相關申請

本申請要求2015年2月6日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/113,153和2015年6月12日提交的62/174,942的優(yōu)先權，兩個申請的全部內(nèi)容據(jù)此以引用的方式并入本文。

本文件尤其涉及使用接種和t細胞共刺激來治療受試者的臨床病狀的材料和方法，包括用于從單一載體共表達疫苗(例如gp96-ig)和t細胞共刺激分子的材料和方法。

以電子方式提交的文本文件的說明

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背景

癌癥是一種由長期的遺傳不穩(wěn)定引起的疾病，它延長了正常細胞的壽命。標記此時期開始的觸發(fā)事件是在細胞類型之間的變異，但通常是獲得腫瘤抑制基因如p53或rb中的突變、原癌基因如kras或myc中的突變、或者細胞感染了致癌病毒如hpv16或ebv。不管來源如何，獲得使它們能逃避正常生長控制或細胞死亡途徑的基因突變的細胞變得更可能獲得額外的突變。一旦細胞已獲得“足夠的”突變，通常認為是至少六個，其便不再對將阻止其生長或觸發(fā)細胞凋亡的內(nèi)部或外部信號有反應。

由于腫瘤是由宿主細胞產(chǎn)生，所以人體的免疫系統(tǒng)最初對這些細胞耐受。致瘤突變的獲得可能或可能不造成含有足夠非自身以變得有免疫原性的表位的突變蛋白的產(chǎn)生。如果細胞獲得免疫原性突變，那么其可被宿主免疫系統(tǒng)搜尋出并破壞，這是被稱為免疫監(jiān)視的過程(smyth等人,advimmunol2006,90:1-50)。鼠科研究提供了關于免疫監(jiān)視假說的支持(dunn等人,natimmunol2002,3:991-998；shankaran等人,nature2001,410:1107-1111；及dunn等人,annurevimmunol2004,22:329-360)，并且還提示除所謂的適應性免疫應答之外先天性免疫應答也可促進免疫原性腫瘤的排斥(unni等人,procnatlacadsciusa2008,105:1686-1691；taieb等人,natmed2006,12:214-219；及raulet和guerra,natrevimmunol2009,9:568-580)。先天性應答可通過誘導nk活化信號的表達如nkg2d配體表達或在由誘變或病毒過程引起的dna損傷之后被誘發(fā)。獲得免疫原性突變的一些細胞還獲得參與正常免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)的能力，其減弱了抗自身免疫應答(rabinovich等人,annurevimmunol2007,25:267-296)。對驅使活化宿主調(diào)節(jié)機制的途徑的了解非常貧乏。其它細胞也可獲得許多致癌突變，而不曾產(chǎn)生免疫原性肽，所述肽導致宿主免疫系統(tǒng)的活化。因此，在其轉化期間產(chǎn)生免疫原性肽的腫瘤細胞必須連續(xù)逃避抗腫瘤免疫應答以存活下來，而變得轉化但不活化免疫系統(tǒng)的腫瘤則不能依靠這種免疫調(diào)節(jié)機制來存活。

發(fā)明概要

有可能包括一種或多種檢查點抑制劑、一種或多種疫苗及一種或多種t細胞共刺激分子的組合或子組合的組合療法可擴大可受益于免疫療法的癌癥患者的基礎。疫苗可通過增加腫瘤抗原特異性cd8+t細胞的出現(xiàn)率以及由那些cd8+t細胞識別的腫瘤抗原的數(shù)量來促進此應答。t細胞共刺激分子可通過進一步提高腫瘤抗原特異性t細胞的出現(xiàn)率和/或增強其活化并且還通過增加cd8+t細胞對腫瘤殺傷效應分子的表達來增強應答。當與檢查點抑制劑組合使用時，有可能產(chǎn)生廣泛的高度活化的cd8+t細胞，其將能浸潤腫瘤并且一旦發(fā)生浸潤將不會受到各種檢查點途徑的抑制。然而，對組合療法成功的障礙在于它們傳統(tǒng)上需要施用至少三種不同的藥物產(chǎn)品(疫苗、t細胞共刺激劑及檢查點抑制劑)，其各自具有顯著的成本且在一些情況下有毒性。

本文件至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：接種(例如gp96-ig接種)和t細胞共刺激與ox40、icos、4-1bb、tnfrsf25、cd40、cd27和/或gitr等的一種或多種激動劑的組合提供協(xié)同的抗腫瘤益處。臨床前模型評估了gp96-ig疫苗與靶向ox40、icos、4-1bb及tnfrsf25的激動性抗體組合的獨立組合物，并且展現(xiàn)對機理及抗腫瘤互補性的可變作用。本文所述的材料和方法的有利之處尤其在于它們提供單一組合物，所述組合物可實現(xiàn)例如gp96-ig的接種與t細胞共刺激，而無需獨立產(chǎn)品。這些材料和方法通過生成單一疫苗蛋白(例如gp96-ig)表達載體實現(xiàn)此目標，所述表達載體經(jīng)遺傳修飾以同時表達共刺激分子，包括但不限于融合蛋白，如icosl-ig、4-1bbl-ig、tl1a-ig、ox40l-ig、cd40l-ig、cd70-ig或gitrl-ig，以便提供t細胞共刺激。所述載體及其使用方法可在無需額外抗體療法的情況下提供共刺激益處以增強抗原特異性cd8+t細胞的活化。因此，組合免疫療法可通過載體再工程化以使得不需要疫苗/抗體/融合蛋白方案來實現(xiàn)，這可降低療法的成本及全身毒性的風險。

一方面，本文件特征在于一種表達載體，其含有編碼分泌型疫苗蛋白的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增加抗原特異性t細胞的活化。在一些實施方案中，本文件特征在于一種表達載體，其含有編碼分泌型gp96-ig融合蛋白的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增強抗原特異性t細胞的活化。表達載體可為哺乳動物表達載體。在一個實施方案中，分泌型gp96-ig融合蛋白可缺乏gp96kdel(seqidno:3)序列。gp96-ig融合蛋白中的ig標簽可包括人igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige的fc區(qū)。t細胞共刺激融合蛋白可為與ox40結合的ox40l-ig或其一部分、與icos結合的icosl-ig或其一部分、與4-1bbr結合的4-1bbl-ig或其一部分、與tnfrsf25結合的tl1a-ig或其一部分、與gitr結合的gitrl-ig或其一部分、與cd40結合的cd40-ig或其一部分、或者與cd27結合的cd70-ig或其一部分等。t細胞共刺激融合蛋白中的ig標簽可包括人igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige的fc區(qū)。表達載體可含有dna或rna。

另一方面，本文件特征在于一種含有表達載體的組合物，所述表達載體包含編碼分泌型疫苗蛋白(如分泌型gp96-ig融合蛋白)的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增強抗原特異性t細胞的活化。載體可為基于dna的哺乳動物表達載體。在一個實施方案中，分泌型gp96-ig融合蛋白可缺乏gp96kdel(seqidno:3)序列。gp96-ig融合蛋白中的ig標簽可含有人igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige的fc區(qū)。t細胞共刺激融合蛋白可為與ox40結合的ox40l-ig或其一部分、與icos結合的icosl-ig或其一部分、與4-1bbr結合的4-1bbl-ig或其一部分、與tnfrsf25結合的tl1a-ig或其一部分、與gitr結合的gitrl-ig或其一部分、與cd40結合的cd40l-ig或其一部分、或者與cd27結合的cd70-ig或其一部分等。t細胞共刺激融合蛋白中的ig標簽可包括人igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige的fc區(qū)。表達載體可摻入到病毒或病毒樣顆粒中，或者可摻入到人腫瘤細胞(例如來自以下確定的細胞系的人腫瘤細胞：例如nsclc、膀胱癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎細胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鱗狀細胞癌、頭頸癌、肝細胞癌、胰腺癌或結腸癌細胞系)中。

另一方面，本文件特征在于一種包含組合物的細胞，所述組合物含有包含以下的表達載體：編碼分泌型疫苗蛋白的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增強抗原特異性t細胞的活化。在一些實施方案中，本文件特征在于一種包含組合物的細胞，所述組合物含有包含以下的表達載體：編碼分泌型gp96-ig融合蛋白的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增強抗原特異性t細胞的活化。在各種實施方案中，這種細胞適于用作現(xiàn)成療法。在各種實施方案中，這種細胞是受過照射的。在各種實施方案中，這種細胞是活的和減毒的。在各種實施方案中，這些細胞表達腫瘤抗原，其可由本發(fā)明組合物的疫苗蛋白(例如gp96)作為伴侶。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的細胞系，例如來自以下的人腫瘤細胞：確定的nsclc、膀胱癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎細胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鱗狀細胞癌、頭頸癌、肝細胞癌、胰腺癌或結腸癌細胞系。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的前列腺癌細胞系。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的肺癌細胞系。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的膀胱癌細胞系。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的肉瘤細胞系。在各種實施方案中，這種細胞可來源于確定的絨毛膜癌細胞系。

另一方面，本文件特征在于一種用于治療受試者的方法。所述方法可包括向受試者施用有效量的例如含有表達載體的本文所述的組合物，所述表達載體包括編碼分泌型疫苗蛋白(如分泌型gp96-ig融合蛋白)的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列，其中所述t細胞共刺激融合蛋白當向受試者施用時增強抗原特異性t細胞的活化。所述載體可摻入到病毒或病毒樣顆粒中，或者摻入到人腫瘤細胞中。受試者可為人癌癥患者。向人患者施用所述組合物可提高患者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖。舉例來說，患者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖與施用之前患者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖水平相比可提高了至少25％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少75％)。所述方法可包括向人癌癥患者聯(lián)合施用所述組合物與抑制由腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制性分子的藥劑。所述藥劑可為針對pd-1的抗體。所述受試者可為患有急性或慢性感染(例如，丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒或瘧疾的感染)的人。向人患者施用所述組合物可刺激致病性抗原特異性t細胞的活化或增殖。所述t細胞共刺激分子可將受試者中的抗原特異性t細胞的活化提高到比單獨gp96-ig接種更高的水平。

除非另外定義，否則本文所用的全部技術和科學術語都具有本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然與本文所述類似或等效的方法和材料可用于實踐本發(fā)明，但合適的方法和材料描述如下。所有出版物、專利申請、專利及本文提及的其它參考文獻以引用的方式整體并入。當發(fā)生沖突時，以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法及實施例僅為說明性的且不意圖限制。

本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)在附圖及以下描述中闡述。本發(fā)明的其它特征、目標及優(yōu)勢將從描述、附圖以及權利要求書中顯而易見。

附圖描述

圖1為原始gp96-ig載體的再工程化以生成基于細胞的組合產(chǎn)物的示意圖，所述組合產(chǎn)物編碼第一盒中的gp96-ig融合蛋白和第二盒中的t細胞共刺激融合蛋白。icos-fc、4-1bbl-fc及ox40l-fc以示例的方式示出。

圖2為哺乳動物表達載體(b45)的示意圖，所述表達載體編碼一個表達盒中的分泌型gp96-ig融合蛋白和第二盒中的t細胞共刺激融合蛋白(借助于非限制性示例，icosl-igg4fc)。

圖3為已用編碼兩種分泌型蛋白的載體轉染的同種異體腫瘤細胞的圖示。第一蛋白gp96-ig形成分泌型二聚體(平整的)，其作為細胞外的細胞來源的抗原的伴侶。第二蛋白為三聚的分泌型t細胞共刺激融合蛋白(粗糙的)，其是由疫苗細胞分泌并且可自由地與t細胞表面上的鄰近共刺激受體結合。

圖4a-4g示出了與gp96-ig細胞疫苗組合的ox40激動劑抗體促進抗原特異性cd8增殖，而foxp3+treg保持不受影響。圖4a-4d描繪了gp96-ig細胞疫苗作用機制。在圖4a中，疫苗細胞分泌gp96-ig以及細胞來源的抗原，或在圖5、6及8的情況下，在此疫苗細胞系中穩(wěn)定表達的單一抗原雞卵清蛋白。在圖4b中，gp96-ig/抗原復合物是由apc攝取并且抗原被轉移到mhci類分子。在圖4c中，抗原交叉呈遞造成cd8+特異性t細胞活化。在圖4d中，在腫瘤環(huán)境中，活化的cd8+t細胞可識別遠距離腫瘤上共有的腫瘤抗原并破壞它們。圖4e為繪制用impact(如本文所用，其是指經(jīng)修飾(例如kdel缺失)的gp96-ig融合蛋白或在一些情況下，經(jīng)設計以表達gp96-ig融合蛋白的工程化細胞系)單獨或與針對icos、4-1bb或ox40的激動性t細胞共刺激抗體組合接種之后的抗原特異性(ot-1)細胞擴增的圖表。示出了初始接種(分別為致敏和記憶)之后第5天與第40天的數(shù)據(jù)。后者還對應于第二次、加強接種之后5天。僅impact/ox40(ab)組合產(chǎn)生ot-1擴增，其顯著地大于impact單獨(*，p<.05)。列出了實驗重復。標繪值為平均值并且誤差為sem。對于圖4e中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：無疫苗、impact單獨、impact加icos抗體、impact加ox40抗體、以及impact加4-1bb抗體。圖4f為繪制foxp3+treg占總cd4+細胞的百分比的圖表。除在增加至減少的foxp3+細胞之間波動的impact/4-1bb處理的小鼠之外，在impact處理之后的treg中沒有顯著變化，這突出了其對cd8+擴增的特異性。列出了實驗重復。標繪值為平均值并且誤差為sem。對于圖4f中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：無疫苗、impact單獨、impact加icos抗體、impact加ox40抗體、以及impact加4-1bb抗體。圖4g為繪制在第二模型系統(tǒng)中響應于佐劑明礬的ot-1/cd8和foxp3+細胞擴增的一對圖表。而且，impact與ox40(ab)的組合除造成foxp3+細胞的中度增加之外，還造成顯著的ot-1增殖。列出了實驗重復。標繪值為平均值并且誤差為sem。對于圖4g中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：無疫苗、igg對照、以及impact加ox40抗體。

圖5a-5d示出了t細胞共刺激物ox40與impact(gp96-ig)細胞疫苗協(xié)同地起作用以活化t細胞并產(chǎn)生抗原特異性cd8+擴增。圖5a為t細胞與抗原呈遞細胞(apc)之間的受體(ox40、icos及4-1bb)和配體(ox40l、icosl及4-1bbl)相互作用促進t細胞活化的示意圖。圖5b為描繪通過選擇表達gp96-ig/hla-a1(impact)以及單一抗原雞卵清蛋白的細胞克隆群以便追蹤施用疫苗之后的抗原特異性t細胞擴增(ot-i細胞)而確定的疫苗細胞系的圖。圖5c為針對促進t細胞擴增的協(xié)同作用而與impact組合測試的鼠科t細胞共刺激物激動劑抗體的列表-所有這些抗體在各種實施方案中都適用作組合療法藥劑。圖5d為繪制foxp3-rfp報道基因小鼠中的ot-1水平的圖，該小鼠是用抗原特異性ot-1(cd8)細胞接種，所述細胞是用gfp標記，在第-1天經(jīng)由尾靜脈注射，如在第0天用impact單獨或impact與100μg針對ox40、icos或4-1bb的激動劑t細胞共刺激抗體組合接種之后43天通過流式細胞術所檢測。未接種的(無疫苗)小鼠作為對照平行評價。在第35天再次用疫苗或疫苗/抗體組合加強小鼠。由注射器指示接種日。初始(致敏)應答在第5天達峰值，并且僅疫苗/ox40(ab)處理的小鼠顯示加強之后的適度記憶應答(箭頭)。標繪值表示來自所有cd8+細胞的ot-1細胞的平均百分比并且誤差為sem。關于實驗重復的次數(shù)和樣品組之間的統(tǒng)計顯著性，也參見圖4a-g。

圖6a-6c顯示t細胞共刺激物ox40l與impact組合到新的疫苗載體(“compact”)中產(chǎn)生與共施用ox40激動劑抗體相比令人驚訝的卓越的抗原特異性cd8+t細胞擴增。圖6a描繪了比較以下的實驗設計：(a)使用原始疫苗impact(gp96-ig)與ox40激動劑抗體組合；與(b)新的疫苗compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)的抗原特異性t細胞擴增。圖6b描繪了在用對照疫苗、表達卵清蛋白的疫苗、表達卵清蛋白和gp96-ig(impact)的疫苗、impact與ox40激動劑抗體的組合、或compact初次免疫之后的抗原特異性cd8+t細胞增殖的峰值。對于圖6b中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：無疫苗、僅ova對照、impact、impact加ox40抗體、以及compact。圖6c為繪制使用在第-1天用ot-1(cd8)細胞接種的foxp3-rfp小鼠的ot-1擴增時程(類似于圖5d)的圖。ot-1/gfp細胞通過流式細胞術在用以下處理的小鼠中分析：無疫苗、僅ova對照細胞、impact、impact+100μgox40(ab)、以及compact，經(jīng)46天，在第0天初始接種且在第35天加強(由注射器指示)。致敏和記憶應答(箭頭)二者在用compact處理的小鼠中是最大的，甚至當與impact+ox40(ab)相比時。在時程(～第7-20天)期間，compact小鼠還驚人地保持升高的ot-1水平。標繪值表示平均值并且誤差為sem。關于實驗重復的次數(shù)和樣品組之間的統(tǒng)計顯著性，也參見圖7a-7f。

圖7a-7f顯示在compact中gp96-ig與ox40l、icosl或4-1bbl表達的組合造成高水平的cd8抗原特異性t細胞應答。圖7a-7d示出了如圖6c中使用的compact的3t3-形式的表征。將3t3細胞用表達雞卵清蛋白(ova)的質粒轉染，并且建立單一高表達克隆并用于以疫苗載體(gp96-ig單獨、gp96-ig/ox40l-fc、gp96-ig/icosl或gp96-ig/4-1bbl)重新轉染。疫苗因此在相同的ova親代克隆中建立。將未接種的小鼠(無疫苗)與用僅表達ova的細胞(作為額外對照)、impact(ova-gp96-ig)、impact+ox40激動劑抗體(ox40(ab))、compact(ova-gp96-ig/icosl)、compact(ova-gp96-ig/ox40l-fc)或compact(ova-gp96-ig/1bbl)處理的小鼠進行比較。圖7a為繪制如由elisa所證實的ova分泌的圖，顯示分泌在僅ova對照、impact及各種compact細胞之間是基本上相同的。值為來自最少6次重復的平均值并且誤差為sem。對于圖7a中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：僅ova對照、impact(3t3-ova-gp96-ig)、compact(ova-gp96-ig/icosl)、compact(ova-gp96-ig/ox40l-fc)及compact(ova-gp96-ig/1bbl)。圖7b為繪制如通過elisa所測定的gp96-ig分泌(檢測為igg)的圖，顯示建立的個別impact和compact克隆分泌相當?shù)乃?。值為來自最?次重復的平均值并且誤差為sem。對于圖7b中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：僅ova對照、impact(3t3-ova-gp96-ig)、compact(ova-gp96-ig/icosl)、compact(ova-gp96-ig/ox40l-fc)及compact(ova-gp96-ig/1bbl)。圖7c為繪制如通過qrt-pcr證實的icosl、ox40l或4-1bbl的mrna表達的圖，其示出了僅在compact細胞中的表達。圖示值為來自最少3次不同重復的平均值并且誤差為sem。對于圖7c中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：僅ova對照、impact(3t3-ova-gp96-ig)、compact(ova-gp96-ig/icosl)、compact(ova-gp96-ig/ox40l-fc)及compact(ova-gp96-ig/1bbl)。圖7d提供示出了ox40l、icosl及4-1bbl表達在compact細胞中的確認的蛋白質印跡。用布雷菲德菌素a(brefeldina)(bfa)處理impact和compact細胞16小時以防止蛋白質轉運和分泌。然后收獲細胞，溶解并經(jīng)受sdspage/蛋白質印跡分析。用針對ox40l(也稱為cd252)、icosl或4-1bbl的抗體探測印跡，并且組蛋白h3或肌動蛋白b(actb)作為上樣對照。ox40l、icosl及4-1bbl僅在compact細胞中檢測到。圖7e為繪制在所指示的初次免疫之后第5天cd4+foxp3+調(diào)節(jié)性t細胞的出現(xiàn)率的圖。對于圖7e中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：無疫苗、僅ova對照、impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，ova-gp96-ig/ox40l-fc)。圖7f為繪制在第42天(加強免疫之后7天)抗原特異性cd8+t細胞(ot-i)在外周血液中的出現(xiàn)率(在左邊示出)以及在同一天在外周血液中的cd4+foxp3+t調(diào)節(jié)性細胞的峰值的一對圖。如圖6c中，用僅表達ova的細胞系、impact、impact與ox40(ab)組合以及compact(在此情況下，ova-gp96-ig/ox40l-fc)接種之后的抗原特異性(ot-1)細胞擴增在初始接種(分別為致敏和記憶)之后5和40天示出。后者還對應于第二次、加強接種之后5天。在impact、impact+ox40(ab)及compact處理小鼠中的ot-1水平與僅ova對照處理的小鼠相比顯著升高。compact處理的小鼠展現(xiàn)ot-1細胞的最大增殖，其致敏和記憶應答點都顯著高于impact+ox40(ab)。列出實驗重復并且誤差為sem。對于圖7f中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：無疫苗、僅ova對照、impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，ova-gp96-ig/ox40l-fc)。

圖8a-8e顯示compact引發(fā)抗原特異性cd8+擴增，而ox40抗體造成非特異性t細胞活化。圖8a為繪制未處理的或用impact、impact+ox40(ab)、或compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)接種的小鼠中的單核(mnc)、cd4、cd8、ot-i及ot-ii細胞總數(shù)的一系列圖。至于圖5d和6c，在第-1天經(jīng)由尾靜脈注射用ot-1細胞接種foxp3-rfp報道基因小鼠，在第0天接種，并且在第8天處死用于分析，包括從腹腔沖洗液獲得的細胞的流式細胞術。compact處理產(chǎn)生穩(wěn)健的ot-i(cd8)特異性應答，而ox40(ab)處理造成所有t細胞亞型的增加，包括foxp3+cd4細胞。標繪值表示來自最少3只小鼠的平均值并且誤差為sem。對于圖8a中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)。圖8b為繪制在初次免疫之后第8天cd127⁺klrg1^-、cd127^-klrg1⁺及cd127⁺klrg1⁺細胞的數(shù)量的一系列圖，其分別對應于記憶前體細胞、短期效應細胞及記憶細胞。所述細胞來源于脾臟(上圖)和腹腔(下圖)。對于圖8b中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、僅ova、impact、compact(ova-gp96-ig/icosl)、compact(ova-gp96-ig/ox40l-fc)、及compact(ova-gp96-ig/1bbl)。圖8c為繪制infγ、tnfα、il2、il6及il5水平的一系列圖。在第8天從以上圖8a中呈現(xiàn)的同一小鼠收獲全血血清，并且使用來自biolegend的legendplextm試劑盒和流式細胞儀進行細胞因子分析。與圖8a的數(shù)據(jù)一致，ox40(ab)處理產(chǎn)生非特異性的全身免疫應答，水平升高的不僅有infγ、tnfα及il2，而且還有il6和il5。標繪值表示來自最少3只小鼠的平均值并且誤差為sem。對于圖8c中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)。圖8d為繪制fnγ、tnfα及粒酶-b(gzmb)的基因表達水平的一系列圖。通過qrt-pcr的t細胞活化基因分析顯示compact的特異性僅在活化抗原特異性cd8(ot-i+)細胞中，而與此相比，ox40(ab)非特異性地活化內(nèi)源性(ot-i-)和抗原特異性cd8(ot-i+)細胞。將以上圖8a中從腹腔沖洗液獲得的細胞分選到ot-1-和ot-1+cd8細胞群中。收獲總rna，逆轉錄并通過qpcr分析。示出了ifnγ、tnfα及gzmb的基因表達水平，針對18smrna標準化，其中第一impact僅處理設定在1的重復。標繪值表示來自最少3只小鼠的平均值并且誤差為sem。對于圖8d中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)。圖8e示出了在小鼠的脾細胞和腫瘤引流淋巴結(tdln)中的foxp3調(diào)節(jié)性t細胞(treg)的數(shù)量。對于圖8e中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、impact、impact加ox40抗體、及compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)。

圖9a-9c顯示compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)處理造成抗原特異性cd8t細胞活化，而ox40(ab)處理的共施用引發(fā)非特異性免疫細胞活化，包括在脾臟和淋巴結二者中foxp3treg的增加。圖9a為繪制未處理的或用impact、impact+ox40(ab)或compact接種的小鼠的mnc、cd4、cd8、ot-i及ot-ii細胞的總數(shù)的一系列圖。如在圖5d和6c中，在第-1天經(jīng)由尾靜脈注射用ot-1細胞接種fir報道基因小鼠，在第0天接種，并且在第8天處死用于分析，包括從脾臟處獲得的細胞的流式細胞術。ox40(ab)處理的小鼠顯示在所有t細胞亞型中的增加，包括cd4/foxp3+細胞。compact處理的小鼠產(chǎn)生穩(wěn)健的ot-1(cd8)特異性應答，其顯著高于ox40(ab)應答。標繪值表示來自最少3只小鼠的平均值并且誤差為sem。對于圖9a中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、impact、impact加ox40抗體、及compact。圖9b為繪制未處理的或用impact、impact+ox40(ab)或compact接種的小鼠的mnc、cd4、cd8、ot-i及ot-ii細胞(如在圖9a中，除外周淋巴結中之外)的總數(shù)的一系列圖。對于圖9b中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、impact、impact加ox40抗體、及compact。圖9c為繪制t細胞活化基因(actb、il2及穿孔素1(prf1))的mrna表達的一系列圖。qrt-pcr揭示了在用compact處理的小鼠中的抗原特異性ot-1(cd8)活化，與用ox40(ab)處理的小鼠中的內(nèi)源性和抗原特異性ot-1cd8細胞的非特異性活化對比。將以上圖8a中從腹腔沖洗液獲得的細胞分選到ot-1⁺和ot-1^-cd8細胞群中。收獲總rna，逆轉錄并通過qpcr分析。actb水平在細胞群與充當對照的處理之間是一致的。il2水平在用impact、impact+ox40(ab)、及compact處理的小鼠的ot-1⁺細胞中顯著地升高，表明在所有疫苗/組合下的顯著t細胞活化。與圖8c一致，prf1水平在用ox40(ab)處理的小鼠的ot-1^-和ot-1⁺cd8部分中非特異性地升高，而僅在compact處理的小鼠的ot-1⁺細胞中有所增加。標繪值表示來自最少3只小鼠的平均值并且誤差為sem。對于圖9c中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：impact、impact加ox40抗體、及compact。

圖10a-10c顯示在攜帶腫瘤的小鼠中，compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)處理造成侵襲腫瘤的淋巴細胞的最大數(shù)量和腫瘤的消退。圖10a為實驗裝置的示意圖。用2x10⁵個ct26細胞皮下接種balb/c小鼠，表示第0天。在第6天和第11天，小鼠是未接種的或用impact、impact+ox86(ab)、compact或ox86(ab)單獨接種。疫苗處理是由1x10⁶個細胞和100μg抗體組成。圖10b為繪制在第0天腫瘤接種之后的所示天數(shù)的腫瘤面積的圖并且繪制為來自每個樣品組最少5只實驗小鼠的平均值，其中誤差為sem。圖10c為繪制研究第21天的腫瘤面積的圖。對于圖10c中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：無疫苗、僅ct26對照、僅ox40抗體、impact、impact加ox40抗體、及compact。

圖11a-11e顯示compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)處理在ct26結腸直腸癌模型中造成cd8+特異性腫瘤浸潤、阻礙腫瘤生長、提高總體存活及顯著的腫瘤排斥。在圖11a中，在第0天用5x10⁵個ct26腫瘤細胞在后側腹中皮下注射來接種小鼠。小鼠為未處理的或在第4、7及10天用ct26親代細胞、ox40(ab)單獨、impact單獨、impact+ox40(ab)或compact接種。在第12天處死一組小鼠用于腫瘤遺傳分析。監(jiān)測剩余小鼠30天以測量腫瘤面積和總體存活率。圖11b描繪了第12天腫瘤基因表達的分析。從分離的腫瘤中分離總rna，逆轉錄并通過qpcr分析。針對18smrna標準化各值并且將第一“未處理的”僅重復設定為1。對于圖11b中的每個數(shù)據(jù)集，直方圖的順序從左到右為：未處理的、僅ct26對照、僅ox40抗體、impact、impact加ox40抗體、及compact。在圖11c中，在處理的小鼠中分析ah1-四聚體/抗原特異性cd8+細胞。對于圖11c中的每個數(shù)據(jù)集，峰的順序從左到右為：未處理的、僅ct26對照、僅ox40抗體、impact、impact加ox40抗體、及compact。圖11d示出了在初始腫瘤接種之后21天每天測量的腫瘤面積。在圖11e中，經(jīng)30天時程測定總體存活率。根據(jù)實驗標準，80％的compact處理的小鼠存活并且47％的小鼠(15只中有7只)徹底消除了確定的腫瘤。一只僅ox40(ab)處理的小鼠到第24天消除了腫瘤，而一只impact+ox40(ab)處理的小鼠到第25天消除。

圖12a-12d顯示compact(在此圖中，gp96-ig/ox40l-fc)在侵襲性b16.f10-ova黑色素瘤模型中造成抗原特異性cd8+擴增、延遲腫瘤生長、提高總體存活及腫瘤排斥。在圖12a中，在第-1天用5x10⁵個ot-i細胞過繼轉移小鼠，然后在第0天在后側腹中皮下注射5x10⁵個b16.f10-ova腫瘤細胞來接種。小鼠為未處理的或在第4、7及10天用b16.f10-ova親代細胞、ox40(ab)單獨、impact單獨、impact+ox40(ab)或compact接種。圖12b示出了經(jīng)25天時程在處理之后的抗原特異性cd8+(ot-i)擴增。在圖12c中，在初始腫瘤接種之后，在25天時程期間測量腫瘤面積。在圖12d中，經(jīng)30天時程測定總體存活率。大約78％的compact處理的小鼠存活且11％的compact處理的小鼠徹底消除了確定的腫瘤。僅compact處理組具有徹底的腫瘤消除者：9只小鼠中有1只或大約11％。

圖13為繪制使用在第-1天用ot-1(cd8)細胞接種的foxp3-rfp小鼠，ot-1擴增時程(類似于圖5d和6c)的圖。通過流式細胞術經(jīng)46天在用以下處理的小鼠中分析ot-1/gfp細胞：無疫苗、僅ova對照細胞、compact(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)或compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)，其中在第0天初始接種且在第35天加強。標繪值表示平均值并且誤差為sem。compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)表示包括compact-ox40l和compact-tl1a(即，在同一注射器中的兩種不同的細胞系)的組合注射。

圖14為示出了compact對卵清蛋白特異性cd8+t細胞(oti)的增殖和活化的作用的圖。在第0天，用impact單獨或compact(gp96-ig/ox40l)、compact(gp96-ig/4-icosl)或compact(gp96-ig/4-1bbl)免疫c57bl/6小鼠。在所示天數(shù)時，監(jiān)測ot-i在外周血液中的出現(xiàn)率。

圖15為示出了在ct26結腸直腸癌模型中compact對腫瘤生長動力學的影響的圖。在第0天，在后側腹中皮下注射5x10⁵個ct26腫瘤細胞來接種小鼠。小鼠為未處理的或在第4、7及10天用以下接種：ct26親代細胞、impact單獨、impact+tnfrsf25激動劑(4c12ab)、4c12(ab)單獨、pd-1(ab)單獨、4c12(ab)和pd-1(ab)、compact(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)、compact(gp96-ig/ox40l)+pd-1(ab)或compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)。監(jiān)測小鼠30天以測量腫瘤面積。compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)表示包括compact-ox40l和compact-tl1a(即，在同一注射器中的兩種不同細胞系)的組合注射。

修正頁(第91條)isa/ru

圖16為示出了在ct26結腸直腸癌模型中compact對總體小鼠存活率的影響的圖。將小鼠用ct26腫瘤細胞處理并且如圖15中所述接種。

圖17為示出了由人前列腺特異性疫苗(hs-1020、pc-3細胞系)產(chǎn)生的人ox40l的量的圖。

圖18為示出了由人肺特異性疫苗(hs-120、ad100細胞系)產(chǎn)生的人ox40l的量的圖

詳述

各種分泌型蛋白，即，如本文所述的疫苗蛋白，可用于體內(nèi)刺激免疫應答。舉例來說，基于分泌型熱休克蛋白gp96-ig的同種異體細胞疫苗可通過體內(nèi)抗原交叉引發(fā)實現(xiàn)針對飛摩爾濃度的腫瘤抗原的高頻多克隆cd8+t細胞應答(oizumi等人,jimmunol2007,179(4):2310-2317)。然而，由確定的腫瘤發(fā)揮的多重免疫抑制機制可削弱此疫苗方法的活性。為了評估組合免疫療法對患晚期疾病的患者的可能效用，執(zhí)行長期確定的b16-f10黑色素瘤的小鼠模型中的pd-1、pd-l1、ctla-4及l(fā)ag-3封閉性抗體的系統(tǒng)比較(參見，本文中的實施例)，顯示與其它檢查點相比在gp96-ig接種與pd-1阻斷之間的優(yōu)良組合。協(xié)同的抗腫瘤益處可由使用以下一者或多者的gp96-ig接種、pd-1阻斷與t細胞共刺激的三重組合產(chǎn)生：ox40的激動劑(例如，結合ox40的ox40配體-ig(ox40l-ig)融合物或其片段)、誘導型t細胞共刺激物(icos)的激動劑(例如，結合icos的icos配體-ig(icosl-ig)融合物或其片段)、cd40的激動劑(例如，cd40l-ig融合蛋白或其片段)、cd27的激動劑(例如，cd70-ig融合蛋白或其片段)、4-1bb的激動劑(例如，結合4-1bb的4-1bb配體-ig(4-1bbl-ig)融合物或其片段)、tnfrsf25的激動劑(例如，結合tnfrsf25的tl1a-ig融合物或其片段)、或糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr)的激動劑(例如，結合gitf的gitr配體-ig(gitrl-ig)融合物或其片段)。然而，對于開發(fā)這種三重組合的積極性被此類療法的預期成本沖淡。為了規(guī)避這個問題，疫苗蛋白質表達載體(例如，gp96-ig表達載體)被再工程化以同時表達t細胞共刺激蛋白(例如，icosl-ig、4-1bbl-ig或ox40l-ig)，以便在無需額外抗體療法的情況下提供共刺激益處。本文提供了再工程化的載體及其使用方法。當gp96-ig與這些共刺激融合蛋白由同種異體細胞系分泌時，觀察到抗原特異性cd8+t細胞的活化增強(參見，本文中的實施例)。因此，組合免疫療法可通過載體再工程化以避免對完全分離的疫苗/抗體/融合蛋白方案的需要而實現(xiàn)。

疫苗蛋白

疫苗蛋白可誘導應用于本發(fā)明中的免疫應答。在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種表達載體，其包含編碼分泌型疫苗蛋白的第一核苷酸序列和編碼t細胞共刺激融合蛋白的第二核苷酸序列。還提供包含本發(fā)明的表達載體的組合物。在各種實施方案中，所述組合物在治療受試者的方法中使用以刺激所述受試者中的免疫應答，包括增強受試者中抗原特異性t細胞的活化。本發(fā)明組合物應用于治療包括癌癥的各種疾病中。

熱休克蛋白(hsp)gp96定位于內(nèi)質網(wǎng)(er)中，其充當肽通向mhci類和ii類分子途中的伴侶。從腫瘤細胞處獲得并用作疫苗的gp96可誘導特異性腫瘤免疫，大概是通過腫瘤特異性肽向抗原呈遞細胞(apc)的轉運(jimmunol1999,163(10):5178-5182)。舉例來說，gp96相關肽通過樹突細胞(dc)交叉呈遞至cd8細胞。

通過以下操作開發(fā)一種接種系統(tǒng)用于抗腫瘤療法：將gp96-igg1-fc融合蛋白轉染到腫瘤細胞中，造成gp96-ig與伴侶腫瘤肽以復合物形式的分泌(參見jimmunother2008,31(4):394-401及其中引用的參考文獻)。分泌gp96-ig的腫瘤細胞的胃腸外施用觸發(fā)穩(wěn)健的抗原特異性cd8細胞毒性t淋巴細胞(ctl)擴增，聯(lián)合先天性免疫系統(tǒng)的活化。腫瘤分泌的gp96引起dc和天然殺傷(nk)細胞向gp96分泌位點的募集，并且介導dc活化。此外，gp96及其伴侶肽的內(nèi)吞攝取觸發(fā)肽經(jīng)由主要mhci類的交叉呈遞以及不依賴于cd4細胞的強的同源cd8活化。

本文所提供的載體含有編碼gp96-ig融合蛋白的第一核苷酸序列。人gp96的編碼區(qū)的長度為2,412個堿基(seqidno:1)，并且編碼803個氨基酸的蛋白(seqidno:2)，其包括在氨基末端處的21個氨基酸的信號肽、富含疏水性殘基的潛在跨膜區(qū)、以及在羧基末端處的er駐留肽序列(登記號x15187；參見maki等人,procnatlacadsciusa1990,87:5658-5562)。人gp96的dna和蛋白序列如下：

atgagggccctgtgggtgctgggcctctgctgcgtcctgctgaccttcgggtcggtcagagctgacgatgaagttgatgtggatggtacagtagaagaggatctgggtaaaagtagagaaggatcaaggacggatgatgaagtagtacagagagaggaagaagctattcagttggatggattaaatgcatcacaaataagagaacttagagagaagtcggaaaagtttgccttccaagccgaagttaacagaatgatgaaacttatcatcaattcattgtataaaaataaagagattttcctgagagaactgatttcaaatgcttctgatgctttagataagataaggctaatatcactgactgatgaaaatgctctttctggaaatgaggaactaacagtcaaaattaagtgtgataaggagaagaacctgctgcatgtcacagacaccggtgtaggaatgaccagagaagagttggttaaaaaccttggtaccatagccaaatctgggacaagcgagtttttaaacaaaatgactgaagcacaggaagatggccagtcaacttctgaattgattggccagtttggtgtcggtttctattccgccttccttgtagcagataaggttattgtcacttcaaaacacaacaacgatacccagcacatctgggagtctgactccaatgaattttctgtaattgctgacccaagaggaaacactctaggacggggaacgacaattacccttgtcttaaaagaagaagcatctgattaccttgaattggatacaattaaaaatctcgtcaaaaaatattcacagttcataaactttcctatttatgtatggagcagcaagactgaaactgttgaggagcccatggaggaagaagaagcagccaaagaagagaaagaagaatctgatgatgaagctgcagtagaggaagaagaagaagaaaagaaaccaaagactaaaaaagttgaaaaaactgtctgggactgggaacttatgaatgatatcaaaccaatatggcagagaccatcaaaagaagtagaagaagatgaatacaaagctttctacaaatcattttcaaaggaaagtgatgaccccatggcttatattcactttactgctgaaggggaagttaccttcaaatcaattttatttgtacccacatctgctccacgtggtctgtttgacgaatatggatctaaaaagagcgattacattaagctctatgtgcgccgtgtattcatcacagacgacttccatgatatgatgcctaaatacctcaattttgtcaagggtgtggtggactcagatgatctccccttgaatgtttcccgcgagactcttcagcaacataaactgcttaaggtgattaggaagaagcttgttcgtaaaacgctggacatgatcaagaagattgctgatgataaatacaatgatactttttggaaagaatttggtaccaacatcaagcttggtgtgattgaagaccactcgaatcgaacacgtcttgctaaacttcttaggttccagtcttctcatcatccaactgacattactagcctagaccagtatgtggaaagaatgaaggaaaaacaagacaaaatctacttcatggctgggtccagcagaaaagaggctgaatcttctccatttgttgagcgacttctgaaaaagggctatgaagttatttacctcacagaacctgtggatgaatactgtattcaggcccttcccgaatttgatgggaagaggttccagaatgttgccaaggaaggagtgaagttcgatgaaagtgagaaaactaaggagagtcgtgaagcagttgagaaagaatttgagcctctgctgaattggatgaaagataaagcccttaaggacaagattgaaaaggctgtggtgtctcagcgcctgacagaatctccgtgtgctttggtggccagccagtacggatggtctggcaacatggagagaatcatgaaagcacaagcgtaccaaacgggcaaggacatctctacaaattactatgcgagtcagaagaaaacatttgaaattaatcccagacacccgctgatcagagacatgcttcgacgaattaaggaagatgaagatgataaaacagttttggatcttgctgtggttttgtttgaaacagcaacgcttcggtcagggtatcttttaccagacactaaagcatatggagatagaatagaaagaatgcttcgcctcagtttgaacattgaccctgatgcaaaggtggaagaagagcccgaagaagaacctgaagagacagcagaagacacaacagaagacacagagcaagacgaagatgaagaaatggatgtgggaacagatgaagaagaagaaacagcaaaggaatctacagctgaaaaagatgaattgtaa(seqidno:1)

mralwvlglccvlltfgsvraddevdvdgtveedlgksregsrtddevvqreeeaiqldglnasqirelreksekfafqaevnrmmkliinslyknkeiflrelisnasdaldkirlisltdenalsgneeltvkikcdkeknllhvtdtgvgmtreelvknlgtiaksgtseflnkmteaqedgqstseligqfgvgfysaflvadkvivtskhnndtqhiwesdsnefsviadprgntlgrgttitlvlkeeasdyleldtiknlvkkysqfinfpiyvwssktetveepmeeeeaakeekeesddeaaveeeeeekkpktkkvektvwdwelmndikpiwqrpskeveedeykafyksfskesddpmayihftaegevtfksilfvptsaprglfdeygskksdyiklyvrrvfitddfhdmmpkylnfvkgvvdsddlplnvsretlqqhkllkvirkklvrktldmikkiaddkyndtfwkefgtniklgviedhsnrtrlakllrfqsshhptditsldqyvermkekqdkiyfmagssrkeaesspfverllkkgyeviyltepvdeyciqalpefdgkrfqnvakegvkfdesektkesreavekefepllnwmkdkalkdkiekavvsqrltespcalvasqygwsgnmerimkaqayqtgkdistnyyasqkktfeinprhplirdmlrrikededdktvldlavvlfetatlrsgyllpdtkaygdriermlrlslnidpdakveeepeeepeetaedttedteqdedeemdvgtdeeeetakestaekdel(seqidno:2)。

編碼gp96-ig融合序列的核酸可使用美國專利號8,685,384中所述的方法產(chǎn)生，該專利以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，gp96-ig融合蛋白的gp96部分可含有所有或一部分野生型gp96序列(例如，seqidno:2中列出的人序列)。舉例來說，分泌型gp96-ig融合蛋白可包括seqidno:2的開頭799個氨基酸，以使得其缺乏c末端kdel(seqidno:3)序列?；蛘?，融合蛋白的gp96部分可具有與野生型gp96序列的開頭799個氨基酸相比含有一個或多個取代、缺失或添加的氨基酸序列，以使得其具有至少90％(例如，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)與野生型多肽的序列同一性。

如本公開通篇所用，具體的核酸或氨基酸序列與具體的序列識別號所參考的序列之間的序列同一性百分比測定如下。首先，使用來自包含blastn2.0.14版和blastp2.0.14版的單機版blastz中的blast2sequences(bl2seq)程序將核酸或氨基酸序列與具體的序列識別號中列出的序列進行比較。此單機版blastz可在fr.com/blast或ncbi.nlm.nih.gov處在線獲得?？稍赽lastz所附的自述文檔中找到如何應用bl2seq程序的說明。bl2seq使用blastn或blastp算法執(zhí)行兩個序列之間的比較。blastn用于比較核酸序列，而blastp用于比較氨基酸序列。為了比較兩個核酸序列，選項設定如下：-i設為含有第一個待比較的核酸序列的文檔(例如，c:\seq1.txt)；-j設為含有第二個待比較的核酸序列的文檔(例如，c:\seq2.txt)；-p設為blastn；-o設為任何所需的文件名(例如，c:\output.txt)；-q設為-1；-r設為2；并且所有其它選項設為默認。例如，下面的指令可用于產(chǎn)生含有兩個序列之間比較結果的輸出文檔：c:\bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2。為了比較兩個氨基酸序列，bl2seq選項設定如下：-i設為含有第一個待比較的氨基酸序列的文檔(例如，c:\seq1.txt)；-j設為含有第二個待比較的氨基酸序列的文檔(例如，c:\seq2.txt)；-p設為blastp；-o設為任何所需的文件名(例如，c:\output.txt)；并且所有其它選項設為默認。例如，下面的指令可用于產(chǎn)生含有兩個氨基酸序列之間比較結果的輸出文檔：c:\bl2seq-ic:\seq1.txt-jc:\seq2.txt-pblastp-oc:\output.txt。如果兩個比較序列享有同源性，那么指定的輸出文檔將把那些同源區(qū)域呈現(xiàn)為比對序列。如果兩個比較序列沒有同源性，那么指定的輸出文檔將不呈現(xiàn)比對序列。

一旦比對，匹配數(shù)便通過計算兩序列中存在的相同核苷酸或氨基酸殘基的位置數(shù)來確定。通過以下測定序列同一性百分比：匹配數(shù)除以鑒定序列(例如seqidno:1)中所示序列的長度或鉸接長度(例如來自鑒定序列中所示序列的100個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基)，接著所得值乘以100。舉例來說，當與seqidno:1中所列序列比對時有2,200個匹配的核酸序列與seqidno:1中所列序列91.2％同一(即，2,000÷2,412x100＝91.2)。注意到，序列同一性百分比值可四舍五入至最近的十分位。舉例來說，75.11、75.12、75.13及75.14可下舍到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18及75.19可上入到75.2。還注意到，長度值始終為整數(shù)。

因此，在一些實施方案中，編碼gp96-ig融合多肽的核酸的gp96部分可編碼在一個或多個氨基酸位置處不同于野生型gp96多肽的氨基酸序列，以使得其含有一個或多個保守取代、非保守取代、剪接變體、同工型、來自其它物種的同源物、及多態(tài)性。

如本文所定義，“保守取代”表示一個氨基酸殘基被另一個生物學相似的殘基取代。通常，如上所提到的生物相似性反映在野生型序列上保守氨基酸的取代。例如，保守的氨基酸取代預期將對生物活性有極小影響或沒有影響，尤其是如果這些取代占多肽或蛋白中殘基總數(shù)的10％以下時。保守取代可以例如在所涉及的氨基酸殘基的極性、電荷、大小、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質的相似性基礎上進行。20種天然存在的氨基酸可分成以下六個標準氨基酸組：(1)疏水性：met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)堿性：his、lys、arg；(5)影響側鏈定向的殘基：gly、pro；以及(6)芳香族：trp、tyr、phe。因此，保守取代可通過一個氨基酸被以上示出的六個標準氨基酸組的同一組內(nèi)列出的另一個氨基酸更換而實現(xiàn)。舉例來說，asp被glu更換在由此修飾的多肽中保留一個負電荷。另外，甘氨酸和脯氨酸可基于它們破壞α-螺旋的能力彼此取代。保守氨基酸取代的另外實例包括但不限于一個疏水性殘基被另一個(如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代；或一個極性殘基被另一個取代，如精氨酸被賴氨酸取代、谷氨酸被天冬氨酸取代、或谷氨酰胺被天冬酰胺取代等等。術語“保守取代”還包括使用取代的氨基酸殘基代替未取代的親本氨基酸殘基，只要針對取代的多肽培養(yǎng)的抗體也與未取代的多肽發(fā)生免疫反應。

如本文所用，“非保守取代”被定義為一個氨基酸被以上示出的六個標準氨基酸組(1)至(6)的不同組中列出的另一個氨基酸更換。

在各種實施方案中，取代還可包括非經(jīng)典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、n-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、gaba和δ-氨基酮戊酸、4-氨基苯甲酸(paba)、常見氨基酸的d-異構體、2,4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、設計者氨基酸如β甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸、nα-甲基氨基酸以及一般氨基酸類似物)。

也可參照遺傳密碼(包括考慮密碼子簡并性)對本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列進行突變。

gp96-ig融合蛋白的ig部分(“標簽”)可例如含有免疫球蛋白分子(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige分子)的非可變部分。通常，這種部分至少含有免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)的ch2和ch3功能結構域。融合也可使用恒定結構域的fc部分的羧基末端或緊鄰重鏈或輕鏈的ch1的氨基末端的區(qū)域進行。ig標簽可來自哺乳動物(例如人、小鼠、猴子或大鼠)免疫球蛋白，但當gp96-ig融合物計劃在體內(nèi)用于人時，人免疫球蛋白可尤其有用。

編碼免疫球蛋白輕或重鏈恒定區(qū)的dna是已知的或容易從cdna文庫中獲得。參見，例如adams等人,biochemistry1980,19:2711-2719；gough等人,biochemistry198019:2702-2710；dolby等人,procnatlacadsciusa1980,77:6027-6031；rice等人,procnatlacadsciusa1982,79:7862-7865；falkner等人,nature1982,298:286-288；及morrison等人,annrevimmunol1984,2:239-256。由于許多免疫試劑和標記系統(tǒng)可用于檢測免疫球蛋白，所以gp96-ig融合蛋白可容易通過本領域中已知的多種免疫技術來檢測和量化，如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、免疫沉淀法及熒光活化細胞分選法(facs)。類似地，如果肽標簽為可容易獲得抗體的表位，那么這種試劑可與以上提及用于檢測、量化和分離gp96-ig融合物的技術一起使用。

在各種實施方案中，gp96-ig融合蛋白和/或共刺激分子融合物包含接頭。在各種實施方案中，接頭可衍生自天然存在的多結構域蛋白質或為例如以下文獻中所述的經(jīng)驗接頭：chichili等人,(2013),proteinsci.22(2):153-167；chen等人,(2013),advdrugdelivrev.65(10):1357-1369，其全部內(nèi)容據(jù)此以引用的方式并入。在一些實施方案中，接頭可使用接頭設計數(shù)據(jù)庫和計算機程序來設計，如以下文獻中所述的那些：chen等人,(2013),advdrugdelivrev.65(10):1357-1369及crasto等人,(2000),proteineng.13(5):309-312，其全部內(nèi)容據(jù)此以引用的方式并入。

在一些實施方案中，接頭為合成接頭，如peg。

在其它實施方案中，接頭為多肽。在一些實施方案中，接頭的長度小于約100個氨基酸。舉例來說，接頭的長度可小于約100、約95、約90、約85、約80、約75、約70、約65、約60、約55、約50、約45、約40、約35、約30、約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約12、約11、約10、約9、約8、約7、約6、約5、約4、約3或約2個氨基酸。在一些實施方案中，接頭為柔性的。在另一實施方案中，接頭為剛性的。在各種實施方案中，接頭基本上由甘氨酸和絲氨酸殘基(例如，約30％、或約40％、或約50％、或約60％、或約70％、或約80％、或約90％、或約95％或約97％甘氨酸和絲氨酸)構成。

在各種實施方案中，接頭為抗體(例如，igg、iga、igd及ige，包括亞類(例如igg1、igg2、igg3和igg4、及iga1和iga2))的鉸鏈區(qū)。見于igg、iga、igd及ige類抗體中的鉸鏈區(qū)用作柔性間隔子，允許fab部分在空間自由移動。與恒定區(qū)相反，鉸鏈結構域在結構上是多樣的，在免疫球蛋白類和亞類之間在序列與長度上是不同的。例如，鉸鏈區(qū)的長度和柔性在igg亞類之間是不同的。igg1的鉸鏈區(qū)包括氨基酸216-231，且因為其是自由柔性的，所以fab片段可圍繞其對稱軸旋轉并且在以兩個重鏈內(nèi)二硫橋的第一個為中心處的球體內(nèi)移動。igg2具有比igg1更短的鉸鏈，具有12個氨基酸殘基和四個二硫橋。igg2的鉸鏈區(qū)缺乏甘氨酸殘基、相對較短、并且含有剛性的聚脯氨酸雙螺旋、由額外的重鏈內(nèi)二硫橋穩(wěn)定化。這些性質限制了igg2分子的柔性。igg3與其它亞類的不同之處在于其獨特的延長的鉸鏈區(qū)(約為igg1鉸鏈的四倍長)、含有62個氨基酸(包括21個脯氨酸和11個半胱氨酸)、形成非柔性的聚脯氨酸雙螺旋。在igg3中，fab片段相對遠離fc片段，造成分子的更大柔性。igg3中的伸長鉸鏈還造成其與其它亞類相比更高的分子量。igg4的鉸鏈區(qū)短于igg1并且其柔性介于igg1與igg2之間。鉸鏈區(qū)的柔性據(jù)報道以如下順序降低：igg3>igg1>igg4>igg2。

額外的說明性接頭包括但不限于具有以下序列的接頭：le、ggggs(seqidno:26)、(ggggs)n(n＝1-4)(seqidno:27)、(gly)8(seqidno:28)、(gly)6(seqidno:29)、(eaaak)n(n＝1-3)(seqidno:30)、a(eaaak)na(n＝2-5)(seqidno:31)、aeaaakeaaaka(seqidno:32)、a(eaaak)4alea(eaaak)4a(seqidno:33)、papap(seqidno:34)、kesgsvsseqlaqfrsld(seqidno:35)、egkssgsgseskst(seqidno:36)、gsagsaagsgef(seqidno:37)以及(xp)n，其中x表示任何氨基酸，例如ala、lys或glu。

在各種實施方案中，接頭可為功能性的。例如但不限于，接頭可發(fā)揮作用以改善本發(fā)明組合物的折疊和/或穩(wěn)定性、改善表達、改善藥代動力學和/或改善生物活性。在另一實施例中，接頭可發(fā)揮作用以將組合物靶向特定的細胞類型或位置。

在一些實施方案中，gp96肽可融合至鼠科igg1的鉸鏈、ch2及ch3結構域(bowen等人,jimmunol1996,156:442-449)。igg1分子的此區(qū)域含有三個半胱氨酸殘基，這些殘基通常參與ig分子中與其它半胱氨酸的二硫鍵。由于肽不需要半胱氨酸來用作標簽，所以一個或多個這些半胱氨酸殘基可被另一個氨基酸殘基(例如像絲氨酸)取代。

本領域中已知的各種前導序列也可用于gp96-ig融合蛋白從細菌和哺乳動物細胞中的高效分泌(參見，vonheijne,jmolbiol1985,184:99-105)。前導肽可基于預期的宿主細胞來選擇，并且可包括細菌、酵母、病毒、動物及哺乳動物序列。舉例來說，皰疹病毒糖蛋白d前導肽適用于多種哺乳動物細胞中。用于哺乳動物細胞中的另一前導肽可由小鼠免疫球蛋白κ鏈的v-j2-c區(qū)處獲得(bernard等人,procnatlacadsciusa1981,78:5812-5816)。編碼肽標簽或前導肽的dna序列是已知的或容易從文庫或商業(yè)供應商處獲得，并且適用于本文所述的融合蛋白中。

此外，在各種實施方案中，可用一種或多種疫苗蛋白取代本公開的gp96。舉例來說，各種熱休克蛋白屬于疫苗蛋白。在各種實施方案中，熱休克蛋白為以下中的一種或多種：小hsp、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90及hsp110家族成員，包括其片段、變體、突變體、衍生物或組合(hickey,等人,1989,mol.cell.biol.9:2615-2626；jindal,1989,mol.cell.biol.9:2279-2283)。

t細胞共刺激

除gp96-ig融合蛋白之外，本文所提供的表達載體還可編碼一種或多種生物應答調(diào)節(jié)劑。在各種實施方案中，本發(fā)明表達載體可編碼一種或多種t細胞共刺激分子。

在各種實施方案中，本發(fā)明表達載體允許穩(wěn)健的、抗原特異性cd8細胞毒性t淋巴細胞(ctl)擴增。在各種實施方案中，本發(fā)明表達載體選擇性地增加cd8細胞毒性t淋巴細胞(ctl)且基本上不增加可為促癌性的t細胞類型，并且其包括但不限于treg、表達一種或多種檢查點抑制性受體的cd4+和/或cd8+t細胞、th2細胞及th17細胞。檢查點抑制性受體是指在免疫細胞上表達的受體(例如ctla-4、b7-h3、b7-h4、tim-3)，其預防或抑制不受控制的免疫應答。例如，本發(fā)明表達載體基本上不增加foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細胞。在一些實施方案中，此選擇性cd8t細胞增加與在gp-96融合物與針對t細胞共刺激分子的抗體的組合療法下觀察到的非特異性t細胞增加形成對比。

舉例來說，載體可編碼ox40的激動劑(例如，結合ox40的ox40配體-ig(ox40l-ig)融合物或其片段)、誘導型t細胞共刺激物(icos)的激動劑(例如，結合icos的icos配體-ig(icosl-ig)融合物或其片段)、cd40的激動劑(例如，cd40l-ig融合蛋白或其片段)、cd27的激動劑(例如，cd70-ig融合蛋白或其片段)、或4-1bb的激動劑(例如，結合4-1bb的4-1bb配體-ig(4-1bbl-ig)融合物或其片段)。在一些實施方案中，載體可編碼tnfrsf25的激動劑(例如，結合tnfrsf25的tl1a-ig融合物或其片段)、或糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(gitr)的激動劑(例如，結合gitr的gitr配體-ig(gitrl-ig)融合物或其片段)、或cd40的激動劑(例如，結合cd40的cd40配體-ig(cd40l-ig)融合物或其片段)；或cd27的激動劑(例如，結合cd40的cd27配體-ig(例如cd70l-ig)融合物或其片段)。

icos為誘導型t細胞共刺激受體分子，其呈現(xiàn)出與cd28和ctla-4的一定同源性，并且與抗原呈遞細胞表面上表達的b7-h2相互作用。icos牽涉于細胞介導和體液的免疫應答的調(diào)節(jié)中。

4-1bb是屬于tnf超家族的2型跨膜糖蛋白，并且在活化的t淋巴細胞上表達。

ox40(也稱為cd134或tnfrsf4)為由ox40l接合的t細胞共刺激分子，且經(jīng)常在抗原呈遞細胞及其它細胞類型中被誘導。已知ox40增加細胞因子表達和效應t細胞的存活。

gitr(tnfrsf18)為由gitrl接合的t細胞共刺激分子并且優(yōu)先在foxp3+調(diào)節(jié)性t細胞中表達。gitr在腫瘤微環(huán)境內(nèi)treg的維持與功能中發(fā)揮顯著作用。

tnfrsf25為t細胞共刺激分子，其在抗原刺激之后在cd4+和cd8+t細胞中優(yōu)先表達。通過tnfrsf25的信號傳導是由tl1a提供，并且起作用而以同源抗原依賴性方式提高t細胞對il-2受體介導的增殖的敏感性。

cd40為見于各種抗原呈遞細胞上的共刺激蛋白，所述蛋白在細胞的活化中起作用。th細胞上的cd40l(cd154)與cd40的結合活化抗原呈遞細胞并誘導多種下游效應。

cd27為屬于tnf超家族的t細胞共刺激分子，其在t細胞免疫的產(chǎn)生和長期維持中起作用。其在不同的免疫過程中與配體cd70結合。

可用于本發(fā)明中的額外共刺激分子包括但不限于hvem、cd28、cd30、cd30l、cd40、cd70、light(cd258)、b7-1及b7-2。

至于gp96-ig融合物，t細胞共刺激融合蛋白的ig部分(“標簽”)可含有免疫球蛋白分子(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga或ige分子)的非可變部分。如上所述，這種部分通常至少含有免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)的ch2和ch3功能結構域。在一些實施方案中，t細胞共刺激肽可融合至鼠科igg1的鉸鏈、ch2及ch3結構域(bowen等人,jimmunol1996,156:442-449)。ig標簽可來自哺乳動物(例如人、小鼠、猴子或大鼠)免疫球蛋白，但當融合蛋白計劃在體內(nèi)用于人時，人免疫球蛋白可尤其有用。再次地，編碼免疫球蛋白輕或重鏈恒定區(qū)的dna是已知的或容易從cdna文庫中獲得。如上所述的各種前導序列也可用于t細胞共刺激融合蛋白從細菌和哺乳動物細胞中的分泌。

提供編碼融合至ig的人icosl的細胞外結構域的代表性核苷酸優(yōu)化序列(seqidno:4)及所編碼的融合物的氨基酸序列(seqidno:5)：

atgagactgggaagccctggcctgctgtttctgctgttcagcagcctgagagccgacacccaggaaaaagaagtgcgggccatggtgggaagcgacgtggaactgagctgcgcctgtcctgagggcagcagattcgacctgaacgacgtgtacgtgtactggcagaccagcgagagcaagaccgtcgtgacctaccacatcccccagaacagctccctggaaaacgtggacagccggtacagaaaccgggccctgatgtctcctgccggcatgctgagaggcgacttcagcctgcggctgttcaacgtgaccccccaggacgagcagaaattccactgcctggtgctgagccagagcctgggcttccaggaagtgctgagcgtggaagtgaccctgcacgtggccgccaatttcagcgtgccagtggtgtctgccccccacagcccttctcaggatgagctgaccttcacctgtaccagcatcaacggctaccccagacccaatgtgtactggatcaacaagaccgacaacagcctgctggaccaggccctgcagaacgataccgtgttcctgaacatgcggggcctgtacgacgtggtgtccgtgctgagaatcgccagaacccccagcgtgaacatcggctgctgcatcgagaacgtgctgctgcagcagaacctgaccgtgggcagccagaccggcaacgacatcggcgagagagacaagatcaccgagaaccccgtgtccaccggcgagaagaatgccgccacctctaagtacggccctccctgcccttcttgcccagcccctgaatttctgggcggaccctccgtgtttctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggggtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgagcggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccagcaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaacgccaccggccagcccagggaaccccaggtgtacacactgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagccagagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggctcattcttcctgtactcccggctgacagtggacaagagcagctggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaagccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgtccctgggcaaatga(seqidno:4)

mrlgspgllfllfsslradtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaatskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlsgkeykckvsskglpssiektisnatgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksswqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:5)。

提供編碼融合至ig的人4-1bbl的細胞外結構域的代表性核苷酸優(yōu)化序列(seqidno:6)及所編碼的氨基酸序列(seqidno:7)：

atgtctaagtacggccctccctgccctagctgccctgcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgagcggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccagcaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaacgccaccggccagcccagggaaccccaggtgtacacactgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagctggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgagcctgggcaaggcctgtccatgggctgtgtctggcgctagagcctctcctggatctgccgccagccccagactgagagagggacctgagctgagccccgatgatcctgccggactgctggatctgagacagggcatgttcgcccagctggtggcccagaacgtgctgctgatcgatggccccctgagctggtacagcgatcctggactggctggcgtgtcactgacaggcggcctgagctacaaagaggacaccaaagaactggtggtggccaaggccggcgtgtactacgtgttctttcagctggaactgcggagagtggtggccggcgaaggatccggctctgtgtctctggctctgcatctgcagcccctgagatctgctgctggcgctgctgctctggccctgacagtggacctgcctcctgcctctagcgaggccagaaacagcgcattcgggtttcaaggcagactgctgcacctgtctgccggccagagactgggagtgcatctgcacacagaggccagagccaggcacgcctggcagctgactcagggcgctacagtgctgggcctgttcagagtgacccccgagattccagccggcctgcctagccccagatccgaatga(seqidno:6)

mskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlsgkeykckvsskglpssiektisnatgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksswqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse(seqidno:7)。

提供編碼融合至ig的人tl1a的細胞外結構域的代表性核苷酸優(yōu)化序列(seqidno:8)及所編碼的氨基酸序列(seqidno:9)：

atgtctaagtacggccctccctgccctagctgccctgcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgagcggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccagcaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaacgccaccggccagcccagggaaccccaggtgtacacactgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagctggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgagcctgggcaagatcgagggccggatggatagagcccagggcgaagcctgcgtgcagttccaggctctgaagggccaggaattcgcccccagccaccagcaggtgtacgcccctctgagagccgacggcgataagcctagagcccacctgacagtcgtgcggcagacccctacccagcacttcaagaatcagttccccgccctgcactgggagcacgaactgggcctggccttcaccaagaacagaatgaactacaccaacaagtttctgctgatccccgagagcggcgactacttcatctacagccaagtgaccttccggggcatgaccagcgagtgcagcgagatcagacaggccggcagacctaacaagcccgacagcatcaccgtcgtgatcaccaaagtgaccgacagctaccccgagcccacccagctgctgatgggcaccaagagcgtgtgcgaagtgggcagcaactggttccagcccatctacctgggcgccatgtttagtctgcaagagggcgacaagctgatggtcaacgtgtccgacatcagcctggtggattacaccaaagaggacaagaccttcttcggcgcctttctgctctga(seqidno:8)

mskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlsgkeykckvsskglpssiektisnatgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksswqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkiegrmdraqgeacvqfqalkgqefapshqqvyaplradgdkprahltvvrqtptqhfknqfpalhwehelglaftknrmnytnkfllipesgdyfiysqvtfrgmtsecseirqagrpnkpdsitvvitkvtdsypeptqllmgtksvcevgsnwfqpiylgamfslqegdklmvnvsdislvdytkedktffgafll(seqidno:9)。

提供編碼人ox40l-ig的代表性核苷酸優(yōu)化序列(seqidno:10)及所編碼的氨基酸序列(seqidno:11)：

atgtctaagtacggccctccctgccctagctgccctgcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgagcggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccagcaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaacgccaccggccagcccagggaaccccaggtgtacacactgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagctggcaggaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtctctgagcctgggcaagatcgagggccggatggatcaggtgtcacacagatacccccggatccagagcatcaaagtgcagtttaccgagtacaagaaagagaagggctttatcctgaccagccagaaagaggacgagatcatgaaggtgcagaacaacagcgtgatcatcaactgcgacgggttctacctgatcagcctgaagggctacttcagtcaggaagtgaacatcagcctgcactaccagaaggacgaggaacccctgttccagctgaagaaagtgcggagcgtgaacagcctgatggtggcctctctgacctacaaggacaaggtgtacctgaacgtgaccaccgacaacaccagcctggacgacttccacgtgaacggcggcgagctgatcctgattcaccagaaccccggcgagttctgcgtgctctga(seqidno:10)

mskygppcpscpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlsgkeykckvsskglpssiektisnatgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksswqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkiegrmdqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl(seqidno:11)。

人tl1a的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:12和seqidno:13中列出：

tcccaagtagctgggactacaggagcccaccaccacccccggctaattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaagatggtcttgatcacctgacctcgtgatccacccgccttggcctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccgcgcccggcctccattcaagtctttattgaatatctgctatgttctacacactgttctaggtgctggggatgcaacaggggacaaaataggcaaaatccctgtccttttggggttgacattctagtgactcttcatgtagtctagaagaagctcagtgaatagtgtctgtggttgttaccagggacacaatgacaggaacattcttgggtagagtgagaggcctggggagggaagggtctctaggatggagcagatgctgggcagtcttagggagcccctcctggcatgcaccccctcatccctcaggccacccccgtcccttgcaggagcaccctggggagctgtccagagcgctgtgccgctgtctgtggctggaggcagagtaggtggtgtgctgggaatgcgagtgggagaactgggatggaccgaggggaggcgggtgaggaggggggcaaccacccaacacccaccagctgctttcagtgttctgggtccaggtgctcctggctggccttgtggtccccctcctgcttggggccaccctgacctacacataccgccactgctggcctcacaagcccctggttactgcagatgaagctgggatggaggctctgaccccaccaccggccacccatctgtcacccttggacagcgcccacacccttctagcacctcctgacagcagtgagaagatctgcaccgtccagttggtgggtaacagctggacccctggctaccccgagacccaggaggcgctctgcccgcaggtgacatggtcctgggaccagttgcccagcagagctcttggccccgctgctgcgcccacactctcgccagagtccccagccggctcgccagccatgatgctgcagccgggcccgcagctctacgacgtgatggacgcggtcccagcgcggcgctggaaggagttcgtgcgcacgctggggctgcgcgaggcagagatcgaagccgtggaggtggagatcggccgcttccgagaccagcagtacgagatgctcaagcgctggcgccagcagcagcccgcgggcctcggagccgtttacgcggccctggagcgcatggggctggacggctgcgtggaagacttgcgcagccgcctgcagcgcggcccgtgacacggcgcccacttgccacctaggcgctctggtggcccttgcagaagccctaagtacggttacttatgcgtgtagacattttatgtcacttattaagccgctggcacggccctgcgtagcagcaccagccggccccacccctgctcgcccctatcgctccagccaaggcgaagaagcacgaacgaatgtcgagagggggtgaagacatttctcaacttctcggccggagtttggctgagatcgcggtattaaatctgtgaaagaaaacaaaacaaaacaa(seqidno:12)

meqrprgcaavaaalllvllgaraqggtrsprcdcagdfhkkiglfccrgcpaghylkapctepcgnstclvcpqdtflawenhhnsecarcqacdeqasqvalencsavadtrcgckpgwfvecqvsqcvssspfycqpcldcgalhrhtrllcsrrdtdcgtclpgfyehgdgcvscptpppslagapwgavqsavplsvaggrvgvfwvqvllaglvvplllgatltytyrhcwphkplvtadeagmealtpppathlspldsahtllappdssekictvqlvgnswtpgypetqealcpqvtwswdqlpsralgpaaaptlspespagspammlqpgpqlydvmdavparrwkefvrtlglreaeieaveveigrfrdqqyemlkrwrqqqpaglgavyaalermgldgcvedlrsrlqrgp(seqidno:13)。

人hvem的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:38(登記號cr456909)和seqidno:39(登記號cr456909)中列出：

atggagcctcctggagactgggggcctcctccctggagatccacccccaaaaccgacgtcttgaggctggtgctgtatctcaccttcctgggagccccctgctacgccccagctctgccgtcctgcaaggaggacgagtacccagtgggctccgagtgctgccccaagtgcagtccaggttatcgtgtgaaggaggcctgcggggagctgacgggcacagtgtgtgaaccctgccctccaggcacctacattgcccacctcaatggcctaagcaagtgtctgcagtgccaaatgtgtgacccagccatgggcctgcgcgcgagccggaactgctccaggacagagaacgccgtgtgtggctgcagcccaggccacttctgcatcgtccaggacggggaccactgcgccgcgtgccgcgcttacgccacctccagcccgggccagagggtgcagaagggaggcaccgagagtcaggacaccctgtgtcagaactgccccccggggaccttctctcccaatgggaccctggaggaatgtcagcaccagaccaagtgcagctggctggtgacgaaggccggagctgggaccagcagctcccactgggtatggtggtttctctcagggagcctcgtcatcgtcattgtttgctccacagttggcctaatcatatgtgtgaaaagaagaaagccaaggggtgatgtagtcaaggtgatcgtctccgtccagcggaaaagacaggaggcagaaggtgaggccacagtcattgaggccctgcaggcccctccggacgtcaccacggtggccgtggaggagacaataccctcattcacggggaggagcccaaaccattaa(seqidno:38)

meppgdwgpppwrstpktdvlrlvlyltflgapcyapalpsckedeypvgseccpkcspgyrvkeacgeltgtvcepcppgtyiahlnglskclqcqmcdpamglrasrncsrtenavcgcspghfcivqdgdhcaacrayatsspgqrvqkggtesqdtlcqncppgtfspngtleecqhqtkcswlvtkagagtssshwvwwflsgslvivivcstvgliicvkrrkprgdvvkvivsvqrkrqeaegeatviealqappdvttvaveetipsftgrspnh(seqidno:39)。

人cd28的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:40(登記號nm_006139)和seqidno:41中列出：

taaagtcatcaaaacaacgttatatcctgtgtgaaatgctgcagtcaggatgccttgtggtttgagtgccttgatcatgtgccctaaggggatggtggcggtggtggtggccgtggatgacggagactctcaggccttggcaggtgcgtctttcagttcccctcacacttcgggttcctcggggaggaggggctggaaccctagcccatcgtcaggacaaagatgctcaggctgctcttggctctcaacttattcccttcaattcaagtaacaggaaacaagattttggtgaagcagtcgcccatgcttgtagcgtacgacaatgcggtcaaccttagctgcaagtattcctacaatctcttctcaagggagttccgggcatcccttcacaaaggactggatagtgctgtggaagtctgtgttgtatatgggaattactcccagcagcttcaggtttactcaaaaacggggttcaactgtgatgggaaattgggcaatgaatcagtgacattctacctccagaatttgtatgttaaccaaacagatatttacttctgcaaaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcctgacacggacgcctatccagaagccagccggctggcagcccccatctgctcaatatcactgctctggataggaaatgaccgccatctccagccggccacctcaggcccctgttgggccaccaatgccaatttttctcgagtgactagaccaaatatcaagatcattttgagactctgaaatgaagtaaaagagatttcctgtgacaggccaagtcttacagtgccatggcccacattccaacttaccatgtacttagtgacttgactgagaagttagggtagaaaacaaaaagggagtggattctgggagcctcttccctttctcactcacctgcacatctcagtcaagcaaagtgtggtatccacagacattttagttgcagaagaaaggctaggaaatcattccttttggttaaatgggtgtttaatcttttggttagtgggttaaacggggtaagttagagtagggggagggataggaagacatatttaaaaaccattaaaacactgtctcccactcatgaaatgagccacgtagttcctatttaatgctgttttcctttagtttagaaatacatagacattgtcttttatgaattctgatcatatttagtcattttgaccaaatgagggatttggtcaaatgagggattccctcaaagcaatatcaggtaaaccaagttgctttcctcactccctgtcatgagacttcagtgttaatgttcacaatatactttcgaaagaataaaatagttctcctacatgaagaaagaatatgtcaggaaataaggtcactttatgtcaaaattatttgagtactatgggacctggcgcagtggctcatgcttgtaatcccagcactttgggaggccgaggtgggcagatcacttgagatcaggaccagcctggtcaagatggtgaaactccgtctgtactaaaaatacaaaatttagcttggcctggtggcaggcacctgtaatcccagctgcccaagaggctgaggcatgagaatcgcttgaacctggcaggcggaggttgcagtgagccgagatagtgccacagctctccagcctgggcgacagagtgagactccatctcaaacaacaacaacaacaacaacaacaacaacaaaccacaaaattatttgagtactgtgaaggattatttgtctaacagttcattccaatcagaccaggtaggagctttcctgtttcatatgtttcagggttgcacagttggtctctttaatgtcggtgtggagatccaaagtgggttgtggaaagagcgtccataggagaagtgagaatactgtgaaaaagggatgttagcattcattagagtatgaggatgagtcccaagaaggttctttggaaggaggacgaatagaatggagtaatgaaattcttgccatgtgctgaggagatagccagcattaggtgacaatcttccagaagtggtcaggcagaaggtgccctggtgagagctcctttacagggactttatgtggtttagggctcagagctccaaaactctgggctcagctgctcctgtaccttggaggtccattcacatgggaaagtattttggaatgtgtcttttgaagagagcatcagagttcttaagggactgggtaaggcctgaccctgaaatgaccatggatatttttctacctacagtttgagtcaactagaatatgcctggggaccttgaagaatggcccttcagtggccctcaccatttgttcatgcttcagttaattcaggtgttgaaggagcttaggttttagaggcacgtagacttggttcaagtctcgttagtagttgaatagcctcaggcaagtcactgcccacctaagatgatggttcttcaactataaaatggagataatggttacaaatgtctcttcctatagtataatctccataagggcatggcccaagtctgtctttgactctgcctatccctgacatttagtagcatgcccgacatacaatgttagctattggtattattgccatatagataaattatgtataaaaattaaactgggcaatagcctaagaaggggggaatattgtaacacaaatttaaacccactacgcagggatgaggtgctataatatgaggaccttttaacttccatcattttcctgtttcttgaaatagtttatcttgtaatgaaatataaggcacctcccacttttatgtatagaaagaggtcttttaatttttttttaatgtgagaaggaagggaggagtaggaatcttgagattccagatcgaaaatactgtactttggttgatttttaagtgggcttccattccatggatttaatcagtcccaagaagatcaaactcagcagtacttgggtgctgaagaactgttggatttaccctggcacgtgtgccacttgccagcttcttgggcacacagagttcttcaatccaagttatcagattgtatttgaaaatgacagagctggagagttttttgaaatggcagtggcaaataaataaatacttttttttaaatggaaagacttgatctatggtaataaatgattttgttttctgactggaaaaataggcctactaaagatgaatcacacttgagatgtttcttactcactctgcacagaaacaaagaagaaatgttatacagggaagtccgttttcactattagtatgaaccaagaaatggttcaaaaacagtggtaggagcaatgctttcatagtttcagatatggtagttatgaagaaaacaatgtcatttgctgctattattgtaagagtcttataattaatggtactcctataatttttgattgtgagctcacctatttgggttaagcatgccaatttaaagagaccaagtgtatgtacattatgttctacatattcagtgataaaattactaaactactatatgtctgctttaaatttgtactttaatattgtcttttggtattaagaaagatatgctttcagaatagatatgcttcgctttggcaaggaatttggatagaacttgctatttaaaagaggtgtggggtaaatccttgtataaatctccagtttagccttttttgaaaaagctagactttcaaatactaatttcacttcaagcagggtacgtttctggtttgtttgcttgacttcagtcacaatttcttatcagaccaatggctgacctctttgagatgtcaggctaggcttacctatgtgttctgtgtcatgtgaatgctgagaagtttgacagagatccaacttcagccttgaccccatcagtccctcgggttaactaactgagccaccggtcctcatggctattttaatgagggtattgatggttaaatgcatgtctgatcccttatcccagccatttgcactgccagctgggaactataccagacctggatactgatcccaaagtgttaaattcaactacatgctggagattagagatggtgccaataaaggacccagaaccaggatcttgattgctatagacttattaataatccaggtcaaagagagtgacacacactctctcaagacctggggtgagggagtctgtgttatctgcaaggccatttgaggctcagaaagtctctctttcctatagatatatgcatactttctgacatataggaatgtatcaggaatactcaaccatcacaggcatgttcctacctcagggcctttacatgtcctgtttactctgtctagaatgtccttctgtagatgacctggcttgcctcgtcacccttcaggtccttgctcaagtgtcatcttctcccctagttaaactaccccacaccctgtctgctttccttgcttatttttctccatagcattttaccatctcttacattagacatttttcttatttatttgtagtttataagcttcatgaggcaagtaactttgctttgtttcttgctgtatctccagtgcccagagcagtgcctggtatataataaatatttattgactgagtgaaaaaaaaaaaaaaaaa(seqidno:40)

mlrlllalnlfpsiqvtgnkilvkqspmlvaydnavnlsckysynlfsrefraslhkgldsavevcvvygnysqqlqvysktgfncdgklgnesvtfylqnlyvnqtdiyfckievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seqidno:41)。

人cd30l的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:42(登記號l09753)和seqidno:43中列出：

ccaagtcacatgattcaggattcagggggagaatccttcttggaacagagatgggcccagaactgaatcagatgaagagagataaggtgtgatgtggggaagactatataaagaatggacccagggctgcagcaagcactcaacggaatggcccctcctggagacacagccatgcatgtgccggcgggctccgtggccagccacctggggaccacgagccgcagctatttctatttgaccacagccactctggctctgtgccttgtcttcacggtggccactattatggtgttggtcgttcagaggacggactccattcccaactcacctgacaacgtccccctcaaaggaggaaattgctcagaagacctcttatgtatcctgaaaagagctccattcaagaagtcatgggcctacctccaagtggcaaagcatctaaacaaaaccaagttgtcttggaacaaagatggcattctccatggagtcagatatcaggatgggaatctggtgatccaattccctggtttgtacttcatcatttgccaactgcagtttcttgtacaatgcccaaataattctgtcgatctgaagttggagcttctcatcaacaagcatatcaaaaaacaggccctggtgacagtgtgtgagtctggaatgcaaacgaaacacgtataccagaatctctctcaattcttgctggattacctgcaggtcaacaccaccatatcagtcaatgtggatacattccagtacatagatacaagcacctttcctcttgagaatgtgttgtccatcttcttatacagtaattcagactgaacagtttctcttggccttcaggaagaaagcgcctctctaccatacagtatttcatccctccaaacacttgggcaaaaagaaaactttagaccaagacaaactacacagggtattaaatagtatacttctccttctgtctcttggaaagatacagctccagggttaaaaagagagtttttagtgaagtatctttcagatagcaggcagggaagcaatgtagtgtggtgggcagagccccacacagaatcagaagggatgaatggatgtcccagcccaaccactaattcactgtatggtcttgatctatttcttctgttttgagagcctccagttaaaatggggcttcagtaccagagcagctagcaactctgccctaatgggaaatgaaggggagctgggtgtgagtgtttacactgtgcccttcacgggatacttcttttatctgcagatggcctaatgcttagttgtccaagtcgcgatcaaggactctctcacacaggaaacttccctatactggcagatacacttgtgactgaaccatgcccagtttatgcctgtctgactgtcactctggcactaggaggctgatcttgtactccatatgaccccacccctaggaacccccagggaaaaccaggctcggacagccccctgttcctgagatggaaagcacaaatttaatacaccaccacaatggaaaacaagttcaaagacttttacttacagatcctggacagaaagggcataatgagtctgaagggcagtcctccttctccaggttacatgaggcaggaataagaagtcagacagagacagcaagacagttaacaacgtaggtaaagaaatagggtgtggtcactctcaattcactggcaaatgcctgaatggtctgtctgaaggaagcaacagagaagtggggaatccagtctgctaggcaggaaagatgcctctaagttcttgtctctggccagaggtgtggtatagaaccagaaacccatatcaagggtgactaagcccggcttccggtatgagaaattaaacttgtatacaaaatggttgccaaggcaacataaaattataagaattc(seqidno:42)

mdpglqqalngmappgdtamhvpagsvashlgttsrsyfylttatlalclvftvatimvlvvqrtdsipnspdnvplkggncsedllcilkrapfkkswaylqvakhlnktklswnkdgilhgvryqdgnlviqfpglyfiicqlqflvqcpnnsvdlklellinkhikkqalvtvcesgmqtkhvyqnlsqflldylqvnttisvnvdtfqyidtstfplenvlsiflysnsd(seqidno:43)。

人cd40的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:44(登記號nm_001250)和seqidno:45中列出：

tttcctgggcggggccaaggctggggcaggggagtcagcagaggcctcgctcgggcgcccagtggtcctgccgcctggtctcacctcgctatggttcgtctgcctctgcagtgcgtcctctggggctgcttgctgaccgctgtccatccagaaccacccactgcatgcagagaaaaacagtacctaataaacagtcagtgctgttctttgtgccagccaggacagaaactggtgagtgactgcacagagttcactgaaacggaatgccttccttgcggtgaaagcgaattcctagacacctggaacagagagacacactgccaccagcacaaatactgcgaccccaacctagggcttcgggtccagcagaagggcacctcagaaacagacaccatctgcacctgtgaagaaggctggcactgtacgagtgaggcctgtgagagctgtgtcctgcaccgctcatgctcgcccggctttggggtcaagcagattgctacaggggtttctgataccatctgcgagccctgcccagtcggcttcttctccaatgtgtcatctgctttcgaaaaatgtcacccttggacaagctgtgagaccaaagacctggttgtgcaacaggcaggcacaaacaagactgatgttgtctgtggtccccaggatcggctgagagccctggtggtgatccccatcatcttcgggatcctgtttgccatcctcttggtgctggtctttatcaaaaaggtggccaagaagccaaccaataaggccccccaccccaagcaggaaccccaggagatcaattttcccgacgatcttcctggctccaacactgctgctccagtgcaggagactttacatggatgccaaccggtcacccaggaggatggcaaagagagtcgcatctcagtgcaggagagacagtgaggctgcacccacccaggagtgtggccacgtgggcaaacaggcagttggccagagagcctggtgctgctgctgctgtggcgtgagggtgaggggctggcactgactgggcatagctccccgcttctgcctgcacccctgcagtttgagacaggagacctggcactggatgcagaaacagttcaccttgaagaacctctcacttcaccctggagcccatccagtctcccaacttgtattaaagacagaggcagaagtttggtggtggtggtgttggggtatggtttagtaatatccaccagaccttccgatccagcagtttggtgcccagagaggcatcatggtggcttccctgcgcccaggaagccatatacacagatgcccattgcagcattgtttgtgatagtgaacaactggaagctgcttaactgtccatcagcaggagactggctaaataaaattagaatatatttatacaacagaatctcaaaaacactgttgagtaaggaaaaaaaggcatgctgctgaatgatgggtatggaactttttaaaaaagtacatgcttttatgtatgtatattgcctatggatatatgtataaatacaatatgcatcatatattgatataacaagggttctggaagggtacacagaaaacccacagctcgaagagtggtgacgtctggggtggggaagaagggtctggggg(seqidno:44)

mvrlplqcvlwgclltavhpepptacrekqylinsqccslcqpgqklvsdctefteteclpcgesefldtwnrethchqhkycdpnlglrvqqkgtsetdtictceegwhctseacescvlhrscspgfgvkqiatgvsdticepcpvgffsnvssafekchpwtscetkdlvvqqagtnktdvvcgpqdrlralvvipiifgilfaillvlvfikkvakkptnkaphpkqepqeinfpddlpgsntaapvqetlhgcqpvtqedgkesrisvqerq(seqidno:45)。

人cd70的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:46(登記號nm_001252)和seqidno:47中列出：

ccagagaggggcaggctggtcccctgacaggttgaagcaagtagacgcccaggagccccgggagggggctgcagtttccttccttccttctcggcagcgctccgcgcccccatcgcccctcctgcgctagcggaggtgatcgccgcggcgatgccggaggagggttcgggctgctcggtgcggcgcaggccctatgggtgcgtcctgcgggctgctttggtcccattggtcgcgggcttggtgatctgcctcgtggtgtgcatccagcgcttcgcacaggctcagcagcagctgccgctcgagtcacttgggtgggacgtagctgagctgcagctgaatcacacaggacctcagcaggaccccaggctatactggcaggggggcccagcactgggccgctccttcctgcatggaccagagctggacaaggggcagctacgtatccatcgtgatggcatctacatggtacacatccaggtgacgctggccatctgctcctccacgacggcctccaggcaccaccccaccaccctggccgtgggaatctgctctcccgcctcccgtagcatcagcctgctgcgtctcagcttccaccaaggttgtaccattgcctcccagcgcctgacgcccctggcccgaggggacacactctgcaccaacctcactgggacacttttgccttcccgaaacactgatgagaccttctttggagtgcagtgggtgcgcccctgaccactgctgctgattagggttttttaaattttattttattttatttaagttcaagagaaaaagtgtacacacaggggccacccggggttggggtgggagtgtggtggggggtagtggtggcaggacaagagaaggcattgagctttttctttcattttcctattaaaaaatacaaaaatca(seqidno:46)

mpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp(seqidno:47)。

人light的代表性核苷酸和氨基酸序列分別在seqidno:48(登記號cr541854)和seqidno:49中列出：

atggaggagagtgtcgtacggccctcagtgtttgtggtggatggacagaccgacatcccattcacgaggctgggacgaagccaccggagacagtcgtgcagtgtggcccgggtgggtctgggtctcttgctgttgctgatgggggccgggctggccgtccaaggctggttcctcctgcagctgcactggcgtctaggagagatggtcacccgcctgcctgacggacctgcaggctcctgggagcagctgatacaagagcgaaggtctcacgaggtcaacccagcagcgcatctcacaggggccaactccagcttgaccggcagcggggggccgctgttatgggagactcagctgggcctggccttcctgaggggcctcagctaccacgatggggcccttgtggtcaccaaagctggctactactacatctactccaaggtgcagctgggcggtgtgggctgcccgctgggcctggccagcaccatcacccacggcctctacaagcgcacaccccgctaccccgaggagctggagctgttggtcagccagcagtcaccctgcggacgggccaccagcagctcccgggtctggtgggacagcagcttcctgggtggtgtggtacacctggaggctggggaggaggtggtcgtccgtgtgctggatgaacgcctggttcgactgcgtgatggtacccggtcttacttcggggctttcatggtgtga(seqidno:48)

meesvvrpsvfvvdgqtdipftrlgrshrrqscsvarvglglllllmgaglavqgwfllqlhwrlgemvtrlpdgpagsweqliqerrshevnpaahltganssltgsggpllwetqlglaflrglsyhdgalvvtkagyyyiyskvqlggvgcplglastithglykrtprypeelellvsqqspcgratsssrvwwdssflggvvhleageevvvrvlderlvrlrdgtrsyfgafmv(seqidno:49)。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供包含本文所述的任何序列的變體，例如，與本文所公開的任何序列(例如，seqidno:1-13和38-49)具有以下序列同一性的序列：至少約60％、或至少約61％、或至少約62％、或至少約63％、或至少約64％、或至少約65％、或至少約66％、或至少約67％、或至少約68％、或至少約69％、或至少約70％、或至少約71％、或至少約72％、或至少約73％、或至少約74％、或至少約75％、或至少約76％、或至少約77％、或至少約78％、或至少約79％、或至少約80％、或至少約81％、或至少約82％、或至少約83％、或至少約84％、或至少約85％、或至少約86％、或至少約87％、或至少約88％、或至少約89％、或至少約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％)。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供一種相對于本文所述的任何蛋白質序列具有一個或多個氨基酸突變的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述一個或多個氨基酸突變可獨立地選自如本文所述的保守或非保守取代、插入、缺失及截短。

檢查點阻斷/腫瘤免疫抑制的阻斷

一些人腫瘤可由患者的免疫系統(tǒng)消除。例如，靶向免疫“檢查點”分子的單克隆抗體的施用可造成完全應答和腫瘤緩解。這種抗體的作用模式是通過抑制免疫調(diào)節(jié)分子，腫瘤指派免疫調(diào)節(jié)分子來保護以免發(fā)生抗腫瘤免疫應答。通過抑制這些“檢查點”分子(例如，用拮抗抗體)，患者的cd8+t細胞可允許增殖并破壞腫瘤細胞。

例如，靶向例如但不限于ctla-4或pd-1的單克隆抗體的施用可造成完全應答和腫瘤緩解。這種抗體的作用模式是通過抑制腫瘤指派來保護以免發(fā)生抗腫瘤免疫應答的ctla-4或pd-1。通過抑制這些“檢查點”分子(例如，用拮抗抗體)，患者的cd8+t細胞可允許增殖并破壞腫瘤細胞。

因此，本文所提供的載體可與一種或多種靶向免疫“檢查點”分子的封閉性抗體組合使用。例如，在一些實施方案中，本文所提供的載體可與一種或多種靶向如ctla-4或pd-1的分子的封閉性抗體組合使用。舉例來說，本文所提供的載體可與阻斷、降低和/或抑制pd-1和pd-l1或pd-l2和/或pd-1與pd-l1或pd-l2的結合的藥劑(作為非限制性實例，以下一種或多種：納武單抗(nivolumab)(ono-4538/bms-936558,mdx1106,opdivo，bristolmyerssquibb)、派姆單抗(pembrolizumab)(keytruda,merck)、匹地利珠單抗(pidilizumab)(ct-011，curetech)、mk-3475(merck)、bms936559(bristolmyerssquibb)、mpdl328oa(roche))組合使用。在一個實施方案中，本文所提供的載體可與阻斷、降低和/或抑制ctla-4的活性和/或ctla-4與一種或多種受體(例如，cd80、cd86、ap2m1、shp-2及ppp2r5a)的結合的藥劑組合使用。例如，在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)劑為抗體，如但不限于易普利單抗(ipilimumab)(mdx-010、mdx-101、yervoy、bms)和/或替西木單抗(tremelimumab)(pfizer)。針對這些分子的封閉性抗體可獲自例如bristolmyerssquibb(newyork,ny)、merck(kenilworth,nj)、medimmune(gaithersburg,md)及pfizer(newyork,ny)。

此外，本文所提供的載體可與一種或多種靶向以下免疫“檢查點”分子的封閉性抗體組合使用：例如像btla、hvem、tim3、gal9、lag3、vista、kir、2b4、cd160(也稱為by55)、cgen-15049、chk1和chk2激酶、a2ar、ceacam(例如，ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)、gitr、gitrl、半乳凝素-9、cd244、cd160、tigit、sirpα、icos、cd172a、及tmigd2以及各種b-7家族配體(包括但不限于b7-1、b7-2、b7-dc、b7-h1、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6及b7-h7)。

載體與宿主細胞

本文件提供編碼疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-ig融合蛋白)和可在原核細胞和真核細胞中表達的t細胞共刺激融合蛋白的核酸構建體。例如，本文件提供表達載體(例如，基于dna或rna的載體)，其含有編碼疫苗蛋白融合物(例如，gp96-ig融合物)和t細胞共刺激融合蛋白(例如，特異性地與ox40結合的ox40l-ig或其一部分、特異性地與icos結合的icosl-ig或其一部分、特異性地與4-1bbr結合的4-1bbl-ig或其一部分、特異性地與cd40結合的cd40l-ig或其一部分、特異性地與cd27結合的cd70-ig或其一部分、特異性地與tnfrsf25結合的tl1a-ig或其一部分、或特異性地與gitr結合的gitrl-ig或其一部分)的核苷酸序列。另外，本文件提供用于制造本文所述的載體的方法以及用于將載體引入適當?shù)乃拗骷毎幸员惚磉_所編碼的多肽的方法。一般說來，本文所提供的方法包括構建編碼疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-ig融合蛋白)和t細胞共刺激融合蛋白的核酸序列，將編碼所述融合蛋白的序列克隆到表達載體中。表達載體可引入宿主細胞中或摻入病毒顆粒中，這兩者都可向受試者施用以例如治療癌癥或感染。例如，可產(chǎn)生基于gp96-ig的疫苗以刺激針對由猿免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒及瘧疾表達的單一抗原的抗原特異性免疫應答。針對這些疫苗的免疫應答可通過由gp96-ig載體共表達t細胞共刺激融合蛋白來增強。

可使用常規(guī)的dna克隆和誘變方法、dna擴增方法和/或合成方法獲得編碼疫苗蛋白融合物(例如，gp96-ig融合物)和t細胞共刺激融合蛋白(且如果需要的話，被修飾)的cdna或dna序列。一般說來，編碼疫苗蛋白融合蛋白(例如，gp96-ig融合蛋白)和/或t細胞共刺激融合蛋白的序列可插入克隆載體中用于表達之前的基因修飾和復制目的。每個編碼序列可與調(diào)控元件(如啟動子)可操作地連接，以便在合適的宿主細胞中體外和體內(nèi)表達所編碼的蛋白質。

表達載體可引入宿主細胞中用于產(chǎn)生分泌的疫苗蛋白(例如，gp96-ig)和t細胞共刺激融合蛋白。存在可用于將核酸引入到活細胞中的多種技術。適用于將核酸體外轉移到哺乳動物細胞中的技術包括使用脂質體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、基于聚合物的系統(tǒng)、deae-葡聚糖、病毒轉導、磷酸鈣沉淀法等。對于體內(nèi)基因轉移，也可使用許多技術和試劑，包括脂質體；基于天然聚合物的遞送媒介物，如殼聚糖和明膠；病毒載體也適用于體內(nèi)轉導。在一些情況下，需要提供靶向劑，如對于細胞表面膜蛋白有特異性的抗體或配體。當采用脂質體時，與同胞吞有關的細胞表面膜蛋白結合的蛋白質可用于靶向和/或幫助攝取，例如對特定的細胞類型有向性的衣殼蛋白或其片段、針對經(jīng)歷循環(huán)中內(nèi)化的蛋白質的抗體、靶向細胞內(nèi)定位并增加細胞內(nèi)半衰期的蛋白質。由例如wu等人,j.biol.chem.262,4429-4432(1987)；及wagner等人,proc.natl.acad.sci.usa87,3410-3414(1990)描述受體介導的胞吞技術。

適當時，還可采用基因遞送劑，例如像整合序列。眾多整合序列是本領域中已知的(參見，例如nunes-duby等人,nucleicacidsres.26:391-406,1998；sadwoski,j.bacteriol.,165:341-357,1986；bestor,cell,122(3):322-325,2005；plasterk等人,tig15:326-332,1999；kootstra等人,ann.rev.pharm.toxicol.,43:413-439,2003)。這些包括重組酶和轉座酶。實例包括cre(sternberg和hamilton,j.mol.biol.,150:467-486,1981)、λ(nash,nature,247,543-545,1974)、fip(broach等人,cell,29:227-234,1982)、r(matsuzaki等人,j.bacteriology,172:610-618,1990)、cpc31(參見，例如groth等人,j.mol.biol.335:667-678,2004)、睡美人(sleepingbeauty)、水手家族(marinerfamily)的轉座酶(plasterk等人，上述)、及用于整合病毒(如aav、逆轉錄病毒)的組分、以及具有提供病毒整合的組分的抗病毒素，如逆轉錄病毒或慢病毒的ltr序列和aav的itr序列(kootstra等人,ann.rev.pharm.toxicol.,43:413-439,2003)。

例如，細胞可體外培養(yǎng)或被遺傳工程化。宿主細胞可獲自正?；蚧疾〉氖茉囌?，包括健康的人、癌癥患者及患有感染性疾病的患者；私人實驗室保藏、公共培養(yǎng)物保藏(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心)；或獲自商業(yè)供應商。

可用于gp96-ig融合蛋白和t細胞共刺激融合蛋白的體內(nèi)產(chǎn)生和分泌的細胞包括但不限于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、角化細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞，如t淋巴細胞、b淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞或粒細胞；各種干細胞或祖細胞，如造血干細胞或祖細胞(例如獲自骨髓)、臍帶血、外周血、胎兒肝臟等；以及腫瘤細胞(例如，人腫瘤細胞)。細胞類型的選擇取決于被治療或預防的腫瘤或感染性疾病的類型，并且可由本領域技術人員確定。

不同的宿主細胞具有針對蛋白質的翻譯后加工和修飾的特征性和特異性機制?？蛇x擇一種宿主細胞，其以類似于接受者加工其熱休克蛋白(hsp)的特殊方式修飾并加工所表達的基因產(chǎn)物。為了產(chǎn)生大量gp96-ig，優(yōu)選的是所述類型的宿主細胞已用于異源基因的表達，并且相當充分地表征并開發(fā)用于大規(guī)模生產(chǎn)加工。在一些實施方案中，宿主細胞是分泌本發(fā)明融合蛋白的本發(fā)明的融合物或重組細胞隨后所施用患者自體的。

在一些實施方案中，如本文所提供的表達構建體可引入抗原性細胞中。如本文所用，抗原性細胞可例如包括感染了引起癌癥的致病因子(如病毒)但仍沒有腫瘤的前期腫瘤細胞、或者已經(jīng)暴露于誘變劑或引起癌癥的因子(如dna破壞劑或放射線)抗原性細胞?？墒褂玫钠渌毎麨榍捌谀[瘤細胞，其從正常形式轉變?yōu)槟[瘤形式，如通過形態(tài)或生理或生物化學功能所表征。

通常，本文所提供的方法中使用的癌細胞和前期腫瘤細胞具有哺乳動物來源。預期的哺乳動物包括人、伴侶動物(例如狗和貓)、家畜動物(例如綿羊、牛、山羊、豬及馬)、實驗室動物(例如小鼠、大鼠和兔)、以及被捕獲或自由狀態(tài)的野生動物。

在一些實施方案中，癌細胞(例如，人腫瘤細胞)可用于本文所述的方法中。癌細胞提供抗原性肽，其變得與所表達的gp96-ig融合蛋白非共價締和。還可使用來源于前期腫瘤病變、癌組織或癌細胞的細胞系，只要所述細胞系的細胞具有至少一個或多個與靶癌細胞上的抗原相同的抗原決定簇。可使用癌組織、癌細胞、感染了引起癌癥的因子的細胞、其它前期腫瘤細胞及人來源的細胞系。最終從融合蛋白最終有待施用的患者上切除的癌細胞可特別有用，不過也可使用同種異體細胞。在一些實施方案中，癌細胞可來自確定的腫瘤細胞系，如但不限于確定的非小細胞肺癌(nsclc)、膀胱癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎細胞癌、前列腺癌、肉瘤、乳腺癌、鱗狀細胞癌、頭頸癌、肝細胞癌、胰腺癌或結腸癌細胞系。

在各種實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白允許共刺激t細胞及各種腫瘤細胞抗原的呈遞。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的疫苗蛋白融合物(例如，gp96融合物)作為這些不同的腫瘤抗原的伴侶。在各種實施方案中，腫瘤細胞分泌多種抗原?？煞置诘恼f明性但非限制性抗原為：mart-1/melan-a、gp100、二肽基肽酶iv(dppiv)、腺苷脫氨酶結合蛋白(adabp)、親環(huán)蛋白b、結腸直腸相關抗原(crc)-0017-1a/ga733、癌胚抗原(cea)及其免疫原性表位cap-1和cap-2、etv6、aml1、前列腺特異性抗原(psa)及其免疫原性表位psa-1、psa-2及psa-3、前列腺特異性膜抗原(psma)、t細胞受體/cd3-ξ鏈、腫瘤抗原的mage家族(例如，mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、mage-xp2(mage-b2)、mage-xp3(mage-b3)、mage-xp4(mage-b4)、mage-c1、mage-c2、mage-c3、mage-c4、mage-c5)、腫瘤抗原的gage家族(例如，gage-1、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、gage-8、gage-9)、bage、rage、lage-1、nag、gnt-v、mum-1、cdk4、酪氨酸酶、p53、muc家族、her2/neu、p21ras、rcas1、α-胎蛋白、e-鈣粘蛋白、α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白及γ-連環(huán)蛋白、p120ctn、gp100pmel117、prame、ny-eso-1、cdc27、腺瘤性結腸息肉病蛋白(apc)、胞襯蛋白、連接蛋白37、ig-獨特型、p15、gp75、gm2和gd2神經(jīng)節(jié)苷脂、病毒產(chǎn)物如人乳頭狀瘤病毒蛋白、腫瘤抗原的smad家族、lmp-1、na、ebv編碼的核抗原(ebna)-1、腦糖原磷酸化酶、ssx-1、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-1、ssx-4、ssx-5、scp-1ct-7、c-erbb-2、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd37、cd56、cd70、cd74、cd138、ags16、muc1、gpnmb、ep-cam、pd-l1、pd-l2、pmsa、膀胱癌抗原如actl8、adam22、adam23、atad2、atad2b、birc5、casc5、cep290、cep55、ctage5、dcaf12、ddx5、fam133a、il13ra2、imp3、kiaa0100、magea11、magea3、magea6、mphosph10、odf2、odf2l、oip5、pbk、rqcd1、spag1、spag4、spag9、tmeff1、ttk、以及前列腺癌抗原如prame、birc5、cep55、atad2、odf2、kiaa0100、spag9、gpatch2、atad2b、cep290、spag1、odf2l、ctage5、ddx5、dcaf12、imp3。在一些實施方案中，抗原為人內(nèi)源性逆轉錄病毒抗原。說明性抗原還可包括來自人內(nèi)源性逆轉錄病毒的抗原，包括但不限于來源于gag的至少一部分、tat的至少一部分、rev的至少一部分、nef的至少一部分及gp160的至少一部分的表位。

此外，在一些實施方案中，本發(fā)明的疫苗蛋白融合物(例如，gp96融合物)提供進一步允許患者的免疫系統(tǒng)當在本文所述的各種方法中使用時針對所關注的疾病被活化的輔佐效應。

原核和真核載體都可用于在本文所提供的方法中表達疫苗蛋白(例如，gp96-ig)和t細胞共刺激融合蛋白。原核載體包括基于大腸桿菌序列的構建體(參見，例如makrides,microbiolrev1996,60:512-538)?？捎糜谠诖竽c桿菌中表達的調(diào)節(jié)區(qū)的非限制性實例包括lac、trp、lpp、phoa、reca、tac、t3、t7及λpl。原核表達載體的非限制性實例可包括λgt載體系列如λgt11(huynh等人,“dnacloningtechniques,第i卷:apracticalapproach,”1984,(d.glover編著),第49-78頁,irlpress,oxford)和pet載體系列(studier等人,methodsenzymol1990,185:60-89)。然而，原核宿主-載體系統(tǒng)不能進行哺乳動物細胞的大部分翻譯后加工。因此，真核宿主-載體系統(tǒng)可尤其有用。

多種調(diào)節(jié)區(qū)可用于在哺乳動物宿主細胞中表達疫苗蛋白(例如，gp96-ig)和t細胞共刺激融合物。例如，可使用sv40早期和晚期啟動子、巨細胞病毒(cmv)立即早期啟動子及勞氏肉瘤(roussarcoma)病毒長末端重復(rsv-ltr)啟動子?？蛇m用于哺乳動物細胞中的誘導型啟動子包括但不限于與以下有關的啟動子：金屬硫蛋白ii基因、小鼠乳腺腫瘤病毒糖皮質激素應答長末端重復(mmtv-ltr)、β-干擾素基因及hsp70基因(參見，williams等人,cancerres1989,49:2735-42；及taylor等人,molcellbiol1990,10:165-75)。熱休克啟動子或脅迫啟動子也可有利地驅使融合蛋白在重組宿主細胞中表達。

在一個實施方案中，本發(fā)明預期使用誘導型啟動子，其能夠瞬時響應于引發(fā)物實現(xiàn)高水平的表達。說明性誘導型表達控制區(qū)包括包含用如小分子化合物的引發(fā)物刺激的誘導型啟動子的區(qū)域。具體實例可見于例如美國專利號5,989,910、5,935,934、6,015,709及6,004,941中，其各自以引用的方式整體并入本文。

展現(xiàn)組織特異性并且已用于轉基因動物中的動物調(diào)節(jié)區(qū)也可在特定組織類型的腫瘤細胞中使用：在胰腺腺泡細胞中有活性的彈性蛋白酶i基因控制區(qū)(swift等人,cell1984,38:639-646；ornitz等人,coldspringharborsympquantbiol1986,50:399-409；及macdonald,hepatology1987,7:425-515)；在胰腺β細胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(hanahan,nature1985,315:115-122)；在淋巴樣細胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(grosschedl等人,cell1984,38:647-658；adames等人,nature1985,318:533-538；及alexander等人,molcellbiol1987,7:1436-1444)；在睪丸、乳腺、淋巴及肥大細胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)(leder等人,cell1986,45:485-495)；在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(pinkert等人,genesdevel,1987,1:268-276)；在肝臟中有活性的α-甲胎蛋白基因控制區(qū)(krumlauf等人,molcellbiol1985,5:1639-1648；及hammer等人,science1987,235:53-58)；在肝臟中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(kelsey等人,genesdevel1987,1:161-171)；在骨髓細胞中有活性的β-球蛋白基因控制區(qū)(mogram等人,nature1985,315:338-340；及kollias等人,cell1986,46:89-94)；在腦的少突膠質細胞中有活性的髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)(readhead等人,cell1987,48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(sani,nature1985,314:283-286)；以及在下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)(mason等人,science1986,234:1372-1378)。

表達載體還可包括轉錄增強子元件，如見于sv40病毒、乙型肝炎病毒、巨細胞病毒、免疫球蛋白基因、金屬硫蛋白及β-肌動蛋白中的那些(參見，bittner等人,methenzymol1987,153:516-544；及gorman,curropbiotechnol1990,1:36-47)。另外，表達載體可含有允許載體在一種以上類型的宿主細胞中維持和復制或者載體整合到宿主染色體中的序列。這種序列包括但不限于復制起點、自主重復序列(ars)、著絲點dna及端粒dna。

另外，表達載體可含有一個或多個可選擇或可篩選的標記基因，用于初始分離、鑒別或追蹤含有編碼本文所述的融合蛋白的dna的宿主細胞。為了gp96-ig和t細胞共刺激融合蛋白的長期高產(chǎn)率產(chǎn)生，在哺乳動物細胞中的穩(wěn)定表達可為有用的。許多選擇系統(tǒng)可用于哺乳動物細胞。舉例來說，單純皰疹病毒胸苷激酶(wigler等人,cell1977,11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(szybalski和szybalski,procnatlacadsciusa1962,48:2026)及腺嘌呤轉磷酸核糖基酶(lowy等人,cell1980,22:817)基因分別可用于tk^-、hgprt^-或aprt^-細胞中。另外，抗代謝物抗性可用作選擇以下的基礎：二氫葉酸還原酶(dhfr)，其賦予對氨甲蝶呤的抗性(wigler等人,procnatlacadsciusa1980,77:3567；o’hare等人,procnatlacadsciusa1981,78:1527)；gpt，其賦予對霉酚酸的抗性(mulligan和berg,procnatlacadsciusa1981,78:2072)；新霉素磷酸轉移酶(neo)，其賦予對氨基糖苷類g-418的抗性(colberre-garapin等人,jmolbiol1981,150:1)；以及潮霉素磷酸轉移酶(hyg)，其賦予對潮霉素的抗性(santerre等人,gene1984,30:147)。還可使用其它可選擇的標記，如組氨醇和zeocin^tm。

有用的哺乳動物宿主細胞包括但不限于來源于人、猴子及嚙齒動物的細胞(參見，例如kriegler“genetransferandexpression:alaboratorymanual,”1990,newyork,freeman&co.)。它們包括由sv40轉化的猴腎細胞系(例如，cos-7，atcccrl1651)；人胚腎細胞系(例如，293、293-ebna或293細胞被亞克隆以便在懸浮培養(yǎng)中生長，graham等人,jgenvirol1977,36:59)；幼倉鼠腎細胞(例如，bhk，atccccl10)；中國倉鼠卵巢細胞dhfr(例如，cho，urlaub和chasin,procnatlacadsciusa1980,77:4216)；小鼠塞托利細胞(sertolicells)(mather,biolreprod1980,23:243-251)；小鼠成纖維細胞(例如，nih-3t3)；猴腎細胞(例如，cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細胞(例如，vero-76，atcccrl-1587)；人宮頸癌細胞(例如，hela，atccccl2)；犬腎細胞(例如，mdck，atccccl34)；水牛大鼠肝細胞(例如，brl3a，atcccrl1442)；人肺細胞(例如，w138，atccccl75)；人肝細胞(例如，hepg2，hb8065)；以及小鼠乳腺腫瘤細胞(例如，mmt060562，atccccl51)。用于表達本文所述的融合蛋白的說明性癌細胞類型包括小鼠成纖維細胞系nih3t3、小鼠lewis肺癌細胞系llc、小鼠肥大細胞瘤細胞系p815、小鼠淋巴瘤細胞系el4及其卵清蛋白轉染子e.g7、小鼠黑色素瘤細胞系b16f10、小鼠纖維肉瘤細胞系mc57、人小細胞肺癌細胞系sclc#2和sclc#7、人肺腺癌細胞系(例如ad100)以及人前列腺癌細胞系(例如pc-3)。

許多基于病毒的表達系統(tǒng)也可與哺乳動物細胞一起用于產(chǎn)生gp96-ig和t細胞共刺激融合蛋白。使用dna病毒骨架的載體來源于猿猴病毒40(sv40)(hamer等人,cell1979,17:725)、腺病毒(vandoren等人,molcellbiol1984,4:1653)、腺相關病毒(mclaughlin等人,jvirol1988,62:1963)以及牛乳頭狀瘤病毒(zinn等人,procnatlacadsciusa1982,79:4897)。當腺病毒用作表達載體時，供體dna序列可連接有腺病毒轉錄/翻譯控制復合物，例如晚期啟動子和三聯(lián)體前導序列。此融合基因可隨后通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)域(例如，區(qū)域e1或e3)中的插入可產(chǎn)生重組病毒，該病毒是活的并且能夠在受感染宿主中表達異源產(chǎn)物(參見，例如logan和shenk,procnatlacadsciusa1984,81:3655-3659)。

牛乳頭狀瘤病毒(bpv)可感染許多高等脊椎動物，包括男人，且其dna作為附加體進行復制。已經(jīng)開發(fā)了許多穿梭載體用于重組基因表達，其作為哺乳動物細胞中的穩(wěn)定多拷貝(20-300個拷貝/細胞)染色體外元件存在。通常，這些載體含有bpvdna的段(整個基因組或69％轉化片段)、具有寬宿主范圍的啟動子、多腺苷酸化信號、剪接信號、可選擇標記以及允許載體在大腸桿菌中增殖的“無毒”質粒序列。在細菌中構建和擴增之后，將表達基因構建體通過例如磷酸鈣共沉淀轉染到培養(yǎng)的哺乳動物細胞中。對于不表現(xiàn)轉化表型的那些宿主細胞，通過利用顯性可選擇標記(如組氨醇和g418抗性)實現(xiàn)轉化體的選擇。

或者，可使用牛痘7.5k啟動子。(參見，例如mackett等人,procnatlacadsciusa1982,79:7415-7419；mackett等人,jvirol1984,49:857-864；及panicali等人,procnatlacadsciusa1982,79:4927-4931)。如果使用人宿主細胞，那么可使用基于埃-巴二氏病毒(epstein-barrvirus)(ebv)來源(orip)及ebv核抗原1(ebna-1；反式作用復制因子)的載體。這種載體可與廣泛的人宿主細胞一起使用，例如ebo-pcd(spickofsky等人,dnaprotengtech1990,2:14-18)；pdr2和λdr2(購自clontechlaboratories)。

gp96-ig和t細胞共刺激融合蛋白也可用基于逆轉錄病毒的表達系統(tǒng)制成?？墒褂媚孓D錄病毒，如莫洛尼(moloney)鼠科白血病病毒，由于大部分病毒基因序列可被去除并用外源性編碼序列置換，而失去的病毒功能可以反式提供。與轉染相對比，逆轉錄病毒可有效地感染并轉移基因到多種細胞類型中，包括例如原代造血細胞。此外，通過逆轉錄病毒載體感染的宿主范圍可通過選擇用于載體包裝的包膜來操縱。

例如，逆轉錄病毒載體可包含5'長末端重復(ltr)、3'ltr、包裝信號、細菌復制起點以及可選擇標記。例如，gp96-ig融合蛋白編碼序列可插入5'ltr與3'ltr之間的位置中，以使得從5'ltr啟動子的轉錄能夠轉錄所克隆的dna。5'ltr以此順序含有啟動子(例如，ltr啟動子)、r區(qū)、u5區(qū)以及引物結合位點。這些ltr元件的核苷酸序列在本領域中是公知的。異源啟動子以及多重藥物選擇標記也可包括在表達載體中以幫助選擇受感染的細胞。參見，mclauchlin等人,prognucleicacidresmolbiol1990,38:91-135；morgenstern等人,nucleicacidres1990,18:3587-3596；choulika等人,jvirol1996,70:1792-1798；boesen等人,biotherapy1994,6:291-302；salmons和gunzberg,humangenether1993,4:129-141；以及grossman和wilson,curropingenetdevel1993,3:110-114。

本文所述的任何克隆和表達載體都可使用本領域中已知的技術由已知的dna序列合成并裝配。調(diào)控區(qū)和增強子元件可以是多種來源的，包括天然和合成的。一些載體和宿主細胞可商購獲得。有用的載體的非限制性實例描述于以下中：currentprotocolsinmolecularbiology,1988,ausubel等人編著,greenepublish.assoc.&wileyinterscience的附錄5，該文獻以引用的方式并入本文；和商業(yè)供應商(如clontechlaboratories、stratageneinc.及invitrogen,inc)的目錄。

治療方法

本文所提供的表達載體可摻入到組合物中以便向受試者(例如，具有臨床病狀如癌癥或感染的研究動物或哺乳動物，如人)施用。例如，表達載體可向受試者施用以用于治療癌癥或感染。因此，本文件提供用本文所提供的表達載體治療如癌癥或感染的臨床病狀的方法。感染可為例如急性感染或慢性感染。在一些實施方案中，感染可為丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒或瘧疾感染。所述方法可包括在以下條件下向受試者施用表達載體、含有表達載體的細胞、或含有表達載體的病毒或病毒樣顆粒，其中所述受試者中的臨床病狀的進展或癥狀以治療方式緩解。

在各種實施方案中，本發(fā)明涉及癌癥和/或腫瘤；例如，癌癥和/或腫瘤的治療或預防。癌癥或腫瘤是指細胞的不受控制生長和/或異常增加的細胞存活和/或細胞凋亡的抑制，其干擾身體器官和系統(tǒng)的正常功能。包括良性和惡性癌癥、息肉、增生以及休眠腫瘤或微轉移。還包括具有異常增殖的細胞，該增殖不受免疫系統(tǒng)阻止(例如，病毒感染細胞)。癌癥可為原發(fā)性癌或轉移性癌。原發(fā)性癌可為在發(fā)生位點處的癌細胞區(qū)域，其變得在臨床上可檢測，并且可為原發(fā)性腫瘤。相比之下，轉移性癌可為疾病從一個器官或部分到另一個非相鄰器官或部分的擴散。轉移性癌可由一種癌細胞引起，所述癌細胞獲得了滲透并浸潤局部區(qū)域中的周圍正常組織的能力，從而形成新的腫瘤，其可為局部轉移。癌癥還可由一種癌細胞引起，所述癌細胞獲得了穿透淋巴管和/或血管壁的能力，之后癌細胞能夠在血流中循環(huán)(由此成為循環(huán)腫瘤細胞)到體內(nèi)的其它位點和組織。癌癥可歸因于如淋巴或血源性(hematogeneous)擴散的過程。癌癥還可由腫瘤細胞引起，所述腫瘤細胞在另一個位點處停下來，再穿透血管或壁，繼續(xù)增殖，并最終形成另一個臨床上可檢測的腫瘤。癌癥可為這個新腫瘤，其可為轉移性(或繼發(fā)性)腫瘤。

癌癥可由已經(jīng)轉移的腫瘤細胞引起，其可為繼發(fā)性或轉移性腫瘤。腫瘤細胞可像原始腫瘤中的那些一樣。舉例來說，如果乳腺癌或結腸癌轉移到肝臟，那么存在于肝臟中的繼發(fā)性腫瘤是由異常的乳腺或結腸細胞組成，而不是異常的肝細胞。肝臟中的腫瘤可因此為轉移性乳腺癌或轉移性結腸癌，而非肝癌。

癌癥可具有來自任何組織的起源。癌癥可起源于黑色素瘤、結腸、乳腺或前列腺，且因此可分別由最初為皮膚、結腸、乳腺或前列腺的細胞組成。癌癥還可為惡性血液腫瘤，其可為淋巴瘤。癌癥可侵襲如肝、肺、膀胱或腸的組織。

可被治療的說明性癌癥包括但不限于癌，例如各種亞型，包括例如腺癌、基底細胞癌、鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、肉瘤(包括例如骨和軟組織)、白血病(包括例如急性髓性、急性成淋巴細胞性、慢性髓性、慢性淋巴細胞性及毛細胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如霍奇金氏(hodgkin)和非霍奇金氏淋巴瘤、輕鏈、非分泌型、mgus及漿細胞瘤)、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥(包括例如腦(例如神經(jīng)膠質瘤(例如星形細胞瘤、少突神經(jīng)膠質細胞瘤及室管膜瘤)、腦膜瘤、垂體腺瘤和神經(jīng)瘤、以及脊髓腫瘤(例如腦膜瘤和神經(jīng)纖維瘤)。

本發(fā)明的代表性癌癥和/或腫瘤包括但不限于基底細胞癌、膽管癌；膀胱癌；骨癌；腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌；乳腺癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結腸及直腸癌；結締組織癌；消化系統(tǒng)癌；子宮內(nèi)膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(包括胃腸癌)；成膠質細胞瘤；肝癌；肝細胞瘤；上皮內(nèi)腫瘤；腎臟或腎癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神經(jīng)母細胞瘤；口腔癌癥(唇、舌、口腔及咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；成視網(wǎng)膜細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統(tǒng)癌；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內(nèi)膜癌；泌尿系統(tǒng)癌；外陰癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏和非霍奇金氏淋巴瘤及b細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)；小淋巴細胞性(sl)nhl；中級/濾泡性nhl；中級彌散性nhl；高級免疫母細胞性nhl；高級成淋巴細胞性nhl；高級小無核裂細胞nhl；巨大腫塊nhl；套細胞淋巴瘤；aids相關淋巴瘤；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom'smacroglobulinemia)；慢性淋巴細胞性白血病(cll)；急性淋巴母細胞性白血病(all)；毛細胞白血??；慢性原始粒細胞性白血病；以及其它癌和肉瘤；及移植后淋巴組織增殖性病癥(ptld)以及與瘢痣病有關的異常血管增生、水腫(如與腦腫瘤有關的)、及梅格斯綜合征(meigs'syndrome)。

在一些方面中，本發(fā)明的融合物用于消除細胞內(nèi)病原體。在一些方面中，本發(fā)明的融合物用于治療一種或多種感染。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白用于治療病毒感染(包括例如hiv及hcv)、寄生蟲感染(包括例如瘧疾)及細菌感染的方法中。在各種實施方案中，感染誘導免疫抑制。例如，hiv感染常常導致受感染的受試者中的免疫抑制。因此，如本文中別處所述，在各種實施方案中，這種感染的治療可涉及用本發(fā)明的融合蛋白調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以促使免疫刺激超過免疫抑制?；蛘撸景l(fā)明提供用于治療誘導免疫活化的感染的方法。例如，腸蠕蟲感染與慢性免疫活化有關。在這些實施方案中，這種感染的治療可涉及用本發(fā)明的融合蛋白調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以促使免疫抑制超過免疫刺激。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供治療病毒感染的方法，包括但不限于例如呼吸道、乳頭狀瘤病毒感染、單純皰疹病毒(hsv)感染、人免疫缺陷病毒(hiv)感染、以及內(nèi)臟病毒感染，如肝炎病毒感染的急性或慢性病毒感染。在一些實施方案中，病毒感染是由黃病毒科病毒引起。在一些實施方案中，黃病毒科病毒選自黃熱病病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易腦炎病毒(st.louisencephalitisvirus)及丙型肝炎病毒。在其它實施方案中，病毒感染是由小核糖核酸病毒科的病毒引起，例如脊髓灰質炎病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus)。在其它實施方案中，病毒感染是由正粘病毒科的成員引起，例如流感病毒。在其它實施方案中，病毒感染是由逆轉錄病毒科的成員引起，例如慢病毒。在其它實施方案中，病毒感染是由副粘病毒科的成員引起，例如呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒屬(例如腮腺炎病毒)、麻疹病毒及人偏肺病毒。在其它實施方案中，病毒感染是由布尼亞病毒科(bunyaviridae)的成員引起，例如漢坦病毒(hantavirus)。在其它實施方案中，病毒感染是由呼腸孤病毒科(reoviridae)的成員引起，例如輪狀病毒。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供治療寄生蟲感染，如原生動物或蠕蟲感染的方法。在一些實施方案中，寄生蟲感染是原生動物寄生蟲感染。在一些實施方案中，oritiziab寄生蟲選自腸道原生動物、組織原生動物或血內(nèi)原生動物。說明性原生動物寄生蟲包括但不限于痢疾阿米巴(entamoebahystolytica)、腸蘭伯式鞭毛蟲(giardialamblia)、鼠隱孢子蟲(cryptosporidiummuris)、岡比亞錐蟲(trypanosomatidagambiense)、羅得西亞錐蟲(trypanosomatidarhodesiense)、嬰兒錐蟲(trypanosomatidacrusi)、墨西哥利什曼原蟲(leishmaniamexicana)、巴西利什曼原蟲(leishmaniabraziliensis)、熱帶利什曼原蟲(leishmaniatropica)、杜氏利什曼原蟲(leishmaniadonovani)、鼠弓形體(toxoplasmagondii)、間日瘧原蟲(plasmodiumvivax)、卵形瘧原蟲(plasmodiumovale)、三日瘧原蟲(plasmodiummalariae)、惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum)、陰道毛滴蟲(trichomonasvaginalis)及火雞組織滴蟲(histomonasmeleagridis)。在一些實施方案中，寄生蟲感染是由蠕蟲寄生蟲如線蟲(例如有腺綱)引起。在一些實施方案中，寄生蟲選自側尾腺口綱(secementea)(例如毛首鞭蟲(trichuristrichiura)、人蛔蟲(ascarislumbricoides)、蠕形住腸蟯蟲(enterobiusvermicularis)、十二指腸鉤蟲(ancylostomaduodenale)、美洲板口線蟲(necatoramericanus)、糞類圓線蟲(strongyloidesstercoralis)、班氏絲蟲(wuchereriabancrofti)、麥地那蟲(dracunculusmedinensis))。在一些實施方案中，寄生蟲選自吸蟲(例如血吸蟲、肝吸蟲、腸吸蟲及肺吸蟲)。在一些實施方案中，寄生蟲選自：曼氏血吸蟲(schistosomamansoni)、埃及血吸蟲(schistosomahaematobium)、日本裂體吸蟲(schistosomajaponicum)、肝片吸蟲(fasciolahepatica)、大片吸蟲(fasciolagigantica)、異形異形蟲(heterophyesheterophyes)、衛(wèi)氏并殖吸蟲(paragonimuswestermani)。在一些實施方案中，寄生蟲選自絳蟲(例如有鉤絳蟲(taeniasolium)、牛肉絳蟲(taeniasaginata)、短膜殼絳蟲(hymenolepisnana)及細粒棘球絳蟲(echinococcusgranulosus))。

在各種實施方案中，本發(fā)明提供治療細菌感染的方法。在各種實施方案中，細菌感染是革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、需氧和/或厭氧菌的感染。在各種實施方案中，細菌選自但不限于葡萄球菌屬(staphylococcus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、鏈球菌屬(streptococcus)、八疊球菌屬(sarcina)、埃希氏桿菌屬(escherichia)、腸桿菌屬(enterobacter)、克雷伯氏桿菌屬(klebsiella)、假單胞菌屬(pseudomonas)、不動桿菌屬(acinetobacter)、分枝桿菌屬(mycobacterium)、變形桿菌屬(proteus)、彎曲桿菌屬(campylobacter)、檸檬酸桿菌屬(citrobacter)、奈瑟氏菌屬(nisseria)、芽孢桿菌屬(baccillus)、擬桿菌屬(bacteroides)、消化球菌屬(peptococcus)、梭狀芽胞桿菌屬(clostridium)、沙門氏菌屬(salmonella)、志賀氏菌屬(shigella)、沙雷氏菌屬(serratia)、嗜血桿菌屬(haemophilus)、布魯氏桿菌屬(brucella)及其它生物體。在一些實施方案中，所述細菌選自但不限于綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、熒光極毛桿菌(pseudomonasfluorescens)、食酸假單胞菌(pseudomonasacidovorans)、產(chǎn)堿假單胞菌(pseudomonasalcaligenes)、惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、洋蔥伯克霍爾德菌(burkholderiacepacia)、親水產(chǎn)氣單孢菌(aeromonashydrophilia)、大腸桿菌(escherichiacoli)、弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)、副傷寒沙門氏菌(salmonellaparatyphi)、腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritidis)、痢疾桿菌(shigelladysenteriae)、福氏痢疾桿菌(shigellaflexneri)、宋內(nèi)氏痢疾桿菌(shigellasonnei)、陰溝腸桿菌(enterobactercloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)、肺炎桿菌(klebsiellapneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、粘質沙雷氏菌(serratiamarcescens)、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、摩氏摩根菌(morganellamorganii)、奇異變形桿菌(proteusmirabilis)、普通變形桿菌(proteusvulgaris)、產(chǎn)堿普羅威登斯菌(providenciaalcalifaciens)、雷氏普羅威登斯菌(providenciarettgeri)、斯氏普羅威登斯菌(providenciastuartii)、鮑氏不動桿菌(acinetobacterbaumannii)、醋酸鈣不動桿菌(acinetobactercalcoaceticus)、溶血不動桿菌(acinetobacterhaemolyticus)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶爾森菌(yersiniapestis)、假結核耶爾森菌(yersiniapseudotuberculosis)、中間耶爾森菌(yersiniaintermedia)、百日咳桿菌(bordetellapertussis)、副百日咳博代桿菌(bordetellaparapertussis)、支氣管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血桿菌(haemophilusparainfluenzae)、溶血嗜血桿菌(haemophilushaemolyticus)、副溶血嗜血桿菌(haemophilusparahaemolyticus)、杜克雷嗜血桿菌(haemophilusducreyi)、多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)、溶血巴斯德菌(pasteurellahaemolytica)、粘膜炎布蘭漢球菌(branhamellacatarrhalis)、幽門螺桿菌(helicobacterpylori)、胎兒彎曲桿菌(campylobacterfetus)、空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)、大腸彎曲桿菌(campylobactercoli)、伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、嗜肺軍團菌(legionellapneumophila)、單核細胞增多性李氏桿菌(listeriamonocytogenes)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、金氏菌屬(kingella)、莫拉氏菌屬(moraxella)、陰道加德菌(gardnerellavaginalis)、脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)、狄氏擬桿菌(bacteroidesdistasonis)、擬桿菌屬(bacteroides)3452a同源性組、普通擬桿菌(bacteroidesvulgatus)、卵形擬桿菌(bacteroidesovalus)、多形擬桿菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、單形擬桿菌(bacteroidesuniformis)、埃氏擬桿菌(bacteroideseggerthii)、內(nèi)臟擬桿菌(bacteroidessplanchnicus)、艱難梭菌(clostridiumdifficile)、結核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、鳥分枝桿菌(mycobacteriumavium)、胞內(nèi)分枝桿菌(mycobacteriumintracellulare)、麻風分枝桿菌(mycobacteriumleprae)、白喉棒桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)、潰瘍棒狀桿菌(corynebacteriumulcerans)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、中間葡萄球菌(staphylococcusintermedius)、豬葡萄球菌豬亞種(staphylococcushyicussubsp.hyicus)、溶血葡萄球菌(staphylococcushaemolyticus)、人型葡萄球菌(staphylococcushominis)或解糖葡萄球菌(staphylococcussaccharolyticus)。可將有待施用的表達載體、細胞或顆?；旌?，膠囊化，與其它分子、分子結構、或化合物(例如像脂質體、受體或細胞靶分子)的混合物、或用于幫助攝取、分布和/或吸收的口服、局部或其它制劑綴合或另外締合。在一些情況下，表達載體可包含在向受試者施用的細胞內(nèi)或包含在病毒或病毒樣顆粒內(nèi)。有待施用的載體、細胞或顆粒可與藥學上可接受的載體組合。

本文件因此還提供含有以下的組合物：編碼如本文所述的分泌的gp96-ig融合多肽和t細胞共刺激融合多肽的載體或含有所述載體的腫瘤細胞或病毒顆粒、以及生理學和藥學上可接受的載體。生理學和藥學上可接受的載體可包括適用于免疫的任何公知組分。載體可促進或增強針對疫苗中所施用的抗原的免疫應答。細胞制劑可含有緩沖劑以維持優(yōu)選的ph范圍、組合物中將抗原呈遞給個體的鹽或其它組分，所述組合物刺激針對抗原的免疫應答。生理學上可接受的載體還可含有一種或多種增強對抗原的免疫應答的佐劑。藥學上可接受的載體包括例如藥學上可接受的溶劑、助懸劑或用于將化合物遞送給受試者的任何其它藥理學惰性媒介物。藥學上可接受的載體可為液體或固體，并且在聯(lián)合特定藥物組合物的一種或多種治療性化合物和任何其它組分時，可以根據(jù)計劃的施用方式來進行選擇從而提供期望的體積、稠度、和其它相關運輸和化學特性。典型的藥學上可接受的載體包括但不限于：水、鹽水溶液、粘合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖或葡萄糖及其它糖、明膠或硫酸鈣)、潤滑劑(例如淀粉、聚乙二醇或乙酸鈉)、崩解劑(例如淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)以及潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。組合物可被配制用于皮下、肌內(nèi)或皮內(nèi)施用、或以可為免疫所接受的任何方式。

佐劑是指當添加到免疫原性劑如表達分泌的疫苗蛋白(例如gp96-ig)和t細胞共刺激融合多肽的腫瘤細胞中時非特異性地增強或強化在暴露于所述混合物后的接受者宿主中對藥劑的免疫應答的物質。佐劑可包括例如水包油乳液、油包水乳液、明礬(鋁鹽)、脂質體和微顆粒，如聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷。

佐劑還可包括例如角鯊烯混合物(saf-i)、胞壁酰肽、皂角苷衍生物、分枝桿菌細胞壁制劑、單磷?；|a、霉菌酸衍生物、非離子型嵌段共聚物表面活性劑、quila、霍亂毒素b亞單位、聚磷腈及衍生物、以及如由takahashi等人,nature1990,344:873-875所述的免疫刺激復合物(iscom)。對于獸醫(yī)用途及抗體在動物中的產(chǎn)生，可使用弗氏佐劑(freund'sadjuvant)(完全和不完全)的促有絲分裂組分。在人中，弗氏不完全佐劑(ifa)是有用的佐劑。各種適當?shù)淖魟┦潜绢I域中公知的(參見，例如warren和chedid,crccriticalreviewsinimmunology1988,8:83；及allison和byars,在vaccines:newapproachestoimmunologicalproblems,1992,ellis編著,butterworth-heinemann,boston)。額外的佐劑包括例如卡介苗(bcg)、detox(含有草分枝桿菌(mycobacteriumphlei)的細胞壁支架(cws)及來自明尼蘇達沙門氏菌(salmonellaminnesota)的單磷酰脂質a(mpl))等等(參見，例如hoover等人,jclinoncol1993,11:390；及woodlock等人,jimmunother1999,22:251-259)。

在一些實施方案中，載體可向受試者施用一次或多次(例如，一次、兩次、兩次至四次、三次至五次、五次至八次、六次至十次、八次至12次、或12次以上)。本文所提供的載體可每天施用一次或多次、每周一次或多次、每隔一周一次、每月一次或多次、每兩至三個月一次、每三至六個月一次或每六至12個月一次。載體可經(jīng)任何合適的時間段施用，如從約1天至約12個月的時期。在一些實施方案中，舉例來說，施用期可為約1天至90天；約1天至60天；約1天至30天；約1天至20天；約1天至10天；約1天至7天。在一些實施方案中，施用期可為約1周至50周；約1周至50周；約1周至40周；約1周至30周；約1周至24周；約1周至20周；約1周至16周；約1周至12周；約1周至8周；約1周至4周；約1周至3周；約1周至2周；約2周至3周；約2周至4周；約2周至6周；約2周至8周；約3周至8周；約3周至12周；或約4周至20周。

在一些實施方案中，在已經(jīng)施用初始劑量(有時稱為“致敏”劑量)的載體并且已經(jīng)實現(xiàn)最大抗原特異性免疫應答之后，可施用一個或多個加強劑量的本文所提供的載體。舉例來說，加強劑量可在致敏劑量之后約10至30天、約15至35天、約20至40天、約25至45天、或約30至50天施用。

在一些實施方案中，本文所提供的方法可用于控制實體腫瘤生長(例如，乳腺、前列腺、黑色素瘤、腎、結腸或子宮頸腫瘤生長)和/或轉移。所述方法可包括向有此需要的受試者施用有效量的如本文所述的表達載體。在一些實施方案中，所述受試者為哺乳動物(例如人)。

本文所提供的載體和方法可適用于刺激針對腫瘤的免疫應答。這種免疫應答適用于治療或減輕與腫瘤有關的體征或癥狀。如本文所用，“治療”意指與未受治療的個體的癥狀相比減輕、預防和/或逆轉本文所述的載體已施用于的個體的癥狀。專業(yè)人員應了解，根據(jù)熟練的專業(yè)人員(醫(yī)生或獸醫(yī))的連續(xù)臨床評價來確定后續(xù)的治療，使用本文所述的方法。這樣的評價會輔助和告知評價是否增加、減少或繼續(xù)特定的治療劑量、施用模式等。

本文所提供的方法因此可用于治療腫瘤，包括例如癌癥。所述方法可用于例如通過防止腫瘤進一步生長、通過減緩腫瘤生長或通過引起腫瘤消退來抑制腫瘤生長。因此，所述方法可用于例如治療癌癥，如肺癌。應當理解，化合物所施用于的受試者不一定患有具體的創(chuàng)傷狀態(tài)。實際上，本文所述的載體可在癥狀出現(xiàn)之前(例如，從癌癥中緩解的患者)預防性地施用。術語“治療性的”和“治療上地”及這些術語的替代用詞用于包括治療、減輕及預防性使用。因此，如本文所用，“治療或減輕癥狀”意指與未接受這種施用的個體的癥狀相比減輕、預防和/或逆轉治療有效量的組合物已施用于的個體的癥狀。

如本文所用，術語“有效量”和“治療有效量”是指足以在受試者(例如，診斷為患有癌癥或感染的人)中提供所需治療(例如，抗癌、抗腫瘤或抗感染)效果的量。抗腫瘤和抗癌效果包括但不限于腫瘤生長(例如，腫瘤生長延遲)、腫瘤大小或轉移的調(diào)節(jié)；與具體抗癌劑有關的毒性和副作用的減?。话┌Y的臨床損害或癥狀的改善或減至最少；延長受試者的存活超過在這種治療不存在下另外所預期的；以及預防施用之前沒有腫瘤形成的動物中的腫瘤生長，即預防性施用。在一些實施方案中，有效量的載體或含有載體的組合物、細胞或病毒顆粒的施用可增強受試者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖。舉例來說，受試者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖與施用之前受試者中腫瘤抗原特異性t細胞的活化或增殖水平相比可提高了至少10％(例如，至少25％、至少50％或至少75％)。

抗感染效果包括例如感染因子(例如，病毒或細菌)數(shù)量的減少。當有待治療的受試者中的臨床病狀為感染時，如本文所提供的載體的施用可刺激受試者中致病性抗原特異性t細胞的活化或增殖。例如，載體的施用可造成受試者中抗原特異性t細胞的活化水平大于由單獨gp96-ig接種所實現(xiàn)的水平。

本領域技術人員應理解，載體的有效量可通過以下方式減少或增加：精調(diào)和/或施用一個以上劑量(例如，通過伴隨施用含有載體的兩種不同的遺傳修飾的腫瘤細胞)或施用載體與另一種藥劑(例如，pd-1的拮抗劑)以增強治療效果(例如協(xié)同地)。因此，本文件提供了一種特定于給定哺乳動物的具體緊急需要而改變施用/治療的方法。治療有效量可通過例如由相對較低的量開始并且根據(jù)有益效果的同時評價使用逐步增量來確定。本文所提供的方法因此可單獨或與其它公知的腫瘤療法組合使用以治療患有腫瘤的患者。本領域技術人員容易理解，本文所提供的載體和方法在例如延長癌癥患者的預期壽命和/或改善癌癥患者(例如，肺癌患者)的生活品質中的有利使用。

組合療法和綴合

在一些實施方案中，本發(fā)明提供進一步包括向受試者施用額外藥劑的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及共施用和/或共配制。

在一些實施方案中，疫苗蛋白(例如gp96-ig)和一種或多種共刺激分子當與另一種藥劑共施用并且以比當這種藥劑用作單一療法時通常采用的劑量低的劑量施用時協(xié)同地起作用。

在一些實施方案中，包括但不限于癌癥應用，本發(fā)明涉及化療劑作為額外的藥劑。化療劑的實例包括但不限于烷化劑，如硫替派和cytoxan環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，如白消安、英丙舒凡及保釋芬；氮丙啶，如苯并多巴、卡波醌、邁托多巴及脲多巴；乙撐亞胺(ethylenimines)和甲基安美拉胺，包括六甲蜜胺、不孕津、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三羥甲基三聚氰胺；多聚乙酰(例如布拉他辛和布拉他辛酮)；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚抑素；卡莉他?。籧c-1065(包括其阿多來新、卡折來新及比折來新合成類似物)；隱藻素(例如隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他??；倍癌霉素(包括合成類似物、kw-2189及cb1-tm1)；伊璐霉素；水鬼蕉堿；肉質網(wǎng)素；軟海綿素；氮芥類，如氮芥苯丁酸、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興、膽固醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲類，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀及雷莫司??；抗生素，如烯二炔類抗生素(例如，卡里奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γll和卡里奇霉素ωll(參見，例如agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186(1994))；達內(nèi)霉素，包括達內(nèi)霉素a；二膦酸鹽，如氯膦酸鹽；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素發(fā)色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放線菌素、胺茴霉素(authramycin)、重氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c、卡拉星(carabicin)、洋紅霉素(caminomycin)、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、adriamycin阿霉素(包括嗎啉代阿霉素、氰基嗎啉代阿霉素、2-吡咯啉并-阿霉素及脫氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素、絲裂霉素如絲裂霉素c、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲霉素、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，如二甲睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；阿莫司汀；比生群；依達曲沙；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋銨；埃博霉素；乙環(huán)氧啶；硝酸鎵；羥基脲；蘑菇多糖；氯尼達明(lonidainine)；美登木素生物堿，如美登素和美登木素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；噴司他?。坏鞍钡?；吡柔比星；洛索蒽醌；足葉草酸；2-乙酰肼；甲基芐肼；psk多糖復合物(jhsnaturalproducts,eugene,oreg.)；丙亞胺；利索新；西佐呋喃(sizofuran)；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯族毒素(例如，t-2毒素、疣孢菌素a(verracurina)、桿孢菌素a及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；長春地辛；氮烯唑胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；雙溴丙基哌嗪；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；環(huán)磷酸酰胺；硫替派；紫杉烷類，例如taxol紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)、不含cremophor的abraxane、紫杉醇的白蛋白工程化納米顆粒制劑(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,111.)、及taxotere多西他賽(rhone-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥；gemzar吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑類似物，如順鉑、奧沙利鉑及卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(vp-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；navelbine長春瑞濱；米托蒽醌；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；卡培他濱；伊班膦酸鹽；依立替康(camptosar，cpt-11)(包括依立替康與5-fu和甲酰四氫葉酸的治療方案)；拓撲異構酶抑制劑rfs2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃醇，如視黃酸；卡培他濱；康普瑞?。患柞Ｋ臍淙~酸(lv)；奧沙利鉑，包括奧沙利鉑治療方案(folfox)；拉帕替尼(tykerb)；減少細胞增殖的pkc-α、raf、h-ras、egfr(例如，埃羅替尼(tarceva))及vegf-a的抑制劑以及以上任一者的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。另外，治療方法可進一步包括放射線的使用。另外，治療方法可進一步包括光動力學療法的使用。

在一些實施方案中，包括但不限于感染性疾病應用，本發(fā)明涉及抗感染藥作為額外的藥劑。在一些實施方案中，抗感染藥為抗病毒劑，包括但不限于阿巴卡韋、阿昔洛韋、阿德福韋、安普那韋、阿扎那韋、西多福韋、地瑞納韋、地拉韋啶、去羥肌苷、二十二醇、依法韋侖、艾特格韋、恩曲他濱、恩夫韋地、依曲韋林、泛昔洛韋及膦甲酸。在一些實施方案中，抗感染藥為抗細菌劑，包括但不限于頭孢菌素類抗生素(頭孢氨芐、頭孢氨呋肟、頭孢羥氨芐、頭孢唑啉、頭孢金素、頭孢克洛、頭孢羥唑、頭孢噻吩、頭孢丙烯及頭孢比普)；氟喹諾酮類抗生素(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星及諾氟沙星)；四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素、米諾環(huán)素、土霉素及強力霉素)；青霉素類抗生素(羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素v、雙氯青霉素、羧芐青霉素、萬古霉素及甲氧西林)；單環(huán)類抗生素(氨曲南)；以及碳青霉烯類抗生素(厄他培南、多利培南、亞胺培南/西司他丁、及美羅培南)。在一些實施方案中，抗感染藥包括抗瘧劑(例如，氯喹、奎寧、甲氟喹、伯氨喹、強力霉素、蒿甲醚/苯芴醇、阿托伐醌/氯胍及磺胺多辛/乙胺嘧啶)、甲硝噠唑、磺甲硝咪唑、雙氫除蟲菌素、雙羥萘酸喹嘧啶及丙硫咪唑。

其它額外的藥劑在本文中別處描述，包括靶向免疫“檢查點”分子的封閉性抗體。

受試者和/或動物

本文所述的方法旨在與可受益于這些方法的任何受試者一起使用。因此，“受試者”、“患者”及“個體”(可互換使用)包括人以及非人受試者，特別是馴養(yǎng)動物。

在一些實施方案中，受試者和/或動物為哺乳動物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、母牛、豬、兔、綿羊或非人靈長類動物，如猴子、黑猩猩或狒狒。在其它實施方案中，受試者和/或動物為非哺乳動物，例如像斑馬魚。在一些實施方案中，受試者和/或動物可包含熒光標記的細胞(用例如gfp)。在一些實施方案中，受試者和/或動物為包含熒光細胞的轉基因動物。

在一些實施方案中，受試者和/或動物為人。在一些實施方案中，所述人為兒童。在其它實施方案中，所述人為成年人。在其它實施方案中，所述人為老年人。在其它實施方案中，人可被稱為患者。

在某些實施方案中，人具有在以下范圍內(nèi)的年齡：約0個月至約6個月大、約6至約12個月大、約6至約18個月大、約18至約36個月大、約1至約5歲大、約5至約10歲大、約10至約15歲大、約15至約20歲大、約20至約25歲大、約25至約30歲大、約30至約35歲大、約35至約40歲大、約40至約45歲大、約45至約50歲大、約50至約55歲大、約55至約60歲大、約60至約65歲大、約65至約70歲大、約70至約75歲大、約75至約80歲大、約80至約85歲大、約85至約90歲大、約90至約95歲大或約95至約100歲大。

在其它實施方案中，受試者為非人動物，且因此本發(fā)明涉及獸醫(yī)用途。在一個具體實施方案中，非人動物為家庭寵物。在另一具體實施方案中，非人動物為家畜動物。在某些實施方案中，受試者為不能接受化療的人癌癥患者，例如，對化療無反應或者病得太重以致于沒有化療適合的治療窗(例如，經(jīng)歷了太多的劑量或方案限制性副作用)的患者。在某些實施方案中，受試者為患有晚期和/或轉移性疾病的人癌癥患者。

如本文所用，“同種異體細胞”是指非源于細胞所施用于的個體的細胞，即，具有與個體不同的遺傳成分。同種異體細胞一般是獲自與細胞所施用于的個體相同的物種。舉例來說，同種異體細胞可為人細胞，如本文所公開用于向人患者如癌癥患者施用。如本文所用，“同種異體腫瘤細胞”是指非源于同種異體細胞所施用于的個體的腫瘤細胞。通常，同種異體腫瘤細胞表達一種或多種腫瘤抗原，所述腫瘤抗原可在細胞所施用于的個體中刺激針對腫瘤的免疫應答。如本文所用，“同種異體癌細胞”(例如肺癌細胞)是指非源于同種異體細胞所施用于的個體的癌細胞。

如本文所用，“經(jīng)遺傳修飾的細胞”是指已經(jīng)例如通過轉染或轉導進行了遺傳修飾以表達外源性核酸的細胞。

除非另外定義，否則本文中使用的技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解的含義。

如本文所用，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“所述”具體地也包括它們所指的術語的復數(shù)形式，除非上下文另有清楚的說明。如本文所用，除非另有特別說明，詞語“或”是以“和/或”的“包含”含義使用，而非“不是/就是”的“排除”含義。除非上下文另外清楚指出，在說明書和所附權利要求書中，單數(shù)形式包括復數(shù)指示物。

術語“約”在本文中用于意指大約、左右、大致或近似。當術語“約”與數(shù)值范圍聯(lián)合使用時，它通過將邊界擴展到所述數(shù)值以上和以下來修飾該范圍。通常而言，術語“約”在本文中用于以20％的差異在所示數(shù)值之上和之下改變數(shù)值。如本說明書中所使用，無論是在過渡性短語還是在權利要求內(nèi)容中的術語“包括”和“含有”應被理解為具有開放式含義。也就是說，該術語應當理解為與短語“至少具有”或“至少包括”同義。當在方法的上下文中使用時，術語“包括”意指該方法至少包括所述步驟，但還可以包括其它步驟。當在化合物或組合物的上下文中使用時，術語“包括”意指該化合物或組合物至少包括所述特征或組分，但還可以包括其它特征或組分。

本發(fā)明將在以下實施例中進一步描述，這些實施例不限制權利要求書中所述的本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1–摻入了gp96-ig和t細胞共刺激融合蛋白的載體工程化免疫療法引發(fā)優(yōu)良的抗原特異性cd8+t細胞應答

基于分泌型熱休克蛋白gp96-ig的同種異體細胞疫苗可通過體內(nèi)抗原交叉致敏實現(xiàn)針對飛摩爾濃度的腫瘤抗原的高頻多克隆cd8+t細胞應答。確定的腫瘤所引出的多重免疫抑制機制可削弱此疫苗方法的活性。如下所述，在長期確定的b16-f10黑色素瘤小鼠模型中pd-1、pd-l1、ctla-4及l(fā)ag-3封閉性抗體的系統(tǒng)比較顯示與其它檢查點相比gp96-ig接種與pd-1阻斷之間的優(yōu)良組合。使用ox40、icos或4-1bb激動劑的gp96-ig接種、pd-1阻斷與t細胞共刺激的三重組合提供協(xié)同的抗腫瘤益處。

將gp96-ig表達載體再工程化以便同時共表達icosl-ig、4-1bbl-ig或ox40l-ig，由此在無需其它抗體療法的情況下提供共刺激益處。如下所述，gp96-ig與這些共刺激融合蛋白在同種異體細胞系中的共分泌導致抗原特異性cd8+t細胞的活化增強。因此，組合免疫療法可通過載體再工程化以避免對疫苗/抗體/融合蛋白方案的需要來實現(xiàn)，且重要的是，可限制療法的成本及全身毒性的風險兩者。

實施例2–疫苗+共刺激物載體再工程化

載體再工程化策略用于將疫苗和t細胞共刺激融合蛋白摻入到單一載體中。具體來說，將原始gp96-ig載體再工程化以產(chǎn)生基于細胞的組合io產(chǎn)物，其分泌gp96-ig融合蛋白和各種t細胞共刺激融合蛋白兩者(圖1和2)。疫苗和共刺激融合蛋白的組合局部分泌(圖3)可活化腫瘤抗原特異性t細胞，并且預期在限制的成本和全身毒性下增強抗原特異性免疫，特別是當與施用抑制由腫瘤細胞產(chǎn)生的免疫抑制性分子的藥劑(例如，針對pd-1的抗體)組合時。

實施例3–impact相對于compact的體內(nèi)研究

材料和方法

細胞培養(yǎng)和疫苗細胞系生成：在37℃下，在5％co2中將3t3細胞維持在具有谷氨酰胺和10％牛生長血清(bgs)的imdm中。根據(jù)制造商說明書，使用編碼雞卵清蛋白(ova)的潮霉素抗性質粒骨架pcdna3.1，通過用4d-nucleofectortm和細胞系nucleofectortm試劑盒se(lonza)核轉染建立3t3-卵清蛋白-hygro親代細胞系。分泌高水平ova的單細胞克隆是通過elisa進行篩選并且用于通過分別編碼鼠科gp96-ig或gp96-ig及ox40l-fc的細胞外結構域的g418抗性質粒pb45的核轉染產(chǎn)生3t3-ova-gp96-ig(impact)和3t3-ova-gp96-ig/ox40l-fc(compact)。再次，通過抗生素選擇產(chǎn)生impact和compact的單細胞克隆并且進一步篩選分泌相似水平的小鼠igg的克隆并用于后續(xù)分析。通過qrt-pcr證實ox40lmrna表達并且經(jīng)由蛋白質印跡評價蛋白質水平。

在37℃下，在5％co2中將ct26細胞維持在具有谷氨酰胺和10％胎牛血清的imdm中。使用如上相同的表達質粒產(chǎn)生ct26形式的impact(ct26-gp96-ig)和compact(ct26-gp96-ig/ox40l-fc)，而根據(jù)制造商說明書，使用轉染試劑(qiagen)轉染到ct26細胞系中。在抗生素選擇下分離單細胞克隆并且通過elisa針對小鼠igg分泌進行篩選。通過qrt-pcr證實ox40lmrna表達。

首先通過產(chǎn)生ova親代克隆(b16.f10-ova：如上對于3t3細胞所述)建立b16.f10細胞系。然后，用如上所述的相同質粒再次轉染b16.f10-ova形式的impact(b16.f10-ova-gp96-ig)和compact(b16.f10-ova-gp96-ig/fc-ox40l)，并且針對高水平的gp96-ig分泌進行選擇。

小鼠模型、ot-i/ot-ii轉移及分析：將抗原特異性cd8t細胞從攜帶t細胞受體轉基因tcrα-v2和tcrβ-v5的ot-i/egfp小鼠的脾臟中分離，這些轉基因在h2k^bmhci類抗原交叉呈遞期間識別卵清蛋白殘基257-264。將抗原特異性cd4t細胞從表達小鼠α-和β-鏈t細胞受體的ot-ii小鼠的脾臟中分離，這些t細胞受體在i-a^bmhcii類抗原交叉呈遞期間與cd4共受體互補并且對雞卵清蛋白殘基323-339有特異性。

簡言之，通過co2窒息，接著頸椎脫位將小鼠處死，并且將脾臟切入無菌pbs+2mmedta中。將脾細胞從組織上分離并通過100μm過濾器。將細胞在1,200rpm下沉淀5分鐘，并且通過添加5ml1xack溶解緩沖劑(150mmnh4cl、10mmkhco3及1mmedta)在室溫下溶解紅細胞1-2分鐘。溶解之后，添加等體積的1xpbs并且在1,200rpm下再次沉淀細胞5分鐘。根據(jù)制造商說明書，使用來自stemcelltechnologies的cd4和cd8分離試劑盒從總脾細胞中分離ot-i(cd8)和ot-ii(cd4)。經(jīng)由靜脈內(nèi)(iv)尾靜脈注射將ot-i(0.5x10⁶個細胞/小鼠)和ot-ii(1x10⁶個細胞/小鼠)轉移到foxp3-rfp轉基因小鼠中(以追蹤調(diào)節(jié)性t細胞：treg)。iv注射日對應于實驗第-1天。

在第0天和第35天(在加強小鼠的情況下)，小鼠是未經(jīng)處理的，用3t3-ova親代克隆接種作為對照，用impact(單獨或與100μg針對icos的激動劑抗體(biolegend#313512)組合)、4-1bb(3h3抗體，bio-x-cell)或ox40(ox86抗體，bio-x-cell)接種，或者用compact接種。接種是由1x10⁶個細胞組成并且通過腹膜內(nèi)注射(ip)施用。在整個時程期間通過流式細胞術分析從外周血收獲的淋巴細胞。

ct26腫瘤模型和分析：對于ct26腫瘤研究，經(jīng)由皮下注射到后側腹中用2x10⁵或5x10⁵個腫瘤細胞接種balb/c小鼠，表示第0天。對于b16.f10-ova研究，將5x10⁵個腫瘤細胞接種到c57bl/6小鼠的后側腹中，表示第0天。在接種日，攜帶腫瘤的小鼠是未經(jīng)處理的或用絲裂霉素-c(sigma)處理過的impact、impact+100mg抗-ox86(通篇稱為ox40(ab))或compact細胞接種。在時程期間評價腫瘤面積(mm²)和總體存活率。30天的存活標準包括小于175mm²的總腫瘤面積，而沒有腫瘤潰瘍體征。完全反應者列在圖12圖d和圖11圖e中，其中建立腫瘤且隨后在治療之后被排除。在腫瘤接種之后11天處死用2x10⁵個細胞接種的一組小鼠。將腫瘤從這些小鼠上切除，在37℃下胰蛋白酶化10分鐘，分離，并且通過100μm細胞過濾器。將細胞沉淀，將紅細胞溶解(如上所述)，并且將rna分離，逆轉錄，并且通過qpcr分析(參見下文)。在第12天對一組ct26實驗小鼠施以安樂死以用于在脾細胞中的ah1-四聚體分析及腫瘤組織的遺傳分析。將腫瘤從這些小鼠上切除，在37℃下胰蛋白酶化10-15分鐘，分離，并且通過100mm過濾器勻漿。將細胞沉淀并加工用于rna分離(參見下文)。

流式細胞術：在sonysh800上進行流式細胞術和細胞分選。對于細胞外染色，將細胞沉淀再懸浮于含有1％牛血清白蛋白(bsa)、0.02％疊氮化鈉、及2mmedta、及適當抗體的1xpbs緩沖液中并且在黑暗中在冰上孵育30分鐘。然后將細胞于流式細胞術緩沖液中洗滌，再懸浮，接著分析。對于細胞內(nèi)染色，將細胞固定并使用來自biolegend的foxp3fix/perm試劑盒透化，如上所述進行染色，在流式細胞術緩沖液中洗滌，再懸浮，接著分析。所用抗體為pe/cy7-cd4(sony,1102640)、af700-cd8a(sony,1103650)、apc-tcrvβ5.1,5.2(sony,1297530)、pacificblue-tcrvα2(sony,1239080)、apc-klrg1(biolegend,138412)、bv421-cd44(biolegend,103039)、bv605-cd127(biolegend,135025)、apc-ki67(biolegend,652406)、pe/cy7-ifnγ(biolegend,505826)及bv421-il2(biolegend,503825)。

elisa：設定標準elisa條件以便將1x10⁶個細胞鋪板在1ml培養(yǎng)基中并且在24小時之后分析上清液。將高結合elisa板在碳酸氫鈉緩沖液中用10μg/ml小鼠igg(jacksonlaboratories#115-005-062)包被。將包被的板在4℃下孵育過夜。次日清晨，將板用tbs-t(50mmtris、150mmnacl及0.05％tween20)洗滌3次，用酪蛋白封閉緩沖液(sigma)封閉1小時，并再次用tbs-t洗滌3次。向板中，將50μl細胞上清液以及11點小鼠igg標準樣品組添加到包被的elisa板中并且在室溫下孵育1小時。用tbs-t洗滌板3次并添加50μl檢測抗體(jacksonlaboratories#115-035-071)，并且在黑暗中，在室溫下孵育1小時。將板用tbs-t洗滌3次并將100μl的sureblue^tmtmb微孔過氧化物酶底物(kpl)添加到每個孔中并且允許在黑暗中在室溫下孵育20分鐘。為了終止反應，將100μl硫酸添加到每個孔中并且在biotek板讀數(shù)器上立即對板進行讀取。在多次稀釋下至少一式三份運行樣品。

rna分離和qrt-pcr：根據(jù)制造商推薦，使用rneasy和rneasymicro試劑盒(qiagen)制備總rna，包括柱上dna酶處理。將總共1μg(使用rneasy)或100ng(使用rneasymicro)用于以來自origene的第一鏈cdna合成試劑盒合成cdna。使用kapasybrfast、sybrgreenmastermix(kapabiosystems)進行qpcr，接著在rochelightcycler上分析。將值針對18smrna標準化并且表示平均值±平均標準誤差(sem)，針對最少3個生物重復，所有都一式三份運行。所用的引物序列為：

ifn-γ：f:5’-ctgccacggcacagtcattg-3’(seqidno:14)

r:5’-gccagttcctccagatatcc-3’(seqidno:15)

tnf-α：f:5’-ccacgctcttctgtctactg-3’(seqidno:16)

r:3’-gccatagaactgatgagaggg-3’(seqidno:17)

粒酶-bf:5’-ctactgctgaccttgtctctg-3’(seqidno:18)

r:3’-agtaaggccatgtagggtcg-3’(seqidno:19)

il-2f:5’-ctgcggcatgttctggatttgact-3’(seqidno:20)

r:5’-agtccaccacagttgctgactcat-3’(seqidno:21)

穿孔素f:5’-gacacagtagagtgtcgcatg-3’(seqid-1no:22)

r:5’-aagcatgctctgtggagctg-3’(seqidno:23)

β-肌動f:5’-aaggccaaccgtgaaaagat-3’(seqidno:24)

蛋白

r:5’-gtggtacgaccagaggcatac3’(seqidno:25)

蛋白質印跡分析：用布雷菲德菌素-a處理impact和compact細胞16小時以抑制蛋白質轉運和分泌。然后在冰上將細胞溶解于含有1x完全蛋白酶抑制劑混合物(roche)的ripa緩沖液(25mmtris-hcl、150mmnacl、1％np-40、1％脫氧膽酸鈉及0.1％sds)中持續(xù)10分鐘。使用dc蛋白質測定試劑盒(bio-rad)測定蛋白質濃度并探測20μg蛋白質?？贵w為：cd252(ox40l，abcam#ab156285，1:1000稀釋)、組蛋白h3(activemotif#61278，1:10,000)、組蛋白h4(activemotif#61300，1:10,000)及β肌動蛋白(abcam#ab8226，1:10,000)。

legendplex細胞因子分析：通過co2窒息和頸椎脫位對實驗小鼠施以安樂死并且經(jīng)由心臟穿刺收集全血。在室溫下依靠重力使紅細胞沉降1小時并且在1,200rpm下沉淀剩余細胞5分鐘。然后將血清轉移到新的1.5mleppendorf管中。根據(jù)制造商推薦，使用legendplex^tm細胞因子分析試劑盒(biolegend)進行細胞因子分析并且在sonysh800上分析。

統(tǒng)計分析：在圖中示出了實驗重復(n)。除非另外指出，否則標繪值表示來自最少3個不同實驗的平均值并且誤差為sem。使用不成對的參數(shù)t檢驗與welch校正確定統(tǒng)計顯著性(p-值)。用星號(*)標記顯著的p-值，并且在每幅圖中標記相應的p-值。

結果

許多新試驗將探究添加治療性疫苗或t細胞共刺激抗體是否是一種增加反應患者的比例和提高臨床反應耐久性的有效策略。這種策略的實行受到若干因素的限制，包括不完全理解哪種藥劑可提供協(xié)同益處、這種組合的毒性是否可以耐受以及衛(wèi)生保健系統(tǒng)最終是如何管理這種組合的。

為了探究疫苗與個別t細胞共刺激分子之間的潛在協(xié)同作用，在臨床前小鼠模型中進行一系列頭對頭研究。使用表達修飾的分泌型gp96-ig融合蛋白的基于細胞的疫苗(圖4a)，進行研究以探明靶向ox40、4-1bb或icos的激動性抗體的共施用是否將提供抗原特異性cd8+t細胞的共刺激(圖5a-5c)。用3t3-ova-gp96-ig疫苗對用卵清蛋白特異性cd8+t細胞(ot-i)過繼轉移的c57bl/6小鼠的免疫造成ot-i細胞增殖為10％的外周血cd8+t細胞。此反應可通過另外施用ox40激動劑抗體而不是4-1bb或icos共刺激抗體而加倍(圖5d)。

經(jīng)2-5天過程，由抗原呈遞細胞通過空間限制的微環(huán)境中的局部炎癥觸發(fā)ox40l的t細胞共刺激。ox40受體激動劑抗體的施用提供可持續(xù)幾周的全身共刺激。由于疫苗通常局部施用，所以進行實驗以確定ox40l融合蛋白(fc-ox40l)是否可以在含有質粒的gp96-ig的第二盒中共表達作為限制全身共刺激并且能夠實現(xiàn)單一化合物的組合免疫療法的策略(圖6a)。作為概念驗證，生成3t3細胞，其共表達可溶性卵清蛋白和單獨gp96-ig(“impact”)或gp96-ig連同fc-ox40l、icosl或4-1bbl。這些細胞系經(jīng)穩(wěn)定選出以分泌相似量的ova和gp96-ig(圖7a和7b)。通過rt-pcr和蛋白質印跡評估fc-ox40l、icosl或4-1bbl的表達(圖7c和7d)，并且通過來自原代脾細胞的il-2分泌測定顯示在細胞培養(yǎng)上清液中有功能活性。

使用圖5中所述的ot-i模型，將impact單獨或與ox40激動劑抗體組合的體內(nèi)活性與compact相比較。不同的細胞系用于此實驗中，因為如上所述的共轉染在圖5中表達ova的新霉素抗性盒下是不可能的。由于compact是局部施用的，所以與全身施用的ox40激動劑抗體的impact組合相比可能無法預期顯著的致敏和加強效應。然而，如圖6b和6c所示，compact免疫在用impact單獨或與ox40激動劑抗體組合進行初次免疫之后提供ot-i細胞增殖的驚人和顯著改善。在compact下，外周血中的擴增峰在第5天升高，但更重要的是，第6-20天的應答持續(xù)時間也增加。

針對ox40激動性抗體與接種組合的記憶應答在抗原特異性cd8區(qū)室內(nèi)相對較弱。在初次免疫之后第35天，通過對小鼠進行再免疫來評估加強應答(圖6c)。盡管ox40激動劑抗體的組合提供ot-i應答的相對較弱加強，但compact處理的小鼠顯示幾乎匹配初次應答強度的加強應答(圖6c)。來自接受compact的小鼠的脾細胞和腹壁細胞的流式細胞分析揭示與其它組相比cd127⁺klrg1^-細胞的明顯增加，表明記憶前體細胞的增加(圖8b)。此效應在各種compacts下觀察到，包括compact(ox40l)、compact(icosl)及compact(4-1bbl)，而不是在ox40激動劑抗體治療下。各種compact不誘導短壽命的效應細胞的增加(cd127^-klrg1⁺，圖8b)，ox40激動劑抗體治療也是如此。然而，compact確實增加脾臟內(nèi)的記憶t細胞(cd127⁺klrg1⁺)(圖8b)。這些數(shù)據(jù)表明ox40l、icosl或4-1bbl激動劑融合蛋白的局部施用顯著地增強抗原特異性cd8區(qū)室中的初次和加強應答，這與致敏之后記憶前體細胞的增加和收縮期的延長有關。另外，這些數(shù)據(jù)還揭示與impact+/-ox40激動劑抗體相比compact處理的小鼠的新型和意想不到的作用機制。

在局部提供的ox40l下抗原特異性cd8區(qū)室中初次和加強應答增強的可能原因是在于通過全身施用ox40激動劑抗體所提供的脫靶活化的減弱。為了測試這一推論，在第8天從用impact+/-ox40激動劑抗體或compact免疫的小鼠中分離腹壁細胞、脾細胞及腫瘤引流淋巴結(tdln)細胞并且通過流式細胞術和定量rt-pcr(qrt-pcr)進行分析以區(qū)分脫靶免疫活化與抗原特異性應答。初次免疫之后第8天分離的腹壁細胞分析顯示在compact處理的小鼠中總單核、ot-i及ot-ii細胞數(shù)量的增加，而且在用ox40激動劑抗體處理的小鼠中總cd4細胞數(shù)量的增加(圖8a)。在用ox40激動劑抗體處理的小鼠的腹腔、脾臟及tdln中檢測到總cd4+細胞和foxp3+調(diào)節(jié)性t細胞(treg)水平的增加(圖8a和8e)。相比之下，compact處理的小鼠在無treg細胞的明顯刺激下特異性擴增抗原特異性ot-i(cd8+)和ot-ii(cd4+)細胞(圖8a和8e)。相似的發(fā)現(xiàn)還在脾臟和淋巴結中觀察到，表明總cd4細胞以及抗原特異性cd4細胞的全身擴增(圖9a和9b)。cd4+foxp3+調(diào)節(jié)性t細胞(treg)對于ox40激動劑也是增加的，但在compact處理的動物中沒有。血清細胞因子分析進一步顯示在用ox40激動劑抗體處理的小鼠中ifnγ、tnfα、il-5及il-6的全身增加(圖8c)。為了研究全身細胞因子增加的細胞來源，在免疫之后第8天在總cd8+細胞或ot-i細胞上進行rt-pcr。compact處理的小鼠顯示被分離到ot-i群中的ifnγ、tnfα及粒酶-b的增加，而用ox40激動劑抗體處理的小鼠顯示ot-i和總cd8群兩者的增加(圖8d)。

這些數(shù)據(jù)表明ox40l融合蛋白可通過穩(wěn)定轉染共表達基于熱休克蛋白gp96-ig的疫苗的質粒來局部提供。與是否分泌了濃度足以提供共刺激的fc-ox40l有關的初始可行性顯示這是可實現(xiàn)的，且令人驚訝地，比ox40激動劑抗體的全身施用更有效。共刺激的ot-i細胞產(chǎn)生與ox40抗體共刺激的ot-i細胞相等水平的效應細胞因子，且將預期發(fā)揮針對靶細胞的提高的細胞毒活性。

為了研究impact+/-ox40抗體相對于compact在鼠科腫瘤模型中的功能活性，用如圖7中針對3t3細胞所述的這些構建體穩(wěn)定轉染ct26細胞(圖10a-10c)。在一組實驗中，將小鼠在第0天用ct26細胞接種，然后在腫瘤接種后第6天和第11天用絲裂霉素c處理過的ct26細胞、ct26-gp96-ig、ct26-gp96-ig與ox40激動劑抗體或與ct26compact組合進行處理。在第二組實驗中，將小鼠在第0天用ct26細胞接種，然后在腫瘤接種后第4天、第7天和第10天用絲裂霉素c處理過的ct26細胞、ct26-impact、ct26-impact與ox40激動劑抗體或與ct26-compact細胞組合進行免疫(圖11a)。腫瘤接種后第12天分離的腫瘤組織的定量rt-pcr揭示在ox40激動劑抗體、impact、compact及impact+ox40激動劑抗體組合處理組中cd8a、il-2及ifnγ的表達增加，提示免疫細胞活化和腫瘤浸潤。如所預期，僅接受ox40激動劑抗體(單獨或連同impact一起)的小鼠顯示腫瘤內(nèi)cd4和foxp3表達的增加(圖11b)。如通過ah1-四聚體染色所檢測，ct26抗原特異性cd8+擴增與未處理組相比在impact+ox40抗體中顯著增加大約4倍且在compact處理的小鼠中增加大約5倍(圖11b)。與對照或單一療法組相比，腫瘤進展在接受impact+ox40激動劑或compact處理的小鼠中顯示出強烈地阻斷(圖11d)。與在b16.f10腫瘤模型中觀察到的相比，這造成了在compact處理的小鼠中長期存活的顯著增加及完全腫瘤排斥率的升高(圖11e，分別為80％和大約47％)。因此，compact產(chǎn)生有效的抗原特異性t細胞擴增和腫瘤浸潤、腫瘤生長的延遲及顯著的存活益處。

b16.f10小鼠黑色素瘤腫瘤模型為侵襲性腫瘤并且通常不能用ox40激動劑抗體有效地治療。為了在b16.f10腫瘤模型中評價基于gp96-ig的疫苗，生成b16.f10-ova細胞系。另外，隨后通過分別穩(wěn)定轉染gp96-ig和gp96-ig-fc-ox40l載體生成b16.f10-ova-impact和-compact疫苗。通過elisa證實從b16.f10-impact和-compact細胞系分泌相當水平的gp96-ig并且還通過qrt-pcr證實在b16.f10-ova-compact細胞系中的fc-ox40l表達。在b16.f10-ova腫瘤接種之前一天用ot-i細胞過繼轉移小鼠(表示第-1天，圖12a)。然后，在第4天、第7天及第10天用絲裂霉素c處理過的b16.f10-ova細胞、b16.f10-ova-impact、b16.f10-ova-impact與ox40激動劑抗體或與b16.f10-ova-compact的組合接種之后來研究小鼠中ot-i細胞的抗原特異性應答(圖12b)。與從3t3-ova模型系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)一致，b16.f10-ova-compact處理的小鼠在第10天與第19天(這對應于初始接種之后第6天至第15天)期間展現(xiàn)ot-i細胞的穩(wěn)健擴增，其大于在impact+/-ox40激動劑抗體下所觀察到的，收縮期的持久動力學與先前所觀察到的相似。因此，b16.f10-ova-compact接種的小鼠顯示比impact+/-ox40激動劑抗體接種更有效的抗腫瘤效應(圖12c)。在compact處理的小鼠中的長期存活率為大約78％，其中11％的小鼠表現(xiàn)出它們的侵襲性腫瘤的完全排斥。比較起來，impact單獨接種的小鼠和impact+ox40激動劑ab處理的小鼠分別顯示了50％和62.5％的總體存活率(圖12d)。

使用先前描述的免疫測定以及ot-i轉移測定探究另外的compact的功能活性。具體來說，通過流式細胞術經(jīng)46天在用以下處理的小鼠中分析ot-1/gfp細胞：無疫苗、僅ova對照細胞、compact(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)或compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)，其為compact-ox40l細胞系與compact-tl1a細胞系的混合物，其中在第0天初始接種且在第35天加強(圖13)。在用compact(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)或compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)處理的小鼠中，致敏和記憶應答都很強。在時程期間(～第7-20天)compact或compact²小鼠還驚人地保持升高的ot-1水平。另外，在第0天，用impact單獨或compact(gp96-ox40l、gp96-ig/4-1bbl或gp96-ig/icos-l)免疫c57bl/6小鼠(圖14)。結果表明與impact相比各種compacts增強oti細胞的增殖。

在ct26結腸直腸癌模型中進一步探究另外的compacts的體內(nèi)活性。具體來說，小鼠是未經(jīng)處理的或在第4天、第7天及第10天用ct26親代細胞、impact單獨、impact+tnfrsf25激動劑(4c12ab)、4c12(ab)單獨、pd-1(ab)單獨、4c12(ab)和pd-1(ab)、compact(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)、compact(gp96-ig/ox40l)+pd-1(ab)或compact²(gp96-ig/ox40l+tl1a)接種(圖15)。結果顯示compact治療單獨(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)和與pd-1組合顯著地減少腫瘤生長。如圖16所示，compact治療單獨(gp96-ig/ox40l或gp96-ig/tl1a)和與pd-1組合還顯著地增加小鼠存活。

測試compact在人癌細胞系中的表達。具體來說，將compact(gp96-ig/ox40l)轉染到人前列腺癌細胞系(例如pc-3)或人肺腺癌細胞系(例如ad100)中。分別參見圖17和18。結果表明兩種細胞系產(chǎn)生并且分泌ox40l。

總而言之，這些數(shù)據(jù)表明組合免疫療法可通過將多個互補模式(在此情況下是疫苗和t細胞共刺激融合蛋白)合并在單一化合物中來實現(xiàn)。由載體編碼的且細胞分泌的fc-ox40l提供t細胞共刺激是可行的，并且與ox40激動性抗體相比在致敏和加強之時都增強抗原特異性cd8+t細胞的增殖。由組合的疫苗和共刺激物活化的t細胞產(chǎn)生ifnγ、il-2、tnfα及粒酶-b，并且不伴有在ox40激動劑抗體下觀察到的脫靶t細胞增殖及全身炎性細胞因子增加。重要的是，此方法還增強確定的鼠科結腸癌模型中的治療性腫瘤免疫?？傊?，這些結果提供一種用于實施組合免疫療法的策略，其不能依賴二聯(lián)或三聯(lián)抗體組合，并且可對患者提供更高的安全性和功效，這歸因于減少的脫靶t細胞活化。

其它實施方案

應理解的是，盡管本發(fā)明已經(jīng)結合其詳細說明來進行描述，但前述描述旨在說明而不應限制本發(fā)明范圍，它是由權利要求來限定范圍。其它方面、優(yōu)點及修改也在以下權利要求的范圍內(nèi)。

任何個別部分的內(nèi)容可同等地適用于所有部分。

以引用的方式并入

在本文中所參考的所有專利和出版物據(jù)此以引用的方式整體并入。

本文所討論的出版物只提供在本申請的申請日之前的公開內(nèi)容。本文中的任何內(nèi)容都不能被解釋為承認本發(fā)明無權使借助于在先發(fā)明的這種出版日期提前。

如本文所用，所有標題僅用于組織本公開，而不旨在以任何方式限制本公開。

序列表

<110>heatbiologics,inc.

schreiber,taylor

fromm,george

<120>共表達gp96-ig和共刺激分子的載體

<130>htb-021pc

<150>us62/113,153

<151>2015-02-06

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<160>49

<170>patentin3.5版

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agagccaggcacgcctggcagctgactcagggcgctacagtgctgggcctgttcagagtg1260

acccccgagattccagccggcctgcctagccccagatccgaatga1305

<210>7

<211>434

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>7

metserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

serglylysglutyrlyscyslysvalserserlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserasnalathrglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplyssersertrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysalacysprotrpalavalserglyalaargala

225230235240

serproglyseralaalaserproargleuarggluglyprogluleu

245250255

serproaspaspproalaglyleuleuaspleuargglnglymetphe

260265270

alaglnleuvalalaglnasnvalleuleuileaspglyproleuser

275280285

trptyrseraspproglyleualaglyvalserleuthrglyglyleu

290295300

sertyrlysgluaspthrlysgluleuvalvalalalysalaglyval

305310315320

tyrtyrvalphepheglnleugluleuargargvalvalalaglyglu

325330335

glyserglyservalserleualaleuhisleuglnproleuargser

340345350

alaalaglyalaalaalaleualaleuthrvalaspleuproproala

355360365

serserglualaargasnseralapheglypheglnglyargleuleu

370375380

hisleuseralaglyglnargleuglyvalhisleuhisthrgluala

385390395400

argalaarghisalatrpglnleuthrglnglyalathrvalleugly

405410415

leupheargvalthrprogluileproalaglyleuproserproarg

420425430

serglu

<210>8

<211>1284

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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agcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaa120

gtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtac180

gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagc240

acctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgagcggcaaagag300

tacaagtgcaaggtgtccagcaagggcctgcccagcagcatcgagaaaaccatcagcaac360

gccaccggccagcccagggaaccccaggtgtacacactgccccctagccaggaagagatg420

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gacagcgacggctcattcttcctgtacagcagactgaccgtggacaagagcagctggcag600

gaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag660

aagtccctgtctctgagcctgggcaagatcgagggccggatggatagagcccagggcgaa720

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ggcagcaactggttccagcccatctacctgggcgccatgtttagtctgcaagagggcgac1200

aagctgatggtcaacgtgtccgacatcagcctggtggattacaccaaagaggacaagacc1260

ttcttcggcgcctttctgctctga1284

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<212>prt

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<220>

<223>合成序列

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metserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

serglylysglutyrlyscyslysvalserserlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserasnalathrglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

valserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspileala

145150155160

valglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthr

165170175

proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplyssersertrpglngluglyasnvalphesercysser

195200205

valmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuser

210215220

leuserleuglylysilegluglyargmetaspargalaglnglyglu

225230235240

alacysvalglnpheglnalaleulysglyglngluphealaproser

245250255

hisglnglnvaltyralaproleuargalaaspglyasplysproarg

260265270

alahisleuthrvalvalargglnthrprothrglnhisphelysasn

275280285

glnpheproalaleuhistrpgluhisgluleuglyleualaphethr

290295300

lysasnargmetasntyrthrasnlyspheleuleuileprogluser

305310315320

glyasptyrpheiletyrserglnvalthrpheargglymetthrser

325330335

glucyssergluileargglnalaglyargproasnlysproaspser

340345350

ilethrvalvalilethrlysvalthraspsertyrprogluprothr

355360365

glnleuleumetglythrlysservalcysgluvalglyserasntrp

370375380

pheglnproiletyrleuglyalametpheserleuglngluglyasp

385390395400

lysleumetvalasnvalseraspileserleuvalasptyrthrlys

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gluasplysthrphepheglyalapheleuleu

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<210>10

<211>1107

<212>dna

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<220>

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accaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgcc480

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aagtccctgtctctgagcctgggcaagatcgagggccggatggatcaggtgtcacacaga720

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aaccccggcgagttctgcgtgctctga1107

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<212>prt

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<220>

<223>合成序列

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metserlystyrglyproprocysprosercysproalaprogluphe

151015

leuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysaspthr

202530

leumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

354045

serglngluaspprogluvalglnpheasntrptyrvalaspglyval

505560

gluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglnpheasnser

65707580

thrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleu

859095

serglylysglutyrlyscyslysvalserserlysglyleuproser

100105110

serileglulysthrileserasnalathrglyglnproargglupro

115120125

glnvaltyrthrleuproproserglngluglumetthrlysasngln

130135140

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proprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserargleu

180185190

thrvalasplyssersertrpglngluglyasnvalphesercysser

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210215220

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glulysglypheileleuthrserglnlysgluaspgluilemetlys

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serleulysglytyrpheserglngluvalasnileserleuhistyr

290295300

glnlysaspglugluproleupheglnleulyslysvalargserval

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asnserleumetvalalaserleuthrtyrlysasplysvaltyrleu

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asnvalthrthraspasnthrserleuaspaspphehisvalasngly

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glygluleuileleuilehisglnasnproglygluphecysvalleu

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<210>12

<211>1588

<212>dna

<213>智人

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<210>13

<211>426

<212>prt

<213>智人

<400>13

metgluglnargproargglycysalaalavalalaalaalaleuleu

151015

leuvalleuleuglyalaargalaglnglyglythrargserproarg

202530

cysaspcysalaglyaspphehislyslysileglyleuphecyscys

354045

argglycysproalaglyhistyrleulysalaprocysthrglupro

505560

cysglyasnserthrcysleuvalcysproglnaspthrpheleuala

65707580

trpgluasnhishisasnserglucysalaargcysglnalacysasp

859095

gluglnalaserglnvalalaleugluasncysseralavalalaasp

100105110

thrargcysglycyslysproglytrpphevalglucysglnvalser

115120125

glncysvalserserserprophetyrcysglnprocysleuaspcys

130135140

glyalaleuhisarghisthrargleuleucysserargargaspthr

145150155160

aspcysglythrcysleuproglyphetyrgluhisglyaspglycys

165170175

valsercysprothrproproproserleualaglyalaprotrpgly

180185190

alavalglnseralavalproleuservalalaglyglyargvalgly

195200205

valphetrpvalglnvalleuleualaglyleuvalvalproleuleu

210215220

leuglyalathrleuthrtyrthrtyrarghiscystrpprohislys

225230235240

proleuvalthralaaspglualaglymetglualaleuthrpropro

245250255

proalathrhisleuserproleuaspseralahisthrleuleuala

260265270

proproaspserserglulysilecysthrvalglnleuvalglyasn

275280285

sertrpthrproglytyrprogluthrglnglualaleucysprogln

290295300

valthrtrpsertrpaspglnleuproserargalaleuglyproala

305310315320

alaalaprothrleuserprogluserproalaglyserproalamet

325330335

metleuglnproglyproglnleutyraspvalmetaspalavalpro

340345350

alaargargtrplysgluphevalargthrleuglyleuarggluala

355360365

gluileglualavalgluvalgluileglyargpheargaspglngln

370375380

tyrglumetleulysargtrpargglnglnglnproalaglyleugly

385390395400

alavaltyralaalaleugluargmetglyleuaspglycysvalglu

405410415

aspleuargserargleuglnargglypro

420425

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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gccagttcctccagatatcc20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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ccacgctcttctgtctactg20

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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<211>21

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<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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<210>20

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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ctgcggcatgttctggatttgact24

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>21

agtccaccacagttgctgactcat24

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>22

gacacagtagagtgtcgcatg21

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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aagcatgctctgtggagctg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>24

aaggccaaccgtgaaaagat20

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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gtggtacgaccagaggcatac21

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<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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glyglyglyglyser

15

<210>27

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>27

glyglyglyglyser

15

<210>28

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>28

glyglyglyglyglyglyglygly

15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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glyglyglyglyglygly

15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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glualaalaalalys

15

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>31

alaglualaalaalalysala

15

<210>32

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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alaglualaalaalalysglualaalaalalysala

1510

<210>33

<211>46

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>33

alaglualaalaalalysglualaalaalalysglualaalaalalys

151015

glualaalaalalysalaleuglualaglualaalaalalysgluala

202530

alaalalysglualaalaalalysglualaalaalalysala

354045

<210>34

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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proalaproalapro

15

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<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>35

lysgluserglyservalsersergluglnleualaglnpheargser

151015

leuasp

<210>36

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

<400>36

gluglylysserserglyserglysergluserlysserthr

1510

<210>37

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成序列

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glyseralaglyseralaalaglyserglygluphe

1510

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<212>dna

<213>智人

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ttgaggctggtgctgtatctcaccttcctgggagccccctgctacgccccagctctgccg120

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ggcacctacattgcccacctcaatggcctaagcaagtgtctgcagtgccaaatgtgtgac300

ccagccatgggcctgcgcgcgagccggaactgctccaggacagagaacgccgtgtgtggc360

tgcagcccaggccacttctgcatcgtccaggacggggaccactgcgccgcgtgccgcgct420

tacgccacctccagcccgggccagagggtgcagaagggaggcaccgagagtcaggacacc480

ctgtgtcagaactgccccccggggaccttctctcccaatgggaccctggaggaatgtcag540

caccagaccaagtgcagctggctggtgacgaaggccggagctgggaccagcagctcccac600

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