本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域中的融合蛋白，特別是涉及一種具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性的重組補體因子h(cfh)融合蛋白，其包含全長cfh或具有生物活性的cfh片段或其片段組合的cfh結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(ch)結(jié)構(gòu)域，還涉及所述融合蛋白的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：補體(complement)是存在于正常人和動物血清與組織液中的一組具有免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)的總稱，包含有c1、c2、……c9等，是先天免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)物。補體是由30余種可溶性蛋白、膜結(jié)合性蛋白和補體受體組成的多分子系統(tǒng)，故稱為補體系統(tǒng)(complementsystem)。根據(jù)補體系統(tǒng)各成分的生物學功能，可將其分為補體固有成分、補體調(diào)控成分和補體受體。補體系統(tǒng)主要參與外源病原體的定靶和清除，也參與免疫復(fù)合物和細胞碎片的排除以及增強細胞免疫。補體系統(tǒng)并被證明在多種自身免疫、炎癥等疾病的病理學過程中扮演重要角色(ehrnthallerc,ignatiusa,gebhardf,huber-langm.newinsightsofanolddefensesystem:structure,function,andclinicalrelevanceofthecomplementsystem.molmed.2011,17(3-4):317-329.)。補體激活的過程有經(jīng)典途徑(classicalpathway)、凝集素途徑(mannose-bindinglectinpathway)和旁路途徑(alternativepathway)三種(nesargikarpn,spillerb,chavezr.thecomplementsystem:history,pathways,cascadeandinhibitors.eur.j.microbiol.immunol(bp).2012,2(2):103-111.)。經(jīng)典途徑是由補體成分c1(c1復(fù)合體由一個clq分子、二個clr分子、二個cls分子組成)與經(jīng)典途徑激活因子(主要是含有igm、igg1、igg2或igg3的抗原-抗體復(fù)合物)的結(jié)合而激活的，c1q與單個igm分子或相鄰兩個igg分子結(jié)合，繼而激活c1r和c1s，經(jīng)典補體激活途徑的反應(yīng)順序是：c1、c4、c2、c3、c5、c6、c7、c8、c9。在凝集素途徑中，甘露糖結(jié)合凝集素在補體激活過程中扮演的角色類似經(jīng)典途徑的c1q蛋白質(zhì)，與病原體表面的甘露糖殘基和果糖殘基結(jié)合，另與masp-1和masp-2兩種蛋白(類似c1r和c1s)組成激活補體的復(fù)合物，繼續(xù)進行類似經(jīng)典途徑的反應(yīng)。旁路途徑的起始依賴血清c3自然水解成c3a、c3b，繼而c3b附著到靶細胞表面與b、d、p因子結(jié)合進入類似經(jīng)典途徑的步驟。自c3b產(chǎn)生以后，三條途徑的反應(yīng)非常類似。三條途徑在各自形成c5轉(zhuǎn)化酶之后c5裂解成c5a、c5b兩部分，c5b則與c6、c7、c8、c9形成所謂膜攻擊復(fù)合物(membrane-attackcomplex，mac)，在目標細胞的細胞膜上產(chǎn)生10nm左右的穿孔，導(dǎo)致目標細胞因為滲透壓無法維持而膨脹破裂。正常情況下，補體系統(tǒng)的激活只發(fā)生在入侵病原體的表面，而不會損傷人體細胞本身。補體因子h(complementh，cfh)是在旁路補體激活過程中實現(xiàn)這種“自我”與“非我”識別的關(guān)鍵分子(ferreiravp,pangburnmk,cortésc.complementcontrolproteinfactorh:thegood,thebad,andtheinadequate.molimmunol.2010,47(13):2187-2197.)。在旁路途徑中，附著在靶細胞表面的c3b與補體因子b結(jié)合，隨后補體因子d切割b因子產(chǎn)生具有酶活性c3bbb，c3bbb與p因子結(jié)合形成c3bbbp(旁路途徑的c3轉(zhuǎn)化酶)。c3bbbp切割c3生成c3b，進一步引起激活，形成急速放大的正反饋環(huán)。而cfh可以與c3b結(jié)合，競爭b因子的結(jié)合位點，從而阻斷c3bbb的形成，而且作為輔因子激活因子i對c3b的降解形成ic3b，ic3b則不能與b因子結(jié)合，還能加速已經(jīng)形成的c3bbb復(fù)合體的不可逆性衰變，因此通過多重效應(yīng)對旁路途徑的激活施加抑制作用。cfh是一種糖蛋白，在血漿中濃度很高(～500μg/ml)，主要由肝臟產(chǎn)生，成熟的cfh由1213個氨基酸組成，是一個由20個短同源重復(fù)序列(shortconsensusrepeats，scr)或補體調(diào)控蛋白模塊(complementcontrolproteinmodules，ccp)構(gòu)成的類似串珠狀的結(jié)構(gòu)。這些scr按從n端到c端的順序分別命名為scr1至scr20。每個scr由約60個氨基酸組成，在空間結(jié)構(gòu)上高度相似。cfh與c3b主要通過兩個結(jié)合位點相互作用，分別位于scr(1-4)(結(jié)合完整的c3b)和scr(19-20)(結(jié)合c3d部分)，有報道scr(6-14)也有結(jié)合c3b的功能(結(jié)合c3c片段)(sharmaak&pangburnmk.identificationofthreephysicallyandfunctionallydistinctbindingsitesforc3binhumancomplementfactorhbydeletionmutagenesis.proc.natl.acad.sci.usa1996,93:10996-11001.；jokirantats,etal.eachofthethreebindingsitesoncomplementfactorhinteractswithadistinctsiteonc3b.jbiolchem.2000,275(36):27657-62.)。cfh與固定在細胞表面的c3b結(jié)合后，能粘附到細胞表面，抑制c3bbb的形成?，F(xiàn)有的研究表明，cfh的補體抑制活性結(jié)構(gòu)域位于scr(1-4)，scr(1-4)具有與c3b結(jié)合、補體因子i的輔因子作用和加速c3bbb衰變的作用。cfh還有與細胞表面c3受體cr3和糖胺聚糖(glycosaminoglycans，gags)結(jié)合的位點，主要分別位于scr7和scr(19-20)(aslamm&perkinssj.folded-backsolutionstructureofmonomericfactorhofhumancomplementbysynchrotronx-rayandneutronscattering,analyticalultracentrifugationandconstrainedmolecularmodelling.jmolbiol.2001,309(25):1117–1138.)。因gags通常只存在于正常動物個體的細胞表面，而細菌、病毒等病原物的表面不具有這種結(jié)構(gòu)，所以cfh通過這樣的特異性識別作用保護自身細胞免受旁路途徑引起的攻膜復(fù)合體的破壞。cfh結(jié)構(gòu)中scr(6-8)和scr(18-20)還能與固定在組織或細胞表面的c-反應(yīng)蛋白(crp)結(jié)合，在炎癥過程中減少補體過度激活對組織造成的損傷(perkinssj,etal.complementfactorh–ligandinteractions:self-association,multivalencyanddissociationconstants.immunobiology2012,217:281-297.)。補體旁路途徑的異常激活或cfh基因的異常如單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)被證實會引起多種自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)，直接涉及cfh異常的疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration，amd，位于cfhscr7的y402h單核苷酸多態(tài)性)、缺血性卒中(ischemicstroke)、非典型溶血性尿毒綜合癥(atypicalhemolyticuremicsyndrome，ahus)、精神分裂癥(schizophrenia)等。涉及補體旁路途徑的病理過程還包括局部的缺血及再灌注之后的遠端組織損傷、狼瘡腎炎、ii型膜增生性腎小球腎炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)或者致密物沉積病(densedepositdisease,ddd)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，pnh)等。通過靶向抑制或下調(diào)過度激活的補體旁路途徑已經(jīng)被證明對于相關(guān)疾病是有效的。例如，多個專利文獻描述了含有cfh的組分用于治療多種疾病，包括amd等眼底病(wo2006/062716.hohj&kleinr.methodsandcompositionsfortreatingoculardisorders.；wo2007/056227.fungsc&yaoz.useofcomplementpathwayinhibitorstotreatoculardiseases.)、溶血性尿毒綜合癥(hus，us2008/0318841.chtourouas,etal.methodforpreparingafactorhconcentrateandtheusethereofintheformofadrug.)，自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎和腎小球腎炎(us4,883,784.kanekoi.humancomplementfactorsandtheirtherapeuticuse.)等。專利文獻wo/2007/149567(cn101563363b)公開的cr2-cfh融合蛋白對濕性和干性amd動物模型均有顯著的癥狀緩解作用。另有公開的抗b因子抗體(wo/2005/077417.holersvm,etal.inhibitionoffactorb,thealternativecomplementpathwayandmethodrelatedthereto.)、抗d因子抗體(cn103724433a.阿瑟.j.黃.人源化抗體因子d抗體及其用途；wo2007/056227.fungsc&yaoz.useofcomplementpathwayinhibitorstotreatoculardiseases.)、抗bb抗體(wo/2013/152020.bansalr.humanizedandchimericanti-factorbbantibodiesandusesthereof.)和crig融合蛋白(cn103349777.阿維.阿什克納齊.用于預(yù)防和治療補體紊亂的crig多肽.)等也各自被證實對于相關(guān)疾病是有效的。以上研究中大部分選擇了補體系統(tǒng)中不同于cfh的靶點如b因子、d因子和bb等，而cfh是目前認為最重要的補體旁路途徑的調(diào)節(jié)因子，具有多重補體調(diào)節(jié)功能，而且能在液相(如血液)和固相(如細胞表面)都有調(diào)節(jié)作用，因此成為一個研究方向。雖然有些專利文獻選擇了cfh，或是全長cfh，或是不同cfh片段(如專利文獻wo/2007/149567(cn101563363b)中的scr(1-5)，但仍然存在功能單一、生物利用方面的缺憾。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性且能延長該活性物質(zhì)在生物體內(nèi)半衰期的重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白。本發(fā)明所提供的重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白，簡稱為cfh-ig融合蛋白，為具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性的重組補體因子h(cfh)和免疫球蛋白(ig)的融合蛋白，其包含：a)含有cfh或其片段或其片段組合的補體因子h部分，和b)含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(ch)的免疫球蛋白部分，其中，所述補體因子h部分具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性，即具有抑制或調(diào)控補體旁路途徑過度激活的作用，或同時具有靶向被補體過度激活的組織的作用；其中，所述免疫球蛋白部分具有延長其在生物體內(nèi)半衰期的作用。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白是在已知c3b的功能和已知cfh的三維空間結(jié)構(gòu)以及其與c3b和其它配體相互作用的模型的基礎(chǔ)上設(shè)計和發(fā)明的，其中含有具有補體因子i的輔因子作用和加速c3bbb衰減作用的片段，或同時具有與c3b有效結(jié)合和與組織細胞或顆粒表面糖胺聚糖(gags)以及crp結(jié)合的片段，或者其片段組合。已知補體旁路途徑自發(fā)產(chǎn)生的c3b是一種重要的調(diào)理素(opsonin)，更是補體系統(tǒng)四種轉(zhuǎn)化酶中的三種轉(zhuǎn)化酶的成分之一，如形成的c3bbb復(fù)合體是一種c3轉(zhuǎn)化酶，能切割c3產(chǎn)生更多的c3b，從而促進補體的級聯(lián)反應(yīng)；進一步形成的c3bbbc3b復(fù)合體則是一種c5轉(zhuǎn)化酶，切割c5產(chǎn)生的c5b最終參與形成膜攻擊復(fù)合物(mac)，過度的補體旁路途徑激活會引起正常組織的損傷而導(dǎo)致組織炎癥或者細胞變性或死亡。因此有效調(diào)控c3b的含量或活性能減少、防止甚至逆轉(zhuǎn)由于補體旁路途徑過度激活所造成的組織損傷。在一實施例中，本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白中cfh部分含有與c3b有效結(jié)合的片段，同時含有補體因子i的輔因子作用和加速c3bbb衰變作用的片段；在另一個實施例中，本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白中cfh部分還具有與組織細胞或顆粒表面糖胺聚糖(gags)以及c-反應(yīng)蛋白(crp)結(jié)合的片段，或者其片段組合，以達到有效抑制或者調(diào)控補體旁路途徑過度激活，或同時具有靶向補體過度激活的組織的作用。在本發(fā)明中，“具有生物活性的任何cfh片段”是指全長cfh的部分或具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性的cfh片段。具體來講，具有生物活性的cfh片段具有以下一種或多種活性：與細胞表面補體受體(cr3、cd11b/cd18或integrinαm/integrinβ2)結(jié)合活性、與c3b結(jié)合活性、與gags結(jié)合活性、與crp結(jié)合活性、與病原體結(jié)合活性、補體因子i切割c3b輔因子活性和c3bbb衰變加速活性。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白，其重組補體因子h(cfh)部分可以是cfh全長序列，也可以是具有生物活性的任何cfhn-端短同源重復(fù)序列(scr)中scr1-scr17之間的任一片段，如scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的組合，或者是scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)和scr(1-17)中的任一片段與cfh分子c-端序列中scr(18-20)或scr(19-20)任意組合的產(chǎn)物。優(yōu)選地，本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的重組補體因子h(cfh)部分可以是cfh全長序列，也可以是cfhscr(1-4)或scr(1-7)，或者是scr(1-4)或scr(1-7)與scr(18-20)或scr(19-20)任意組合的產(chǎn)物。更加優(yōu)選地，本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的重組補體因子h(cfh)部分可以是cfhscr(1-7)，也可以是scr(1-7)與scr(18-20)組合的產(chǎn)物。本發(fā)明cfh-ig融合蛋白中的人全長cfh、人cfhscr(1-4)、scr(1-7)、scr(18-20)和scr(19-20)的氨基酸序列分別如序列表中seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5所示，或與序列表中seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5具有至少90％同源性的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白，其重組補體因子h(cfh)部分也可以是含有2個或多個cfh全長序列，或2個或多個具有生物活性的任何cfhn-端scr片段，如2個或多個scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的組合，或者是2個或多個scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)與scr(18-20)和/或scr(19-20)任意組合的產(chǎn)物。優(yōu)選地，本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的重組補體因子h(cfh)部分可以是2-4個cfh全長序列，也可以是2-4個cfhscr片段，即2-4個scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的組合，或者是2-4個scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)與scr(18-20)和/或scr(19-20)任意組合的產(chǎn)物。本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的重組補體因子h(cfh)部分可以來源于人類。為了驗證本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白在其它物種中的藥理作用，其cfh部分也可以來源于其它物種如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、豬、羊和非人靈長類動物。優(yōu)選地，cfh部分來源于人類、小鼠、大鼠和非人靈長類動物。更優(yōu)選地，cfh部分來源于人類。本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的免疫球蛋白(ig)部分可以是來源于人類或者其它物種如大鼠或小鼠的免疫球蛋白，優(yōu)選地，是來自于人類的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白(ig)部分含有免疫球蛋白恒定區(qū)，所述免疫球蛋白恒定區(qū)是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(ch)，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)可以選自不同的免疫球蛋白，如iga、igd、ige、igg和igm；優(yōu)選地，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)選自igg，可以選自igg的不同亞型igg1、igg2(igg2a、igg2b)、igg3和igg4，以及不同亞型之間的組合(如igg2/igg4)；更優(yōu)選地，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)來自于igg1、igg2和igg4。為了減少或避免免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能如激活補體和/或與抗體受體(fc受體)結(jié)合，選用的igg1的fc結(jié)構(gòu)域中與fc受體結(jié)合位點的氨基酸可以被刪掉或者被置換，或直接選用不激活補體的igg4(taomh,smithri,morrisonsl.structuralfeaturesofhumanimmunoglobulingthatdetermineisotype-specificdifferencesincomplementactivation.j.exp.med.1993,178:661-667；smithri,colomamj,morrisonsl.additionofamu-tailpiecetoiggresultsinpolymericantibodieswithenhancedeffectorfunctionsincludingcomplement-mediatedcytolysisbyigg4.j.immunol.1995,154:2226-2236.)或不與fc受體結(jié)合的igg2(canfieldsm&morrisonsl.thebindingaffinityofhumaniggforitshighaffinityfcreceptorisdeterminedbymultipleaminoacidsinthech2domainandismodulatedbythehingeregion.j.exp.med.1991,173:1483-1491；burtondr&woofjm.humanantibodyeffectorfunction.adv.immunol.1992,51:1-84.)或igg2和igg4的組合。igg重鏈恒定區(qū)可以包括ch1區(qū)、鉸鏈區(qū)、ch2區(qū)和ch3區(qū)，至少包括fc片段(鉸鏈區(qū)、ch2區(qū)和ch3區(qū))。所述fc部分，可以是來源于人類或者其它物種如大鼠或小鼠的免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地，是來源于人類的免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明cfh-ig融合蛋白中的大鼠、小鼠和人的免疫球蛋白igg1fc部分對應(yīng)的氨基酸序列分別如序列表中seqno.6、seqno.7和seqno.8所示，或分別與seqno.6、seqno.7和seqno.8具有至少90％同源性的氨基酸序列。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白中的cfh部分和fc部分的連接順序可以是fc部分在n端，cfh部分在c端，即fc-cfh；或者，cfh部分在n端，fc部分在c端，即cfh-fc。在一些實施方式中，cfh部分和fc部分以共價鍵方式連接：其共價連接方式可以是肽段接頭，如(gly4ser)n，n應(yīng)滿足最大程度保證cfh部分和fc部分的正確裝配以實現(xiàn)其補體活性調(diào)節(jié)功能，優(yōu)選地，n在1-6之間；其共價連接方式也可以是cfh部分和fc部分直接以肽鍵連接；其連接方式還可以是其它能夠滿足最大程度保證cfh片段和fc片段的正確裝配以實現(xiàn)其補體活性調(diào)節(jié)功能的任意共價連接方式(如化學交聯(lián)劑)。本發(fā)明實驗中，cfh-ig融合蛋白中的cfh部分和fc部分之間直接以肽鍵連接。在一些實施方式中，所述cfh部分和所述fc部分可以是非共價連接的，例如，這兩部分可以通過兩個相互作用的橋接蛋白(如生物素和鏈霉抗生物素蛋白，或者亮氨酸拉鏈)介導(dǎo)而連接，每個橋接蛋白連接到cfh部分或fc部分。本發(fā)明中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)和人fc融合而成，從n-端到c-端的順序為hfc-l-hscr(1-7)或hscr(1-7)-l-hfc，其中h代表人，l代表肽段接頭，例如，從n-端到c-端的順序為hscr(1-7)-l-hfc。在另一些實施例中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)和小鼠fc融合而成，從n-端到c-端的順序為mfc-l-hscr(1-7)或hscr(1-7)-l-mfc，其中m代表小鼠，l代表肽段接頭，例如，從n-端到c-端的順序為hscr(1-7)-l-mfc。再在另一些實施例中，重組cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)、人scr(18-20)和人fc融合而成，從n-端到c-端的順序為hfc-l-hscr(1-7)-hscr(18-20)或hfc-l-hscr(18-20)-hscr(1-7)或hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-hfc或hscr(18-20)-hscr(1-7)-l-hfc，例如，從n-端到c-端的順序為hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-hfc。還有在另一些實施例中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)、人scr(18-20)和小鼠fc融合而成，從n-端到c-端的順序為mfc-l-hscr(1-7)-hscr(18-20)或mfc-l-hscr(18-20)-hscr(1-7)或hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-mfc或hscr(18-20)-hscr(1-7)-l-mfc，例如，從n-端到c-端的順序為hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-mfc。以上l表示的肽段接頭可以為(gly4ser)n，n應(yīng)滿足最大程度保證cfh部分和fc部分的正確裝配以實現(xiàn)其補體活性調(diào)節(jié)功能，優(yōu)選地，n為0或在1-6之間；n為0時，表示的是融合蛋白的兩部分以肽鍵連接而未使用肽段l連接，故實施例中與上述命名對應(yīng)的融合蛋白表示形式均省略“l(fā)”，分別為hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc和hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc，其氨基酸序列分別如序列表中seqno.9、seqno.10、seqno.11所示，或是分別與seqno.9、seqno.10、seqno.11具有至少90％同源性的氨基酸序列。本發(fā)明中，以“scr(1-3)”或“scr1-3”的表述為例，其含義為“scr1至scr3的片段”。其它數(shù)字的類似表示含義與此相同。術(shù)語“價”在本發(fā)明使用時，是指單個融合蛋白中所包含的cfh片段的具體數(shù)量，比如術(shù)語“二價”，指在單個融合蛋白中存在兩個cfh或兩個cfh片段。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白至少是“二價”的，成熟重組人補體因子cfh-ig融合蛋白(二價)的結(jié)構(gòu)如圖1之b所示，也可以是“多價”的(例如“三價”、“四價”等)。所述“二價”，由兩個fc片段之間以二硫鍵配對實現(xiàn)，最終所形成的是一個對稱的類似抗體形狀的融合蛋白。在一些實施方式中，所述cfh-ig融合蛋白中的cfh部分可以由兩個或多個cfh片段(相同或不同)相互串聯(lián)(例如通過融合表達，或者通過橋接蛋白介導(dǎo)的非共價連接)而成，從而形成“多價”，成熟重組人補體因子cfh-ig融合蛋白(多價)的結(jié)構(gòu)如圖1之c所示。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白還包括但不限于以下所述的變體：(i)在保留補體調(diào)節(jié)活性的前提之下，cfh部分和/或免疫球蛋白fc部分的一個或多個氨基酸被保守或非保守氨基酸(優(yōu)選為保守氨基酸)置換，而且置換的氨基酸可以是遺傳密碼編碼的氨基酸，也可以是不被遺傳密碼編碼的氨基酸，還可以是人工合成的非天然氨基酸；或(ii)有其它氨基酸序列被融合到所保護的融合蛋白中，以便于提純(如his標簽、gst標簽蛋白等)，或者便于分泌表達(如信號肽序列)，或者是便于靶向到特定組織或部位的序列如cr2或crig，或者是其它提高半衰期的部分(如血清白蛋白)；或(iii)被化學修飾的變體，包括但不限于聚乙二醇(peg)修飾、生物素修飾和糖鏈修飾，修飾后的重組人補體因子cfh-ig融合蛋白的示意圖如圖1之d所示。編碼上述具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性的重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。含有本發(fā)明重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)編碼基因的表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和宿主菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)的方法。具體來講，本發(fā)明cfh-ig融合蛋白的制備方法，可包括以下步驟：1)合成編碼cfh-ig融合蛋白的cdna序列；2)將編碼cfh-ig融合蛋白的cdna序列插入工具載體，構(gòu)建可在宿主細胞中表達的重組表達載體，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1之a(chǎn)所示；3)將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，使其在宿主細胞中表達；4)分離、純化表達的cfh-ig融合蛋白。在上述cfh-ig融合蛋白的制備方法中，所述步驟2)中的工具載體為市售商業(yè)化載體或自行構(gòu)建的可供表達的載體；所述宿主細胞包括大腸桿菌、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞和昆蟲細胞。在一個實施例中，所述哺乳動物細胞是cho細胞。本發(fā)明具有補體調(diào)節(jié)活性尤其是補體旁路途徑調(diào)節(jié)活性的重組補體因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)作為活性成分在制藥中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明各種結(jié)構(gòu)類型的cfh-ig融合蛋白通過藥學可接受的、適合于給藥的藥物載體制備成藥物組合物，合適的藥物載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于生理鹽水、磷酸緩沖液、水、脂質(zhì)體、納米載體等。含有cfh-ig融合蛋白的藥物載體可通過常規(guī)方法制備。本發(fā)明含有各種結(jié)構(gòu)類型的cfh-ig融合蛋白的藥物組合物可以通過各種給藥途徑施用有效劑量于人類或其它哺乳動物，給藥途徑包括但不限于靜脈注射(iv)、靜脈滴注(infusion)、肌肉注射(im)、皮下注射(sc)、玻璃體內(nèi)注射(ivt)、結(jié)膜下注射(scj)、經(jīng)鞏膜注射(ts)、通過玻璃體內(nèi)植入裝置給藥、口服(po)、舌下給藥(sl)、噴霧(spray)和滴眼劑外用(eyedrop)。對于不同的疾病，可以選擇不同的給藥途徑。在一些實施例中，cfh-ig融合蛋白可以通過玻璃體內(nèi)注射(ivt)、結(jié)膜下注射(scj)、經(jīng)鞏膜注射(ts)、通過玻璃體內(nèi)植入裝置給藥或滴眼劑外用(eyedrop)給藥；在另一些實施例中，cfh-ig融合蛋白可以通過靜脈注射(iv)、靜脈滴注(infusion)、肌肉注射(im)或皮下注射(sc)給藥。本發(fā)明含有各種結(jié)構(gòu)類型的重組cfh-ig融合蛋白的藥物組合物可以通過上述給藥途徑單獨使用或者與其它藥物聯(lián)合使用，或者與其它藥物偶聯(lián)后用于人類或其它哺乳動物。所述其它藥物為抗血管內(nèi)皮生長因子-a(vegf-a)抗體或抗體片段、重組vegf受體融合蛋白或抗c5抗體。本發(fā)明含有各種結(jié)構(gòu)類型的重組cfh-ig融合蛋白的藥物組合物可以用于制備治療人類或者其它哺乳動物中由補體旁路途徑介導(dǎo)、失調(diào)或缺陷所致的自身免疫性疾病或其它疾病的藥物。所述疾病包括年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(pnh)、非典型溶血性尿毒綜合癥(ahus)、ii型膜增生性腎小球腎炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)、致密物沉積病(densedepositdisease,ddd)。本發(fā)明含有各種結(jié)構(gòu)類型的重組cfh-ig融合蛋白的藥物組合物還可以被涂在醫(yī)療裝置尤其是與組織或體液直接接觸的可植入式醫(yī)療裝置如人工器官和心臟支架、或血液體外分流系統(tǒng)表面，以抑制其表面的因補體過度激活而引起的血栓形成。本發(fā)明提供的由重組補體因子h(cfh)部分和含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(ch)的免疫球蛋白(ig)部分組成的融合蛋白cfh-ig，一方面通過cfh部分的作用抑制補體旁路途徑過度激活，使本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白具有補體調(diào)節(jié)活性，該活性包括：(1)c3b結(jié)合活性；(2)補體因子i切割c3b輔因子活性；(3)c3bbb衰變加速活性；(4)抑制補體旁路途徑活性。除了補體調(diào)節(jié)活性以外，所述cfh-ig融合蛋白，尤其是含有cfh分子c-端scr(18-20)或scr(19-20)片段的融合蛋白還具有同時靶向融合蛋白至補體異常激活組織的作用。本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白可以用于緩解或治療由于補體旁路途徑介導(dǎo)、失調(diào)或缺陷導(dǎo)致的相關(guān)疾病，如自身免疫性疾病或其它疾病，尤其是amd、pnh、ahus和mpgn-ii。另一方面通過免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)fc作用延長在生物體內(nèi)的半衰期，以減少給藥次數(shù)，增加病人的用藥順應(yīng)性。本發(fā)明將在人類或者其它哺乳動物中由補體旁路途徑介導(dǎo)、失調(diào)或缺陷所致的自身免疫性疾病或其它疾病以及因補體過度激活而引起的血栓的治療中發(fā)揮作用，具有應(yīng)用前景。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。附圖說明圖1為重組人補體因子cfh-ig融合蛋白表達載體及其成熟蛋白，以及修飾后的重組人補體因子cfh-ig融合蛋白的示意圖：a.重組人補體因子cfh-ig融合蛋白表達載體示意圖，b.成熟重組人補體因子cfh-ig融合蛋白(二價)的結(jié)構(gòu)，c.成熟重組人補體因子cfh-ig融合蛋白(多價)的結(jié)構(gòu)，d.經(jīng)修飾過的重組人補體因子cfh-ig融合蛋白。圖2中a幅為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai基因序列的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖2中b幅為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai基因序列的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖3中a幅為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai表達載體陽性克隆篩選的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖3中b幅為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai表達載體陽性克隆篩選的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖4中a幅為hscr(1-7)-hfc融合蛋白純化后樣品的電泳圖。圖4中b幅為hscr(1-7)-mfc融合蛋白純化后樣品的電泳圖。圖5中a幅為hscr(1-7)-hfc融合蛋白的westernblot圖譜。圖5中b幅為hscr(1-7)-mfc融合蛋白的westernblot圖譜。圖6為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai基因序列的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖7為人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai表達載體陽性克隆篩選的1％瓊脂糖電泳檢測結(jié)果。圖8為hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白純化后樣品的電泳圖。圖9為hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的westernblot圖譜。圖10為hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh與c3b親和力比較結(jié)果，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。圖11為hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh的溶血抑制活性曲線，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。圖12為hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh輔助factori切割c3b活性比較結(jié)果：a.切割后樣品電泳檢測結(jié)果，b.不同樣品切割率對比。具體實施方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。所用基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的設(shè)計與制備一、scr(1-7)-hfc融合蛋白的核酸序列設(shè)計與合成從genbank分別獲得人cfh(序列號：aai42700.1)和人igg1重鏈(序列號：caa75032.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)和人igg1中fc結(jié)構(gòu)域的序列，按照從n端至c端方向直接以肽鍵連接，為便于純化，在c端引入tev(tobaccoetchvirusprotease)酶切位點(氨基酸序列為enlyfqg)和6×his標簽，得到分子a1；然后將分子a1融合到人cfh信號肽3’端，得到分子b1(融合蛋白人cfh信號肽-hscr(1-7)-hfc-6×his，其中，“h”是單詞“human”的首字母，代表來源于人類)；再在分子b1編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點xhoi和xbai，得到分子c1(融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai)。將分子c1的基因序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優(yōu)化獲得易于在cho細胞中表達的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.12所示，合成該基因序列。合成基因序列的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2a所示，獲得了2079bp的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。二、scr(1-7)-hfc融合蛋白的表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定表達株篩選將測序正確的融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai通過xhoi和xbai雙酶切連接到pci-neo載體(購自promega)中，通過pcr法篩選陽性克隆，結(jié)果如圖3a所示，取3個陽性克隆經(jīng)dna測序分析，與設(shè)計完全一致。然后將陽性克隆轉(zhuǎn)染cho-dg44貼壁細胞(購自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩(wěn)定表達株。通過western方法篩選到表達水平(產(chǎn)量)較高的穩(wěn)定細胞株，產(chǎn)量為5mg/l-100mg/l。三、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的分離與純化收集培養(yǎng)液上清，按順序用ni-nta螯合層析和proteina親和層析進行分離。具體的說，將培養(yǎng)基上清1000g離心10min，留上清。然后將上清上樣到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)預(yù)平衡的ni-nta親和層析柱(購自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗滌5-10個柱體積，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脫雜質(zhì)。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集洗脫峰。將其上樣至用溶液ⅳ(pbs，配方：135mmnacl,1.5mmkh2po4,and8mmk2hpo4，ph7.4)預(yù)處理過的proteina層析柱(購自millipore)，用溶液ⅳ洗滌5-10個柱體積,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脫，收集目的流出峰。用bca方法進行定量。對經(jīng)分離、純化的表達產(chǎn)物進行8％sds-page檢測，結(jié)果如圖4之a(chǎn)所示，獲得了151kd的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，純度>95％。對表達的hscr(1-7)-hfc融合蛋白進行測序，其氨基酸序列如序列表中seqno.9所示。四、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的westernblot鑒定取步驟三純化的蛋白樣品進行8％sds-page電泳，然后通過電轉(zhuǎn)儀(bio-rad)轉(zhuǎn)印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl,ph7.5)洗膜三次，然后用5％脫脂牛奶封閉1h，然后分別以抗人cfh鼠單抗(購自santacruz)和羊抗鼠單抗-hrp(購自碧云天)為一抗和二抗各在常溫孵育2h，最后以tmb(購自碧云天)顯色并記錄，期間用tbs洗滌三次。westernblot檢測結(jié)果如圖5之a(chǎn)所示，可以看出條帶呈陽性，且條帶單一，表明所獲得的蛋白確為hscr(1-7)-hfc。實施例2、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的設(shè)計與制備一、scr(1-7)-mfc融合蛋白的核酸序列設(shè)計與合成從genbank分別獲得人cfh(序列號：aai42700.1)和小鼠igg1重鏈(序列號：aac08348.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)和小鼠igg1中fc結(jié)構(gòu)域的序列，按照從n端至c端方向方式連接，連接方式為肽鍵直接連接，為便于純化在c端引入tev酶切位點和6×his標簽，得到分子a2。然后將分子a2融合到人cfh信號肽3’端，得到分子b2(融合蛋白人cfh信號肽-hscr(1-7)-mfc-6×his，其中，“h”和“m”分別是單詞“human”和“mouse”的首字母，分別代表來源于人類和小鼠)，再在分子b2編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點xhoi和xbai，得到分子c2(融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai)，將分子c2的基因序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優(yōu)化獲得易于在cho細胞中表達的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.13所示，合成該基因序列。合成基因序列的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2之b所示，獲得了2064bp的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。二、scr(1-7)-mfc融合蛋白的表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定表達株篩選將測序正確的融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai通過xhoi和xbai雙酶切連接到pci-neo載體(購自promega)中，通過pcr法篩選陽性克隆，結(jié)果如圖3之b所示，取2個陽性克隆經(jīng)dna測序分析，與設(shè)計完全一致。然后將陽性克隆轉(zhuǎn)染cho-dg44貼壁細胞(購自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩(wěn)定表達株。通過western方法篩選到表達水平(產(chǎn)量)較高的穩(wěn)定細胞株，產(chǎn)量為5mg/l-100mg/l。對表達的hscr(1-7)-mfc融合蛋白進行測序，其氨基酸序列如序列表中seqno.10所示。三、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的分離與純化收集培養(yǎng)液上清，按順序用ni-nta螯合層析和proteina親和層析進行分離。具體的說，將培養(yǎng)基上清1000g離心10min，留上清。然后將上清上樣到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)預(yù)平衡的ni-nta親和層析柱(購自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗滌5-10個柱體積，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脫雜質(zhì)。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集洗脫峰。將其上樣至用溶液ⅳ(pbs，ph7.4)預(yù)處理過的proteina層析柱(購自millipore)，用溶液ⅳ洗滌5-10個柱體積,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脫，收集目的流出峰。用bca方法進行定量。對經(jīng)分離、純化的表達產(chǎn)物進行8％sds-page檢測，結(jié)果如圖4之b所示，獲得了151kd的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，純度>95％。四、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的westernblot鑒定取步驟三純化的蛋白樣品進行8％sds-page電泳，然后通過電轉(zhuǎn)儀(bio-rad)轉(zhuǎn)印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl，ph7.5)洗膜三次，然后用5％脫脂牛奶封閉1h，然后分別以抗人cfh鼠單抗(購自santacruz)和羊抗鼠單抗-hrp(購自碧云天)為一抗和二抗各在常溫孵育2h，最后以tmb(購自碧云天)顯色并記錄，期間用tbs洗滌三次。westernblot檢測結(jié)果如圖5之b所示，可以看出條帶呈陽性，且條帶單一，表明所獲得的蛋白確為hscr(1-7)-mfc。實施例3、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的設(shè)計與制備一、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的核酸序列設(shè)計與合成從genebank分別獲得人cfh(序列號：aai42700.1)和人igg1重鏈(序列號：caa75032.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)、scr(18-20)和人igg1中fc結(jié)構(gòu)域的序列，按照從n端至c端方向方式連接，scr(1-7)和scr(18-20)之間以及scr(18-20)和fc之間都通過肽鍵直接連接。為便于純化在c端引入6×his標簽，得到分子a3。然后將分子a3融合到人cfh信號肽3’端，得到分子b3(融合蛋白人cfh信號肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his，其中，“h”是單詞“human”的首字母，代表來源于人類)，再在分子b3編碼序列的5’和3’端分別引入酶切位點xhoi和xbai，得到分子c3(融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai)，將分子c3的基因序列委托南京金斯瑞公司進行序列密碼子優(yōu)化獲得易于在cho細胞中表達的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.14所示，合成該基因序列。合成基因序列的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6所示，獲得了2640bp的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。二、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的表達載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及穩(wěn)定表達株篩選將測序正確的融合基因人xhoi-cfh信號肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai通過xhoi和xbai雙酶切連接到pci-neo載體(購自promega)中，通過pcr法篩選陽性克隆，結(jié)果如圖7所示，取3個陽性克隆經(jīng)dna測序分析，與設(shè)計完全一致。然后將陽性克隆轉(zhuǎn)染cho-dg44貼壁細胞(購自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加壓，并通過有限稀釋方法分離穩(wěn)定表達株。通過western方法篩選到表達水平(產(chǎn)量)較高的穩(wěn)定細胞株，產(chǎn)量為5mg/l-100mg/l。對表達的hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白進行測序，其氨基酸序列如序列表中seqno.11所示。三、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的分離與純化收集培養(yǎng)液上清，按順序用ni-nta螯合層析和proteina親和層析進行分離。具體的說，將培養(yǎng)基上清1000g離心10min，留上清。然后將上清上樣到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)預(yù)平衡的ni-nta親和層析柱(購自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗滌5-10個柱體積，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脫雜質(zhì)。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集洗脫峰。將其上樣至用溶液ⅳ(pbs，ph7.4)預(yù)處理過的proteina層析柱(購自millipore)，用溶液ⅳ洗滌5-10個柱體積,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脫，收集目的流出峰。用bca方法進行定量。對經(jīng)分離、純化的表達產(chǎn)物進行8％sds-page檢測，結(jié)果如圖8所示，獲得了199kd的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，純度>95％。四、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的westernblot鑒定取步驟三純化的蛋白樣品進行8％sds-page電泳，然后通過電轉(zhuǎn)儀(bio-rad)轉(zhuǎn)印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl,ph7.5)洗膜三次，然后用5％脫脂牛奶封閉1h，然后分別以抗人cfh鼠單抗(購自santacruz)和羊抗鼠單抗-hrp(購自碧云天)為一抗和二抗各在常溫孵育2h，最后以tmb(購自碧云天)顯色并記錄，期間用tbs洗滌三次。westernblot檢測結(jié)果如圖9所示，可以看出條帶呈陽性，且條帶單一，表明所獲得的蛋白確為hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。實施例4、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh與c3b親和力比較用elisa法檢測hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh與c3b親和力，具體方法為：用100μl終濃度為5μg/mlc3b包被96板4℃過夜，次日用pbst(pbs+0.1％tween20)洗滌三次，加200μl5％脫脂牛奶封閉2h，再pbst洗滌三次，然后以60nm為初始濃度的連續(xù)對半稀釋(稀釋后濃度梯度為60nm，30nm，15nm，7.5nm)的待測樣品(hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc和hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc)孵育2h，pbst洗滌三次，再用1:5000一抗(抗人cfh鼠單抗)孵育2h，pbst洗滌三次，再用1:5000二抗(hrp偶聯(lián)的羊抗鼠單抗)孵育2h，最后pbst洗滌，tmb顯色，2m硫酸終止，測450nm波長吸收值，以人cfh作為陽性對照，以pbs作為陰性對照，每樣三個復(fù)孔。結(jié)果如圖10所示，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc，可以看出，scr(1-7)-hfc和scr(1-7)-mfc與c3b結(jié)合的親和力相當，且顯著高于人cfh與c3b結(jié)合的親和力，而scr(1-7)-scr(18-20)-hfc與人cfh接近。實施例5、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh的溶血抑制活性比較一、實驗材料準備5×vbs(500ml)配制：稱取1.15g巴比妥酸，200ml沸水溶解；稱取1.15g巴比妥酸鈉及20.95gnacl，250ml水溶；冷卻后加水至500ml，最終溶液用naoh調(diào)至ph在7.2-7.4之間。0.1mmgegta(100ml)：準確稱取3.80gegta(sigma),2.03gmgcl2·6h2o(amersco)，加90ml水，最終溶液用naoh調(diào)至ph在7.2-7.4之間,定容至100ml。gvb(200ml，現(xiàn)配現(xiàn)用)：取40ml5×vbs，0.2ggelatin(fluka)，溶入150ml超純水，45℃水浴至于gelatin完全溶解，調(diào)節(jié)ph至7.2-7.4，定容至200ml，0.22μm過濾后使用。gvbe(100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用)：取20ml5×vbs，0.1ggelatin(fluka)，0.37gedta-na2(amresco)，溶入70ml超純水，45℃水浴至gelatin完全溶解。調(diào)節(jié)ph至7.3，定容至100ml，0.22μm過濾后使用。兔紅細胞的處理與計數(shù)：取脫纖維兔血，gvbe洗滌一次，gvb洗滌兩次之后計數(shù)，然后稀釋至5×108/ml。取25μl，加1ml純水溶血之后測412nm吸收值為1.3左右。nhs(1/2)(健康人血清)制備：取出nhs，gvb對半稀釋后冰浴備用。二、nhs(1/2)50％溶血劑量的確定正常情況下，涎酸可抑制b因子活性。家兔紅細胞所含涎酸量低于其它動物的紅細胞，可以激活血清中的b因子，引起旁路途徑激活，導(dǎo)致兔紅細胞溶解。在紅細胞量一定時，在給定反應(yīng)條件下，溶血程度與血清中參與旁路活化的補體量及活性呈正相關(guān)。按表1所示順序及劑量依次在2ml圓底離心管(tube)中加入各種試劑，每一組做2個平行樣，單位為μl。按順序在冰浴中混合。轉(zhuǎn)到37℃水浴，孵育30分鐘，每5分鐘振蕩混勻一次。加入1ml冰冷的gvbe，混合并1000g離心3分鐘。將上清轉(zhuǎn)出，測量412nm吸收值。其中，tube1為背景樣，其它結(jié)果要減去這個結(jié)果。tube2為100％溶血時的結(jié)果。tube3作為空白對照。每個管所得吸收值除以tube2吸收值即為溶血百分比。采用graphprism6進行曲線擬合，求得50％溶血所需nhs(1/2)體積為18μl。補體介導(dǎo)的紅細胞溶血實驗在50％溶血附近，“s”形曲線最陡，在此點附近溶血程度對補體活性的變化有最敏感的響應(yīng)，因而取此點對應(yīng)的nhs(1/2)使用量18μl作為以下溶血抑制活性實驗的加入量。表1確定nhs(1/2)50％溶血劑量的實驗方案三、溶血抑制活性實驗cfh是一種重要的補體旁路途徑的負調(diào)控因子，它決定補體c3b的命運，不論是在血管內(nèi)或在細胞表面，控制c3轉(zhuǎn)化酶的形成和其穩(wěn)定性。因此在上述實驗中，加入cfh會抑制血清中補體介導(dǎo)的旁路途徑溶血活性。兔紅細胞溶血抑制實驗方法與上述實驗相同，nhs的加入量以達到50％的溶血時的加入量為準。在100μl的反應(yīng)體系中加入不同濃度的樣品，30min反應(yīng)結(jié)束后在412nm波長下測定吸光度值。對hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc、和人cfh的溶血抑制活性的比較結(jié)果如圖11所示，根據(jù)曲線擬合結(jié)果，可獲得各自的ic50值，如表2所示，其中7007指的是hscr(1-7)-hfc，7004指的是hscr(1-7)-mfc，7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。由實驗結(jié)果可知，hscr(1-7)-hfc活性最高，為人cfh的5倍，其次為hscr(1-7)-mfc，也顯著高于人cfh活性，hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc與人cfh活性相當，表明所設(shè)計的重組蛋白均具有預(yù)期的生物活性。表2溶血抑制活性實驗結(jié)果(ic50值)檢測樣品ic5070070.074μm70080.33μm70040.086μm人cfh0.37μm實施例6、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh輔助factori切割c3b活性比較cfh可輔助factori切割c3b的亞基(101kd)，在電泳圖上形成68kd和43kd大小的條帶。本實驗比較hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh輔助factori切割c3b活性，實驗方法為：按表3所示實驗方案在離心管(tube)中添加樣品(添加過程保持冰浴)，混勻后37℃水浴，分別在5min和30min取10μl，加dtt至終濃度100mm，再加電泳上樣緩沖液終止反應(yīng)，然后進行8％sds-page電泳檢測。以人cfh作為陽性對照，以pbs代替樣品作為陰性對照。8％sds-page電泳結(jié)果如圖12之a(chǎn)所示，以光密度分析c3bα亞基的切割率，并對各樣品進行比較，比較結(jié)果如圖12之b所示，可以看出，融合蛋白hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc的輔助factori切割c3b的活性均不低于對照人cfh，但在本實驗中hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc的活性低于對照人cfh。表3輔助factori切割c3b活性比較的實驗方案根據(jù)實施例4、實施例5和實施例6的結(jié)果，得出以下結(jié)論：hscr(1-7)-hfc和hscr(1-7)-mfc是本發(fā)明最優(yōu)選的cfh-ig融合蛋白。綜上所述，本發(fā)明將人cfh片段與免疫球蛋白fc片段融合形成新的結(jié)構(gòu)，相比于自然的cfh，優(yōu)選的cfh-ig融合蛋白具有更高的補體旁路途徑抑制作用；而且融合蛋白中含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)fc片段，能延長其在生物體內(nèi)的半衰期，以減少給藥次數(shù)，增加病人的用藥順應(yīng)性。因此，本發(fā)明的cfh-ig融合蛋白可用于制備治療人類由補體旁路途徑介導(dǎo)、失調(diào)或缺陷所致的各類疾病，如自身免疫性疾病(如類風濕性關(guān)節(jié)炎)或其它疾病(如缺血再灌注)，尤其是年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(pnh)，非典型溶血性尿毒綜合癥(ahus)和ii型膜增生性腎小球腎炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)或者致密物沉積病(densedepositdisease,ddd)，也可被涂在醫(yī)療裝置尤其是與組織或體液(包括但不限于血液)直接接觸的可植入式醫(yī)療裝置如人工器官、心臟支架、起搏器、植入式傳感-遙測系統(tǒng)、血液體外分流系統(tǒng)，以抑制其表面的補體過度激活而引起的血栓形成?，F(xiàn)有技術(shù)中，雖然有些專利文獻選擇了cfh，或是全長cfh，或是不同cfh片段(如專利文獻wo/2007/149567(cn101563363b)中的scr(1-5)，而本發(fā)明設(shè)計的cfh部分既含有能調(diào)節(jié)補體旁路途徑的片段，或同時含有具有靶向被補體過度激活組織的作用的片段，具有雙重作用，scr(1-7)其中的scr7和scr(18-20)其中的scr(19-20)是gag和crp結(jié)合域，可以與由于補體過度激活、c3b在其表面沉積的組織或細胞的gag或/crp結(jié)合，有效調(diào)節(jié)補體激活，，因此能把抑制補體激活的部分(scr1-4)靶向到有過度補體激活的組織或細胞表面。再者，本發(fā)明公開的cfh融合蛋白還含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)fc片段，能延長其在生物體內(nèi)的半衰期，以減少給藥次數(shù)，增加病人的用藥順應(yīng)性?？傊?，本發(fā)明利用補體因子h的多重功能公開了一種融合蛋白，既含有能調(diào)節(jié)補體系統(tǒng)尤其是補體旁路途徑的片段，或同時含有具有靶向被補體過度激活組織的作用的片段，又含有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)fc片段以延長其在生物體內(nèi)的半衰期。序列表<110>江蘇匡亞生物醫(yī)藥科技有限公司<120>具有補體調(diào)節(jié)活性的重組補體因子h-免疫球蛋白融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用<130>cgcnb165189w<160>14<210>1<211>1213<212>prt<213>人全長cfh<400>1gluaspcysasngluleuproproargargasnthrgluileleuthr151015glysertrpseraspglnthrtyrprogluglythrglnalailetyr202530lyscysargproglytyrargserleuglyasnvalilemetvalcys354045arglysglyglutrpvalalaleuasnproleuarglyscysglnlys505560argprocysglyhisproglyaspthrpropheglythrphethrleu65707580thrglyglyasnvalpheglutyrglyvallysalavaltyrthrcys859095asngluglytyrglnleuleuglygluileasntyrargglucysasp100105110thraspglytrpthrasnaspileproilecysgluvalvallyscys115120125leuprovalthralaprogluasnglylysilevalserseralamet130135140gluproaspargglutyrhispheglyglnalavalargphevalcys145150155160asnserglytyrlysilegluglyaspgluglumethiscysserasp165170175aspglyphetrpserlysglulysprolyscysvalgluilesercys180185190lysserproaspvalileasnglyserproileserglnlysileile195200205tyrlysgluasngluargpheglntyrlyscysasnmetglytyrglu210215220tyrsergluargglyaspalavalcysthrgluserglytrpargpro225230235240leuprosercysgluglulyssercysaspasnprotyrileproasn245250255glyasptyrserproleuargilelyshisargthrglyaspgluile260265270thrtyrglncysargasnglyphetyrproalathrargglyasnthr275280285alalyscysthrserthrglytrpileproalaproargcysthrleu290295300lysprocysasptyrproaspilelyshisglyglyleutyrhisglu305310315320asnmetargargprotyrpheprovalalavalglylystyrtyrser325330335tyrtyrcysaspgluhisphegluthrproserglysertyrtrpasp340345350hisilehiscysthrglnaspglytrpserproalavalprocysleu355360365arglyscystyrpheprotyrleugluasnglytyrasnglnasntyr370375380glyarglysphevalglnglylysserileaspvalalacyshispro385390395400glytyralaleuprolysalaglnthrthrvalthrcysmetgluasn405410415glytrpserprothrproargcysileargvallysthrcysserlys420425430serserileaspilegluasnglypheilesergluserglntyrthr435440445tyralaleulysglulysalalystyrglncyslysleuglytyrval450455460thralaaspglygluthrserglyserilethrcysglylysaspgly465470475480trpseralaglnprothrcysilelyssercysaspileprovalphe485490495metasnalaargthrlysasnaspphethrtrpphelysleuasnasp500505510thrleuasptyrglucyshisaspglytyrgluserasnthrglyser515520525thrthrglyserilevalcysglytyrasnglytrpseraspleupro530535540ilecystyrgluargglucysgluleuprolysileaspvalhisleu545550555560valproasparglyslysaspglntyrlysvalglygluvalleulys565570575phesercyslysproglyphethrilevalglyproasnservalgln580585590cystyrhispheglyleuserproaspleuproilecyslysglugln595600605valglnsercysglyproproprogluleuleuasnglyasnvallys610615620glulysthrlysgluglutyrglyhissergluvalvalglutyrtyr625630635640cysasnproargpheleumetlysglyproasnlysileglncysval645650655aspglyglutrpthrthrleuprovalcysilevalglugluserthr660665670cysglyaspileprogluleugluhisglytrpalaglnleuserser675680685proprotyrtyrtyrglyaspservalglupheasncyssergluser690695700phethrmetileglyhisargserilethrcysilehisglyvaltrp705710715720thrglnleuproglncysvalalaileasplysleulyslyscyslys725730735serserasnleuileileleuglugluhisleulysasnlyslysglu740745750pheasphisasnserasnileargtyrargcysargglylysglugly755760765trpilehisthrvalcysileasnglyargtrpaspprogluvalasn770775780cyssermetalaglnileglnleucysproproproproglnilepro785790795800asnserhisasnmetthrthrthrleuasntyrargaspglyglulys805810815valservalleucysglngluasntyrleuileglngluglygluglu820825830ilethrcyslysaspglyargtrpglnserileproleucysvalglu835840845lysileprocysserglnproproglnilegluhisglythrileasn850855860serserargserserglnglusertyralahisglythrlysleuser865870875880tyrthrcysgluglyglypheargileserglugluasngluthrthr885890895cystyrmetglylystrpserserproproglncysgluglyleupro900905910cyslysserproprogluileserhisglyvalvalalahismetser915920925aspsertyrglntyrglyglugluvalthrtyrlyscyspheglugly930935940pheglyileaspglyproalailealalyscysleuglyglulystrp945950955960serhispr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