本發(fā)明涉及一種應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)生物表面活性素的方法,屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
生物表面活性素,即surfactin,是枯草芽孢桿菌經(jīng)非核糖體途徑(NRPS)合成的由長(zhǎng)鏈脂肪酸(C12-C17)和含7個(gè)氨基酸的多肽經(jīng)內(nèi)酯鍵連接起來(lái)的一種環(huán)狀脂肽,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、溶血栓、降膽固醇的藥用功效以及優(yōu)越的表面活性功能。生物表面活性素的廣譜抗菌功效有望彌補(bǔ)現(xiàn)今普遍存在的抗生素耐藥性難題,生物表面活性素的抗病毒和抗腫瘤功能也為新型藥物設(shè)計(jì)提供了一些可選方案,而生物表面活性素優(yōu)越的表面活性功能(能夠?qū)⑺肿拥谋砻鎻埩?2mN/M降低至27mN/M)使其在化妝品,醫(yī)藥,乳化劑,保濕劑和精細(xì)化工中有著廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)統(tǒng)計(jì),2006年世界表面活性劑產(chǎn)業(yè)的產(chǎn)值在200億美元以上,其中北美,西歐和中國(guó)占據(jù)了70%以上的市場(chǎng)份額。生物表面活性素作為一種優(yōu)越的生物表面活性劑,顯示出廣闊的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。因此,開(kāi)發(fā)能夠高效合成surfactin的微生物菌株及生產(chǎn)工藝對(duì)于surfactin的工業(yè)化生產(chǎn)和普及有重要意義。
目前,生物表面活性素產(chǎn)生菌的選育主要采用誘變育種和隨機(jī)篩選相結(jié)合的方法,雖然誘變菌株的生物表面活性素產(chǎn)量有所提高,但仍由于產(chǎn)率過(guò)低、菌株穩(wěn)定性差而無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),篩選野生型高產(chǎn)菌株仍然是實(shí)現(xiàn)生物表面活性素工業(yè)化生產(chǎn)的首要任務(wù)。
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌,解淀粉芽孢桿菌)在菌體生長(zhǎng)過(guò)程中僅有部分細(xì)胞能合成生物表面活性素,繼而誘發(fā)形成生物菌膜(biofilm)。芽孢桿菌菌膜形成途徑被激活后,生物表面活性素的合成受到反饋抑制,繼而表面活性素的代謝合成也隨之結(jié)束。自然界中的芽孢桿菌通過(guò)形成生物菌膜以達(dá)到應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力,獲取競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的目的,因而其生物表面活性素的合成能力都較弱,僅能合成誘導(dǎo)生物膜形成的劑量。此外,生物表面活性素surfactin具有抗生素活性,通過(guò)非特異性攻擊細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,形成胞漿滲漏,從而達(dá)到殺滅微生物的目的。這也是大多數(shù)芽孢桿菌不能過(guò)量合成surfactin的另一原因。野生型芽孢桿菌的原始產(chǎn)量一般為100-200mg/L,雖然經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件后,生物表面活性素的產(chǎn)量能達(dá)到一定程度的提高,要想繼續(xù)提高生物表面活性素的產(chǎn)率則需要昂貴的特殊發(fā)酵設(shè)備,如應(yīng)用發(fā)酵-膜提取偶聯(lián)反應(yīng)器,枯草芽孢桿菌的生物表面活性素最高產(chǎn)量約為6.5g/L。昂貴的生產(chǎn)成本是生物表面活性素仍不能商業(yè)化生產(chǎn)的主要因素。因此,獲得高產(chǎn)生物表面活性素的天然高產(chǎn)菌株,提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本,仍然是生物表面活性素商業(yè)化應(yīng)用的根本解決途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明首先提供一株超高效合成生物表面活性素surfactin的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45,該菌株已于2016年6月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC NO.12593,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào),中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
所述的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株的菌落形態(tài)表現(xiàn)為:菌落圓形、半透明,菌落表面光滑無(wú)褶皺、不形成生物菌膜,菌落中央微微凸起,顯微鏡下細(xì)胞呈桿狀、形成芽孢,革蘭氏染色陽(yáng)性。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述解淀粉芽孢桿菌MT45生產(chǎn)生物表面活性素的方法,包括以下步驟:
(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落,活化得到種子培養(yǎng)液;
(2)將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液按照1%-5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,并在25-37℃條件下培養(yǎng)30-55h。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖2%、酵母粉1%、氯化鈉0.5%,自然pH。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-100g/L,氮源1-10g/L,蛋白胨0.1-1.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0-0.2g/L;所述碳源包括蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精中的一種或幾種;所述氮源包括硝酸銨,硫酸銨,氯化銨,碳酸銨,碳酸氫銨中的一種或幾種。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為蔗糖、葡萄糖、果糖、或甘油。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖或蔗糖。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為硝酸銨、碳酸銨或硫酸銨。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為碳源10-30g/L,氮源2-6g/L,蛋白胨0.1-1.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0-0.2g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖或葡萄糖10-30g/L,硝酸銨或碳酸安或硫酸銨2-6g/L,蛋白胨0.1-1.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0.01-0.2g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L,硝酸銨6g/L,蛋白胨0.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0.18g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L,硝酸銨6g/L,蛋白胨1.5g/L,磷酸二氫鉀2g/L,磷酸氫二鈉2g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖30g/L,硝酸銨6g/L,蛋白胨0.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0.18g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為蔗糖10g/L,氮源6g/L,蛋白胨1.5g/L,硫酸鋅0.14g/L,磷酸二氫鉀4g/L,磷酸氫二鈉2g/L,硫酸鎂0.18g/L。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,步驟(1)挑取解淀粉芽孢桿菌CGMCC NO.12593純種菌落,種于種子培養(yǎng)基,在溫度37℃,搖床轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)24h得到種子培養(yǎng)液。
本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供一種新型解淀粉芽孢桿菌MT45菌株,該菌株能夠利用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基超強(qiáng)合成生物表面活性素。所述菌株生物表面活性素的合成與菌體生長(zhǎng)同步,具有產(chǎn)物(surfactin)合成與菌株生長(zhǎng)同步且無(wú)延滯期,菌株不形成生物菌膜、避免產(chǎn)物反饋抑制,菌株對(duì)產(chǎn)物耐受性強(qiáng)的特點(diǎn)。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法采用優(yōu)選的碳源和氮源及碳氮源優(yōu)選的配比,發(fā)酵55h能最高合成生產(chǎn)9.43g/L的生物表面活性素、,能夠滿(mǎn)足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)要求,具有巨大的工業(yè)應(yīng)用前景。
生物材料保藏
解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),已于2016年6月6日保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,其保藏編號(hào)為CGMCC No.12593,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
附圖說(shuō)明
圖1為解淀粉芽孢桿菌MT45在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落形態(tài)(A)和顯微鏡圖片(B)。
圖2為基于16s rRNA序列比對(duì)的解淀粉芽孢桿菌MT45系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
圖3為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)MT45(A)和模式微生物枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051(B)在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)和生物表面活性素的合成曲線(xiàn)。
圖4解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純化。
具體實(shí)施方式
活化培養(yǎng)液的組成為:以質(zhì)量百分配比計(jì),葡萄糖1%-5%、酵母粉1%-5%、氯化鈉0.3%-1.0%,水余量;pH6.5-7.0。
固體培養(yǎng)基組成為:1-10mM磷酸鉀,50-100mM Mops,2-6mM氯化鎂,0.1-1mM氯化鈣,10-80μM氯化錳,10-80μM氯化鐵,2-6μM氯化鋅,2-6μM硫胺素,0.1-1%甘油,0.1-1%谷氨酸,1%-2%瓊脂。
營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:蛋白胨2%,酵母粉1%,葡萄糖0.5%,pH 7.5。
種子培養(yǎng)基:葡萄糖2%、酵母粉1%、氯化鈉0.5%,自然pH。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基:碳源10-100g/L,氮源1-10g/L,蛋白胨0.1-1.5g/L,磷酸二氫鉀2-10g/L,磷酸氫二鈉2-10g/L,硫酸鎂0.01-0.1g/L。
實(shí)施例1菌株篩選
從中國(guó)白酒釀造高溫大曲中采集樣品,取5g樣品溶解于10ml的質(zhì)量百分比1%的氯化鈉溶液中,漩渦震蕩混勻后吸取1mL接種于活化培養(yǎng)液中,在溫度50-60℃,200rpm轉(zhuǎn)速條件下活化24-36h,制成成熟活化菌液。
取成熟活化菌液,加入質(zhì)量百分比為1%的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋。選擇稀釋梯度為10-2-10-6的稀釋液,依次涂布于固體培養(yǎng)基平板上。在溫度為30℃,濕度為40%-60%條件下培養(yǎng)48-72h;獲得大量單菌落。將獲得的單菌落接種至營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后,檢測(cè)發(fā)酵液中的生物表面活性素含量,最終得到一株高產(chǎn)生物表面活性素的純培養(yǎng)物,編號(hào)為MT45。
實(shí)施例2生物表面活性素的測(cè)定方法
生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm,4℃,離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH 2.0,放在4℃冰箱靜置2小時(shí)。然后,12000rpm,4℃,離心30min,獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。
發(fā)酵液中生物表面活性素的測(cè)定方法:采用超高效液相色譜法對(duì)生物表面活性素進(jìn)行準(zhǔn)確定量。采用waters BEH C18色譜柱,流動(dòng)相分別為(A)0.1%甲酸水溶液和(B)HPLC級(jí)甲醇,洗脫條件為30%-70%甲醇5min,70%-100%甲醇1min。采用二極管陣列檢測(cè)器,在210nm檢測(cè)樣品。將得到的色譜峰積分后,采用插入法同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比對(duì),得到表面活性素的準(zhǔn)確含量。
實(shí)施例3將實(shí)施例1篩選得到的菌株進(jìn)行菌種鑒定。
將實(shí)施例1獲得的編號(hào)為MT45的菌株進(jìn)行菌種鑒定。
解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在固體平板培養(yǎng)基上形成圓形、半透明菌落;菌落表面光滑無(wú)褶皺,不形成以褶皺菌落為代表的生物菌膜;菌落中央微微凸起。顯微鏡下細(xì)胞呈桿狀、形成芽孢,革蘭氏染色陽(yáng)性(圖1)。
對(duì)菌株16r rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)序(SEQ ID NO.1),并和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),進(jìn)化樹(shù)分析,確定MT45為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)(圖2)。
解淀粉芽孢桿菌MT45于2016年6月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏號(hào)為CGMCC No.12593。
實(shí)施例4解淀粉芽孢桿菌MT45的發(fā)酵過(guò)程
將實(shí)施例3鑒定得到的解淀粉芽孢桿菌MT45菌株在種子培養(yǎng)基中活化后,以5%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g/L,蛋白胨1.5g/L,磷酸二氫鉀2g/L,磷酸氫二鈉2g/L,硫酸鎂0.18g/L。采用500ml三角瓶裝液量100mL,在37℃,200rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵。定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)量和發(fā)酵過(guò)程中的生物表面活性素產(chǎn)量。結(jié)果如圖3,解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵至55h能最高合成3.0g/L的生物表面活性素。
解淀粉芽孢桿菌MT45能超高效合成生物表面活性素,最高產(chǎn)量可達(dá)生物量的50%;培養(yǎng)過(guò)程中合成的高濃度生物表面活性素也體現(xiàn)了菌株MT45對(duì)產(chǎn)物的高耐受性。且與模式菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ATCC6051相比,生物表面活性素合成與菌體生長(zhǎng)同步進(jìn)行,產(chǎn)物合成無(wú)延滯期。這些特性有利于縮短解淀粉芽孢桿菌MT45發(fā)酵周期,產(chǎn)生更多的目標(biāo)產(chǎn)物,有利于MT45菌株的工業(yè)化應(yīng)用。
實(shí)施例5解淀粉芽孢桿菌MT45對(duì)碳源的利用。
解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種糖作為碳源來(lái)生產(chǎn)生物表面活性劑,主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、殼聚糖、甘油、可溶性淀粉、糊精。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為:蛋白胨0.5g/L,磷酸二氫鉀2.7g/L,磷酸氫二鈉5g/L,硫酸鎂0.5g/L。碳源的濃度為10g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL,接種量為2%,培養(yǎng)條件為37℃,200rpm。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1解淀粉芽孢桿菌MT45對(duì)碳源的利用
實(shí)施例6解淀粉芽孢桿菌MT45對(duì)銨鹽的利用。
解淀粉芽孢桿菌MT45可以利用各種無(wú)機(jī)銨鹽來(lái)生產(chǎn)生物表面活性劑,主要有硝酸銨,硫酸銨,氯化銨,碳酸銨,碳酸氫銨。發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組成為:蔗糖20g/L,蛋白胨0.5g/L,磷酸二氫鉀2.7g/L,磷酸氫二鈉5g/L,硫酸鎂0.5g/L。氮源的濃度為8g/L。250mL的錐形瓶的裝樣量為50mL,接種量為2%,培養(yǎng)條件為37℃,200rpm。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2解淀粉芽孢桿菌MT45對(duì)銨鹽的利用
實(shí)施例7解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)生物表面活性素
將解淀粉芽孢桿菌MT45接種于LB培養(yǎng)基中,37℃,200rpm下培養(yǎng)過(guò)夜。將種子液按照2%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃,200rpm下培養(yǎng)48h。不同組分的發(fā)酵培養(yǎng)基的生物表面活性劑的產(chǎn)量如表3
表3解淀粉芽孢桿菌MT45利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)生物表面活性素
其中,LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化鈉10g/L。
生物表面活性素的提?。簩l(fā)酵液8000rpm,4℃,離心10min。發(fā)酵上清液用6mol/L的鹽酸調(diào)pH 2.0,放在4℃冰箱靜置2小時(shí)。然后,12000rpm,4℃,離心30min,獲得沉淀。將沉淀用甲醇萃取后獲得到生物表面活性素粗產(chǎn)品。
實(shí)施例8解淀粉芽孢桿菌MT45產(chǎn)生物表面活性素的純品制備
將實(shí)施例7中得到的生物表面活性素粗產(chǎn)品采用制備液相的方法進(jìn)行純化。采用C18色譜柱柱,流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和甲醇,洗脫條件為線(xiàn)性洗脫(30%-70%甲醇60min)。設(shè)置紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。收集40.5-53.5分鐘之間的洗脫組分,洗脫組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸去除溶劑,得到生物表面活性素純品(附圖4)。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上,但其并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉此技術(shù)的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),都可做各種的改動(dòng)與修飾,因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。