本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7，還涉及含有該表達(dá)盒表達(dá)載體及該載體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鏈霉菌是一類重要的次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌，有重要價值的抗生素等次級代謝產(chǎn)物約80％由鏈霉菌產(chǎn)生。很多鏈霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物都具有很高的應(yīng)用價值，構(gòu)建相應(yīng)的高產(chǎn)菌株可以有效降低成本，提高生產(chǎn)效率。目前常用的構(gòu)建次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的方法包括提升限速步驟酶活、增強(qiáng)基因簇內(nèi)正調(diào)控基因的表達(dá)、敲除負(fù)調(diào)控基因、改造與倍增次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇等。在這些方法中，提升限速步驟酶活與增強(qiáng)基因簇內(nèi)正調(diào)控基因的表達(dá)這兩種方法最為簡單易行，僅需要通過整合型載體導(dǎo)入對應(yīng)的基因表達(dá)盒即可，也得到了廣泛的應(yīng)用。已有部分高效表達(dá)系統(tǒng)用于鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提升等研究，但是這些系統(tǒng)不同程度的存在轉(zhuǎn)錄量不夠高或者在不同種的鏈霉菌間通用性不好等問題。

T7RNA聚合酶來源于大腸桿菌T7噬菌體，T7RNA聚合酶-T7啟動子系統(tǒng)由于其特異性與高效性，是目前在大腸桿菌中應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。理論上，只要在鏈霉菌中穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶，在該菌株中即可利用T7啟動子大量表達(dá)目的基因。但是與大腸桿菌相比，鏈霉菌的基因組GC含量更高，T7RNA聚合酶中有大量的密碼子在鏈霉菌中的使用頻率很低，這會使得T7RNA聚合酶的鏈霉菌中的表達(dá)受到影響。想要使T7RNA聚合酶-T7啟動子系統(tǒng)在鏈霉菌中高效運(yùn)行，對T7RNA聚合酶所有序列根據(jù)鏈霉菌的密碼子使用偏好性進(jìn)行優(yōu)化是必需的。因此，有必要提供一套適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶-T7啟動子高效表達(dá)系統(tǒng)用于次級代謝產(chǎn)物的超量表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7；本發(fā)明的目的之二在于提供含有所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7的高效表達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在于提供高效表達(dá)載體的應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、含有所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7的高效表達(dá)載體。

優(yōu)選的，所述高效表達(dá)載體由以下方法構(gòu)建：將SEQ ID NO.1所示序列經(jīng)SpeI和EcoRI酶切后連入經(jīng)XbaI和EcoRI酶切的pSET152質(zhì)粒，獲得pPAT載體，然后再將SEQ ID NO.2所示序列經(jīng)EcoRI酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pPAT載體，得到高效表達(dá)載體pPhT7-PAT。

3、所述適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7在提高鏈酶菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量中的應(yīng)用。

4、所述高效表達(dá)載體在提高鏈酶菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量或表達(dá)重組蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了適用于鏈霉菌的T7RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7，該表達(dá)盒根據(jù)鏈霉菌的密碼子偏好優(yōu)化設(shè)計，能夠在鏈霉菌中高效表達(dá)，可用于提高鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和高效表達(dá)重組蛋白，并縮短發(fā)酵時間，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說明：

圖1為高效表達(dá)激活子的重組菌株與野生型菌株的放線紫紅素產(chǎn)量對比，WT：野生型菌株Streptomyces coelicolor M145，S1：高效表達(dá)放線紫紅素的重組菌株Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T。

圖2為高效表達(dá)激活子的重組菌株與野生型菌株的生長量(干重)，WT：野生型菌株Streptomyces coelicolor M145，S1：高效表達(dá)放線紫紅素的重組菌株Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

本發(fā)明中放線紫紅素(actinorhodin，ACT)產(chǎn)量的測定采用比色法，具體方法如下：取1ml發(fā)酵液，加入1ml 2M氫氧化鉀混合均勻，5000g離心5min后，取1ml上清測定其OD₆₄₀值。

實(shí)施例1、構(gòu)建適用于鏈霉菌的高效表達(dá)載體pPhT7-PAT

擴(kuò)增目的基因表達(dá)盒PAT：以pNgrR為模板，引物對PT7F與T7TER進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PT7F與T7TER序列如下：

PT7F：aattactagtctcgatcccgcgaaattaata(下劃線表示SpeI酶切位點(diǎn))(SEQ ID NO.1)；

T7TER：aattgaattcatccggatatagttcctcctttc(下劃線表示EcoRI酶切位點(diǎn))(SEQ ID NO.2)；

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃5min變性；95℃30s，60℃30s，72℃30s擴(kuò)增30個循環(huán)； 72℃10min；

擴(kuò)增獲得目的基因表達(dá)盒PAT，具體如SEQ ID NO.3所示。將擴(kuò)增產(chǎn)物用SpeI和EcoRI酶切處理后與經(jīng)XbaI和EcoRI酶切的pSET152質(zhì)粒相連，得到載體pPAT。

再根據(jù)模式菌株天藍(lán)色鏈霉菌的密碼子使用頻率對大腸桿菌T7噬菌體T7RNA聚合酶進(jìn)行優(yōu)化，然后合成T7RNA聚合酶表達(dá)盒pPhT7，具體序列如SEQ ID NO.4所示，該序列上游包含了鏈霉菌組成型表達(dá)啟動子P_hrdB，下游含有密碼子優(yōu)化后的T7RNA聚合酶序列，然后將SEQ ID NO.4所示序列用EcoRI酶切后連入經(jīng)同樣酶切的pPAT質(zhì)粒，得到鏈霉菌高效表達(dá)載體pPhT7-PAT。

實(shí)施例2、表達(dá)載體pPhT7-PA2O4T的構(gòu)建

根據(jù)actII-ORF4序列(NCBI登錄號AF335989.1)設(shè)計擴(kuò)增放線紫紅素生物合成的激活子actII-ORF4的引物，具體序列如下：

A2O4F:5’-aattcatatgagattcaacttattgggac-3’(SEQ ID NO.5)(下劃線表示NdeI酶切位點(diǎn))；

A2O4R:5’-aattagatctctacacgagcaccttctcaccg-3’(SEQ ID NO.6)(下劃線表示BglII酶切位點(diǎn))；

然后以天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor M145基因組DNA為模板，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：95℃5min變性；95℃30s，65℃30s，72℃30s擴(kuò)增30個循環(huán)；72℃10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的條帶，然后將回收產(chǎn)物用NdeI與BglII進(jìn)行雙酶切，然后將酶切產(chǎn)物連接經(jīng)NdeI與BamHI酶切的pPhT7-PAT載體，得到表達(dá)載體pPhT7-PA2O4T。

實(shí)施例3、放線紫紅素的高效表達(dá)

將表達(dá)載體pPhT7-PA2O4T利用大腸桿菌-鏈霉菌種間接合轉(zhuǎn)移的方法導(dǎo)入Streptomyces coelicolor M145菌株(WT)中，獲得重組菌株，命名為Streptomyces coelicolor M145/pPhT7-PA2O4T(S1)。將重組菌株在種子培養(yǎng)液YEME中以200rpm，28℃培養(yǎng)48h，以1％接種量接種至R5培養(yǎng)基中以200rpm，28℃培養(yǎng)192h，每隔24h取一次樣檢測放線紫紅素和菌株濃度。同時將野生型Streptomyces coelicolor M145菌株按照相同方式培養(yǎng)與取樣，作為對照。

放線紫紅素檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示與野生型菌株相比，重組菌株在48h時即開始大量表達(dá)放線紫紅素，且在144h時就能達(dá)到最高產(chǎn)量(約為對照菌株最高產(chǎn)量的15.7倍)，而對照菌株在72h后才開始大量表達(dá)放線紫紅素，且在192h時才達(dá)到最高產(chǎn)量。菌株濃度檢 測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果顯示重組菌株的生長狀況與野生型菌株相比則沒有明顯差別。該結(jié)果說明本方法可以應(yīng)用于鏈霉菌，大幅提升次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，并有效縮短發(fā)酵時間。

雖然本發(fā)明已經(jīng)以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以作各種改動與修飾，包括但不限定于替換T7RNA聚合酶啟動子、替換表達(dá)的目的基因、替換作用的宿主鏈霉菌等。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求書界定的為準(zhǔn)。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。

<110> 西南大學(xué)；

<120> 適用于鏈霉菌的T7 RNA聚合酶表達(dá)盒PhT7及其表達(dá)載體和應(yīng)用

<160> 6

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PT7F

<400> 1

aattactagt ctcgatcccg cgaaattaat a 31

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PT7F

<400> 2

aattgaattc atccggatat agttcctcct ttc 33

<210> 3

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 目的基因表達(dá)盒PAT

<400> 3

ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact atagggagaa ggagacggag aatctcgacg 60

ggggcgcagc atatgaacct tggatccggt accagtactc accaccacca ccaccactga 120

gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa 180

taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga 240

ggaactatat ccggatgaat tc 262

<210> 4

<211> 3080

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7 RNA聚合酶表達(dá)盒pPhT7

<400> 4

ccgccttccg ccggaacggc ggggtccggg cacgccaaac ccctcctgtg gctgtggccg 60

gccaccgccg tcaccttcgg accccgtgga gccgctcccg gttccacggg gtccgaaggt 120

gtgatgagca ggctgcgcct tcctcgcgcg gccgcaaggt acgagttgat gaccttgttt 180

atccgcatct gaccaatttt gatcgcttac ggggtgtgac tcgggccacg cggattgggc 240

gtaacgctct tgggaacaac acgatgacct aagaggtgac agccgcggag ggaatacgga 300

cgccgttcac ggcgctgtgc atctccccgg cccgcccgca ccgtcggccc attcccaagc 360

cggtggtcgg cccctgtccg ccgtggacgg ggccggaagc cgtttttcaa cgttccgaga 420

ggttgttcat gaataccatc aacattgcga aaaacgactt ctccgatatc gagctggccg 480

cgatcccctt caataccctc gcggaccact atggcgaacg gctggcccgg gaacaactgg 540

cgctggagca cgagtcctac gagatgggcg aggcccggtt ccggaaaatg ttcgaacggc 600

agctgaaggc cggcgaagtc gccgacaacg cggccgcgaa gcccctgatc acgaccctgc 660

tgcccaagat gattgcccgc atcaacgact ggttcgaaga ggtcaaggcg aagcgcggca 720

agcgccccac ggccttccag ttcctccagg agatcaaacc cgaagccgtc gcgtacatca 780

ccatcaagac gaccctggcc tgcctcacct ccgccgacaa tacgacggtc caggcggtgg 840

cgtccgccat cggccgcgcg atcgaggacg aagcccggtt tggccgcatc cgcgatctcg 900

aggccaagca cttcaaaaag aacgtcgaag agcaactgaa caagcgcgtc ggccacgtgt 960

acaagaaggc cttcatgcag gtggtcgagg cggacatgct gtccaagggc ctgctgggcg 1020

gcgaggcgtg gtcctcctgg cacaaggagg actcgatcca cgtgggggtg cgctgcattg 1080

agatgctgat cgagtccacg gggatggtct ccctgcaccg gcagaacgcg ggggtggtcg 1140

ggcaggattc cgagaccatc gaactggccc ccgagtatgc cgaagccatc gcgacccgcg 1200

cgggcgcgct cgccggcatc tcgccgatgt tccagccctg cgtggtgccg cccaaaccgt 1260

ggaccggcat caccgggggc ggctattggg ccaacgggcg ccggcccctg gccctcgtcc 1320

ggacccactc gaagaaggcc ctgatgcgct atgaggacgt ctatatgccg gaggtctaca 1380

aggcgatcaa catcgcccaa aataccgcgt ggaagatcaa caagaaggtc ctggccgtgg 1440

ccaatgtcat cacgaaatgg aagcactgcc ccgtggagga catcccggcc atcgagcgcg 1500

aggaactccc catgaagccc gaggacatcg acatgaaccc cgaagccctc accgcgtgga 1560

aacgcgccgc ggcggcggtc taccgcaagg acaaagcgcg gaaatcccgc cgcatctccc 1620

tggagttcat gctggagcag gcgaacaagt ttgccaacca caaggcgatc tggttcccgt 1680

acaacatgga ctggcgcggg cgcgtgtatg cggtgtccat gttcaacccg cagggcaacg 1740

atatgaccaa gggcctcctc accctcgcga agggcaagcc gatcgggaag gagggctact 1800

actggctgaa gatccatggg gcgaactgcg ccggcgtcga caaagtcccg ttcccggagc 1860

ggatcaaatt catcgaggag aaccacgaga acatcatggc gtgcgccaag tcgcccctgg 1920

aaaacacctg gtgggccgag caggattcgc ccttctgctt tctggccttc tgcttcgaat 1980

acgccggggt gcaacaccat ggcctctcct acaattgctc gctgcccctg gcctttgacg 2040

gctcctgctc cggcatccag cacttctccg ccatgctgcg ggacgaagtg ggcgggcggg 2100

ccgtcaatct gctcccgtcc gagacggtcc aggacatcta cgggatcgtg gccaagaagg 2160

tcaacgaaat tctgcaggcc gacgccatca atggcacgga caacgaggtg gtgaccgtca 2220

cggacgagaa caccggcgag atttccgaga aggtcaaact gggcaccaag gccctcgccg 2280

ggcaatggct ggcgtatggc gtcacgcggt ccgtgaccaa gcggtccgtc atgacgctgg 2340

cgtacggctc gaaggagttc ggcttccggc aacaggtcct cgaagacacg atccaaccgg 2400

ccatcgactc cgggaagggc ctgatgttca cccagccgaa ccaggccgcc ggctacatgg 2460

ccaagctgat ctgggaatcg gtctcggtga ccgtcgtcgc ggccgtcgag gccatgaact 2520

ggctgaagtc cgcggccaaa ctgctggcgg cggaagtcaa agacaagaag accggggaga 2580

tcctgcgcaa gcgctgtgcc gtccactggg tcacccccga tggcttcccg gtgtggcagg 2640

agtacaaaaa gcccatccaa acgcgcctga acctgatgtt tctgggccag ttccggctcc 2700

agccgacgat caacacgaac aaggactccg agatcgacgc gcacaagcag gagtccggca 2760

tcgcccccaa ttttgtccac tcgcaagacg gctcccacct gcgcaaaacc gtggtctggg 2820

cccacgagaa gtacggcatc gagtcgtttg ccctgatcca cgactccttc ggcacgattc 2880

cggccgacgc cgccaacctc ttcaaagccg tgcgcgaaac catggtcgac acgtatgagt 2940

cctgcgacgt cctggcggac ttctatgatc aattcgcgga ccagctgcac gagtcgcagc 3000

tggacaaaat gccggcgctc cccgccaagg ggaatctgaa tctccgggac atcctcgagt 3060

ccgacttcgc gtttgcgtga 3080

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物A2O4F

<400> 5

aattcatatg agattcaact tattgggac 29

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物A2O4R

<400> 6

aattagatct ctacacgagc accttctcac cg 32