本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法和應(yīng)用，和可以用在這些方法和應(yīng)用中的細菌及啟動子等。
背景技術(shù)：
：通過產(chǎn)L-賴氨酸的細菌（如，棒桿菌屬的桿狀細菌，尤其是谷氨酸棒桿菌）發(fā)酵來生產(chǎn)L-賴氨酸已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。這些細菌，可以是從自然界分離的細菌，也可以是通過誘變或基因工程改造獲得的細菌，或者兩者兼而有之。通過基因工程改造棒桿菌屬的細菌，主要是通過增加或減少與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的酶活性或表達量來實現(xiàn)的。例如，中國專利CN1017906B公開了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括使用含合成二氫二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀酰四氫吡啶羧酸合成酶的重組DNA的棒狀桿菌屬細菌來發(fā)酵的步驟；中國專利申請CN1187539A公開了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括使用含編碼天冬氨酸激酶和編碼二氨基庚二酸脫羧酶的重組DNA的棒桿菌屬細菌來發(fā)酵的步驟；中國專利申請CN1310234A公開了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脫氫酶的基因的棒桿菌屬細菌來發(fā)酵的步驟；中國專利申請CN1890372A公開了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加谷氨酸棒桿菌來發(fā)酵的步驟；中國專利申請CN101065484A公開了具有產(chǎn)生L－氨基酸的能力的棒菌屬細菌，其被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少；中國專利申請CN104245921A公開了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括使用含編碼木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的基因的棒桿菌屬細菌來發(fā)酵的步驟。要增加酶活性，除了改造基因本身之外，主要涉及對啟動子的改進。然而，現(xiàn)有技術(shù)中對棒桿菌屬的桿狀細菌的啟動子改進很少，多數(shù)仍舊保留了野生型啟動子，如CorynebacteriumglutamicumATCC13869株（可參見GenBank:CP016335.1的第2531528至2531972位）、CP株（可參見GenBank:CP012194.1的第2575805至2576249位）、ZL-6株（可參見GenBank:CP004062.1的第2560677至2561121位）、BrevibacteriumflavumZL-1（（可參見GenBank:|CP004046.1的第2569176至2569620位）的。而本發(fā)明人經(jīng)過長期研究和實踐，經(jīng)歷了眾多的失敗，憑借了一些運氣，發(fā)現(xiàn)對cspB基因的野生型的啟動子的兩個位點進行突變，即可獲得改進的啟動子，用其替換棒桿菌屬的桿狀細菌染色體上的其他位置上的野生型啟動子，也能增強相應(yīng)基因的表達，并最終提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。尤其是，該方法與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-賴氨酸的細菌的染色體改造位點沒有沖突，可以疊加提高的效果，從而在實踐上可用于多種細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法及其相關(guān)的方法，包括相對于未改造細菌提高L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的方法，改造的細菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用，改造的細菌在相對于未改造細菌提高L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)量的應(yīng)用，和/或，改造細菌的方法等。另外，本發(fā)明還涉及相應(yīng)改造獲得的細菌，以及其中所使用的啟動子及其表達盒、載體和宿主細胞等。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其包括：（1）將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第51位保持為C，其第88位保持為T；和，（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。替換的技術(shù)手段廣泛記載于分子生物學(xué)和微生物學(xué)文獻中，有許多甚至已經(jīng)商品化了。在本發(fā)明的具體實施方式中，根據(jù)同源重組的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV質(zhì)粒系統(tǒng)來進行改造，也可以采用pK18mobsacB質(zhì)粒系統(tǒng)來進行改造。因此，在本文中，替換優(yōu)選是通過同源重組進行的替換。被替換的基因的啟動子優(yōu)選是該基因的野生型的啟動子。在本文中，野生型的啟動子可以被定義為谷氨酸棒桿菌ATCC13032（其基因組全序列可獲取自網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因的啟動子。在本文中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。這些基因不限于本發(fā)明實施例和
背景技術(shù)：
部分所列的。被替換的基因的啟動子可以是一個，也可以是多個，優(yōu)選是幾個，如2-6個。在本發(fā)明的具體實施方式中被替換的基因的啟動子分別有1、2、3、4個。本發(fā)明人設(shè)計改造的啟動子的關(guān)鍵在于對應(yīng)于SEQIDNO：1的第51位保持為C，其第88位保持為T，因此這兩個位點保持不變后，其他位置可以有少許變化，包括添加、缺失和/或替換一個和/或幾個核苷酸。本發(fā)明的EP5啟動子的多核苷酸序列優(yōu)選是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有95%（更優(yōu)選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列。通過常規(guī)的Blast和FASTA等程序，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以計算出多核苷酸序列的同一性。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了其他的應(yīng)用或方法。例如，在第二方面，本發(fā)明提供了提高L-賴氨酸的發(fā)酵量的方法，其包括：（1）將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第50位保持為C，其第88位保持為T；和，（2）用步驟（1）改造而得到的細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸。又如，在第三方面，本發(fā)明提供了改造獲得的細菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸中的應(yīng)用，其中，所述改造獲得是將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第51位保持為C，其第88位保持為T。還如，在第四方面，本發(fā)明提供了所述改造獲得是將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第51位保持為C，其第88位保持為T。在本文中，如無特別限定（如未以“改造獲得”來限定），術(shù)語“細菌”或“棒桿菌屬細菌”是未改造或改造前的細菌或棒桿菌屬細菌，其染色體具有野生型的啟動子。L-賴氨酸作為細菌的重要代謝產(chǎn)物，大多數(shù)棒桿菌屬細菌或多或少都能夠發(fā)酵產(chǎn)生一定量的L-賴氨酸?，F(xiàn)有技術(shù)沒有在賴氨酸生產(chǎn)/發(fā)酵中關(guān)注過本發(fā)明的啟動子所對應(yīng)的野生型的啟動子（如，GenBank:CP016335.1的第2531528至2531972位，等），因此現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬細菌通常都帶有野生型的啟動子，基本上都可以采用本發(fā)明的方法進行改造，提高L-賴氨酸的發(fā)酵量。在本文中，棒桿菌屬細菌包括谷氨酸棒桿菌或北京棒桿菌，優(yōu)選是谷氨酸棒桿菌。更本質(zhì)地，在第五方面，本發(fā)明提供了改造細菌的方法，其包括將棒桿菌屬細菌染色體上一個或多個基因的啟動子替換為EP5啟動子，其中，所述基因編碼酶活性和/或表達量提高有利于提高L-賴氨酸產(chǎn)量的蛋白質(zhì)，所述EP5啟動子的多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第51位保持為C，其第88位保持為T。本發(fā)明第五方面的方法改造而獲得的細菌能夠用于發(fā)酵生產(chǎn)或產(chǎn)生L-賴氨酸。因此，在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第五方面的方法改造而獲得的細菌。本發(fā)明第六方面的細菌是棒桿菌屬細菌，其染色體上編碼一個或多個野生型啟動子的基因座位的核苷酸序列被替換為本發(fā)明的EP5啟動子的核苷酸序列。在第七方面，本發(fā)明提供了EP5啟動子，其多核苷酸序列（a）如SEQIDNO：1所示，或者，（b）是與如SEQIDNO：1所示的多核苷酸序列具有90%（優(yōu)選95%，更優(yōu)選97%，如98%、99%）以上的同一性的多核苷酸序列，且其保留（a）所述啟動子的啟動活性，并且其第51位保持為C，其第88位保持為T。在第八方面，本發(fā)明提供了表達盒，其包含本發(fā)明第七方面的啟動子和可操縱連接在所述啟動子后的編碼序列。在本文中，可操縱連接指的是編碼序列功能地連接啟動子，通常連接在啟動子的3’端，使得啟動子序列可以起始或者介導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄。在第九方面，本發(fā)明提供了載體，其包含本發(fā)明第七方面的啟動子和可操縱連接在所述啟動子后的編碼序列。載體優(yōu)選是表達載體。在第十方面，本發(fā)明提供了宿主細胞，其包含本發(fā)明第八方面的表達盒或本發(fā)明第九方面的載體，或者是經(jīng)本發(fā)明第八方面的表達盒或本發(fā)明第九方面的載體轉(zhuǎn)化而得的。本發(fā)明的宿主細胞包含EP5啟動子。優(yōu)選宿主細胞是棒桿菌屬細菌，如谷氨酸棒桿菌。在第十一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第七方面的啟動子在發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸或者提高L-賴氨酸的發(fā)酵量中的應(yīng)用，優(yōu)選在棒桿菌屬細菌中發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸或者提高L-賴氨酸的發(fā)酵量中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于，開辟并且實踐證明了新的提高L-賴氨酸的發(fā)酵量的方式，而且與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬細菌的染色體改造位點沒有沖突，從而在實踐上可用于進一步提高L-賴氨酸的產(chǎn)量。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發(fā)明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南（第3版）》（科學(xué)出版社）、《微生物學(xué)實驗（第4版）》（高等教育出版社）以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說明書等參考。實施例1本發(fā)明的啟動子根據(jù)本發(fā)明人設(shè)計的多核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的啟動子，委托合成相應(yīng)的多核苷酸并連接入pMD19-T載體，獲得的新載體為T-EP5，進行測序（委托上海英俊公司測序），測序結(jié)果如下：GTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGGTGAACAAATTTCAGCTTCGGGTAGAAGACcTTCGATGCGCTTCAGAGCTTCTATTGGGAAATCTGAtACCACTTGATTAAATAGCCTACCCCCGAATTGGGGGATTGGTCATTTTTTGCTGTGAAGGTAGTTTTGATGCATATGACCTGCGTTTATAAAGAAAGTAAACGTGATCAGATCGATATAAAAGAAACAGTTTGTACTCAGGTTTGAAGCATTTTCTCCGATTCGCCTGGCAAAAATCTCAATTGTCGCTTACAGTTTTTCTCAACGACAGGCTGCTAAGCTGCTAGTTCGGTGGCCTAGTGAGTGGCGTTTACTTGGATAAAAGTAATCCCATGTCGTGATCAGCCATTTTGGGTTGTTTCCATAGCAATCCAAAGGTTTCGTCTTTCGATACCTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCT測序結(jié)果包含了如SEQIDNO：1所示的啟動子，表明克隆正確。相對于野生型的啟動子，本發(fā)明人設(shè)計的啟動子序列主要設(shè)計了T->C和C->T的兩個突變（用小寫表示），SEQIDNO：1所示的啟動子在下文被簡稱為EP5。實施例2EP5啟動子調(diào)節(jié)ddh基因表達的構(gòu)建實驗根據(jù)已上述EP5的序列及NCBI上公布的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設(shè)計引物，用于將EP5片段插入到ddh基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅(qū)動ddh基因的表達，具體引物設(shè)計如下：P15：5'GCTCTAGACGTAGCCAACGAAGTAATC3'（xba1）P16：5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGACCAACATCCGCGTAGCTATC3'P17:CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACGTTCTTGTAATCCTCCAAAATTGP18:CAATTTTGGAGGATTACAAGAACGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGP19:5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACATGATGATTCAGGGACATCT3'P20:5'CGGAATTCTTTCGGGCGGCAATATAG3'（EcoR1）以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P15/P16及P19/P20，進行PCR擴增，獲得上游同源臂片段700bp及下游同源臂片段650bp，再用引物P17/P18以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P15/P20為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Xba1和EcoR1酶切位點。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增的產(chǎn)物進行電泳回收，采用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的1800bp的DNA片段，并通過酶切回收連接，與穿梭質(zhì)粒pk18mobsacB質(zhì)粒相連接，獲得整合質(zhì)粒。該質(zhì)粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質(zhì)粒整合到基因組上的重組子。將整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入賴氨酸生產(chǎn)專利菌株YP97158菌株（其構(gòu)建方法可參見WO2014121669A1，經(jīng)測序確認該菌株染色體上保留有野生型的ddh基因的啟動子），對培養(yǎng)產(chǎn)生的單菌落通過P17/P20引物進行PCR鑒定，PCR擴增出含有大小1100bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在不含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不生長的菌株進一步采用P17/P20引物進行PCR鑒定，擴增出大小為1100bp的菌為EP5整合到ddh基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-004。實施例3EP5啟動子調(diào)節(jié)lysC基因表達的構(gòu)建實驗根據(jù)已上述EP5的序列及NCBI上公布的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設(shè)計引物，用于將EP5片段插入到lysC基因起始密碼子CTG的前端，使得EP5來驅(qū)動lysC基因的表達，具體引物設(shè)計如下：P3:5'CGGAATTCCCGCAAGCAGCCACATTC3'（EcoR1）P4:5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACCTTTGTGCACCTTTCGATCTAC3'P5:5'GTAGATCGAAAGGTGCACAAAGGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAG3'P6:5'CATATTTCTGTACGACCAGGGCCAGAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG3'P7:5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTCTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATG3'P8:5'CCCAAGCTTGTGGTGCCGTCTTCTACAG3'（Hind3）以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P3/P4及P7/P8，進行PCR擴增，獲得上游同源臂片段740bp及下游同源臂片段940bp，再用引物P5/P6以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P3/P8為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增的產(chǎn)物進行電泳回收，采用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的2140bp的DNA片段，并通過酶切回收連接，與穿梭質(zhì)粒pk18mobsacB質(zhì)粒相連接，獲得整合質(zhì)粒。該質(zhì)粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質(zhì)粒整合到基因組上的重組子。將整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入YPL-1-004（經(jīng)測序確認該菌株染色體上保留有野生型的lysC基因的啟動子），對培養(yǎng)產(chǎn)生的單菌落通過P5/P8引物進行PCR鑒定，PCR擴增出含有大小1400bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在不含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不生長的菌株進一步采用P5/P8引物進行PCR鑒定，擴增出大小為1400bp的菌為EP5整合到lysC基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-005。實施例4EP5啟動子調(diào)節(jié)lysA基因表達的構(gòu)建實驗根據(jù)已上述EP5的序列及NCBI上公布的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設(shè)計引物，用于將EP5片段插入到lysA基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅(qū)動lysA基因的表達，具體引物設(shè)計如下：P9：5'CGGAATTCCGAGGTAGGTTCCGTAGG3'（EcoR1）P10：5'CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACGGGGAGAAATTCTAGCCGAGG3'P11：5'CCTCGGCTAGAATTTCTCCCCGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAG3'P12：5'GTTGCGAGATCAGCTGGTGTCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAG3'P13：5'CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGACACCAGCTGATCTCGCAAC3'P14：5'CCCAAGCTTGCCCTCGTTTTCGTACAG3'（Hind3）以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P9/P10及P13/P14，進行PCR擴增，獲得上游同源臂片段750bp及下游同源臂片段850bp，再用引物P11/P12以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P9/P14為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增的產(chǎn)物進行電泳回收，采用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的2050bp的DNA片段，并通過酶切回收連接，與穿梭質(zhì)粒pk18mobsacB質(zhì)粒相連接，獲得整合質(zhì)粒。該質(zhì)粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質(zhì)粒整合到基因組上的重組子。將整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入YPL-1-005（經(jīng)測序確認該菌株染色體上保留有野生型的lysA基因的啟動子），對培養(yǎng)產(chǎn)生的單菌落通過P11/P14引物進行PCR鑒定，PCR擴增出含有大小1300bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在不含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不生長的菌株進一步采用P11/P14引物進行PCR鑒定，擴增出大小為1300bp的菌為EP5整合到lysA基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-006。實施例5EP5啟動子調(diào)節(jié)gnd基因表達的構(gòu)建實驗根據(jù)已上述EP5的序列及NCBI上公布的谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組序列設(shè)計引物，用于將EP5片段插入到gnd基因起始密碼子ATG的前端，使得EP5來驅(qū)動gnd基因的表達，具體引物設(shè)計如下：P21：5'CCCAAGCTTTCGCCTGCGTTCCATTCC3'（Hind3）P22:CTATTCAAGGAGCCTTCGCCTCTATGCCGTCAAGTACGATCAATAACP23:GTTATTGATCGTACTTGACGGCATAGAGGCGAAGGCTCCTTGAATAGP24:CGATTTTGCTGACACCGGGCTGTAACCCGAGGTTAAGTGTATTTTAGP25:CTAAAATACACTTAACCTCGGGTTACAGCCCGGTGTCAGCAAAATCGP26：5'CGGAATTCTGCGCTGGGTTGTTATCTG3'（EcoR1）以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為模板，分別以引物P21/P22及P25/P26，進行PCR擴增，獲得上游同源臂片段720bp及下游同源臂片段700bp，再用引物P23/P24以T-EP5為模板擴增EP5片段450bp，再以P21/P26為引物，以以上擴增的三個片段混合為模板進行擴增，獲得整個同源臂片段，兩端分別含有Hind3和EcoR1酶切位點。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對擴增的產(chǎn)物進行電泳回收，采用柱式DNA凝膠回收試劑盒進行回收所需要的1870bp的DNA片段，并通過酶切回收連接，與穿梭質(zhì)粒pk18mobsacB質(zhì)粒相連接，獲得整合質(zhì)粒。該質(zhì)粒上含有卡納抗性標記，可以通過卡納篩選獲得質(zhì)粒整合到基因組上的重組子。將整合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入YPL-1-006（經(jīng)測序確認該菌株染色體上保留有野生型的gnd基因的啟動子），對培養(yǎng)產(chǎn)生的單菌落通過P23/P26引物進行PCR鑒定，PCR擴增出含有大小1150bp的片段的為陽性菌株，擴增不到片段的為原菌。陽性菌株分別在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在不含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，而在含卡那霉素的培養(yǎng)基上不生長的菌株進一步采用P23/P26引物進行PCR鑒定，擴增出大小為1150bp的菌為EP5整合到gnd基因起始密碼子前的菌株，其被命名為YPL-1-007。實施例6賴氨酸發(fā)酵實驗將實施例2-5構(gòu)建的菌株和原始菌株在BLBIO-5GC-4-H型號的發(fā)酵罐（購自上海百侖生物科技有限公司）中以表1所示的培養(yǎng)基和表2所示的過程進行發(fā)酵實驗。每個菌株重復(fù)三次，結(jié)果如表3所示。表1發(fā)酵培養(yǎng)基配方品名配比淀粉水解糖30g/l硫酸銨12g/L硫酸鎂0.87g/l糖蜜20g/l酸化玉米漿3ml/l磷酸0.4ml/l氯化鉀0.53g/l消泡劑（2%泡敵）4ml/L硫酸亞鐵120mg/l硫酸錳120mg/l煙酰胺42mg/l泛酸鈣6.3mg/lVB16.3mg/l銅、鋅鹽溶液0.6g/L生物素0.88mg/L表2發(fā)酵過程表3賴氨酸發(fā)酵實驗結(jié)果(賴氨酸含量g/dl)批次\菌株對照YPL-1-004YPL-1-005YPL01-006YPL01-00712223.524.124.925.7222.223.424.024.825.6322.123.424.124.925.8均值22.123.424.124.925.7結(jié)果如表3所示，在棒桿菌中將EP5啟動子構(gòu)建在表達量升高對L-賴氨酸產(chǎn)量有利的基因前調(diào)控它們的表達，基本都有助于L-賴氨酸產(chǎn)量的提高，而且EP5啟動子構(gòu)建得越多，L-賴氨酸的產(chǎn)量增加得也基本越多，表明存在疊加效應(yīng)。<110>寧夏伊品生物科技股份有限公司<120>棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的方法及其啟動子改造<130>CN<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>445<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>啟動子<400>1cgaggttaagtgtattttaggtgaacaaatttcagcttcgggtagaagaccttcgatgcg60cttcagagcttctattgggaaatctgataccacttgattaaatagcctacccccgaattg120ggggattggtcattttttgctgtgaaggtagttttgatgcatatgacctgcgtttataaa180gaaatgtaaacgtgatcagatcgatataaaagaaacagtttgtactcaggtttgaagcat240tttctccgattcgcctggcaaaaatctcaattgtcgcttacagtttttctcaacgacagg300ctgctaagctgctagttcggtggcctagtgagtggcgtttacttggataaaagtaatccc360atgtcgtgatcagccattttgggttgtttccatagcaatccaaaggtttcgtctttcgat420acctattcaaggagccttcgcctct445當(dāng)前第1頁1 2 3