本發(fā)明屬于生物技術領域或者酶工程技術領域，涉及一種海藻糖合成酶的表達過程，具體涉及在微生物中表達該海藻糖合成酶，并提高其熱穩(wěn)定性的方法。

背景技術：

海藻糖合成酶（EC 5.4.99.16）是一種新型變位酶，通過分子內轉塘基作用將α,α-1,4糖苷鍵連接的麥芽糖一步轉化為α,α-1,1糖苷鍵連接的海藻糖，工藝簡單，易于調控，適合工業(yè)放大生產。海藻糖合成酶一步酶催化過程既不消耗高能物質（如UDP，二磷酸尿核苷），也不依賴磷酸，且底物麥芽糖目前生產技術成熟，廉價易得，與成品海藻糖相比有較大的價格空間?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成酶分子量集中在60-80 kDa，報道的麥芽糖轉化率在50%-70%左右，其中轉化率較高的海藻糖合成酶基因多來自極端微生物和嗜熱菌，也體現(xiàn)了海藻糖的抗逆性。

海藻糖是自然界中普遍存在的一種非還原性二糖，作為一種天然的非特異性生物保護劑備受人們的矚目。隨著海藻糖應用范圍日益擴大，市場需求不斷增加。海藻糖化學性質非常穩(wěn)定，1,1糖苷鍵決定海藻糖本身為非還原性，耐水解性，與蛋白質相互作用顯示出化學惰性，具有較高的熱穩(wěn)定性和較寬的pH穩(wěn)定范圍，不與蛋白質或氨基酸發(fā)生美拉德反應。自然界中，海藻糖可以作為碳源/能源，調節(jié)滲透，是細菌細胞壁的結構成分，干燥保護劑，防凍劑，免疫原性（分枝桿菌的索狀因子）和植物生長調節(jié)劑。海藻糖對多種生物活性物質具有保護作用，可以在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣條件下在細胞表面形成保護膜，有效保護蛋白質分子不變性失活，在科學界素有“生命之糖”的美譽。

蛋白質的質量控制系統(tǒng)，即蛋白質內穩(wěn)態(tài)，包括蛋白質合成、折疊、去折疊和周轉。細胞內，分子伴侶不僅可以識別并幫助新合成蛋白的折疊，且對許多錯誤折疊蛋白的聚集-降解具有調控作用。細胞內大多數(shù)天然蛋白質能自發(fā)形成比較穩(wěn)定的天然結構（或配體、代謝因子輔助穩(wěn)定），但10%-20%新合成的多肽鏈需要分子伴侶的幫助才能正確折疊。分子伴侶網(wǎng)絡和蛋白酶系統(tǒng)是保證蛋白質正常功能的兩大質量控制系統(tǒng)。分子伴侶廣泛存在于生物體內，保護蛋白質胞內合成與運輸，防止其產生聚集；或應激各種外界壓力，輔助其合成正確的蛋白質。Drummond及其同事用同位素標記酵母細胞中的蛋白質，高溫處理細胞（細胞不致死），緊接著迅速冷凍，獲取細胞內源蛋白的實時變性圖像并通過質譜分析蛋白質的聚集。研究院推測高溫導致蛋白變性的同時，刺激細胞過量表達分子伴侶熱激蛋白，協(xié)助變性蛋白的復性，蛋白質變性聚集的復合體可能會重塑蛋白合成途徑，抑制大多數(shù)正在翻譯的新蛋白，避免新合成蛋白的變性聚集。蛋白質整體結構上的剛性和催化中心柔性之間的平衡，共同決定了酶的熱穩(wěn)定性。（Edward W.J. WALLACE, et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress [J]. Cell, 2015, 162(6): 1286-1298.）。

本課題組已經(jīng)在前期研究中構建了一株能產海藻糖合成酶的大腸桿菌工程菌，已于2012.05.22申請了中國發(fā)明專利并已授予專利權，專利公開號為CN102690795A，發(fā)明名稱為“一種灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶及其編碼基因和應用”。

目前，通過蛋白質工程對海藻糖合成酶的合成過程進行改造，進一步提高酶的催化效率，具有廣闊的前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于提高海藻糖合成酶催化麥芽糖生成海藻糖反應中酶的催化效率，以降低催化劑成本。

為了解決本發(fā)明的技術問題，本發(fā)明提供的技術方案為：

一種提高海藻糖合成酶熱穩(wěn)定的方法，其中，在大腸桿菌中共表達熱激蛋白基因和海藻糖合成酶基因，且還包括，在表達海藻糖合成酶的體系中外源添加海藻糖。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述熱激蛋白基因為GroEL/S基因（GENE BANK ID94866/ID948655）， DnaK/J基因（GENE BANK ID944750/ID944753）， TF基因（GENE BANK ID945081）， GrpE基因（GENE BANK ID947097）中的一種或多種。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述海藻糖的添加濃度為0.25-1mol/L。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述熱激蛋白和海藻糖合成酶通過誘導表達，且在表達過程中，依次誘導表達熱激蛋白，海藻糖合成酶；且在海藻糖合成酶誘導表達后外源添加海藻糖。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述熱激蛋白由阿拉伯糖誘導表達，由葡萄糖抑制熱激蛋白的表達，阿拉伯糖的誘導濃度為0.5-4 mg/mL，葡萄糖的抑制濃度為0.5-2 mg/mL；海藻糖合成酶由IPTG誘導表達。

本發(fā)明所述的方法，其中，誘導表達所述熱激蛋白時，大腸桿菌OD₆₀₀值為在0.2-0.4之間；誘導表達所述海藻糖合成酶時， OD₆₀₀值為在0.6-0.8，誘導表達的時間為8-12h。

本發(fā)明所述的方法，其中，所述海藻糖合成酶基因為Tres基因。

在一個優(yōu)選的方案中，將灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶pET28a-Tres質粒，與熱激蛋白質粒pG-KJE8 (DnaK-DnaJ-GrpE GroES-GroEL)， pGro7 (GroES-GroEL)，pKJE7 (DnaK-DnaJ-GrpE)，pG-TF2 (GroES-GroEL-tig)，pTF16 (tig)采用熱激法共轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中共表達。

其中，海藻糖合成酶pET28a-Tres質?？剐詾閗an，工作濃度為30-50 ug/mL，使用濃度為0.1-1 mmol/L的 IPTG在OD₆₀₀ 達到0.6-0.8 時誘導；熱激蛋白質?？剐詾閏mr，工作濃度為20 ug/mL，使用濃度為0.5-4 mg/mL L-阿拉伯糖和或1-10 ng/mL四環(huán)素在OD₆₀₀達到0.2-0.4時誘導熱激蛋白的表達，使用濃度為0.5-2 mg/mL葡萄糖抑制熱激蛋白的表達。具體的，將具有共表達能力的菌株以1.5%的接種量轉接到新的液體LB培養(yǎng)基中。當大腸桿菌工程菌37℃培養(yǎng)1 h左右，OD₆₀₀達到0.2-0.4，含有pG-KJE8 (DnaK-DnaJ-GrpE GroES-GroEL)使用L-阿拉伯糖和四環(huán)素作為誘導劑，pGro7 (GroES-GroEL)，pKJE7 (DnaK-DnaJ-GrpE)，pTF16 (tig)使用L-阿拉伯糖作為誘導劑，pG-TF2 (GroES-GroEL-tig)使用四環(huán)素作為誘導劑。葡萄糖抑制阿拉伯糖操縱子的表達，作為對照。37℃培養(yǎng)2 h左右，OD₆₀₀ 達到0.6-0.8，加入IPTG誘導海藻糖合成酶的表達。

同時，在大腸桿菌的培養(yǎng)過程中的任一時間段加入海藻糖，優(yōu)選在海藻糖合成酶誘導表達以后加入海藻糖后，使海藻糖在體系中的濃度為0.25-1mol/L。

在本發(fā)明的有益效果在于：

（1）通過在培養(yǎng)過程中的措施，有效提高了在高溫條件處理后海藻糖合成酶的催化效率，有利于其催化麥芽糖合成海藻糖的過程。

（2）經(jīng)過改造，海藻糖合成酶耐熱溫度得到提高，可以抵御環(huán)境的惡劣程度，進而降低對生產環(huán)境的要求。

（2）本發(fā)明的技術原理可能在于：海藻糖作為一種化學分子伴侶，通過維持細胞的滲透壓，穩(wěn)定蛋白質的天然結構，提高蛋白質抵抗外界各種壓力的能力，作用方式類似于分子伴侶，是獨立于分子伴侶系統(tǒng)的另一種輔助蛋白質正確折疊的系統(tǒng)。海藻糖加入體系后，會明顯改變介質粘度和水活度。海藻糖不僅可以協(xié)助分子伴侶穩(wěn)定蛋白質的結構，降低蛋白質的錯誤折疊和聚集，且作為通用持久存在的伴侶，直接輔助蛋白質折疊過程中形成的柔性通道結構域，增加非天然構象的靈活性，緩解壓力條件下蛋白質產生的錯誤折疊。

（3）本發(fā)明的另一技術原理可能在于，熱激蛋白可以識別并幫助新合成蛋白的折疊，且對錯誤折疊蛋白的聚集-降解具有調控作用。胞內新生肽鏈的成熟是在較高溫度和較高蛋白濃度且十分擁擠的環(huán)境中，以極快的速度和極高的保真度進行，分子伴侶保護胞內蛋白質的合成與運輸，防止其產生聚集；應激各種外界壓力，輔助蛋白質正確折疊。

附圖說明

圖1為海藻糖合成酶在不添加海藻糖和添加0.2 M海藻糖條件下60℃保溫酶活隨時間的變化。

圖2為海藻糖合成酶表達及與海藻糖合成酶與熱激蛋白共表達在高溫誘導條件下海藻糖合成酶酶活變化。

圖3為化學分子伴侶（海藻糖）與熱激蛋白協(xié)同作用于50℃誘導下海藻糖合成酶酶活情況。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。所列的實施例僅作闡釋之用，并標明本發(fā)明的精神和范圍并非限于此中的細節(jié)及其修改案。

實施例1

本實施例說明各生物材料的來源以及菌株的構建篩選過程

本實施例中所用的表達宿主為E.coli BL21(DE3)，為本實驗室保藏。所用的海藻糖合成酶基因來源于灰產色鏈霉菌（Streptomyces griseochromogenes），實驗室保存，相關內容已申請專利并授權。來源于灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶基因含有572個氨基酸，分子量約為66 kDa，predict protein預測蛋白質含有22.9% α-螺旋，34.09%暴露在溶劑中。

本實施例中所用的分子伴侶質粒購自TaKaRa的分子伴侶質粒試劑盒，分別是pG-KJE8 (DnaK-DnaJ-GrpE GroES-GroEL)， pGro7 (GroES-GroEL)，pKJE7 (DnaK-DnaJ-GrpE)，pG-TF2 (GroES-GroEL-tig)，pTF16 (tig)。該質粒與pET系列質粒可以在大腸桿菌中共同表達，具有質粒相容性。

本實施例中，采用熱激法共轉化兩種質粒的方法構建可同時過表達海藻糖合成酶和分子伴侶蛋白的菌株。

熱激法轉化質粒方法如下：取50 μl E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，冰上融化，取1 μl pET28a-Tres和1 μl 五種分子伴侶質粒中的一種加入感受態(tài)細胞中，輕輕轉動混勻。冰浴30 min，42 ^oC熱激1 min 30 s，冰浴2 min。加入900 μl LB培養(yǎng)基，37 ^oC培養(yǎng)45 min。取200 μl培養(yǎng)液均勻涂布在Kan⁺和Cmr⁺雙抗平板上，過夜培養(yǎng)篩選陽性克隆。即可獲得同時表達分子伴侶和目的蛋白的表達菌株。

實施例2

本實施例說明外源添加海藻糖的具體步驟以及提高海藻糖合成酶耐熱性的效果。

本實施例所用的海藻糖為食品級，有效物質含量98%，白色結晶粉末。

步驟一：誘導灰產色鏈霉菌海藻糖合成酶在大腸桿菌中大量表達，使用鎳柱純化，獲得純海藻糖合成酶溶解在PBS（Na₂HPO₄，NaH₂PO₄，pH 7.0）溶液中。

步驟二：取20毫升海藻糖合成酶酶液，分別添加0 M，0.2 M海藻糖，溶解后，分別置于60℃水浴鍋中，轉速100 rmp。保證酶均勻受熱。

步驟三：保溫0 min，5 min，10 min，15 min，20 min，25 min取200 ul酶液加入800 ul麥芽糖底物（濃度：0.15 M，PBS溶解）中，30℃條件下反應30 min測海藻糖合成酶酶活。（注：添加海藻糖保護的海藻糖合成酶酶活已經(jīng)將酶液中的海藻糖去除，所測酶活為海藻糖合成酶催化。）

海藻糖合成酶酶活測定方法：利用高效液相色譜儀（HPLC）來進行海藻糖合成酶轉化麥芽糖后的產物分析，色譜柱為Shodex Sugar SZ5532柱（6.0 mm ID × 150 mm）；檢測器：Shodex RI101；柱溫：60 ℃，壓力：30 × 10⁵ Pa；反應樣品稀釋5倍，進樣10 ul；流動相為乙腈：水（75：25）；流速1.0 mL/min。酶活力單位定義：在最適條件下，1 min轉化1 nmol麥芽糖為海藻糖所需海藻糖合成酶的量為1個酶活單位（U）。

測算后的結果如圖1所示，結果顯示海藻糖的加入可以提高海藻糖合成酶在高溫下酶活保持的時間。

實施例3

本實施例說明海藻糖合成酶與熱激蛋白大腸桿菌中共表達可以提高高溫誘導條件下海藻糖合成酶的可溶性表達量。

本實施例所用的熱激蛋白是pGro7 (GroES-GroEL)質粒，使用終濃度為0.5 mg/mL L-阿拉伯糖誘導熱激蛋白的表達，使用終濃度為0.5 mg/mL葡萄糖抑制熱激蛋白的表達。葡萄糖抑制熱激蛋白表達，0.5 mg/mL的葡萄糖濃度不會影響海藻糖合成酶的表達。

誘導溫度選取30℃，35℃，40℃，45℃，分別取同樣OD的發(fā)酵液，離心收集菌體，超聲破碎，按照實施例2步驟三酶活測定方法測定酶活。

測算后的結果如圖2所示，結果顯示熱激蛋白與海藻糖合成酶大腸桿菌中共表達提高了海藻糖合成酶高溫誘導條件下相同菌體濃度獲得較高的酶活。

實施例4

本實施例說明化學分子伴侶（海藻糖）和熱激蛋白協(xié)同作用于高溫下誘導海藻糖合成酶與熱激蛋白大腸桿菌中共表達可以提高高溫誘導條件下海藻糖合成酶的催化效率

按照實施例3進行熱激蛋白與海藻糖合成酶大腸桿菌中共同表達，協(xié)同化學分子伴侶（海藻糖）來提高高溫誘導條件下海藻糖合成酶酶活。

分別在大腸桿菌培養(yǎng)4 h時添加化學分子伴侶（海藻糖）。誘導溫度為50℃，外源添加海藻糖濃度為0 M，0.05 M，0.1 M，0.15 M，0.2 M，0.25 M。相同菌體濃度下測定海藻糖合成酶酶活。

化學分子伴侶（海藻糖）的加入提高了大腸桿菌在高溫條件下的菌體濃度。海藻糖被大腸桿菌高溫下利用，測定了菌體破碎液中未檢測到海藻糖成分。去除了外源添加海藻糖對海藻糖合成酶酶活測定過程中的影響。

本實施例的結果：L-阿拉伯糖誘導熱激蛋白的表達，培養(yǎng)4 h后添加0.15 M的海藻糖，海藻糖合成酶相對酶活最高，菌體濃度也達到最高。葡萄糖抑制熱激蛋白的表達，葡萄糖提高了菌體濃度，但海藻糖的加入沒有提高菌體濃度，且外源添加0.05 M的海藻糖，海藻糖合成酶酶活較高。結果表明，化學分子伴侶在提高海藻糖合成酶高溫誘導條件下酶活是有最適濃度的，濃度太高反而不會提高菌體濃度，也不會提高相對酶活。