使用重組酵母全細(xì)胞的豬圓環(huán)病毒(pcv2)亞單位疫苗及其制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于為母豬和豬崽接種疫苗的重組的豬圓環(huán)病毒（PCV2)亞單位疫苗 及其生產(chǎn)方法，該重組的豬圓環(huán)病毒（PCV2)亞單位疫苗包括重組的酵母全細(xì)胞并且可預(yù) 防豬圓環(huán)病毒（PCV)相關(guān)的疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2 (PCV-2)已知是斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)的主要致病源的病 毒。難以開發(fā)能夠預(yù)防豬圓環(huán)病毒造成傷害的疫苗的原因是，使用動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗需要 相對昂貴的培養(yǎng)基和動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以及在血清培養(yǎng)基中所含的各種異源蛋白有可能 在接種期間產(chǎn)生副作用。
[0003] 四種基于來自PCV2a病毒的0RF2抗原的PCV2疫苗正在全球市場上出售。在外 國，在技術(shù)上處于最高水平的公司是梅里亞（Merial，法國），該公司有很多與PCV相關(guān)的專 利，并且使用經(jīng)滅活的PCV2全病毒（Circovac)。勃林格殷格翰（BoehringerIngelheim) 開發(fā)了一種通過在桿狀病毒中表達(dá)0RF2所獲得的基于重組蛋白的疫苗（避開了PCV和 Ciroflex)，其中該疫苗的優(yōu)點(diǎn)在于純化之后每次以lml的量進(jìn)行注射。英特威（Intervet) 有限公司通過在桿狀病毒中表達(dá)0RF2并且純化表達(dá)產(chǎn)物也開發(fā)了一種基于重組蛋白的疫 苗，其中該疫苗被設(shè)計(jì)為以3周的間隔，以2ml的量注射到豬崽體內(nèi)兩次。FortDodge有限 公司通過在PCV-1病毒中表達(dá)PCV2的0RF2開發(fā)了一種嵌合體疫苗，其中該嵌合體疫苗以 2ml的量一次注射到豬患體內(nèi)。
[0004] 在重組病毒的亞單位疫苗的情況中，形成病毒樣顆粒（VLP)能增加疫苗的抗原性 是已知的。在酵母的情況中，已經(jīng)開發(fā)了利用釀酒酵母（S.cerevisiae)菌株中的Tyl( - 種很久之前就已知的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件）的技術(shù)。Tyl在基因、結(jié)構(gòu)和功能上與逆轉(zhuǎn)錄病毒 的核苷/核相似。在1987年報(bào)道了使用Tyl獲得的疫苗，并且當(dāng)疫苗候選基因與Tyl基因 的3'區(qū)域融合并且進(jìn)行表達(dá)時(shí)，有如下優(yōu)點(diǎn)：不阻礙病毒樣顆粒的形成并且可在細(xì)胞中形 成病毒樣顆粒，而不需要其它分離的因子。有幾篇報(bào)道指出：當(dāng)在酵母中生產(chǎn)疫苗時(shí)，酵母 細(xì)胞壁組分還可用作佐劑（ChanGC,ChanWK，SzeDM. 2009,Theeffectsofbeta-glucan onhumanimmuneandcancercells.JHematolOncol2:25)。
[0005] 已知的是，如果裂解酵母細(xì)胞以提取在細(xì)胞中表達(dá)的抗原，則在制備細(xì)胞裂解液 之后，諸如病毒樣顆粒的抗原難以穩(wěn)定地保持在溶液中。此外，還可能需要各種添加劑（例 如，諸如聚山梨醇酯20的表面活性劑，諸如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇的糖，等等），來防止 病毒樣顆粒發(fā)生聚集和沉淀（LangR,WinterG,VogtL，ZuercherA，DorigoB，Schimmele B(2009))。被開發(fā)用來克服上述缺點(diǎn)的使用酵母全細(xì)胞的重組疫苗可享有酵母能表達(dá)一種 或多種抗原、具有高穩(wěn)定性并且還易于進(jìn)行大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)豬圓環(huán)病毒抗原0RF2的酵母全細(xì)胞疫苗具有非常高的 免疫原性，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種表達(dá)重組載體的酵母全細(xì)胞，或該細(xì)胞的裂解液，包括 細(xì)胞或其裂解液的豬圓環(huán)病毒疫苗組合物，以及它們的生產(chǎn)方法，其中重組載體包括編碼 豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白的基因0RF2。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，提供了一種用于豬圓環(huán)病毒疫苗的酵母全細(xì)胞，所 述酵母全細(xì)胞包括豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白0RF2。在該實(shí)施方式中，基因0RF2可以是 由SEQIDN0:1表示的基因。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的菌株。具體地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全細(xì)胞可經(jīng)熱 滅活或者經(jīng)福爾馬林滅活。
[0011] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供了一種用于豬圓環(huán)病毒疫苗的酵母全細(xì)胞的裂 解液，所述酵母全細(xì)胞的裂解液包括豬圓環(huán)病毒的Π型衣殼蛋白0RF2?；?RF2可以 是由SEQIDN0:1表示的基因。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的菌株。具體地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全細(xì)胞可經(jīng)熱滅 活或者經(jīng)福爾馬林滅活，并且所述酵母全細(xì)胞的裂解液可來源于經(jīng)熱滅活或經(jīng)福爾馬林滅 活的酵母全細(xì)胞。
[0012] 在又一實(shí)施方式中，提供了一種豬圓環(huán)病毒疫苗組合物，所述豬圓環(huán)病毒疫苗組 合物包括酵母全細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解液，該酵母全細(xì)胞包括豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白 0RF2。在該實(shí)施方式中，基因0RF2可以是由SEQIDN0:1表示的基因，并且0RF2蛋白可以 是包括SEQIDN0:2的氨基酸序列的多肽。進(jìn)一步地，酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒 酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具體地，所述酵母可以是Y2805菌株，并且可缺乏 半乳糖操縱子（gal)80基因。此外，所述酵母全細(xì)胞可經(jīng)熱滅活或者經(jīng)福爾馬林滅活。根 據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物可包括濃度為4x10s的酵母全細(xì)胞或更少的細(xì)胞。
[0013] 在又一實(shí)施方式中，提供了一種生產(chǎn)用于豬圓環(huán)病毒疫苗的經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母全細(xì)胞 或其裂解液的方法，所述方法包括如下步驟：制備包括基因0RF2的重組表達(dá)載體，該基因 0RF2編碼豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白；和，使用所述重組載體轉(zhuǎn)化酵母。在該實(shí)施方式 中，基因0RF2可以是由SEQIDNO: 1表示的基因。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵 母Saccharomycescerevisiae的菌株。具體地，所述酵母可以是缺乏gal80基因的Y2805 菌株。在該實(shí)施方式中，重組表達(dá)載體可包括GAL10啟動子，因此0RF2可與Tyl融合，以便 可增加它的表達(dá)。此外，所述酵母全細(xì)胞可進(jìn)一步經(jīng)熱滅活或者經(jīng)福爾馬林滅活。
[0014] 在又一實(shí)施方式中，提供了一種用于為豬接種疫苗的方法，所述方法包括：對豬 給予豬圓環(huán)病毒疫苗組合物，所述豬圓環(huán)病毒疫苗組合物包括酵母全細(xì)胞或該細(xì)胞的裂解 液，該酵母全細(xì)胞包括豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白0RF2。在該實(shí)施方式中，所述0RF2蛋白 可以由SEQIDN0:1表示的基因編碼，并且可以是包括SEQIDN0:2表示的氨基酸序列的 多肽。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具體 地，所述酵母可以是Y2805菌株，并且可缺乏gal80基因。在該實(shí)施方式中，重組表達(dá)載體 可包括GAL10啟動子，因此0RF2可與Tyl融合，以便增加它的表達(dá)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行滅活。所述滅活優(yōu)選通 過化學(xué)途徑進(jìn)行，例如通過使抗原暴露于諸如甲醛（福爾馬林）、多聚甲醛、β-丙內(nèi)酯或吖 丙啶或其衍生物的化學(xué)試劑，但并不限于此。
[0016] 本文所使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化株"指通過將外源DNA(例如質(zhì)?；螂s種DNA)引入到細(xì) 胞中，然后使該DNA在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)而獲得的細(xì)胞。按照醋酸鋰的方法（Nucleic AcidsResearch19, 5791 (1991))將包含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中。
[0017] 本文所使用的術(shù)語"克隆"指一系列的過程，其中，基因通過PCR技術(shù)被插入到包 括質(zhì)粒的遞送系統(tǒng)中或從該遞送系統(tǒng)中移出，用于在基因中形成新的限制酶切位點(diǎn)。
[0018] 本文所使用的術(shù)語"為……接種疫苗"指如下過程：將諸如蛋白或抗原的活性成分 注入體內(nèi)以產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生記憶B細(xì)胞，然后誘導(dǎo)針對同一抗原的快速免疫應(yīng)答， 以便活性成分可用作對抗特定疾病的治療試劑。
[0019] 本文所使用的術(shù)語"細(xì)胞裂解"指破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞壁以釋放細(xì)胞內(nèi)容物的過程 (例如攪拌珠子和細(xì)胞的過程），并且術(shù)語"細(xì)胞裂解液"指通過裂解細(xì)胞獲得的細(xì)胞內(nèi)組 分和細(xì)胞外組分的混合物。
[0020] 本文所使用的術(shù)語"斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS) "指以斷奶豬崽中的消耗綜 合征為特征的豬病，這已經(jīng)在多個國家（包括加拿大、美國、北愛爾蘭、歐洲、韓國、日本、臺 灣等）中進(jìn)行了報(bào)道。斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS)在斷奶豬崽中引起死亡、萎縮或體 增重降低，并且它通常持續(xù)6個月至1年的時(shí)間段，從而帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在韓國，1997 年報(bào)道了PMWS的第一次爆發(fā)，并且PMWS在2007年導(dǎo)致約六百萬豬崽的死亡，這對應(yīng)于損 失約二十億圓（韓國貨幣）（韓國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究所（KoreaRuralEconomicInstitute))。
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