本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種來源于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體的內溶素及其應用。

背景技術：

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)為革蘭氏陽性菌，是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，空氣、土壤、水及食具上。食用了被該菌污染的食物可能會引起全身非特異性炎癥反應，如惡心、嘔吐、惡寒、胃部痙攣、肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等疾病，嚴重時甚至會導致敗血癥、膿毒癥等全身性感染，對人類的健康造成極大地潛在威脅。尤其是近幾年來，金黃色葡萄球菌中出現(xiàn)了可以耐受甲氧西林的“超級細菌”(MRSA)，感染者死亡率可達有31％，目前已經有50多萬人死于“超級細菌”。

噬菌體內溶素作為一種新型的生物制劑，具有專一性強、安全性能高、不易產生抗性的特點，可以用于金黃色葡萄球菌的生物防控。盡管在1957年噬菌體內溶素裂解細菌的能力就被首次報道，但直到2001年Nelson等才證實純化的重組內溶素可以作為抗菌劑有效控制大鼠感染A族鏈球菌。到目前為止，內溶素已被用來防控和檢測食品中的食源性致病菌。與使用小分子抗生素用于抗菌治療或預防相比，專一性的內溶素不易導致抗性菌株的快速出現(xiàn)。在細菌耐藥性日益嚴重的現(xiàn)在，尤其在市場對新型抗菌劑的需求空前提高，內溶素不易產生抗性且裂解專一性的特點，使其作為新型抗菌劑具有一定的優(yōu)勢。

因此，為了更好地解決金黃色葡萄球菌日趨嚴重的耐藥性及相關內溶素缺乏的問題，本發(fā)明開發(fā)出能夠高效裂解金黃色葡萄球菌及某些革蘭氏陰性菌的寬裂解譜內溶素或內溶素基因。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種來自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體的具有顯著殺菌效果，并且具有寬裂解譜的內溶素。

本發(fā)明還提供所述的內溶素在制備殺菌劑中的應用。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種來源于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體的高效寬譜內溶素，其氨基酸序列為SEQ ID No：1所示的全部或部分氨基酸序列。經過序列結構分析，顯示該酶為噬菌體中的能夠裂解細菌細胞壁的裂解酶，經試驗證實，該氨基酸序列形成的蛋白具有較好的殺菌活性。

編碼所述的內溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

含有所述的基因的表達載體、工程菌或細胞系。

所述原核細胞表達載體為pET-28a。

所述工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

一種所述的高效寬譜內溶素在制備殺菌劑中的應用。目前尚未有文獻公開過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa002能夠產生裂解金黃色葡萄球菌細胞壁的裂解酶，而本發(fā)明的內溶素具有該功能，對金黃色葡萄球菌及某些革蘭氏陰性菌均具有有效的殺菌活性。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的內溶素通過市場上已有的適合表達載體表達、純化后，體外對金黃色葡萄球菌及某些革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出顯著的殺菌效果，可用于金黃色葡萄球菌及某些革蘭氏陰性菌殺菌劑的制備。

附圖說明

圖1為內溶素蛋白進行結構域分析預測圖；

圖2為內溶素蛋白在大腸桿菌中高效表達圖譜，M為Protein marker；1為破碎大腸桿菌后得到的粗酶液，2為粗酶液上柱過程中的流出液，3，4為過柱過程中洗脫液，5為鎳柱純化后的蛋白。

圖3為內溶素蛋白裂解耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300的吸光值變化圖譜；

圖4為溶菌酶裂解耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC43300的吸光值變化圖譜；

圖5為內溶素Lys qdsa002的在不同pH下的作用效果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。

本發(fā)明試驗涉及的菌株：金黃色葡萄球菌43300(保藏號為ATCC43300)，購買于美國ATCC中心。

本發(fā)明涉及的金黃色葡萄球菌噬菌體，該噬菌體qdsa002保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢、武漢大學，保藏編號：CCTCC NO：M 2015554，保藏日期為2015年9月17日，分類學命名：金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa002(Staphylococcus aureus bacteriophage qdsa002)。

TSB培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；

LB液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術有限責任公司；

質粒Pet-28a，美國默克公司；

大腸桿菌BL21(DE3)，北京康為世紀公司；

Ni-IDA填料，生工生物工程(上海)股份有限公司；

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，北京索萊寶科技有限公司。

溶菌酶，北京索萊寶科技有限公司。

實施例1：內溶素蛋白功能預測

本發(fā)明人對從污水中分離出金黃色葡萄球菌噬菌體qdsa002進行全基因組測序和分析，鑒定該噬菌體ORF84編碼的蛋白在氨基酸序列上與多株金黃色葡萄球菌噬菌體內溶素具有一定的相似度。使用SMART軟件對ORF84編碼的蛋白Lys qdsa002進行結構域預測分析。結構域預測結果如圖1所示，Lys qdsa002為金黃色葡萄球菌噬菌體內溶素典型的雙酶裂解系統(tǒng)的模塊結構，即在N端具有兩個催化區(qū)域：CHAP區(qū)域和Amidase-2區(qū)域，Lys qdsa002的29-160氨基酸區(qū)間屬于CHAP域，196-369氨基酸區(qū)間屬于Amidase-2域，以上兩個區(qū)域與內溶素的裂解細胞壁肽聚糖相關；Lys qdsa002的409-481氨基酸區(qū)間屬于SH3b家族，該家族與細胞壁肽聚糖結合有關。

實施例2：內溶素在大腸桿菌中的高效表達

1、重組質粒的構建

根據內溶素基因序列(SEQ ID No：2)，在不改變氨基酸序列的前提下，對內溶素基因序列的前后兩端分別設定限制性內切酶NcoI和XhoⅠ，得到將要進行合成內溶素基因序列。按得到的序列設計70條引物進行PCR擴增，完成后進行電泳，將PCR回收產物克隆入pET-28a載體的多克隆位點NcoI和XhoⅠ之間，得到重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中。

2、重組蛋白的制備

重組質粒命名為pET-28a-Lys qdsa002轉化大腸桿菌BL21(DE3)，篩選得到可表達內溶素的工程菌BL21(Lys qdsa002)，接種單菌落于2.5mL LB液體培養(yǎng)基(含30μg/mL卡那霉素)中，37℃，150r/min，過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按1:100比例接種于4L的LB液體培養(yǎng)基(含30μg/mL卡那霉素)中，37℃，220rpm培養(yǎng)約3h，當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5mM IPTG，20℃，220rpm，誘導過夜，離心收集細胞菌體。

將收集的細菌菌體用破碎Buffer(50mM Tris，500mM NaCl，pH 8.0)溶解，冰浴中超聲破碎菌體后離心，上清液過0.22μm無菌濾膜，獲得粗酶液。采用Ni-IDA進行純化，利用透析進行脫鹽處理獲得純度較高的重組蛋白。結果如圖2所示，重組蛋白Lys qdsa002得到高效表達。

圖2中M為marker，1為未經IPTG誘導的細菌總蛋白，2、3、4、5過柱過程中收集的洗脫液，6為鎳柱純化后的融合蛋白，7為超濾濃縮脫鹽后的融合蛋白，8為經過誘導的細菌總蛋白

實施例3：以金黃色葡萄球菌ATCC43300為靶細菌測試內溶素Lys qdsa002抑菌效果

挑取單菌落ATCC43300于50ml TSB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，細菌離心用0.9％無菌生理鹽水清洗2次。測定活性之前，將細菌沉淀用緩沖液(20mM PB,150mM NaCl,20％甘油，pH 7.4復融)，調整OD₅₉₀至1.5左右。在96孔板中先加入100μL細菌復融液，再加入100μl重組蛋白溶液，每隔一定時間，測定一次OD₅₉₀值，將緩沖液和溶菌酶作為空白組和陽性對照組，相同條件下培養(yǎng)，用酶標儀測定OD₅₉₀值，每組3個平行。吸光值下降反映細菌被裂解。

結果如圖3和圖4所示，重組蛋白Lys qdsa002作用持續(xù)時間可長達3天，并且裂解細菌的效果也非常好，可以使?jié)岫认陆?.3左右，證明重組蛋白Lys qdsa002具有活性；而作為陽性對照的溶菌酶的菌液濁度僅下降0.4左右，其裂解細菌的效果遠遠不及重組蛋白Lys qdsa002的裂解效果。

檢測Lys qdsa002對多株金黃色葡萄球菌及多種革蘭氏陰性菌株的抑菌活性，表1所示，Lys qdsa002能夠裂解其余多株金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性菌，具有較寬的裂解譜。(注：OD₅₉₀下降值為內溶素過夜作用后的下降值，并不是最終的下降值，最終下降值要比表中的下降值大，在此，僅利用下降值表明對作用的細菌具有一定的裂解性)

表1內溶素Lys qdsa002抑菌效果分析

實施例4：以金黃色葡萄球菌ATCC43300為靶細菌測試內溶素Lys qdsa002在不同pH下的作用效果

挑取金黃色葡萄球菌單菌落至TSB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，菌體離心，用生理鹽水清洗，得細菌沉淀，將沉淀用pH 1.0-12.0蛋白保存液復融獲得不同pH的細菌懸浮液；將重組蛋白用pH 1.0-12.0蛋白保存液稀釋。然后將不同pH值條件下的等量的重組蛋白與細菌復融液進行充分混勻，作用一段時間后，測定OD₅₉₀的數(shù)值。

為更直觀表示，各個實驗組的酶活力＝各個組的OD下降值/實驗組中OD下降最多值×100％。結果如圖5所示，內溶素Lys qdsa002在pH 8-10表現(xiàn)出較好的裂解活性，說明其作用的最適pH為8-10。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國海洋大學

<120> 來源于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌噬菌體的寬譜內溶素及其應用

<130> ZGHY-201701

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 495

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala

1 5 10 15

Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly

35 40 45

Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp

50 55 60

Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile

65 70 75 80

Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser

85 90 95

Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr

100 105 110

Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser

115 120 125

Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys

130 135 140

Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu

145 150 155 160

Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys

165 170 175

Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val

180 185 190

Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro

195 200 205

Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln

210 215 220

Tyr Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly

225 230 235 240

Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp

245 250 255

Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn

260 265 270

Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser

275 280 285

Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe

290 295 300

Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr

305 310 315 320

Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser

325 330 335

Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser

340 345 350

Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys

355 360 365

Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly

370 375 380

Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser

385 390 395 400

Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr

405 410 415

Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe

420 425 430

Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val

435 440 445

Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn

450 455 460

Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly

465 470 475 480

Val Pro Pro Asn His Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys

485 490 495

<210> 2

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctaaga ctcaagcaga aataaataaa cgtttagacg cttatgcaaa aggtacagta 60

gacagtcctt atagaattaa aaaagctaca agctatgacc catcgtttgg tgtaatggaa 120

gcaggagcaa ttgacgcaga tggttactat catgcacagt gccaagactt aattactgat 180

tatgtattat ggttaacaga taataaagtt agaacttggg gtaatgctaa agaccaaatc 240

aaacaaagtt atggtactgg atttaaaata catgaaaata aaccttctac agtacctaaa 300

aaaggatgga ttgctgtatt tacatccggt agttatcagc aatggggtca cataggtatt 360

gtatatgatg gaggtaatac ttctacattt actattttag agcaaaactg gaacggttac 420

gctaataaaa aacctacaaa acgtgtagat aattattacg gattaactca ttttattgag 480

atacctgtaa aagcaggaac tactgttaaa aaagaaacag ctaagaaaag tgcaagtaaa 540

acacctgcac ctaaaaagaa agcaacacta aaagtttcta agaaccatat taactataca 600

atggataaac gtggtaagaa acctgaagga atggtaatac acaacgatgc aggtcgttct 660

tcagggcaac aatacgagaa ttcattagct aacgcaggtt atgctagata tgctaatggt 720

attgctcatt actatggctc tgaaggttat gtatgggaag caatagatgc taagaatcaa 780

attgcttggc acacaggaga tggaacagga gcaaactcag gtaactttag atttgcaggt 840

attgaagtct gtcaatcaat gagtgctagt gatgctcaat tccttaaaaa cgaacaagca 900

gtattccaat ttactgcaga gaaatttaaa gaatggggtc ttactcctaa tcgtaaaact 960

gtaagattgc atatggaatt tgttccaaca gcttgtcctc atcgttctat ggttcttcat 1020

acaggattta atccagtaac acaaggaaga ccatctcaag caataatgaa taaactaaaa 1080

gattatttca ttaaacaaat taaaaactac atggataaag gaacttcaag ttctacagta 1140

gttaaagacg gtaaaacaag tagcgcaagt acaccggcaa ctagaccagt aacaggctct 1200

tggaaaaaga accagtacgg aacttggtac aaaccggaaa atgcaacatt tgttaatggt 1260

aaccaaccta tagtaactag aataggttct ccattcttaa atgctccagt aggaggtaac 1320

ttaccggcag gagctacaat tgtatatgac gaagtttgta tccaagcagg tcacatttgg 1380

ataggttaca atgcttacaa tggtaacaga gtatattgcc ctgttagaac ttgtcaagga 1440

gttccaccta atcatatacc tggggttgct tggggagtat tcaaa 1485