。d.RAPD片段31的陽(yáng)性克隆酶切鑒定。通道1顯示未經(jīng)酶切的質(zhì)粒DNA，而通道2顯示質(zhì)粒經(jīng)EcoR I消化。藍(lán)色顯示的克隆10-1,13-4和31-2挑選出來(lái)做Sanger測(cè)序。通道“M”顯示有分子重量(bp)的DL2000DNA標(biāo)記。

圖3.為SCAR標(biāo)記BC10-1,BC13-4和BC31-2在乳腺癌患者中的基因組DNA擴(kuò)增分析圖；

a.SCAR標(biāo)記BC31-2在5對(duì)乳腺癌組織及其鄰近正常組織的基因組DNA擴(kuò)增。通道1,3,5,7和9是擴(kuò)增乳腺癌組織DNA(see Table 1)，而通道2,4,6,8和10是擴(kuò)增癌旁的正常組織DNA。b.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)SCAR標(biāo)記BC10-1.c.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)SCAR標(biāo)記BC13-4。“Cancer”：乳腺癌組織；“Adjacent”：相應(yīng)的癌旁正常組織；“Ctrl”,正常女性血液DNA；“**”,p value≤0.05。

圖4.為DPEP1和PHKG2基因在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中的mRNA表達(dá)分析圖；

a.在6個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)DPEP1的mRNA表達(dá)量。b.乳腺癌組織及其鄰近正常組織的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)DPEP1的mRNA表達(dá)量。C.在6個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)PHKG2的mRNA表達(dá)量。d.乳腺癌組織及其鄰近正常組織的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)PHKG2的mRNA表達(dá)量?！癕DA231”,MDA-MB-231細(xì)胞；“MDA435”,MDA-MB-435細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。

本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)試劑與儀器如下：

pGM-T載體(批號(hào)：VT202)、質(zhì)粒小提試劑盒、膠DNA回收試劑盒、總RNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。RT-PCR試劑盒購(gòu)買自TIANGEN公司。PCR 2×Mix，DNA分子大小標(biāo)記DL2000購(gòu)買自TIANGEN公司(TIANGEN公司，北京)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)買自ABI公司。Taqman探針:Universal Probe Library，Roche。

Nanodrop，ND1000；PCR儀(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology,USA)；0.1ml薄壁PCR板(The AppliedOptical 96-Well Reaction Plate,USA)；熒光定量PCR儀(ABI stepone plus,Applied Biosystems,USA)；電泳儀由北京百晶生物有限公司生產(chǎn)，BG-subMID Icell；凝膠分析系統(tǒng)使用BIO-RAD公司(Universal Hood Ⅱ)。

實(shí)施例1 RAPD方法特異擴(kuò)增得到本發(fā)明檢測(cè)乳腺癌的標(biāo)記物(SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列)

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)--即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，主要用于動(dòng)植物基因組信息未知的情況下的分子檢測(cè)。RAPD技術(shù)依賴于PCR，選用10個(gè)堿基的單鏈隨機(jī)引物，對(duì)生物個(gè)體、居群或物種基因組的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其遺傳位點(diǎn)的差異。

一、實(shí)驗(yàn)方法

(一)腫瘤組織DNA獲取

1.取乳腺癌組織及癌旁正常組織(取病變部位旁2cm的組織區(qū)域)5對(duì)(表1)。每個(gè)取乳腺癌組織5mg，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入2-3ml的細(xì)胞核裂解緩沖液勻漿至不見(jiàn)組織塊；

2.將勻漿器全部轉(zhuǎn)入5ml離心管中，加入蛋白酶K(20mg/ml)10μl，混勻。在56℃恒溫水浴鍋中水浴4-5小時(shí)或者37℃過(guò)夜；

3.加等體積的飽和酚，用力顛倒混勻5-10min，12000rpm離心10min；

4.取上清液至另一5ml離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕柔顛倒混勻，12000rpm離心10min。若水相仍不澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。

5.取上清液全部至另一5ml離心管中，加入100％酒精3倍體積以上，出現(xiàn)絮狀物(若無(wú)絮狀物，12000rpm離心5min)。

6.用鉤針將DNA鉤出，倒置。

7.用500μl 70％乙醇洗滌沉淀物1-2次。要小心，不要將DNA沖洗掉。

8.室溫干燥1-2分鐘。不要太長(zhǎng)，否則DNA難溶解。

9.加300μl 1×TE重新溶解沉淀物，室溫轉(zhuǎn)動(dòng)溶解DNA 1-2小時(shí)。吸取適量樣品檢測(cè)濃度和純度后，4℃使用或-20℃長(zhǎng)期保存。

注意事項(xiàng)：根據(jù)需要，DNA的純化也可采用商業(yè)銷售的各種DNA純化試劑盒純化。

10、DNA質(zhì)量檢測(cè)和濃度分析

(1)電泳法：1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

(2)NANO DROP法：(測(cè)OD值法)

·打開(kāi)分光光度計(jì)圖標(biāo)，選擇Nuncli Acid；(Nanodrop，ND1000)

·加入ddH2O 4μl，點(diǎn)擊OK，初始化儀器；

·再次加入ddH2O 4μl，選擇DNA-50，點(diǎn)擊BLANK；

·加入樣本1μl，點(diǎn)擊Measure，測(cè)出值后作好詳細(xì)記錄。

·滴入ddH2O 4μl洗滌兩次。

11、將DNA用1×TE稀釋到10～20ng/μl,保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

12、動(dòng)物組織或者細(xì)胞樣本中DNA提取采用酚/氯仿法，部分詳細(xì)見(jiàn)《精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江)

表1. 5個(gè)乳腺癌標(biāo)本的組織病理信息

(二)改良RAPD技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增

1、設(shè)計(jì)并合成3條長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸的高GC含量的引物，90％的GC含量。各條高GC含量引物的名稱、序列見(jiàn)下表2：

表2.各個(gè)高GC引物序列

2、用改良RAPD技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

(1)用ramp率0.125℃/s(5％)條件下的RAPD：取乳腺癌組織及癌旁正常組織5對(duì)DNA作為模板，分別用RAMP率為0.125℃/s和高GC含量的引物FY-10、FY-13和FY-31做RAPD擴(kuò)增，PCR體系如下所示。

PCR體系(10μl)

模板(10ng/μl)1μl

引物 1μl

2×Mix(天根，KT207) 5μl

ddH2O 3μl

充分混勻后，于離心機(jī)12000rpm離心15s，置于PCR儀(Applied Biosystems 96-Well Thermal Cycler，Life Technology,USA)。

(2)RAPD PCR條件如下：

注意事項(xiàng)：

(1)ramp rate是指退火溫度上升到延伸溫度的速率。對(duì)于Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler而言，5％ramp rate(0.125℃/s)、10％ramp rate(0.25℃/s)、20％ramp rate(0.5℃/s)、40％ramp rate(1℃/s)、100％ramp rate(2.5℃/s)。常規(guī)的RAPD即100％ramp rate。

(2)不同的PCR儀器，RAMP rat可能不一樣，一旦選定了特定的PCR儀器，就在同一款項(xiàng)儀器上完成所有的PCR擴(kuò)增。

3、DNA電泳：詳見(jiàn)《精編醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，主編：傅俊江)

(1)制備1.5％的瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物按順序全部點(diǎn)樣到凝膠孔內(nèi)，同時(shí)點(diǎn)樣一個(gè)DNA分子大小標(biāo)記(DL2000，TIANGEN公司，北京)。注意：不需要加載樣緩沖液，PCR擴(kuò)增用的2×Mix中就預(yù)加了相關(guān)成分。

(2)電泳(電泳儀由北京百晶生物有限公司生產(chǎn)，BG-subMID Icell)，常選擇電壓110V，電泳時(shí)間30min即可，也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

4、凝膠分析并照相(使用(BIO-RAD，Universal Hood Ⅱ)凝膠系統(tǒng)觀察結(jié)果和照相。

5、結(jié)果：RAPD擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

(三)GC含量引物改良RAPD擴(kuò)增條帶的分離

1、將上述用高GC含量引物在乳腺癌組織及癌旁正常組織5對(duì)DNA中進(jìn)行改良RAPD擴(kuò)增獲得電泳產(chǎn)物，割取目的條帶(如圖1藍(lán)色箭頭所示)，用膠回收試劑盒(天根，DP209)回收目的片段(常用20-30μl洗脫)；

割取目的條帶：

片段10：FY-10引物擴(kuò)增片段

片段13：FY-13引物擴(kuò)增片段

片段31：FY-31引物擴(kuò)增片段

注意事項(xiàng)：

割取目的條帶時(shí)要迅速，長(zhǎng)時(shí)間的紫外線照射可能會(huì)使DNA降解。切膠條帶較多時(shí)，應(yīng)注意標(biāo)記，勿要混淆。

2、將膠回收產(chǎn)物和T載體分別為2μl和0.5μl進(jìn)行1.0％的瓊脂糖凝膠電泳(電泳儀由北京百晶生物有限公司生產(chǎn)，BG-subMID Icell)，常選擇110V，20min，EB染色確定連接時(shí)加入目的片段與T載體的各自的量)，見(jiàn)圖2a。

(四)克隆

應(yīng)用A/T克隆法(T載體克隆)

1、連接反應(yīng)(反應(yīng)體系10μl)：兩EP管分別加入：

充分混勻后，12000rpm離心15s，于4℃連接過(guò)夜(或者16℃8～12h)。

2、DH5α感受態(tài)細(xì)菌的制備：

(1)取1.5ml EP管，加入500μl無(wú)Amp(無(wú)氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基，挑取一DH5α感受態(tài)細(xì)菌，于37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(不超過(guò)16h)；

(2)取一100ml錐形瓶，加入10無(wú)Amp(無(wú)氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基，按照1：50或者1:100加入培養(yǎng)過(guò)夜的DH5α菌液，37℃震蕩培養(yǎng)2-3h達(dá)OD值0.6-0.8(具體時(shí)間根據(jù)菌液的渾濁度而定)；

(3)將10ml菌液全部轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml管中，冰浴15min；

(4)4000rpm離心5min(Thermo公司，Legend Micro 21R)，棄去上清(將上清棄干凈，殘留的培養(yǎng)基可能會(huì)影響感受態(tài)細(xì)胞的活性)；

注意：

a.不同的離心機(jī)，離心條件不一樣嚴(yán)格掌物離心力和離心時(shí)間；

b.離心過(guò)了會(huì)嚴(yán)重影響感受態(tài)細(xì)菌的活性；

(5)加入1ml 4℃100mmol/L的CaCl2溶液，輕輕混勻后再加入9ml于4℃預(yù)冷100mmol/L的CaCl2溶液，冰浴30min(此步驟操作應(yīng)輕柔，勿用Tip吹打，利用手腕的力量使其混勻，整個(gè)操作應(yīng)在冰上完成)；

(6)4000rpm離心5min，棄去上清；

(7)加入2ml 4℃100mmol/L的CaCl2溶液，輕輕混勻后置于4℃冰箱備用。

3、轉(zhuǎn)化：

(1)連接過(guò)夜的兩管分別加入50μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞，手指輕彈管底混勻。另取一空白預(yù)冷EP管加入50μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞作為空白對(duì)照，冰浴30min。

(2)42℃熱激45s～90s，冰浴2-3min，不要搖動(dòng)離心管。

(3)加入300μl LB無(wú)Amp(無(wú)氨芐青霉素)的液體培養(yǎng)基，于37℃振蕩培養(yǎng)45min，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

(4)將離心管中的菌液混勻，全部鋪皿(涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)作相應(yīng)的調(diào)整)，待平板表面干燥后，倒置平板，37℃CO2孵箱中孵育12-16h。

4、陽(yáng)性克隆的鑒定

(1)藍(lán)白篩選法

①首先LB Amp﹢固體培養(yǎng)板配制方法：稱取LB肉體粉末5g、3.75g瓊脂粉(1.5％)于一干凈錐形瓶中，加入250ml ddH2O充分混勻后，于121kpa高壓滅菌30min，放入水浴鍋中降到60℃，加入250μl氨芐青霉素(100mg/μl)，250μl IPTG(50mg/μl，Solarbio，No.I8070)、1000μl X-gal(20mg/μl，Solarbio，No.924B035)充分混勻后，于超凈工作臺(tái)中倒制固體培養(yǎng)板(20ml/板)，待其冷卻后置于4℃保存。另外，IPTG、X-gal也可使用前30min鋪皿后于CO2孵箱中烤干備用[20ml培養(yǎng)板使用20μl IPTG(50mg/μl)、40μl X-gal(20mg/μl)即可]。

②將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部涂布到上述固體培養(yǎng)板上，37℃孵箱孵育16h，可見(jiàn)固體板上藍(lán)白菌落，白色可能為陽(yáng)性克隆。

③挑取白色菌落，振蕩培養(yǎng)用于下述PCR鑒定、酶切鑒定以及測(cè)序測(cè)定。

(2)PCR鑒定：設(shè)計(jì)pGM-T載體引物(T7與SP6的引物對(duì)，

T7引物:5’-TAA TACGACTCACTATAGGG-3’,

SP6引物:5’-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3’。)進(jìn)而進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系10μl)。擴(kuò)增的片段大小與目的片段大小一致即為陽(yáng)性克隆。

①取1.5ml EP管，加入500μl含有Amp(有氨芐青霉素)的LB液體培養(yǎng)基，挑取一陽(yáng)性克隆菌，于37℃震蕩培養(yǎng)4-5h；

②待菌液稍渾濁，取0.2-0.5μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

③菌液PCR：

菌液PCR體系(總體積10μl)

充分混勻后，于離心機(jī)12000rpm離心15s，置于PCR儀(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。PCR條件：

PCR結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度根據(jù)其目的片段的大小而定)。

④PCR鑒定為陽(yáng)性，大小相符的，可以選擇測(cè)序。

(3)酶切鑒定法：EcoRI酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)目的片段(大小相符的)即為陽(yáng)性克隆。

①取1.5ml EP管，加入500μl A+(有氨芐青霉素)的LB培養(yǎng)基，挑取一陽(yáng)性克隆菌，于37℃震蕩培養(yǎng)4-5h；

②待菌液渾濁，將其全部轉(zhuǎn)入加有0.2ml菌液的10-20ml管中，37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

③取2-3ml菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根，DP103)提取質(zhì)粒DNA,60-100μl的ddH2O洗脫；

④質(zhì)粒DNA含量的測(cè)定(測(cè)OD值)

·打開(kāi)分光光度計(jì)圖標(biāo)，選擇Nuncli Acid；(Nanodrop，ND1000)

·加入ddH2O 4μl，點(diǎn)擊OK，初始化儀器；

·再次加入ddH2O 4μl，選擇DNA-50，點(diǎn)擊BLANK；

·加入樣本1μl，點(diǎn)擊Measure，測(cè)出值后作好詳細(xì)記錄。

·滴入ddH2O 4μl洗滌兩次。

⑤質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切：

酶切體系(10μl)：

充分混勻后，于離心機(jī)12000rpm離心15s。

⑥37℃水浴2-3h；

⑦酶切結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳(膠的濃度根據(jù)其目的片段的大小而定)。酶切鑒定顯示圖2b,c,d的克隆10-1，13-4，31-2分別為片段10，13，31 的陽(yáng)性克隆并進(jìn)行Sager測(cè)序。

二、結(jié)果分析

將酶切鑒定提示的圖2b,c,d為陽(yáng)性克隆的BC10-1、BC13-4和BC31-2進(jìn)行Sanger測(cè)序分析(如圖2通道用藍(lán)色所示)，序列如下：

乳腺癌BC10-1克隆的序列：1027bp(SEQ ID NO.1)

CCCGCCGGTTCCATCCTCTGAGAGCCTCACCCTTCACTGCCCGTGATGGCACGAGCTGAGGCCCCCCACCCGGTTCCATCCTCTGAGACTCTCGCCCTTCACTGCCTGTGATGGTGCTCCATGCTATGCTGTAGATGCCTACTCTCTGAGGTTCTCCCTCGCTGACGGTGGATCACAGGCAGTCAGAGAGGAGAGGGGCTTTCCGCCCTCATTACAGCCCTGGGCCTCAACCTGGCTGCACGCTCCCCAAAACCACAACCCCTGGCTCCCGGCTCCCCGCTCCCCGAGACTCACCATGCGCGGGACAGGGTCCCGAGTACCTCGGCTCAGCCACCCAAGTCCCAGGGAGACAGACCCGCCTCCTGCCTCCCAGGTCACAAGGCTTGGGGGTTGTTTCTGGTGTTCAAGTTCAGTCCTGCCACCCACGGAGCTCTCCAGCTACAGAACAGCCACCTCCTTGAGGGCTCGCACAGTACCCCAGGGAGAGCCGGGCTAAAGCCTCACACATGTCAGCTGGTTCTTGTTTCCGAAGATACGCATGCCCTCAGTGAGGCCTTGAGCATCCGGCCAGCCCAGGGGCTTCTGGGACTCTCGGTCCCAGGCCAGGCAGGAGAGCTTGTGCTGGGTGATCACCCTTTGAGGCCCCCCAGGCAGTAGTGTAGGGTATCTGCCTTAGGTGGCAGCAGGTTGAGAAATGGAGAGGAGGGGGCCTGGGAGCTTGGGCCCAGCCCAACGAGCCCAGAGAGTCTCAAGTGGCCTGGGGGTCCCAGGTCGTGTGTCCCCCCCAATGGCAGACCCCAGCCACCTCCCTGACTCCCTCGGAGGACACTGACCCTGGCCCCGGAGTTGGGACAAACTCCGTCCTCAGTTTCTTTATCTGTAAGTGCGATGGGTTGATCTCCCTCCATCCCCAGCCACAATCGAGGATTGGAATGTCCTCTGGCAAAGCCACACGGGCTTTCGAAATCCAAGGAGGGTCTGCGTGTGGACCGCACTGAGCTGGAGACCAGGCTGGCTTTGGAATTCT

乳腺癌BC13-4克隆的序列：663bp(SEQ ID NO.2)

GTCCCGCCACTCGGGTCCTCTGGCTTCTTCCCAAACACCTCCTCTTTCTCTCGGTGATTGGCCAAGAGGCAGTTCCCATAGTAACTGACACCGCGCTCCCACTTCCCAGCCTGGAGGACAGCACCGGCCCTCGTATTAGCAACCTGGAAGAGAGGGCGCCCAGGTGGGCACTCGCAACTTCTCACGTATCTGCGCGTTCTCTTCGCTCCCACTGGCGTGAGCCTGCGCTTTCCGCCTTCCTTCCCTCACAAGCCCCCTTGGCAACCGTCGCCGTTGAGACGGAGGGAGACGCCCCCACGGATTCGCCCCGCCGCGCCTCTCCGCGCGTAGATTGGCCGGAGCGAGGCGAACGGGCCCGGCCTTGGTAGCCGCCGACCGAGCGCTGGCTGTCCTGGAACCTAGGCGGCGGGAGCCCGGGGCGCCTCGCGGCACGGAAGAGCGGCGAGATGCTCAACCGCAAGACCAGCCACTTTTTGGGAATGAGGGTGCAGTCGGAGCTTGAACATCTCTCCGAGCTGCGGCGGGAAGCGGGGAAGGATCGCAGCTCAGTGCATGGGTCGGCCGCGCGGACGCGTGCGAGTGTGCGGACTCAGTGGACGACGGCGGCGGCGGCGAAAGCGGATGAAGACCCCGGAGCCAACTTGTTTCCGGTGAGGGCGGGAC

乳腺癌BC31-2克隆的序列：1104bp(SEQ ID NO.21)

CCCCGAATGAAGTACACAACATCTTCCATGATGCAGCTGTGACAAAGAAAGAAAAAAATTGTTCCTAAACCGTATGAGCTTCTGGAGCTAAGTCCCAGGTTACAGAAACGCAGGGGACAGAGAACATGTCAAACACCACCAAAAAGACACAGTCAACAAAACCCACACCATGGGAAACCCTACAGGACAAACGGCCCCATTTCTTTGATAGATAATTTACTAGGAAAAAATAAAAGATGAAAGAGCAATCAACCAATTGCAATTATGGACTTCTGTTTGGATCTCATTCAAACAAACCGTAAAACCTATGCATATTTATAGCACAAATTAGAAATTAGAACAATTACTGGATATTTGATGATATTAAGAGATTATTTTATAAGTTGGTATTATGGTTTTTTTTTTTTGAGCCCTTATCTTTCAGAGATGCATCCGGAAATATTTACAGATGAAATGAGATGCTGTCTGGGCAAAGTGCAGGGGTGTGTAGAGGAAATAAGACTAGCCATAGGCTGGCAAGTGTCAAAGTGAAGGGATGGGTGCGAGGAGTCCATCAGGCTGTGCTCGCTACCCTCTCGCTGTCTACAGTAGAAATTCCCCATCACCACGGACACCAGCCACCTGGCCCGGCAGTCCACGCTCTCAGCCTCATCCCTCCAACGCTCCCTCCTTCGGGTCCCATCTACCACAACCACCAAACACCCATGCCACTTCAAGCCACCTCCCCCACGCACATGTGGCTCCCTCTGCCTCCTTCCCTTGTCTCTTAGGGGCCAGCTGAGCAGCAGCTTTGAGGCACCTTCTGCTGAGCACCCCCCCAACAGTCAGGCAGCCCCTTTCCTGGCACCCCAGCATGGCTCTCTTTTCCCTGCCCACTGGGAGGAGCTCCTTGGGGACAGGGGCCAAGTCTGACTAATTCTCAGATCTCCAGCACCCAGCACAGGGCCTGGCCCAGCTCCAAAGCTGGCTGGAGTCTTCCTGGGAGGAAAATCCCCCACACTGGTCACAGGGCAGCCTTGACCGGCTGGTGACCTGTACACACTACTTAATACCACATTACCCACTGCGGTGCATGGCAGTGACTTCACTTTCAACGGGGCCACG

實(shí)施例2 SEQ ID NO.1、2所示的核苷酸序列表達(dá)水平與乳腺癌的關(guān)系(基因組水平)

一、實(shí)驗(yàn)方法

(一)測(cè)序分析后，根據(jù)測(cè)定的序列，用Primer3.0軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)設(shè)計(jì)特異性引物，并合成引物(表3)，這些引物用于擴(kuò)增腫瘤和正常人的基因組DNA，GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，它們可以用于半定量PCR。

BC10-1L(SEQ ID NO.3)，BC10-1R(SEQ ID NO.4)；

BC31-2L(SEQ ID NO.5)，BC31-2R(SEQ ID NO.6)；

GAPDH5G(SEQ ID NO.15)，GAPDH3G(SEQ ID NO.16)。

同時(shí)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析引物(表4)。表4引物用于擴(kuò)增腫瘤和正常人的基因組DNA，β-actin為內(nèi)參對(duì)照，并標(biāo)明了所使用的Taqman探針號(hào)(Universal Probe Library，Roche)。

BC10-1L87(SEQ ID NO.7)，BC10-1R87(SEQ ID NO.8)；

BC13-4L34(SEQ ID NO.9)，BC13-4R34(SEQ ID NO.10)；

Q-b-actin55LG(SEQ ID NO.17)，Q-b-actin55RG(SEQ ID NO.18)。

(二)根據(jù)新合成的引物，建立合適PCR條件，進(jìn)行PCR半定量和實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增。

1.取腫瘤組織、癌旁組織和外周血白細(xì)胞的樣本DNA66例(其中各種正常人白細(xì)胞DNA10例、乳腺癌組織30例及其鄰近正常組織22例)，稀釋成10ng/μl備用，即為熒光定量PCR的gDNA模板；

2.根據(jù)新合成的引物進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增：

(1)PCR體系(10μl)

充分混勻后，于離心機(jī)12000rpm離心15s，置于PCR儀(Applied Biosystems96-Well Thermal Cycler，Life Technology，USA)。

(2)PCR擴(kuò)增條件

3.瓊脂糖凝膠電泳(膠濃度根據(jù)其目的片段的大小而定)。

4.圖像攝?。?BIO-RAD，Universal Hood Ⅱ)。

(三)根據(jù)新合成的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：

1.取0.1ml薄壁PCR板(The AppliedOptical 96-Well Reaction Plate)，各孔加入：

內(nèi)參對(duì)照組：

實(shí)驗(yàn)組：

充分混勻后離心、擴(kuò)增；每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次。

2.將加好樣的薄壁PCR板放入熒光定量PCR儀(ABI stepone plus,Applied Biosystems)內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10min，95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、SCAR標(biāo)記BC10-1在各種正常人白細(xì)胞DNA(10例)、乳腺癌組織(30例)及其鄰近正常組織(22例)的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3b。

由圖3b可見(jiàn)，乳腺癌組織中的基因組BC10-1表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明BC10-1的高表達(dá)會(huì)顯著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺組織的BC10-1片段水平可反映正常人乳腺組織的BC10-1水平，因此，可以通過(guò)檢測(cè)待檢者的BC10-1的表達(dá)水平，將乳腺癌的易感人群篩查出來(lái)。

2、SCAR標(biāo)記BC13-4在各種正常人白細(xì)胞DNA(10例)、乳腺癌組織(30例)及其鄰近正常組織(22例)的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3c。

由圖3c可見(jiàn)，乳腺癌組織中的基因組BC10-1片段表達(dá)量顯著高于正常人白細(xì)胞DNA，癌旁組織的基因組BC10-1片段表達(dá)量顯著高于正常人白細(xì)胞DNA，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

說(shuō)明SCAR標(biāo)記BC13-4在乳腺癌組織和癌旁組織均有異常DNA擴(kuò)增，因此，BC13-4片段可以對(duì)乳腺組織進(jìn)行鑒定；并且可以通過(guò)檢測(cè)待檢者的BC13-4片段的表達(dá)水平，將乳腺癌的易感人群篩查出來(lái)。

3、SCAR標(biāo)記BC31-2在5對(duì)乳腺癌組織及其鄰近正常組織的基因組DNA的半定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖3a。

由圖3a可見(jiàn)，與同一患者的癌旁正常組織相比，通道3-8中的乳腺癌組織的BC31-2片段表達(dá)量均無(wú)明顯區(qū)別，僅在通道1和9的腫瘤組織顯示出BC31-2片段表達(dá)量升高。

SCAR標(biāo)記BC31-2片段的表達(dá)不能完全體現(xiàn)出乳腺癌組織及其鄰近正常組織的差異，無(wú)法用來(lái)篩查乳腺癌易感人群，不能作為乳腺癌患者診斷的分子標(biāo)記。

因此，SCAR標(biāo)記BC10-1和BC13-4可以用于檢測(cè)腫瘤患者腫瘤組織和癌旁組織的異常DNA擴(kuò)增，對(duì)乳腺癌進(jìn)行基因組水平的檢測(cè)，可以作為乳腺癌腫瘤診斷的分子標(biāo)記。

實(shí)施例3 DPEP1和PHKG2表達(dá)水平與乳腺癌的關(guān)系(mRNA水平)

一、實(shí)驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞和腫瘤組織總RNA提取

細(xì)胞總RNA提取

1.使用miRNeasy Mini Kit或者RNeasy Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司(Cat#217004或Cat No.74104)

2.取生長(zhǎng)良好的密度達(dá)95％以上的乳腺癌細(xì)胞(6孔板)，吸凈培養(yǎng)基殘液，用預(yù)冷的1×PBS飄洗2次；

3.加入700μl的QIAzol Lysis(miRNeasy Mini Kit)，用1ml注射器抽吸5次，靜置5min；

4.加入140μl氯仿，用力搖晃15s再室溫靜置2-3min；

5.4℃離心10000rpm離心15min；

6.小心吸取上清液于另一EP管中，加入1.5倍體積無(wú)水乙醇，上下顛倒數(shù)次；

7.取700μl樣品加入到吸附柱中，10000rpm離心30s,超過(guò)700μl的重復(fù)一次；

8.加入700μl RWT，10000rpm離心30s；

9.加入500μl RPE，10000rpm離心30s；

10.加入500μl RPE，12000rpm離心2min；

11.換一新的收集管，12000rpm離心1min；

12.用40μl RNease Free水洗脫和收集RNA，測(cè)定RNA濃度后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

13.RNA質(zhì)量檢測(cè)

(1)紫外儀測(cè)RNA的OD值：在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA的純度和濃度OD260/OD280＝1.8～2.0(260、280nm)下的吸光度分別代了蛋白和核酸值,表示優(yōu)質(zhì)在微量核酸檢測(cè)儀上檢測(cè)RNA的純度和濃度，OD260/OD280＞2.0(260、280nm下的吸光度分別代了蛋白和核酸值)，表示RNA優(yōu)質(zhì)。

(2)瓊脂糖凝膠電泳

⑴制備1％的瓊脂糖凝膠，備用；

⑵分別取RNA樣品(400ng)，分別加入5×Loading Buffer電泳上樣緩沖液各1μl，混勻后點(diǎn)樣；

⑶電泳條件：120V電壓下電泳30min；

⑷用凝膠成像儀觀察結(jié)果、照相并保存，RNA呈現(xiàn)28S和18S兩條明亮條帶。

腫瘤組織總RNA提取

1.取乳腺癌組織5mg，剪碎后置于玻璃勻漿器中，勻漿，腫瘤組織總RNA提取同細(xì)胞總RNA提取。

2.RNA質(zhì)量檢測(cè)同“細(xì)胞總RNA提取”的步驟13。

(二)RT(反轉(zhuǎn)錄)

1.配置反轉(zhuǎn)錄20ul反應(yīng)體系：將0.2ml微量離心管中置于冰上，各管中加入：

充分混勻后離心；

2.將上一步驟中配置好的微量離心管放入PCR儀器內(nèi)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反應(yīng)程序：30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min，4℃保存)；

3.反應(yīng)結(jié)束后取出微量離心管，每管中加入80ul滅菌ddH₂O稀釋產(chǎn)物，-20℃保存，即為熒光定量PCR的cDNA模板。

(三)DPEP1和PHKG2的mRNA表達(dá)的熒光定量PCR分析

1.取0.1ml薄壁PCR板(The AppliedOptical 96-Well Reaction Plate)，各孔加入：

內(nèi)參對(duì)照組：

實(shí)驗(yàn)組：

充分混勻后離心，擴(kuò)增；每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三次

注：熒光定量PCR分析的試劑等見(jiàn)表5：其中，探針來(lái)自(Universal Probe Library，Roche)

Q-PHKG2-L2(SEQ ID NO.11)，Q-PHKG2-R2(SEQ ID NO.12)；

Q-DPEP1-13L(SEQ ID NO.13)，Q-DPEP1-13R(SEQ ID NO.14)；

18S48R(SEQ ID NO.19)，18S48L(SEQ ID NO.20)。

2.將加好樣的薄壁PCR板放入熒光定量PCR儀(ABI stepone plus,Applied Biosystems)內(nèi)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)?5℃10min，95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、在4株乳腺癌細(xì)胞T47D，MCF7，BT549，MDA-MB-231中，DPEP1基因的mRNA表達(dá)明顯比正常乳腺細(xì)胞MCF10A高(如圖4a)。

說(shuō)明乳腺癌中DPEP1基因的表達(dá)量顯著升高。

2、乳腺癌組織(33例)及其鄰近正常組織(11例)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4b。

可見(jiàn)，乳腺癌組織DPEP1基因的mRNA表達(dá)比癌旁正常組織高11.6倍以上，乳腺癌組織中DPEP1基因表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明DPEP1基因的高表達(dá)會(huì)顯著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺組織的DPEP1基因表達(dá)水平可反映正常人乳腺組織的DPEP1基因表達(dá)水平，因此，可以通過(guò)檢測(cè)待檢者乳腺組織中的DPEP1基因表達(dá)水平，將乳腺癌的易感人群篩查出來(lái)。

3、在5株乳腺癌細(xì)胞T47D，MCF7，BT549，MDA-MB-231，MDA-MB-435中，PHKG2基因的mRNA表達(dá)明顯比正常乳腺細(xì)胞MCF10A高；而高侵襲性乳腺癌細(xì)胞BT549，MDA-MB-231，MDA-MB-435的表達(dá)又比低侵襲性乳腺癌細(xì)胞T47D，MCF7高(圖4c)。

說(shuō)明乳腺癌中PHKG2基因的表達(dá)量顯著升高，而且PHKG2基因在乳腺癌腫瘤中，特別是腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。

4、乳腺癌組織(33例)及其鄰近正常組織(11例)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4d。

可見(jiàn)，乳腺癌組織PHKG2基因的mRNA表達(dá)比癌旁正常組織高3倍以上，乳腺癌組織中PHKG2基因表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明PHKG2基因的高表達(dá)會(huì)顯著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁正常乳腺組織的PHKG2基因表達(dá)水平可反映正常人乳腺組織的PHKG2基因表達(dá)水平，因此，可以通過(guò)檢測(cè)待檢者乳腺組織中的PHKG2基因表達(dá)水平，將乳腺癌的易感人群篩查出來(lái)。

綜上，與癌旁鄰近正常組織相比，乳腺癌癌組織的DPEP1和HPKG2基因表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明乳腺癌與DPEP1、HPKG2表達(dá)水平呈正相關(guān)，DPEP1、HPKG2的高表達(dá)會(huì)顯著提高患乳腺癌的可能性。

由于癌旁鄰近正常組織的DPEP1、HPKG2水平可反映正常人乳腺癌組織的DPEP1、HPKG2水平，因此，可以通過(guò)檢測(cè)待檢者的DPEP1、HPKG2的表達(dá)水平，將乳腺癌癌的易感人群篩查出來(lái)。

因此，DPEP1和HPKG2基因可以作為乳腺癌診斷的分子標(biāo)記。

實(shí)施例4 本發(fā)明乳腺癌篩查試劑盒的組成及待檢樣本的檢測(cè)

一、基因組DNA水平的半定量PCR檢測(cè)試劑盒

1、試劑盒的組成

(1)BC10-1檢測(cè)時(shí)的半定量PCR試劑(每份總體積25μl，50人份的相應(yīng)用量)

(2)BC13-4檢測(cè)時(shí)的半定量PCR試劑(每份總體積25μl，50人份的相應(yīng)用量)

2、試劑盒的使用方法

(1)取待檢樣本，按照酚/氯仿法提取總DNA。

(2)DNA擴(kuò)增

以步驟(1)得到的DNA為模板，用上述半定量檢測(cè)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增條件：

(3)數(shù)據(jù)分析，獲得擴(kuò)增片段的表達(dá)情況。

二、基因組DNA水平的定量PCR檢測(cè)試劑盒

1、試劑盒的組成

(1)BC10-1檢測(cè)時(shí)的熒光定量PCR試劑(每份總體積20μl，50人份的相應(yīng)用量)

(2)BC13-4檢測(cè)時(shí)的熒光定量PCR試劑(每份總體積20μl，50人份的相應(yīng)用量)

2、試劑盒的使用方法

(1)取待檢樣本，按照酚/氯仿法提取總DNA。

(2)DNA擴(kuò)增

以步驟(1)得到的DNA為模板，用上述定量檢測(cè)試劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在熒光定量PCR儀(ABI stepone plus,Applied Biosystems)內(nèi)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min，95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

(3)數(shù)據(jù)分析，獲得擴(kuò)增片段的表達(dá)情況。

三、mRNA水平的定量PCR檢測(cè)試劑盒

1、試劑盒的組成

(1)DPEP1檢測(cè)時(shí)的熒光定量PCR試劑(每份總體積20μl，50人份的相應(yīng)用量)

(2)HPKG2檢測(cè)時(shí)的熒光定量PCR試劑(每份總體積20μl，50人份的相應(yīng)用量)

2、試劑盒的使用方法

(1)取待檢樣本，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書的方法提取總RNA。

(2)反轉(zhuǎn)錄：

以步驟(1)得到的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的方法，得cDNA。

(3)cDNA擴(kuò)增

以步驟(2)得到的cDNA為模板，用上述熒光定量檢測(cè)試劑進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。在熒光定量PCR儀(ABI stepone plus,Applied Biosystems)內(nèi)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10min，95℃15s，60℃1min，共40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

(4)數(shù)據(jù)分析，獲得DPEP1、HPKG2基因表達(dá)情況。

對(duì)乳腺組織異常者，可分別取異常部位、正常部位組織，比較基因表達(dá)水平，進(jìn)而評(píng)價(jià)其患乳腺癌的可能性，作為臨床乳腺癌的輔助診斷手段。

綜上，本發(fā)明試劑盒通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)的基因表達(dá)水平，可以判斷乳腺異常者的異常部位與正常部位的基因表達(dá)水平差異，進(jìn)而篩查待檢者患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，可用于臨床乳腺癌的輔助診斷，應(yīng)用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成競(jìng)梁

<120> 一種乳腺癌篩查試劑盒

<130> GY185-17P1014

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1027

<212> DNA

<213> BC10-1序列

<400> 1

cccgccggtt ccatcctctg agagcctcac ccttcactgc ccgtgatggc acgagctgag 60

gccccccacc cggttccatc ctctgagact ctcgcccttc actgcctgtg atggtgctcc 120

atgctatgct gtagatgcct actctctgag gttctccctc gctgacggtg gatcacaggc 180

agtcagagag gagaggggct ttccgccctc attacagccc tgggcctcaa cctggctgca 240

cgctccccaa aaccacaacc cctggctccc ggctccccgc tccccgagac tcaccatgcg 300

cgggacaggg tcccgagtac ctcggctcag ccacccaagt cccagggaga cagacccgcc 360

tcctgcctcc caggtcacaa ggcttggggg ttgtttctgg tgttcaagtt cagtcctgcc 420

acccacggag ctctccagct acagaacagc cacctccttg agggctcgca cagtacccca 480

gggagagccg ggctaaagcc tcacacatgt cagctggttc ttgtttccga agatacgcat 540

gccctcagtg aggccttgag catccggcca gcccaggggc ttctgggact ctcggtccca 600

ggccaggcag gagagcttgt gctgggtgat caccctttga ggccccccag gcagtagtgt 660

agggtatctg ccttaggtgg cagcaggttg agaaatggag aggagggggc ctgggagctt 720

gggcccagcc caacgagccc agagagtctc aagtggcctg ggggtcccag gtcgtgtgtc 780

ccccccaatg gcagacccca gccacctccc tgactccctc ggaggacact gaccctggcc 840

ccggagttgg gacaaactcc gtcctcagtt tctttatctg taagtgcgat gggttgatct 900

ccctccatcc ccagccacaa tcgaggattg gaatgtcctc tggcaaagcc acacgggctt 960

tcgaaatcca aggagggtct gcgtgtggac cgcactgagc tggagaccag gctggctttg 1020

gaattct 1027

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<213> BC13-4序列

<400> 2

gtcccgccac tcgggtcctc tggcttcttc ccaaacacct cctctttctc tcggtgattg 60

gccaagaggc agttcccata gtaactgaca ccgcgctccc acttcccagc ctggaggaca 120

gcaccggccc tcgtattagc aacctggaag agagggcgcc caggtgggca ctcgcaactt 180

ctcacgtatc tgcgcgttct cttcgctccc actggcgtga gcctgcgctt tccgccttcc 240

ttccctcaca agcccccttg gcaaccgtcg ccgttgagac ggagggagac gcccccacgg 300

attcgccccg ccgcgcctct ccgcgcgtag attggccgga gcgaggcgaa cgggcccggc 360

cttggtagcc gccgaccgag cgctggctgt cctggaacct aggcggcggg agcccggggc 420

gcctcgcggc acggaagagc ggcgagatgc tcaaccgcaa gaccagccac tttttgggaa 480

tgagggtgca gtcggagctt gaacatctct ccgagctgcg gcgggaagcg gggaaggatc 540

gcagctcagt gcatgggtcg gccgcgcgga cgcgtgcgag tgtgcggact cagtggacga 600

cggcggcggc ggcgaaagcg gatgaagacc ccggagccaa cttgtttccg gtgagggcgg 660

gac 663

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1L

<400> 3

gatcacaggc agtcagagag g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1R

<400> 4

caggccactt gagactctct g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> BC31-2L

<400> 5

acaaacggcc ccatttcttt g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> BC31-2R

<400> 6

ttggtggttg tggtagatgg g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> BC10-1L87

<400> 7

cccaggcagt agtgtagggt a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> BC10-1R87

<400> 8

ccctcctctc catttctcaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> BC13-4L34

<400> 9

tctggcttct tcccaaacac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> BC13-4R34

<400> 10

cgcggtgtca gttactatgg 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Q-PHKG2-L2

<400> 11

caatatgcag atccgacttt ca 22

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Q-PHKG2-R2

<400> 12

ggggtcccac acaactctc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Q-DPEP1-13L

<400> 13

tgcactgcag acttctttcg 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Q-DPEP1-13R

<400> 14

gccaggggag gtcattgt 18

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH5G

<400> 15

acccagaaga ctgtggatgg 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH3G

<400> 16

tgacaaagtg gtcgttgagg 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Q-b-actin55LG

<400> 17

aagtcccttg ccatcctaaa a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Q-b-actin55RG

<400> 18

atgctatcac ctcccctgtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S48R

<400> 19

gcaattattc cccatgaacg 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 18S48L

<400> 20

gggacttaat caacgcaagc 20

<210> 21

<211> 1104

<212> DNA

<213> BC31-2序列

<400> 21

ccccgaatga agtacacaac atcttccatg atgcagctgt gacaaagaaa gaaaaaaatt 60

gttcctaaac cgtatgagct tctggagcta agtcccaggt tacagaaacg caggggacag 120

agaacatgtc aaacaccacc aaaaagacac agtcaacaaa acccacacca tgggaaaccc 180

tacaggacaa acggccccat ttctttgata gataatttac taggaaaaaa taaaagatga 240

aagagcaatc aaccaattgc aattatggac ttctgtttgg atctcattca aacaaaccgt 300

aaaacctatg catatttata gcacaaatta gaaattagaa caattactgg atatttgatg 360

atattaagag attattttat aagttggtat tatggttttt tttttttgag cccttatctt 420

tcagagatgc atccggaaat atttacagat gaaatgagat gctgtctggg caaagtgcag 480

gggtgtgtag aggaaataag actagccata ggctggcaag tgtcaaagtg aagggatggg 540

tgcgaggagt ccatcaggct gtgctcgcta ccctctcgct gtctacagta gaaattcccc 600

atcaccacgg acaccagcca cctggcccgg cagtccacgc tctcagcctc atccctccaa 660

cgctccctcc ttcgggtccc atctaccaca accaccaaac acccatgcca cttcaagcca 720

cctcccccac gcacatgtgg ctccctctgc ctccttccct tgtctcttag gggccagctg 780

agcagcagct ttgaggcacc ttctgctgag caccccccca acagtcaggc agcccctttc 840

ctggcacccc agcatggctc tcttttccct gcccactggg aggagctcct tggggacagg 900

ggccaagtct gactaattct cagatctcca gcacccagca cagggcctgg cccagctcca 960

aagctggctg gagtcttcct gggaggaaaa tcccccacac tggtcacagg gcagccttga 1020

ccggctggtg acctgtacac actacttaat accacattac ccactgcggt gcatggcagt 1080

gacttcactt tcaacggggc cacg 1104