本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領域，涉及一種基因擴增引物，尤其涉及一種基于硨磲線粒體16S基因擴增引物以及應用在鑒定硨磲物種。

背景技術(shù)：

硨磲的閉殼肌和足塊很肥大，是味鮮質(zhì)優(yōu)的烹飪原料；在中醫(yī)藥中，硨磲貝的貝殼被認為與珍珠具有同樣的療效；硨磲的觀賞價值主要在于兩個方面，一是以貝殼為原材料的各種貝雕、珠鏈等，一是活體硨磲；硨磲與其他貝類相似，在偶爾受到異物的寄生或者刺激時也能生成珍珠；在當今佛教界流行的寶石種類中可作為驅(qū)邪避兇的寶石應首推“佛教七寶”；硨磲在海洋中扮演著非常重要的角色，是評價珊瑚礁生態(tài)是否健康的重要指標之一。近年來由于各地濫捕，造成硨磲資源銳減，今后應采取措施保護有限野生資源，并開展硨磲的基礎生物學及人工養(yǎng)殖技術(shù)研究，發(fā)展硨磲養(yǎng)殖業(yè),以滿足人們的消費需求，硨磲將是一種非常有養(yǎng)殖前景的海洋經(jīng)濟貝類。

硨磲隸屬于雙殼綱，異齒亞綱，簾蛤目，是海洋中最大的雙殼貝類。截至目前發(fā)現(xiàn)并命名的有2個屬共10種，主要分布在太平洋和印度洋，我國有六種，分布在臺灣和南海，我國重點保護水生野生動物名錄里將庫氏硨磲列為一級國家保護海洋生物。

利用形態(tài)特征對硨磲進行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育的分析變得異常困難，特別對于一些近緣物種，單利用形態(tài)特征很難區(qū)分開來。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于硨磲線粒體16S基因擴增引物，通過PCR擴增特異16S片段來鑒別硨磲種類。對比分析美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)中已有的硨磲16S序列并設計特異性引物，通過重復試驗，確定了可以鑒別硨磲物種的反向引物，并找出最佳反應條件。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供基于硨磲線粒體16S基因擴增引物：

F:GGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATG

Tri_squ_YZ_R(鱗硨磲引物):TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

Tri_max_YZ_R(長硨磲引物):CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

Tri_gig_YZ_R(庫氏硨磲引物):TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

Tri_cro_YZ_R(番紅硨磲引物):TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

Hip_hip_YZ_R(硨蠔引物):CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA。

采用本發(fā)明的硨磲線粒體16S基因擴增引物，可以迅速，準確的鑒別出硨磲物種。

附圖說明

圖1為硨蠔實物圖；

圖2為圖1硨磲的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為鱗硨磲實物圖；

圖4為圖3硨磲的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5為番紅硨磲實物圖；

圖6為圖5硨磲的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實施方式

本發(fā)明的硨磲線粒體16S基因擴增引物的篩選方法采用四個步驟：a、在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載我國已有的硨磲科序列，如序列表中的序列所示；并根據(jù)硨磲科序列設計引物；b、通過PCR篩選出能較好擴增16S基因的正向引物；c、從上述得到的硨磲序列中，通過比對找出特異性序列片段設計引物；d、利用設計的特異性引物進行PCR，對硨磲物種的鑒別。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明：

1.樣品采集：于2015年～2016年，從中國南北沿海共采集硨磲2個屬6個種類的50個個體。

2.在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載已有的5種硨磲16S序列:番紅硨磲、大硨磲、鱗硨磲、長硨磲、硨蠔。

3.DNA提?。河锰旄Ｑ髣游锝M織DNA提取試劑盒提取硨磲的DNA。

4.找到擴增16S較好的正向引物：通過NCBI，找到在我國分布的五種硨磲的16S基因序列，設計了硨磲科的引物(說明：由于無鱗硨磲和其它硨磲具有明顯的不同，無需通過分子手段進行區(qū)別)。選取部分采集的硨磲個體通過正反引物兩兩組合進行PCR擴增，PCR熱循環(huán)退火溫度范圍為55℃，由1％瓊脂糖凝膠電泳比挑選出較好的F。

5.結(jié)合特異性反向引物鑒別硨磲物種：

通過比對序列設計驗證不同硨磲的引物，針對特異性序列設計反向引物如下：

Tri_squ_YZ_R(鱗硨磲引物):TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

Tri_max_YZ_R(長硨磲引物):CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

Tri_gig_YZ_R(庫氏硨磲引物):TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

Tri_cro_YZ_R(番紅硨磲引物):TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

Hip_hip_YZ_R(硨蠔引物):CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA，

通過反向引物R和F組合，PCR熱循環(huán)退火溫度范圍為60℃，擴增產(chǎn)物用1％的瓊脂糖電泳進行檢測。

6.驗證引物擴增條件：上述F與驗證R擴增引物的50μL PCR反應體系為：

反應條件:(三步法)

98℃10sec，60℃5sec，72℃30sec，循環(huán)35圈。

7.驗證引物擴增結(jié)果：取硨磲進行驗證，如說明書附圖2、4、6瓊脂糖凝膠電泳圖所示，左邊第一個孔為2000Marker，第二孔到第六個孔分別對應的反向引物為，Tri_gig_YZ_R(庫氏硨磲引物)，Hip_hip_YZ_R(硨蠔引物)，Tri_max_YZ_R(長硨磲引物)，Tri_squ_YZ_R(鱗硨磲引物)，Tri_cro_YZ_R(番紅硨磲引物)。

圖1所示的硨磲通過提取DNA后，進行PCR，結(jié)果如說明書附圖2所示，從圖2的瓊脂糖凝膠電泳圖可以看出第三個孔有明顯亮帶，因此可以證明該硨磲是硨蠔。

圖3所示的硨磲通過提取DNA后，進行PCR，結(jié)果如說明書附圖4所示，從圖4的瓊脂凝膠電泳圖可以看出第五個孔有明顯亮帶，因此可以證明該硨磲是鱗硨磲。

圖5所示的硨磲通過提取DNA后，進行PCR，結(jié)果如說明書附圖6所示，從圖6的瓊脂凝膠電泳圖可以看出第六個孔有明顯亮帶，因此可以證明該硨磲是番紅硨磲。

因此，采用本發(fā)明的硨磲線粒體16S基因擴增引物，可以迅速，準確的鑒別出硨磲物種。

以上所揭露的僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，當然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，因此依本發(fā)明權(quán)利要求所作的等同變化，仍屬于本發(fā)明所涵蓋的范圍。

序列表

<110> 海南大學

<120> 基于硨磲線粒體16S基因擴增引物及其應用

<130> 2016

<160> 12

<210> 1

<211>345

<212>DNA

<213>Tridacna_squamosa （鱗硨磲）

<400> 1

CCTTAAAGTA GCGTGATAAG TCGGCCTTTA ATTGGGGTCT GGTATGAAAG GGTTGACGTC 60

GGAAAAACTG TCTCGGAAGA ACTAAGTGAA ATTTACTTTT AAGTGAAAAG GCTTAAATTA 120

AAGTAAAAGA CGAGAAGACC CTGTCGAGCT TGAGGGATTT GAATGTTTAT TAAACGTGAT 180

TAGGAGTTTG GCTGGGGCAG CAATGGAGAT ACCCTCCGTT TTTAATGCAA AGATCCATTA 240

TACTTAGAAT AATGAAAAAA GAAAAAAGCT ACCGCAGGGA TAACAGCACA AGACCGCCTC 300

AGAGGTCGTA TCGAAGGCGG TAAGTGTGAC CTCGATGTTG GATTA 345

<210> 2

<211>491

<212>DNA

<213> Tridacna derasa （無鱗硨磲）

<400> 2

AAAACATCTC TTCTAGAACT ATATTAGAAG TAGGCCCTGC CCGGTGCCCT GCGGGGTTAA 60

CGGCGGTGTT AAGCCTTAAA GTAGCGTGAT AAGTTGGCCT TTAATTGGGG TCTGGTATGA 120

AGGGGTTGAC GTCGGAGAAA CTGTCTCGGA AAGATAAAAT GAAATTTACG TCCTAGTGAA 180

AAGGCTGGGA TGGCTGTAAA AGACGAGAAG ACCCTGTCGA GCTTGAGGGA TATGAATGTT 240

TTAACAACAT GATTAGGAGT TTGGCTGGGG CAGCAATGGA GGTAGCCTCC ATTTTTAAAG 300

CAAAGATCCA TTAGAAAGAG ATAATGATAA AAGGAAAAAG TTACCGCAGG GATAACAGCA 360

CAAGACCGCC TCAGAGGTCG TATCGAAGGC GGTGAGTGTG ACCTCGATGT TGGATTAGGG 420

TGAACCCTTT CGTGCAGGAG CGAAAGTTGG TGGGACTGTT CTTCCTTTAA TACCCTACAT 480

GATCTGAGTT C 491

<210> 3

<211>503

<212>DNA

<213> Tridacna maxima （長硨磲）

<400> 3

CGCCTGTTTA TCAAAAACAT CTCTTCTAGC ATGATATTAG AAGTAGGCCC TGCCCGGTGC 60

CTTGCGAGGT AAACGGCGGT GTTAAACCTT AAAGTAGCGT GATAAGTCGG CCTTTAATTG 120

GGGTCTGGTA TGAAGGGGTT GACGTCGGAA AAACTGTCTC AGAAAAATTA AATGAAATTT 180

ACTTTTAAGT GAAAAGGCTT AAATGAGAGT AAAAGACGAG AAGGCCCTGT CGAGCTTGAG 240

GGATTTGAAT ATTTAGTAAA TGTGATTAGG AGTTTGGCTG GGGCAGCAAT GGAGATAGCC 300

TCCGTTTTTA AAGCAAAGAT CCATTATGTT CAAGATAATG AAAAAGGAAA AAGCTACCGC 360

AGGGATAACA GCACAAGACC GCCTCAGAGG TCGTATCGAA GGCGGTAAGT GTGACCTCGA 420

TGTTGGATTA GGGTAAACCT CTTTGTGCAG GAGCAAAGTG GGTAGGACTG TTCTTCCTTT 480

AATCCCCTAC ATGATCTGAG TTC 503

<210> 4

<211>500

<212>DNA

<213> Tridacna gigas （庫氏硨磲）

<400> 4

TCGCCTGTTT TTCAAAAACA TCTCTTCTAG AACTATATTA GAAGTAGGCC CTGCCCGGTG 60

CCCTGCGGGG TTAACGGCGG TGTTAAGCCT TAAAGTAGCG TGATAAGTTG GCCTTTAATT 120

GGGGTCTGGT ATGAAGGGGT TGACGTCGGA GAAACTGTCT CGGAAAGATA AAATGAAATT 180

TACGTCCTAG TGAAAAGGCT GGGATGGCTG TAAAAGACGA GAAGACCCTG TCGAGCTTGA 240

GGGATATGAA TGTTTTAACA ACATGATTAG GAGTTTGGCT GGGGCAGCAA TGGAGGTAGC 300

CTCCATTTTT AAAGCAAAGA TCCATTAGAA AGAGATAATG ATAAAAGGAA AAAGTTACCG 360

CAGGGATAAC AGCACAAGAC CGCCTCAGAG GTCGTATCGA AGGCGGTGAG TGTGACCTCG 420

ATGTTGGATT AGGGTGAACC CTTTCGTGCA GGAGCGAAAG TTGGTGGGAC TGTTCTTCCT 480

TTAATACCCT ACGTGATCTG 500

<210> 5

<211>504

<212>DNA

<213> Tridacna crocea （番紅硨磲）

<400> 5

TCGCCTGTTT ATCAAAAACA TCTCTTCTAG TATGATATTA GAAGTAGGCC CTGCCCGGTG 60

CCTTGCGAGG TAAACGGCGG TGTTAAACCT TAAAGTAGCG TGATAAGTCG GCCTTTAATT 120

GGGGTCTGGT ATGAAAGGGT TGACGTCGGA AAAACTGTCT CGGAAGAATT AAGTGAAATT 180

TACTTTTAAG TGAAAAGGCT TAAATTAAAG TAAAAGACGA GAAGACCCTG TCGAGCTTGA 240

GGGATTTGAA TGTTTATCAA ACGTGATTAG GAGTTTGGCT GGGGCAGCAA TGGAGGTAGC 300

CTCCGTTTTT AGCGCATAGA TCCATTTTAT CTAAGATAAT GAAAAAAGAA AAAAGCTACC 360

GCAGGGATAA CAGCACAAGA CCGCCTCAGA GGTCGTATCG AAGGCGGTAA GTGTGACCTC 420

GATGTTGGAT TAGGGTAAAC CTCTTTGTGC AGGAGCAAAG CGGGTAGGAC TGTTCTTCCT 480

TTAATCCCCT ACATGATCTG AGTT 504

<210> 6

<211>450

<212>DNA

<213> Hippopus hippopus （硨蠔）

<400> 6

GAAGTATACT GGAAGTAGGC CCTCGCCCGG TGCCCTGCGG GGTTAACGGC GGTGTTAAAC 60

CTTAAAGTAG CGTGATAGAT TGGCCTTTAA TTGGGGTCTG GTATGAATGG GTTGACGTCG 120

GAAATGCTGT CTCAAAAAAA TATAATGAAA TTTACTTTTC AGTGAAAAGG CTGAAATTTG 180

AGTAAAAGAC GAGAAGACCC TATCGAGCTT GAGGGATTCT AATGTTGTAA AACCGTTAGA 240

AGGAGTTTGG CTGGGGCAGC AACGGAGGTA ACCTCCGTTT TTAAGTCGAA GATCCATTAG 300

ATTGGTTAAT GATAAGAGGA AAAAGTTACC GTAGGGATAA CAGCACCAGA CCGCCTCAGA 360

GGCCGTATCG AAGGCGGAAG GTGTGACCTC GATGTTGGAT CACGGTGAAC CGCATGGTGC 420

AGGAGCTATG CAGGTGGGAG TGTTCTTCCT 450

<210> 7

<211>24

<212>DNA

<213> 正向引物

<400> 7

F: GGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATG

<210> 8

<211>24

<212>DNA

<213>鱗硨磲引物

<400> 8

TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

<210> 9

<211>25

<212>DNA

<213>長硨磲引物

<400> 9

CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

<210> 10

<211>24

<212>DNA

<213>庫氏硨磲引物

<400> 10

TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

<210> 11

<211>25

<212>DNA

<213>番紅硨磲引物

<400> 11

TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

<210> 12

<211>25

<212>DNA

<213>硨蠔引物

<400> 12

CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA