本發(fā)明涉及一種解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株可產(chǎn)重樓皂苷Ⅵ，屬于微生物技術領域。

背景技術：

目前植物內(nèi)生菌的研究逐漸受到重視，不同植物的各種內(nèi)生菌相繼被發(fā)現(xiàn)。內(nèi)生菌種類的多樣性也賦予了其代謝產(chǎn)物的多樣性，這也預示著利用微生物代謝發(fā)掘生物、化學、醫(yī)藥等新資源具有巨大的潛力。大量的研究表明，植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)及前體，這一發(fā)現(xiàn)直接推動了植物內(nèi)生菌尤其是藥用植物內(nèi)生菌研究的廣泛展開。隨著人們對藥用植物內(nèi)生菌的逐步研究，利用能夠代謝產(chǎn)生相應活性成分的內(nèi)生菌來生產(chǎn)新型、高效、低成本的活性藥物，解決珍稀中藥植物資源緊缺的現(xiàn)狀，必將成為將來藥用植物內(nèi)生菌研究的重點。

雖然植物內(nèi)生菌尤其是藥用植物內(nèi)生菌近些年來越來越受到廣大學者的關注，但是目前仍然只開展了幾百種植物的內(nèi)生菌研究，而關于珍稀中藥重樓的產(chǎn)藥用成分內(nèi)生菌的研究更是基本上僅現(xiàn)于國內(nèi)。從重樓植物體中篩選出可代謝產(chǎn)生重樓皂苷、薯蕷皂苷及皂苷元的內(nèi)生菌的研究為解決重樓藥用成分緊缺的現(xiàn)狀提供了一條新的途徑，目前已有一些學者篩選出了一些產(chǎn)皂苷或其類似物的內(nèi)生菌，但菌株數(shù)量及種類都不多，繼續(xù)篩選出一些新的產(chǎn)皂苷或皂苷元的菌株，對深入開展微生物發(fā)酵產(chǎn)皂苷或皂苷元的途徑的研究具有重要意義。

陳小靜等從華重樓塊莖中分離得到107株內(nèi)生細菌，其中有6株能夠產(chǎn)生薯蕷皂苷或其類似物，分別屬于德克斯氏菌屬、芽孢桿菌屬、動性球菌屬、腸桿菌屬。張曉潔等從華重樓中分離得到16株內(nèi)生菌，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)編號SNUS-1的菌株能代謝產(chǎn)生重樓皂苷或其類似物，并鑒定為托氏假單胞菌。任智等從華重樓中分離得到2株能代謝產(chǎn)生薯蕷皂苷的內(nèi)生細菌RZ03和RZ07。魏超等從華重樓根莖中篩選出4株能夠代謝產(chǎn)生薯蕷皂苷元的內(nèi)生真菌(WD6H、WD7H、XIAZX和A221H)，分別屬于腐皮孢霉菌、木賊鐮刀菌、尖抱鐮刀菌、大團囊菌科紅曲霉。

重樓內(nèi)生菌近幾年來才開始受到人們的關注，總體來說，關于重樓內(nèi)生菌尤其是能夠代謝產(chǎn)生相應甾體皂苷成分的研究依然相對較少，并且大部分集中在華重樓方面，而滇重樓內(nèi)生菌的研究也只限于內(nèi)生真菌，鮮有關于產(chǎn)皂苷成分的滇重樓內(nèi)生細菌的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了背景技術中的問題，提供了一種產(chǎn)重樓皂苷Ⅵ的解淀粉芽孢桿菌CLX-60菌株，該菌株可產(chǎn)重樓皂苷Ⅵ。

本發(fā)明人篩選到一株新型菌株，該菌株被命名為clx-60，屬一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學；郵編430072，保藏日期為2016年9月7日，保藏編號為：CCTCC NO：M2016463；該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述解淀粉芽孢桿菌clx-60菌株能夠用于發(fā)酵制備重樓皂苷Ⅵ。微生物發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基配方為：蔗糖12g/L，豆粕15g/L，MgCl₂ 15g/L，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH值6.0，培養(yǎng)溫度34℃，搖床轉速150r/min。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明所提供的解淀粉芽孢桿菌CLX-60菌株能夠代謝產(chǎn)生重樓皂苷Ⅵ。本發(fā)明提供的菌株可以在短期內(nèi)進行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，且發(fā)酵成本較低，又不受時域、季節(jié)等條件限制，因此能夠通過微生物發(fā)酵的途徑解決重樓自然資源日益匱乏的現(xiàn)狀，保證重樓藥用資源的長期可持續(xù)利用。同時本發(fā)明中還提供了優(yōu)化后的微生物發(fā)酵條件以及培養(yǎng)基的配方，重樓皂苷Ⅵ的產(chǎn)量較高。

附圖說明

圖1為解淀粉芽孢桿菌clx-60菌株第一次HPLC檢測圖；

圖2為解淀粉芽孢桿菌clx-60菌株第二次HPLC檢測圖；

圖3為解淀粉芽孢桿菌clx-60菌株的液質(zhì)聯(lián)用色譜檢測圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不局限于以下實施例。

菌株的分離、培養(yǎng)

本實施例中將買回來的新鮮種子用75％的乙醇進行表面消毒20min，然后用無菌水清洗3-5次，放入事先滅菌備用的研缽中，加5mL無菌水研磨成白色懸濁液。取300μL懸濁液于各個PDA培養(yǎng)基平板中，用無菌涂棒涂勻，待風干后用封口膜封口，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～9d，及時觀察，并于第3、5、7、9d分別拍照記錄，若真菌長滿平板則不再進行分離，并滅菌處理。用牙簽挑取平板上長出的細菌至LB固體培養(yǎng)基平板上進行反復純化，直至得到單一的菌落。

同時將塊莖洗凈，除去壞死的表面硬物部分，然后橫切成1cm²的薄片小塊，先用75％的酒精浸泡3～5min，再用無菌水清洗2～3遍，洗去殘余的酒精，再用無菌水浸泡大約5分鐘，取出后用滅菌的濾紙吸干表面水分。將處理后的小塊貼至PDA固體平板上，每個平板上放5片，封口膜封口后于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)5-9d，每天觀察、記錄，對長出的細菌進行反復純化。

將平板上純化完成的細菌挑取至裝有600μL LB液體培養(yǎng)基的1.5mL EP管中，封口膜封口，然后于37℃恒溫搖床中190r/min搖床培養(yǎng)1d后，加入等體積的50％的甘油，混勻后于-80℃超低溫冰箱中保存，每個菌株至少保存3份。

將保存的菌種取8μL接種到600μL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床190r/min活化培養(yǎng)，24h后取8μL活化的菌種至三角瓶中的LB液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，裝液量60ml/100ml，37℃、190r/min搖床培養(yǎng)7d。經(jīng)過以上發(fā)酵培養(yǎng)后，收集發(fā)酵液。

菌株的篩選

對各菌株發(fā)酵液樣品中重樓皂苷I、II、VI、VII進行第一次檢測，將其譜圖、數(shù)據(jù)與標品數(shù)據(jù)進行比對，即可大致確定樣品中是否含有相應重樓皂苷，再根據(jù)相應皂苷的標準曲線，即可算出相應樣品中的相應皂苷含量。為避免其它物質(zhì)可能帶來的干擾，我們在改變色譜檢測條件后，對第一次檢測所得的陽性菌株發(fā)酵液進行第二次驗證性定性檢測，包括標品的檢測和樣品的檢測。

經(jīng)過以上檢測后篩選得到一株產(chǎn)重樓皂苷Ⅵ的重樓內(nèi)生菌，將其命名為CLX-60菌株。該菌株的發(fā)酵液中重樓皂苷Ⅵ的第一次HPLC檢測如圖1所示，clx-60菌株的重樓皂苷VI的平均產(chǎn)量為：0.238mg/L。該菌株的發(fā)酵液中重樓皂苷Ⅵ的第二次HPLC檢測如圖2所示。clx-60菌株的發(fā)酵液的液質(zhì)聯(lián)用檢測圖譜中發(fā)現(xiàn)了相應的離子流，如圖3所示，進一步確定clx-60號菌株能夠代謝產(chǎn)生重樓皂苷VI。

對該菌株進行分子鑒定

取保存的CLX-60菌種接種到裝有5mL LB液體培養(yǎng)基的10mL培養(yǎng)瓶中，37℃、190r/min搖床培養(yǎng)3d。

內(nèi)生細菌DNA的提取及電泳檢測

16SrDNA的引物序列：

上游引物：16F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)

下游引物：16R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)

利用Sigma NA1020PCR產(chǎn)物回收試劑盒進行16SrDNAPCR產(chǎn)物的純化回收。

16SrDNA片段與克隆載體的連接

將回收的16S rDNA片段與pMD 18-T Vector載體連接，輕彈混勻后，16℃連接6h或4℃連接12h。

連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞

菌液PCR—克隆檢測

采用通用引物進行菌液PCR，確定目的片段是否成功轉化，篩選陽性克隆。

引物序列：M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

采用常規(guī)擴增反應體系及擴增程序，其中反應體系中以2μL菌液代替原3μL模板。取10μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對獲得的相應陽性克隆進行分裝、保種。

測序及序列比對、分析

陽性克隆送某生物技術有限公司測序，該菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。測序結果在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blast相似性分析，經(jīng)Blast序列比對及進化樹分析，clx-60與Bacillus amyloliquefaciens strain SWM1的同源性為99％，與Bacillus amyloliquefaciens strain W16的同源性為99％，結合進化樹，確定其為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens strain)。

菌株的保藏：

將該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學；郵編430072，保藏日期為2016年9月7日，保藏編號為：CCTCC NO：M2016463。

發(fā)酵條件的優(yōu)化

微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基組分必須能夠滿足菌株菌株快速生長繁殖的需要，同時最適的發(fā)酵培養(yǎng)條件又能夠保證其次生代謝物的大量積累。本發(fā)明通過單因素及正交試驗實驗對clx-60菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行了優(yōu)化，優(yōu)化后的最適培養(yǎng)基配方為：蔗糖12g/L，豆粕15g/L，MgCl2 15g/L。確定了培養(yǎng)基組分及對應濃度之后，再進一步對該菌株代謝產(chǎn)生重樓皂苷Ⅵ的最適初始pH值、培養(yǎng)溫度及搖床轉速進行了優(yōu)化，最終確定clx-60菌株的最適培養(yǎng)條件為：初始pH值6.0，培養(yǎng)溫度34℃，搖床轉速150r/min。