專利名稱：利用固定化酶從花生餅粕中生產(chǎn)活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明方法涉及花生副產(chǎn)物的深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種花生活性肽的酶法制備エ藝，是以花生餅柏為原料，利用化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒固定復(fù)合蛋白酶水解，從而獲得花生活性肽的方法。
背景技術(shù)：
花生是世界上種植的主要農(nóng)作物之一。我國是花生的生產(chǎn)大國，花生產(chǎn)量常年穩(wěn)居世界首位，花生年產(chǎn)量在1400萬噸左右?；ㄉ鸂I養(yǎng)豐富，富含優(yōu)質(zhì)蛋白和油脂，脂肪含量在44 一 50%，蛋白質(zhì)含量在24 — 34%，且含有多種維生素和礦物質(zhì)?；ㄉ鞍缀腥梭w所必需的8種氨基酸，消化性可達(dá)99%，是營養(yǎng)價值高且資源豐富的植物蛋白資源。由于花生營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨特，所以深受我國人民的喜愛。目前，花生除一部分用于食品加工以外，50%以上的花生用于榨油。由此，我國每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸的蛋白含量大于50%的花生餅柏。由于我國花生深加工技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化水平低，花生餅柏中蛋白的利用有限，大量的花生餅柏用作動物飼料或肥料，產(chǎn)品附加值低，資源浪費嚴(yán)重。因此，有必要開展花生餅柏中蛋白深加工方面的研究。生物活性肽是通過酶法水解、化學(xué)改性或物理作用得到的具有特殊生理功能的肽類。生物活性肽具有的生理功能有抗氧化、調(diào)節(jié)血壓、促進微量元素吸收、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)睡眠等功效。與化學(xué)藥物相比，生物活性肽具有毒副作用小、功效平緩、成本低等優(yōu)勢，因此國內(nèi)外已經(jīng)有活性肽藥品、保健品上市，并得到了消費者的認(rèn)可。研究表明，花生蛋白采用酶法水解具有顯著的抗氧化、降低血壓功能，研究花生餅柏制備花生活性肽有利于開發(fā)花生餅柏這一潛在的蛋白資源，生產(chǎn)高附加值的蛋白產(chǎn)品。目前，花生蛋白生產(chǎn)活性肽的エ藝主要有化學(xué)處理和酶法水解兩大類?；瘜W(xué)處理會降低花生肽的品質(zhì)，且生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的酸堿廢液污染環(huán)境，這限制了化學(xué)處理的發(fā)展。采用酶法水解花生蛋白時，蛋白酶成本較高，單ー酶水解蛋白有限，且酶在熱、酸堿及有機溶劑中不穩(wěn)定，這也限制酶法制備花生活性肽的エ業(yè)化轉(zhuǎn)化。固定化酶技術(shù)雖然一定程度上提高酶的利用率，但是酶解效果不佳。主要是酶與載體結(jié)合后，形成空間位阻阻礙酶與底物的結(jié)合，同時，加入的化學(xué)交聯(lián)劑也會影響酶活。因此，提高酶穩(wěn)定性、回收率和酶解效率是酶法生產(chǎn)活性肽エ藝中需要解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供ー種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，采用該方法所得花生活性肽純度高且活性好。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
ー種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其包括如下步驟
O制備化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒
在堿性條件下，將殼聚糖粉末與環(huán)氧氯丙烷混合后于50-70°C攪拌反應(yīng)1-2 h，然后加入ニ胺化合物繼續(xù)反應(yīng)I. 5-2. 5 h，反應(yīng)結(jié)束后固液分離，取固體備用，投料比按照每Ig殼聚糖粉末添加3-5ml環(huán)氧氯丙烷和l-5ml ニ胺化合物計；將固體用稀酸(所用稀酸可以是こ酸、鹽酸、硫酸等)溶解后，加入三聚磷酸鈉和粒徑彡lOOnm、純度不小于95%的四氧化三鐵超聲波攪拌處理，三聚磷酸鈉的加入量為固體重量的O. 05-0. I倍，四氧化三鐵的加入量為固體重量的O. 25-0. 75倍，反應(yīng)完畢后用磁鐵吸附體系中的固體顆粒，即為改性后的磁性殼聚糖微粒，記為固體顆粒a ；
2)磁性殼聚糖固定復(fù)合蛋白酶將上述改性后的磁性殼聚糖微粒(即固體顆粒a)加入到含2-5V%戊ニ醛的磷酸緩沖液中室溫下攪拌1-3 h，然后加入含復(fù)合蛋白酶的磷酸緩沖液繼續(xù)攪拌3-6 h，結(jié)束后用磁鐵將體系中的固體顆粒吸附出，記為固體顆粒b，備用(固體顆粒b可4°C儲存于磷酸緩沖液中，長期儲存時，應(yīng)冷凍干燥保存)；其中，所述磷酸緩沖液濃度為O. 05 - O. 2 mol/L, pH 6. 8-8. O ;投料比按照每Ig改性后的磁性殼聚糖微粒添加10-30mL含戊ニ醛的磷酸緩沖液和2-6 mL含復(fù)合蛋白酶的磷酸緩沖液計，復(fù)合蛋白酶在體系中的質(zhì)量終濃度為O. 1-2. 5% ；
3)制備花生蛋白將花生餅柏粉碎、脫油后，采用堿提酸沉提取花生蛋白；
4)制備花生活性肽將花生蛋白用蒸餾水溶解(以每Ig花生蛋白用8一 12ml蒸餾水溶解為宜)并調(diào)至pH為8. O — 10. 5，然后加入固體顆粒b于35 — 50で酶解2 — 4h，酶用量為3000 — 4000 u/g蛋白，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)至酶解反應(yīng)體系pH為7. O ;酶解過程攪拌轉(zhuǎn)速以 80 — 120 rpm 為宜。5)肽液純化處理取步驟4)所得酶解反應(yīng)體系，將除去固體顆粒后的剰余溶液離心，取上清液用活性炭吸附脫色、納濾膜脫鹽、超濾膜分離得花生活性肽精制液，花生肽精制液再經(jīng)濃縮、噴霧干燥制得花生活性肽干粉。除去固體顆粒的具體操作可以為用磁鐵從酶解反應(yīng)體系中吸附固體顆粒，吸附后將其加入到稀堿液中浸泡10 — 20 min，蒸餾水洗至中性，4°C保存。其中，活性炭吸附脫色條件具體為40 — 60°C攪拌30 — 60 min，活性炭加入量為花生餅柏重量的I 一 4%。納濾膜截留分子量為70 — 200 Da,超濾膜截留分子量為5000 Da,操作壓カO. 15 — O. 25 Mpa。噴霧干燥選用壓力噴霧干燥機，3 — 5%肽液濃度，進ロ溫度160 — 180°C，出口溫度為 7O — 80°C，壓カ為 I. 2 — I. 6 Mpa0具體的，步驟I)中，將殼聚糖用堿液浸泡6 — 9 h后，加入環(huán)氧氯丙烷于50 — 100°C攪拌(攪拌速度在100 — 300 rpm為宜)反應(yīng)1_2 h ;所述的ニ胺化合物為こニ胺、I，4_ 丁ニ胺、1，6-已ニ胺、1，8_辛ニ胺或1，12-ニ氨基十二烷等。其中，Ig殼聚糖以用8 一15ml、濃度I mol/L的堿液浸泡為佳，所述堿液可以是NaOH水溶液、KOH水溶液等。步驟I)中，超聲波攪拌處理條件為20 kHZ，500 — 800 W，30 — 60 min, 150 - 250rpm ο步驟2)中，復(fù)合蛋白酶由堿性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比2:1混合而成，所述堿性蛋白酶為蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase，所述中性蛋白酶為胰蛋白酶、蛋白酶Neutrase 或蛋白酶 ASl. 398。步驟3)具體為將花生餅柏粉碎后過60 — 80目，與正己烷混合(以每I克花生 餅柏添加4-8mL正己烷為宜)回流2 — 4 h進行脫油，脫油后的花生餅柏粉與水按質(zhì)量比1:6 - 12混合，用堿試劑(如NaOH, KOH等)調(diào)至pH值為8 — 12，機械攪拌I — 2h (攪拌速度100 — 250 rpm), 4000 — 4500 rpm離心10 — 20 min,取沉淀重復(fù)堿提過程,合并兩次上清液，用80 — 100目濾網(wǎng)過濾，濾液加酸調(diào)至pH為4. 10 — 4. 60，靜置10 — 20 min,4000 — 4500 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 — 20 min,收集沉淀，即為花生蛋白。本發(fā)明中所用的粒徑彡lOOnm、純度不小于95%的四氧化三鐵可以購買符合條件的市售產(chǎn)品，也可以按照下述方法制備氮氣保護下，在Fe3+和Fe2+鹽溶液中加入氨水(Fe3+和Fe2+摩爾比為2:1，所加氨水與Fe3+的摩爾比不小于20)，然后于60 — 90°C攪拌反應(yīng)O. 5 — I. 5 h，反應(yīng)過程中可通過補加氨水使體系pH始終保持在10以上；反應(yīng)結(jié)束后固液分離，所得固體為四氧化三鐵微球；可暫儲存于PH 2-4的こ酸水溶液中，備用。本發(fā)明提供了ー種利用固定化酶制備花生肽的生產(chǎn)エ藝，該方法采用化學(xué)共價方法改性磁性殼聚糖微粒，使酶與載體之間通過碳鏈連接，既提高了固定化酶的酶活又不影響固定化酶的穩(wěn)定性；固定復(fù)合蛋白酶，提高了酶法水解的效率；膜分離、脫鹽和干燥獲得的花生活性肽純度高且活性好。本發(fā)明方法提高花生副產(chǎn)物的綜合利用率，不但能為社會帶來可觀的經(jīng)濟價值，而且具有生理保健功能的活性肽產(chǎn)品可以提高我國居民身體素質(zhì)，具有積極的社會價值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的優(yōu)點和有益效果如下。I、采用本發(fā)明方法生產(chǎn)出來的花生肽純度高、活性好。其中肽含量高于85%，灰分含量小于5%,脂肪含量小于2%,干燥失重小于5%,分子量小于1000 Da的短肽含量大于60%,三氯こ酸氮溶解指數(shù)大于99% ;花生活性肽ACE抑制活性(降血壓)的IC5tl小于O. 6 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性大于50%。2、采用改性磁性殼聚糖微粒固定復(fù)合蛋白酶酶活高，性質(zhì)穩(wěn)定，耐儲藏。通過增加酶與載體間的碳鏈，固定化酶的水解活性較傳統(tǒng)固定化酶提高2倍以上。經(jīng)過上述改性磁性殼聚糖微粒固定的復(fù)合蛋白酶，適用pH范圍增寬，且45 — 55°C依然具有較好的熱穩(wěn)定性。前五次重復(fù)使用后酶活力可保留同等量游離酶活力的50 — 95%，重復(fù)使用10次，殘留酶活力為原有酶活的10 — 20%。3、采用噴霧干燥制備活性肽粉，一方面提高縮短了干燥時間，提高生產(chǎn)效率，另ー方面提高了肽粉的復(fù)水溶解性。4、本發(fā)明中在常溫下采用膜分離技術(shù)對料液進行分離純化脫鹽，高效節(jié)能且無污染。5、本發(fā)明方法生產(chǎn)效率高，成本低，生產(chǎn)エ藝安全、環(huán)保、節(jié)能，產(chǎn)品品質(zhì)高，可廣泛用于化妝品、食品、藥品等領(lǐng)域。
具體實施例方式以下通過優(yōu)選實施例對本發(fā)明作進ー步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此。實施例I :
ー種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其包括如下步驟
O制備化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒
氮氣保護下，取 13. 9914 g FeCl3 · 6H20 和 5. 1465 g 的 FeCl2 · 4H20 加入到 240 mL 蒸餾水中，于80°C攪拌Ih (轉(zhuǎn)速400 rpm),隨即逐滴加入80 mL質(zhì)量濃度28%的氨水反應(yīng)30min,反應(yīng)過程中需補加氨水使體系pH始終保持在10以上；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,固液分離，所得固體為四氧化三鐵；用水洗滌后，暫存于PH 2-4的こ酸水溶液中，備用。稱取36 g殼聚糖粉末，加入到360 mL lmol/L的NaOH中室溫浸泡6 h，然后加入
110m L環(huán)氧氯丙烷于60°C、120 rpm攪拌反應(yīng)lh，隨后加入72 mL 1，6-已ニ胺繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后固液分離，固體水洗后浙干水，備用，記為改性殼聚糖微粒。取20g上述所得固體(即改性殼聚糖微粒)用3000 mL 1%こ酸溶液攪拌溶解后，加入5g四氧化三鐵和2. O g三聚磷酸鈉，超聲波攪拌處理40 min (條件為20 kHZ，600 W,150 rpm)。反應(yīng)完畢后用磁鐵吸附體系中的固體顆粒，該固體顆粒即為改性后的磁性殼聚糖微粒，記為固體顆粒a，水洗后浙干水，備用。2)磁性殼聚糖固定復(fù)合蛋白酶將上述所得改性后的磁性殼聚糖微粒(即固體顆粒a)加入到1000 mL含3V%戊ニ醛的磷酸緩沖液中室溫下攪拌lh，然后加入含6wt%復(fù)合蛋白酶(復(fù)合蛋白酶由酶活比為2:1的堿性蛋白酶2709和胰蛋白酶混合而成)的磷酸緩沖液200 mL繼續(xù)攪拌4 h，結(jié)束后用磁鐵將體系中的固體顆粒吸附出，記為固體顆粒b，該固體顆粒b即為固定復(fù)合蛋白酶的殼聚糖微粒，備用；其中，所述磷酸緩沖液濃度為O. 05mol/L，pH 8. O ;復(fù)合蛋白酶在體系中的質(zhì)量終濃度為1%。3)制備花生蛋白將花生餅柏粉碎、脫油后，采用堿提酸沉提取花生蛋白，具體為稱取1000 g市售低溫壓榨花生餅柏(蛋白質(zhì)含量54. 85%)，用粉碎機粉碎至80目，加入8L正己烷于85°C回流3 h進行脫油?；亓魍戤吚鋮s至室溫，除去正己烷，將脫油后的花生餅柏粉轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中，加入脫油后花生餅柏粉6倍重量份的蒸餾水，機械攪拌至分散均勻，用I mol/L的食品級NaOH調(diào)整體系pH到9. O,攪拌60 min,隨后4000 rpm離心15 min,取沉淀重復(fù)堿提過程，合并兩次上清液用100目濾網(wǎng)過濾，用lmol/L食品級鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH值在4. 3 — 4. 4之間,靜置15 min, 4000 rpm離心20 min,收集沉淀，即為花生蛋白。4)制備花生活性肽將花生蛋白用蒸餾水溶解(每Ig花生蛋白用8ml蒸餾水溶解)并調(diào)至pH為9 一 10，然后加入固體顆粒b于45°C酶解2h，酶用量為3500 u/g蛋白，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)至酶解反應(yīng)體系PH為7. O;酶解過程中需要攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速以80 — 120 rpm為宜。5)肽液純化處理取步驟4)所得酶解反應(yīng)體系，將除去固體顆粒后的剰余溶液離心，取上清液用活性炭吸附脫色(50°C攪拌40 min，抽濾除去活性炭)、脫色后的酶解液用截留分子量為150 Da的納濾膜稀釋10倍脫鹽，脫鹽后的酶解液用截留分子量為5000 Da的超濾膜分離得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至肽濃度3%左右，經(jīng)噴霧干燥制得245. 32 g花生活性肽干粉。獲得的花生活性肽干粉是ー種乳白色粉末，干基情況下，肽含量為89%，灰分為3%，脂肪含量為O. 8%，糖含量為7. 2% ;三氯こ酸氮溶解指數(shù)為99%，分散指數(shù)為99. 7%。花生活性肽ACE抑制活性(降血壓)的IC5tl小于O. 52 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性 56%ο實施例2
ー種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其包括如下步驟
O制備化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒
氮氣保護下，取 27. 9828 g FeCl3 ·6Η20 和 11. 5862 g 的 FeSO4 · 4Η20 加入到 240 mL 蒸餾水中，于60°C攪拌Ih(轉(zhuǎn)速400 rpm),隨即逐滴加入100 mL質(zhì)量濃度28%的氨水反應(yīng)60min,反應(yīng)過程中需補加氨水使體系pH始終保持在10以上；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,固液分離，所得固體為四氧化三鐵；用水洗滌后，暫存于PH 2-4的こ酸水溶液中，備用。稱取40 g殼聚糖粉末，加入到360 mL lmol/L的NaOH中室溫浸泡8 h，然后加入160 mL環(huán)氧氯丙烷于55°C、150 rpm攪拌反應(yīng)2h，隨后加入120mL 1，4-丁ニ胺繼續(xù)反應(yīng)2. 5h，反應(yīng)結(jié)束后固液分離，固體水洗后浙干水，備用，記為改性殼聚糖微粒。將30g上述所得固體(即改性殼聚糖微粒)用3000 mL 1%こ酸溶液攪拌溶解后，カロΛ 10 g四氧化三鐵和I. 5g三聚磷酸鈉，超聲波攪拌處理30 min (條件為20 kHZ，800 W,150 rpm)。反應(yīng)完畢后用磁鐵吸附體系中的固體顆粒，該固體顆粒即為改性后的磁性殼聚糖微粒，記為固體顆粒a，水洗后浙干水，備用。2)磁性殼聚糖固定復(fù)合蛋白酶將上述改性后的磁性殼聚糖微粒(即固體顆粒a)加入到1000 mL含4V%戊ニ醛的磷酸緩沖液中室溫下攪拌2h，然后加入含10wt%復(fù)合蛋白酶(復(fù)合蛋白酶由酶活比為2:1的堿性蛋白酶2709和中性蛋白酶Neutrase混合而成)的 磷酸緩沖液200 mL繼續(xù)攪拌6 h，結(jié)束后用磁鐵將體系中的固體顆粒吸附出，記為固體顆粒b，該固體顆粒b即為固定復(fù)合蛋白酶的殼聚糖微粒，備用；其中，所述磷酸緩沖液濃度為O. 05mol/L, pH 7. 5 ;復(fù)合蛋白酶在體系中的質(zhì)量終濃度為I. 67%。3)制備花生蛋白與實施例I中的步驟3)相同。4)制備花生活性肽將花生蛋白用蒸餾水溶解(每Ig花生蛋白用IOml蒸餾水溶解)并調(diào)至pH為8 一 9，然后加入固體顆粒b于45°C酶解4h，酶用量為4000u/g蛋白，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)至酶解反應(yīng)體系pH為7. O ;酶解過程中需要攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速以80 — 120 rpm為宜。5)肽液純化處理取步驟4)所得酶解反應(yīng)體系，將除去固體顆粒后的剰余溶液離心，取上清液用活性炭吸附脫色(60°C攪拌30 min，抽濾除去活性炭)、脫色后的酶解液用截留分子量為150 Da的納濾膜稀釋15倍脫鹽，脫鹽后的酶解液用截留分子量為5000 Da的超濾膜分離得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至肽濃度5%左右，經(jīng)噴霧干燥制得238. 68 g花生活性肽干粉。獲得的花生活性肽干粉是ー種乳白色粉末，干基情況下，肽含量為89. 8%，灰分為2. 7%，脂肪含量為O. 7%，糖含量為6. 8% ;三氯こ酸氮溶解指數(shù)為99%，分散指數(shù)為99. 7%?；ㄉ钚噪腁CE抑制活性(降血壓)的IC5tl小于O. 59 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性51%。實施例3
ー種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其包括如下步驟
O制備化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒
氮氣保護下，取 25. 6741 g Fe2 (S04) 3 和 7. 1909 g 的 FeSO4 · 4H20 加入到 250 mL 蒸餾水中，于70°C攪拌Ih (轉(zhuǎn)速400 rpm),隨即逐滴加入100 mL質(zhì)量濃度28%的氨水反應(yīng)60min,反應(yīng)過程中需補加氨水使體系pH始終保持在10以上；反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫,固液分離，所得固體為四氧化三鐵；用水洗滌后，暫存于PH 2-4的こ酸水溶液中，備用。稱取36 g殼聚糖，加入到360 mL lmol/L的NaOH中室溫浸泡8 h，然后加入160mL環(huán)氧氯丙烷于70°C、150 rpm攪拌反應(yīng)lh，隨后加入130mL 1，8-辛ニ胺繼續(xù)反應(yīng)I. 5h，反應(yīng)結(jié)束后固液分離，固體水洗后浙干水，備用，記為改性殼聚糖微粒。
將26 g上述所得固體(即改性殼聚糖微粒)用3000 mL 1%こ酸溶液攪拌溶解后，加入6. 5 g四氧化三鐵和2. 6 g三聚磷酸鈉，超聲波攪拌處理40 min (條件為20 kHZ，600W，150 rpm)。反應(yīng)完畢后用磁鐵吸附體系中的固體顆粒，該固體顆粒即為改性后的磁性殼聚糖微粒，記為固體顆粒a，水洗后浙干水，備用。2)磁性殼聚糖固定復(fù)合蛋白酶將上述改性后的磁性殼聚糖微粒(即固體顆粒a)加入到1000 mL含5V%戊ニ醛的磷酸緩沖液中室溫下攪拌2h，然后加入含8wt%復(fù)合蛋白酶(復(fù)合蛋白酶由酶活比為2:1的堿性蛋白酶Alcalase和胰蛋白酶混合而成)的磷酸緩沖液200 mL繼續(xù)攪拌4h，結(jié)束后用磁鐵將體系中的固體顆粒吸附出，記為固體顆粒b，該固體顆粒b即為固定復(fù)合蛋白酶的殼聚糖微粒，備用；其中，所述磷酸緩沖液濃度為O. 2mol/L,pH7. 5 ;復(fù)合蛋白酶在體系中的質(zhì)量終濃度為I. 3%。3)制備花生蛋白與實施例I中的步驟3)相同。4)制備花生活性肽將花生蛋白用蒸餾水溶解(每Ig花生蛋白用12ml蒸餾水溶 解)并調(diào)至pH為8 一 9，然后加入固體顆粒b于35°C酶解4h，酶用量為3500u/g蛋白，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)至酶解反應(yīng)體系pH為7. O ;酶解過程中需要攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速以80 — 120 rpm為宜。5)肽液純化處理取步驟4)所得酶解反應(yīng)體系，將除去固體顆粒后的剰余溶液離心，取上清液用活性炭吸附脫色(60°C攪拌30 min，抽濾除去活性炭)、脫色后的酶解液用截留分子量為150 Da的納濾膜稀釋12倍脫鹽，脫鹽后的酶解液用截留分子量為5000 Da的超濾膜分離得花生活性肽精制液，花生肽精制液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至肽濃度5%左右，經(jīng)噴霧干燥制得249. 75 g花生活性肽干粉。獲得的花生活性肽干粉是ー種乳白色粉末，干基情況下，肽含量為89. 6%，灰分為2. 9%，脂肪含量為O. 7%，糖含量為6. 8% ;三氯こ酸氮溶解指數(shù)為99%，分散指數(shù)為99. 7%?；ㄉ钚噪腁CE抑制活性(降血壓)的IC5tl小于O. 51 mg/mL, 20 mg/mL花生活性肽抗氧化活性54%。上述各實施例中所用到的相關(guān)測定方法如下。①三氯こ酸氮溶解指數(shù)測定方法
分別取兩份質(zhì)量相同(Ig)的花生活性肽干粉，將其中ー份用10 mL蒸餾水溶解，隨后加入10 mL濃度10%的三氯こ酸溶液混勻，靜置30min,3500rpm離心5min,采用凱氏定氮法計算上清液中可溶性氮的質(zhì)量(g)和另外ー份中總氮的質(zhì)量(g)。計算公式如下
三氯こ酸氮溶解指數(shù)(％)=(上清液中氮質(zhì)量/總氮質(zhì)量)X 100
三氯こ酸氮溶解指數(shù)越高，表明肽粉中蛋白、多肽等雜質(zhì)含量越低，肽粉純度越高。②ACE抑制活性測定方法
將花生活性肽干粉適當(dāng)稀釋(濃度O. 5 一 lmg/mL)，使用96孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器。取20μ 樣液(無抑制的反應(yīng)液用蒸餾水代替)與40 PL底物溶液(底物是4. 66 mmol/L馬尿酰-組氨酰-亮氨酸的氯化鈉磷酸緩沖液)混合，然后加入40 μ L濃度為12. 5 πιμ/mL血管緊張素轉(zhuǎn)換酶液(對照液中以蒸餾水代替)，在微孔板混合器上混勻后置于37 C恒溫箱中反應(yīng)I h，然后加入150μ 濃度I. 2 mol/L NaOH溶液終止酶反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入2%鄰苯ニ甲醛甲醇溶液40 PL混勻，室溫下靜置20 min后加入6 mol/L的HCl溶液40 μ 終止衍生反應(yīng)。將上述溶液稀釋50倍后，測定熒光吸收強度，測定的激發(fā)波長340 nm;發(fā)射波長為455 nm ;狹縫寬度為5 nm。樣液的ACE抑制活性的計算公式如下
ACE 抑制率(％)= [l-(a-c) + (b-d) ] X 100 式中，a表示抑制劑與ACE都存在時的熒光吸收強度； b表示抑制劑不存在而ACE存在時的熒光吸收強度； c表示抑制劑存在而ACE不存在時的熒光吸收強度； d表示抑制劑與ACE都不存在時的熒光吸收強度。ACE抑制率越大，表明該樣品的ACE抑制活性越強。以抑制劑濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，計算抑制率達(dá)到50%時抑制劑的濃度，即為半抑制濃度，記為IC5(I。IC5tl值越小，說明抑制劑對ACE活性的抑制能力越強。
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③抗氧化活性測定方法
將花生活性肽干粉溶于水(濃度15 — 20 mg/mL)，取一定體積的上清液加入10 mL 50mmol/L pH7. O的磷酸緩沖液和10 mL I. 3%亞油酸こ醇溶液，定容至25 mL，置于40°C暗室中反應(yīng)10 min。從中取80 PL溶液，加入100 μ 1%KSCNこ醇溶液和100 μ 1.3 mmol/LFeCl2こ醇溶液于酶標(biāo)板中，測定波長為492 nm?？寡趸嬎愎饺缦?br> AA (%) =A0-AJA0X 100
式中AA為抗氧化能力；A。為空白吸光度；AS為加抗氧化劑的樣品吸光度。AA值越高，表明該物質(zhì)的抗氧化能力越強。
權(quán)利要求
1.一種利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其特征在于，包括如下步驟 1)制備化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒 在堿性條件下，將殼聚糖粉末與環(huán)氧氯丙烷混合后于50 - 100°C攪拌反應(yīng)1-2 h，然后加入二胺化合物繼續(xù)反應(yīng)I. 5-2. 5 h，反應(yīng)結(jié)束后固液分離，取固體備用，投料比按照每Ig殼聚糖粉末添加3-5ml環(huán)氧氯丙燒和l_5ml 二胺化合物計； 將固體用稀酸溶解后，加入三聚磷酸鈉和粒徑< lOOnm、純度不小于95%的四氧化三鐵超聲波攪拌處理，三聚磷酸鈉的加入量為固體重量的0. 05-0. I倍，四氧化三鐵的加入量為固體重量的0. 25-0. 75倍，反應(yīng)完畢后用磁鐵吸附體系中的固體顆粒，即為改性后的磁性殼聚糖微粒，記為固體顆粒a ； 2)磁性殼聚糖固定復(fù)合蛋白酶將上述改性后的磁性殼聚糖微粒加入到含2-5V%戊二醛的磷酸緩沖液中室溫下攪拌1-3 h，然后加入含復(fù)合蛋白酶的磷酸緩沖液繼續(xù)攪拌3-6h，結(jié)束后用磁鐵將體系中的固體顆粒吸附出，記為固體顆粒b，備用；其中，所述磷酸緩沖液濃度為0. 05 - 0. 2 mol/L,pH 6. 8-8. 0 ;投料比按照每Ig改性后的磁性殼聚糖微粒添加10-30mL含戊二醛的磷酸緩沖液和2-6 mL含復(fù)合蛋白酶的磷酸緩沖液計，復(fù)合蛋白酶在體系中的質(zhì)量終濃度為0. 1-2. 5% ； 3)制備花生蛋白將花生餅柏粉碎、脫油后，采用堿提酸沉提取花生蛋白； 4)制備花生活性肽將花生蛋白用蒸餾水溶解并調(diào)至pH為8.0— 10. 5，然后加入固體顆粒b于35 — 50 °C酶解2 — 4h，酶用量為3000 — 4000 u/g蛋白，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)至酶解反應(yīng)體系PH為7. 0 ; 5)肽液純化處理取步驟4)所得酶解反應(yīng)體系，將除去固體顆粒后的剩余溶液離心，取上清液用活性炭吸附脫色、納濾膜脫鹽、超濾膜分離得花生活性肽精制液，花生肽精制液再經(jīng)濃縮、噴霧干燥制得花生活性肽干粉。
2.如權(quán)利要求I所述利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其特征在于，步驟I)中，將殼聚糖用堿液浸泡6 — 9 h后加入環(huán)氧氯丙烷；所述的二胺化合物為乙二胺、I，4-丁二胺、I，6-已二胺、I，8-辛二胺或I，12-二氨基十二烷。
3.如權(quán)利要求I所述利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其特征在于，步驟 I)中，超聲波攪拌處理條件為20 kHZ，500 - 800 W，30 — 60 min, 150 一 250 rpm。
4.如權(quán)利要求I所述利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其特征在于，步驟2)中，復(fù)合蛋白酶由堿性蛋白酶和中性蛋白酶按酶活比2:1混合而成，所述堿性蛋白酶為蛋白酶2709或蛋白酶Alcalase,所述中性蛋白酶為胰蛋白酶、蛋白酶Neutrase或蛋白酶ASl. 398。
5.如權(quán)利要求I所述利用固定化酶從花生餅柏中生產(chǎn)活性肽的方法，其特征在于，步驟3)具體為將花生餅柏粉碎后過60 — 80目，與正己烷混合回流2 — 4 h進行脫油，脫油后的花生餅柏粉與水按質(zhì)量比1:6 - 12混合，用堿試劑調(diào)至pH值為8 - 12，攪拌I 一 2h，4000 - 4500 rpm離心10 — 20 min，取沉淀重復(fù)堿提過程，合并兩次上清液，用80 — 100目濾網(wǎng)過濾，濾液加酸調(diào)至pH為4. 10 — 4. 60，靜置10 - 20 min, 4000 — 4500 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 — 20 min,收集沉淀，即為花生蛋白。
全文摘要
本發(fā)明屬于花生蛋白深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用固定化酶從花生餅粕中生產(chǎn)活性肽的方法，具體為采用化學(xué)改性的磁性殼聚糖微粒固定堿性和中性兩種蛋白酶，以此進行酶法水解，離心、脫色、納濾脫鹽、超濾分級、噴霧干燥獲得花生活性肽。較傳統(tǒng)制備方法，該方法具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品得率高、純度高、生產(chǎn)工藝具有溫和、綠色、節(jié)能等特點。采用本發(fā)明方法生產(chǎn)出的花生功能肽除了具有良好的溶解性外，還具有降血壓和抗氧化功能，因此具有廣闊的市場開發(fā)價值。
文檔編號C12N11/10GK102676624SQ20121016190
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者侯傳偉, 孫強, 宋國輝, 張麗霞, 蘆鑫, 黃紀(jì)念 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院