本申請(qǐng)根據(jù)35usc§119(e)主張2014年12月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/093,105的權(quán)益。上面引用的專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容在此通過(guò)引用明確并入本文。

背景

本發(fā)明涉及用于測(cè)定懷疑含有分析物的樣品中分析物的濃度的方法。更具體地，本發(fā)明涉及減少干擾物質(zhì)對(duì)上述測(cè)定樣品中分析物的濃度的方法期間進(jìn)行的測(cè)量的影響。

疏水性化合物諸如，例如藥物，維生素諸如例如維生素d和維生素b12，以及半抗原激素，通常存在于脂蛋白(其替代分析物標(biāo)記物是膽固醇)的疏水核心中，膽固醇存在于所有脂蛋白，包括低密度脂蛋白(ldl)、極低密度脂蛋白(vldl)、中密度脂蛋白(idl)、高密度脂蛋白(hdl)和乳糜微粒。

如上所述，維生素d是一種此疏水性化合物。通過(guò)uv光形成維生素d后，其通過(guò)血液中的脂蛋白和維生素d結(jié)合蛋白(vdbp)轉(zhuǎn)運(yùn)。在不使用有機(jī)溶劑諸如例如醇提取維生素d的維生素d的測(cè)定中，使用合適的釋放劑從vdbp釋放維生素d。然而，脂蛋白核心中的維生素d分子留在脂蛋白的核心中，并且對(duì)于大部分未被觸及。提取測(cè)定法是費(fèi)力的，并且如上所提及，涉及對(duì)樣品使用有機(jī)溶劑。因此，維生素d或其他疏水性化合物的大多數(shù)免疫測(cè)定法受樣品中的一種或多種干擾物質(zhì)(諸如例如膽固醇和脂蛋白)負(fù)面影響，因?yàn)槲磸母蓴_物質(zhì)(諸如例如脂蛋白的核心)釋放的維生素d分子不是免疫測(cè)定法中使用的抗體可及的。樣品中維生素d的實(shí)際量可能無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定，并且在免疫測(cè)定法中觀察到的維生素d的量可能被錯(cuò)誤地升高或抑制。

評(píng)價(jià)生物樣品中的維生素d水平是重要的，因?yàn)榫S生素d缺乏與哺乳動(dòng)物中的許多疾病相關(guān)。持續(xù)需要開(kāi)發(fā)快速和準(zhǔn)確的診斷方法來(lái)測(cè)量取自患者的樣品中疏水性半抗原分析物的水平。所述方法應(yīng)當(dāng)是完全可自動(dòng)化的，并且是準(zhǔn)確的，甚至當(dāng)對(duì)具有各種干擾物質(zhì)的樣品進(jìn)行時(shí)也是如此。測(cè)定方法應(yīng)當(dāng)提供樣品中疏水性半抗原分析物的量的精確測(cè)量，同時(shí)盡可能降低由樣品中存在的干擾物質(zhì)導(dǎo)致的不準(zhǔn)確性。

概述

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測(cè)定懷疑含有疏水性半抗原分析物的未知樣品中的疏水性半抗原分析物的實(shí)際濃度的方法，其中所述未知樣品懷疑含有干擾物質(zhì)。對(duì)未知樣品進(jìn)行第一測(cè)定方法以獲得未知樣品中的疏水性半抗原分析物的測(cè)量濃度。對(duì)未知樣品進(jìn)行第二測(cè)定方法以獲得未知樣品中的干擾物質(zhì)的濃度。應(yīng)用利用步驟(a)中獲得的疏水性半抗原分析物的測(cè)量濃度和干擾物質(zhì)的測(cè)量濃度的預(yù)先確定的校正公式，以測(cè)定未知樣品中的疏水性半抗原分析物的實(shí)際濃度。校正公式通過(guò)包括以下的方法預(yù)先確定：(i)使用第一測(cè)定方法測(cè)量至少兩種不同樣品的疏水性半抗原分析物的濃度，且使用參考方法測(cè)量至少兩種不同樣品的疏水性半抗原分析物的濃度，其中所述至少兩種不同樣品還包含干擾物質(zhì)，(ii)確定第一測(cè)定方法和參考方法之間的偏差，其中所述偏差是每種不同樣品的通過(guò)參考方法和第一測(cè)定方法測(cè)定的疏水性半抗原分析物的濃度之間的差異，(iii)測(cè)量所述至少兩種不同樣品各自的干擾物質(zhì)的濃度，且(iv)通過(guò)使用所述至少兩種不同樣品各自中的偏差和干擾物質(zhì)的濃度進(jìn)行回歸分析來(lái)確定校正公式。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測(cè)定懷疑含有維生素d分析物的未知樣品中的維生素d分析物的實(shí)際濃度的方法，其中所述未知樣品懷疑含有膽固醇。對(duì)未知樣品進(jìn)行第一測(cè)定方法以獲得未知樣品中的維生素d分析物的測(cè)量濃度。對(duì)未知樣品進(jìn)行第二測(cè)定方法以獲得膽固醇的濃度。應(yīng)用利用步驟(a)中獲得的維生素d分析物的測(cè)量濃度和膽固醇的測(cè)量濃度的預(yù)先確定的校正公式，以測(cè)定未知樣品中的維生素d分析物的實(shí)際濃度。校正公式通過(guò)包括以下的方法預(yù)先確定：(i)使用第一測(cè)定方法測(cè)量至少兩種不同樣品的維生素d分析物的濃度，且使用參考方法測(cè)量至少兩種不同樣品各自的維生素d分析物的濃度，其中所述樣品還包含膽固醇，(ii)確定第一測(cè)定方法和參考方法之間的偏差，其中所述偏差是至少兩種不同樣品各自的通過(guò)參考方法和測(cè)定方法測(cè)定的維生素d分析物的濃度之間的差異，(iii)測(cè)量所述至少兩種不同樣品各自中的膽固醇的濃度，且(iv)通過(guò)使用所述至少兩種不同樣品各自中的偏差和膽固醇的濃度進(jìn)行回歸分析來(lái)確定校正公式。

附圖簡(jiǎn)述

本文提供的附圖不是按比例的，并且為了便于理解根據(jù)本文所述的原理的某些實(shí)例的目的而提供，并且通過(guò)說(shuō)明而非限制所附權(quán)利要求的范圍的方式來(lái)提供。

圖1是描繪針對(duì)樣品集合的每個(gè)成員的膽固醇濃度繪制的偏差(通過(guò)從相同樣品集合上的維生素d的免疫測(cè)定結(jié)果減去樣品集合上的維生素d的液相色譜-質(zhì)譜(lcms)測(cè)定的結(jié)果而獲得)的圖。

圖2是描繪針對(duì)樣品集合的每個(gè)成員的膽固醇濃度繪制的圖1的偏差(基于獲得的校正公式校正)的圖。

圖3是描繪針對(duì)通過(guò)參考方法測(cè)量的維生素d的濃度繪制的通過(guò)免疫測(cè)定測(cè)量的維生素d的濃度(不應(yīng)用校正公式)的圖。

圖4是描繪針對(duì)通過(guò)參考方法測(cè)量的維生素d的濃度繪制的通過(guò)免疫測(cè)定測(cè)量的維生素d的濃度(應(yīng)用校正公式)的圖。

具體實(shí)施方案的詳述

總體討論

根據(jù)本文所述的原理的方法的實(shí)例提供了取自宿主的樣品中的疏水性半抗原分析物的精確測(cè)量，其中所述樣品含有一種或多種干擾物質(zhì)，其影響精確地檢測(cè)疏水性半抗原分析物的能力。在根據(jù)本文所述的原理的方法的實(shí)例中，通過(guò)使用測(cè)定方法測(cè)量未知樣品的一部分中疏水性半抗原分析物的濃度和使用另一種通常不同的測(cè)定方法測(cè)量未知樣品的另一部分中干擾物質(zhì)的濃度和應(yīng)用利用上述測(cè)量值兩者的預(yù)先確定的校正公式來(lái)校正疏水性半抗原分析物的測(cè)量濃度，以獲得未知樣品中疏水性半抗原分析物的精確測(cè)量值。在一些實(shí)例中，干擾物質(zhì)的濃度的測(cè)量作為測(cè)試組(其還包括疏水性半抗原分析物的測(cè)量)的一部分進(jìn)行。

校正公式通過(guò)包括以下的方法預(yù)先確定：(i)使用第一測(cè)定方法測(cè)量至少兩種不同樣品的疏水性半抗原分析物的濃度，且使用參考方法測(cè)量?jī)煞N不同樣品各自的疏水性半抗原分析物的濃度，其中所述樣品還包含干擾物質(zhì)，(ii)確定第一測(cè)定方法和參考方法之間的偏差，其中所述偏差是兩種不同樣品各自的通過(guò)參考方法和第一測(cè)定方法測(cè)定的疏水性半抗原分析物的濃度之間的差異，(iii)測(cè)量所述兩種不同樣品各自中的干擾物質(zhì)的濃度，且(iv)通過(guò)使用所述至少兩種不同樣品各自的偏差和干擾物質(zhì)的濃度進(jìn)行回歸分析來(lái)確定校正公式。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用如上所討論的校正公式導(dǎo)致疏水性半抗原分析物的更準(zhǔn)確的確定，而無(wú)論在校正公式不存在的情況下干擾物質(zhì)引起測(cè)定測(cè)量值是過(guò)高還是過(guò)低。

短語(yǔ)“疏水性半抗原分析物”是指這樣的分析物，其具有小于約2,500、或小于約2,000、或小于約1,500、或小于約1,000、或小于約500的分子量，并且在例如約100至約2,500、或約300至約2,500、或約300至約2,000、或約300至約1,500、或約300至約1,000、或約500至約2,500、或約500至約2,000、或約500至約1,500、或約500至約1,000的分子量范圍內(nèi)。疏水性半抗原分析物是脂溶性的，這意味著疏水性半抗原分析物可溶于例如脂肪、油和脂質(zhì)中的一種或多種。

在一些實(shí)例中，所述疏水性半抗原分析物包括但不限于例如維生素、濫用藥物、治療藥物和類固醇激素。維生素包括但不限于例如維生素d、維生素b12、維生素e和維生素k。類固醇激素包括，通過(guò)說(shuō)明而不是限制的方式，例如孕激素、雌激素、雄激素、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素和開(kāi)環(huán)甾類化合物(secosteroid)。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，例如，所述疏水性半抗原分析物是維生素d。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“維生素d”是指一組脂溶性開(kāi)環(huán)甾類化合物，并且包括例如，以下中的一種或多種：25-羥膽鈣化醇(也被稱為骨化二醇(calcidiol,calcifediol)、25-羥膽鈣化醇、或25-羥基維生素d(簡(jiǎn)寫為25(oh)d)，包括25-羥基維生素d3和25-羥基維生素d2；骨化二醇(calcidiol)；1,25-二羥基維生素d3(骨化三醇；1,25(oh)2d3)；1,25-二羥基維生素d4；1,25-二羥基維生素d5；和1,25-二羥基維生素d6；包括上述所有的一種或多種代謝物。

待分析的樣品是懷疑含有疏水性半抗原分析物和一種或多種干擾物質(zhì)的樣品。所述樣品可以是生物樣品或非生物樣品。生物樣品可以來(lái)自哺乳動(dòng)物主體或非哺乳動(dòng)物主體。哺乳動(dòng)物主體可以是例如人或其他動(dòng)物物種?！胺巧飿悠贰笔桥c生物材料無(wú)關(guān)的樣品，且包括例如土壤樣品、廢物流、水樣品、空氣樣品、除空氣以外的氣體樣品和礦物樣品。短語(yǔ)“生物樣品”是指任何生物材料，諸如，例如，體液、機(jī)體組織、機(jī)體化合物和培養(yǎng)基。樣品可以是來(lái)自任何來(lái)源的固體、半固體或流體(液體或氣體)。在一些實(shí)施方案中，樣品可以是機(jī)體排泄物、機(jī)體抽吸物(aspirant)、機(jī)體切割物(excisant)或機(jī)體提取物。機(jī)體通常是哺乳動(dòng)物的機(jī)體，在某些實(shí)施方案中，機(jī)體是人體。機(jī)體排泄物是從機(jī)體排泄的那些物質(zhì)(盡管它們也可以通過(guò)切除或提取獲得)，諸如，例如尿、排泄物、糞便、陰道粘液、精液、淚液、呼氣、汗、水泡液和炎性滲出物。機(jī)體切割物是從機(jī)體切割的那些物質(zhì)，諸如，例如，皮膚、毛發(fā)和組織樣品，包括來(lái)自器官和機(jī)體其他部分的活檢樣品。機(jī)體抽吸物是從機(jī)體抽吸的那些物質(zhì)，諸如，例如，粘液、唾液和痰液。機(jī)體提取物是從機(jī)體提取的那些物質(zhì)，諸如，例如，全血、血漿、血清、脊髓液、腦脊髓液、淋巴液、關(guān)節(jié)液和腹膜液。在一些實(shí)例中，樣品是全血、血漿或血清。

短語(yǔ)“干擾物質(zhì)”是指一種或多種化合物，其與疏水性半抗原分析物相互作用且使疏水性半抗原分析物不能用于結(jié)合結(jié)合配偶體，諸如測(cè)定疏水性半抗原分析物的測(cè)定法中使用的疏水性半抗原分析物的抗體。此類干擾物質(zhì)包括但不限于例如膽固醇，其存在于所有脂蛋白包括ldl、vldl、idl、hdl和乳糜微粒中。

校正公式的確定

根據(jù)本文所述的原理的實(shí)例具體應(yīng)用于疏水性半抗原分析物的測(cè)定，其中干擾物質(zhì)影響測(cè)量的準(zhǔn)確性。如上所提及，采用預(yù)先確定的校正公式來(lái)校正由于測(cè)試的樣品中存在一種或多種干擾物質(zhì)導(dǎo)致的不精確結(jié)果的測(cè)定測(cè)量。在根據(jù)本文所述的原理的實(shí)例中，用于預(yù)先確定校正公式的方法包括使用第一測(cè)定方法測(cè)量至少兩種不同樣品的疏水性半抗原分析物的濃度和使用參考方法測(cè)量至少兩種不同樣品各自的疏水性半抗原分析物的濃度，其中所述樣品各自還包含干擾物質(zhì)。

對(duì)于可用于測(cè)定來(lái)自宿主的未知樣品中的疏水性半抗原分析物的濃度的每個(gè)測(cè)定，由例如制造商或開(kāi)發(fā)者確定預(yù)先確定的校正公式。一旦預(yù)先確定，校正公式可以通過(guò)例如與測(cè)定說(shuō)明書一起包括來(lái)傳播給用戶諸如例如實(shí)驗(yàn)室，用于測(cè)定未知樣品中疏水性半抗原分析物的濃度。用戶簡(jiǎn)單地將預(yù)先確定的校正公式應(yīng)用于對(duì)于未知樣品的后續(xù)分析獲得的測(cè)定結(jié)果，以便計(jì)算未知樣品中疏水性半抗原分析物的準(zhǔn)確濃度。

在預(yù)先確定校正公式中，經(jīng)受第一測(cè)定方法的含有疏水性半抗原分析物的不同樣品的數(shù)目是至少兩種、或至少三種、或至少四種、或至少五種、或至少六種。在一些實(shí)例中，可以采用的含有疏水性半抗原分析物的不同樣品的數(shù)目為例如2至20，或2至15，或2至14，或2至13，或2至12，或2至11，或2至10，或3至20，或3至15，或3至14，或3至13，或3至12，或3至11，或3至10，或4至20，或4至15，或4至12，或4至10，或5至20，或5至15，或5至12，或5至10，或6至15，或6至14，或6至13，或6至12，或7至15，或7至14，或7至13，或7至12，或8至20，或8至15，或8至12。

在一些實(shí)例中，采用的疏水性半抗原分析物的濃度跨越待分析的未知樣品中疏水性半抗原分析物的預(yù)期濃度范圍?？梢詼y(cè)定的疏水性半抗原分析物的濃度通常例如從約10^-5至約10^-17m、或約10^-6至約10^-14m、或約10^-8m至約10^-10m變化。所述樣品各自中的干擾物質(zhì)的濃度可以在例如約10mg/dl至約1,000mg/dl、或約50mg/dl至約1,000mg/dl、或約100mg/dl至約1,000mg/dl、或約200mg/dl至約1,000mg/dl、或約300mg/dl至約1,000mg/dl、或約500mg/dl至約1,000mg/dl、或約10mg/dl至約500mg/dl、或約50mg/dl至約500mg/dl、或約100mg/dl至約500mg/dl、或約200mg/dl至約500mg/dl、或約300mg/dl至約500mg/dl變化。

用于預(yù)先確定校正公式的第一測(cè)定方法是隨后用于測(cè)量懷疑含有疏水性半抗原分析物的樣品(即未知樣品)的測(cè)定方法?？梢圆捎萌魏螠y(cè)定方法作為第一測(cè)定方法。在一些實(shí)例中，所述第一測(cè)定方法包括向包含樣品的介質(zhì)中添加用于測(cè)定樣品中疏水性分析物的濃度的試劑，其中所述試劑包含至少一種疏水性分析物的結(jié)合配偶體，和在使所述疏水性分析物與所述疏水性分析物的結(jié)合配偶體結(jié)合的條件下孵育所述介質(zhì)。所述結(jié)合產(chǎn)生包含分析物的結(jié)合配偶體和分析物或分析物類似物的復(fù)合物。測(cè)量此類復(fù)合物的量且將其與樣品中分析物的量相關(guān)。

短語(yǔ)“結(jié)合配偶體”是指作為特異性結(jié)合對(duì)的成員的分子，其是特異性結(jié)合另一分子并因此被定義為與另一分子互補(bǔ)的兩種不同分子之一。例如，特異性結(jié)合對(duì)的一個(gè)成員可以在表面上或在空腔中具有特異性結(jié)合特異性結(jié)合對(duì)的另一成員的特定空間和極性組織的區(qū)域。通過(guò)說(shuō)明而非限制的方式，所述結(jié)合配偶體可以是例如抗體或適體(例如，核酸適體或肽適體)。

采用抗體作為一種試劑的測(cè)定法被稱為免疫測(cè)定法。短語(yǔ)“分析物的抗體”是指與分析物(且在一些實(shí)例中，與分析物的密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)類似物，諸如分析物的代謝物)特異性結(jié)合并且不會(huì)與將扭曲分析物的分析的其他物質(zhì)結(jié)合至任何顯著程度的抗體。因此，特異性結(jié)合涉及對(duì)于兩種不同分子中的一種相對(duì)于另一種的特異性識(shí)別，相比之下，對(duì)其他分子的識(shí)別實(shí)質(zhì)上較差。另一方面，非特異性結(jié)合涉及相對(duì)獨(dú)立于特定表面結(jié)構(gòu)的分子之間的非共價(jià)結(jié)合。非特異性結(jié)合可以由幾種因素導(dǎo)致，包括分子之間的疏水性相互作用。

通常，通過(guò)在測(cè)定介質(zhì)中組合含有疏水性半抗原分析物的樣品和疏水性半抗原分析物的抗體來(lái)進(jìn)行用作用于根據(jù)本文所述的原理預(yù)先確定校正公式的第一測(cè)定方法的測(cè)定法?？梢砸杂坞x或綴合模式采用所述抗體。綴合的抗體是例如與支持物或標(biāo)記或與支持物和標(biāo)記的組合結(jié)合的抗體。采用的其他試劑的性質(zhì)取決于待進(jìn)行的測(cè)定法的具體類型。介質(zhì)中的組合經(jīng)受用于使分析物或分析物類似物與抗體結(jié)合以形成復(fù)合物的條件。測(cè)量所述復(fù)合物的量，其中所述復(fù)合物的量與介質(zhì)中分析物的量相關(guān)。

“分析物類似物”是與分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體(例如分析物的抗體)的修飾分析物。修飾提供了將分析物類似物與另一分子接合的方式。分析物類似物將通常通過(guò)超過(guò)用將分析物類似物連接至中心(hub)或標(biāo)記的鍵代替氫而不同于分析物，但不必如此。所述分析物類似物可以是例如通過(guò)例如鍵或連接基團(tuán)與另一分子諸如例如標(biāo)記或支持物綴合的分析物。

測(cè)定可以在不分離(均質(zhì))或分離(非均質(zhì))任何測(cè)定組分或產(chǎn)物的情況下進(jìn)行。非均質(zhì)測(cè)定通常涉及一個(gè)或多個(gè)分離步驟，并且可以是競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的。免疫測(cè)定可以涉及標(biāo)記或未標(biāo)記的試劑。涉及未標(biāo)記的試劑的免疫測(cè)定通常包括形成相對(duì)大復(fù)合物，所述相對(duì)大復(fù)合物涉及由根據(jù)本文所述的原理的免疫原性綴合物制備的一種或多種抗體。對(duì)于抗體復(fù)合物的檢測(cè)，此類測(cè)定包括例如免疫沉淀素和凝集法，以及相應(yīng)的光散射技術(shù)例如，例如濁度測(cè)定法(nephelometry)和比濁法(turbidimetry)。標(biāo)記免疫測(cè)定包括但不限于例如化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定、熒光偏振免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、抑制測(cè)定、誘導(dǎo)發(fā)光測(cè)定、以及熒光氧通道測(cè)定。

一組通常的免疫測(cè)定包括使用有限濃度的試劑之一的免疫測(cè)定。另一組免疫測(cè)定涉及使用過(guò)量的一種或多種主要試劑。另一組免疫測(cè)定是無(wú)分離均質(zhì)測(cè)定，其中標(biāo)記的試劑在樣品中分析物或分析物類似物與抗體結(jié)合后調(diào)節(jié)標(biāo)記信號(hào)。

如上所提及，所述測(cè)定可以在不分離(均質(zhì))或分離(非均質(zhì))任何測(cè)定組分或產(chǎn)物的情況下進(jìn)行。均質(zhì)免疫測(cè)定由以下例舉：rubenstein等人，美國(guó)專利號(hào)3,817,837，第3欄，第6行至第6欄，第64行中公開(kāi)的emit?測(cè)定(siemenshealthcarediagnosticsinc.，deerfield，il)；免疫熒光法，諸如ullman等人，美國(guó)專利號(hào)3,996,345，第17欄，第59行至第23欄，第25行中公開(kāi)的那些；酶通道免疫測(cè)定(“ecia”)，諸如maggio等人，美國(guó)專利號(hào)4,233,402，第6欄，第25行至第9欄，第63行中公開(kāi)的那些；熒光偏振免疫測(cè)定(“fpia”)，如例如尤其是美國(guó)專利號(hào)5,354,693中公開(kāi)的那些；和酶免疫測(cè)定，諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(“elisa”)。非均質(zhì)測(cè)定的示例為放射免疫測(cè)定，其公開(kāi)于yalow等人，j.clin.invest.39:1157(1960)中。上述公開(kāi)內(nèi)容的相關(guān)部分全部通過(guò)引用并入本文。

其他酶免疫測(cè)定是例如由ngo和lenhoff，febslett.(1980)116:285-288討論的酶調(diào)節(jié)介導(dǎo)的免疫測(cè)定(“emmia”)；由oellerich，j.clin.chem.clin.biochem.(1984)22:895-904公開(kāi)的底物標(biāo)記的熒光免疫測(cè)定(“slfia”)；由khanna等人，clin.chem.acta(1989)185:231-240公開(kāi)的組合酶供體免疫測(cè)定(“cedia”)；均質(zhì)顆粒標(biāo)記的免疫測(cè)定，諸如顆粒增強(qiáng)的比濁抑制免疫測(cè)定(“petinia”)和顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測(cè)定(“petia”)。

其他測(cè)定包括例如溶膠顆粒免疫測(cè)定(“spia”)，分散染料免疫測(cè)定(“dia”)；金屬免疫測(cè)定(“mia”)；酶膜免疫測(cè)定(“emia”)；和發(fā)光免疫測(cè)定(luminoimmunoassay)(“l(fā)ia”)。其他測(cè)定類型包括免疫傳感器測(cè)定，其涉及在結(jié)合抗體后，監(jiān)測(cè)化合物的光學(xué)、聲學(xué)和電學(xué)特性的變化。此類測(cè)定包括例如光學(xué)免疫傳感器測(cè)定、聲學(xué)免疫傳感器測(cè)定、半導(dǎo)體免疫傳感器測(cè)定、電化學(xué)換能器免疫傳感器測(cè)定、電位型免疫傳感器測(cè)定和電流型電極測(cè)定。

非均質(zhì)測(cè)定通常涉及一個(gè)或多個(gè)分離步驟，并且可以是競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的。各種競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性非均質(zhì)測(cè)定形式公開(kāi)于davalian等人，美國(guó)專利號(hào)5,089,390，第14欄，第25行至第15欄，第9行，其通過(guò)引用并入本文。在競(jìng)爭(zhēng)性非均質(zhì)測(cè)定的一個(gè)實(shí)例中，將分析物的抗體與之結(jié)合的支持物與介質(zhì)接觸，所述介質(zhì)含有懷疑含有分析物的樣品和標(biāo)記的分析物類似物。樣品中的分析物與可攜帶可檢測(cè)標(biāo)記的分析物類似物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析物的抗體。將支持物和介質(zhì)分離之后，支持物或介質(zhì)的標(biāo)記活性通過(guò)常規(guī)技術(shù)測(cè)定，并且與樣品中的分析物的量相關(guān)。

用于根據(jù)本文所述的原理預(yù)先確定校正公式的測(cè)定方法中采用的介質(zhì)是在通常提供最佳測(cè)定靈敏度的中等ph下的水性緩沖介質(zhì)。水性介質(zhì)可以僅為水，或可以包括0.1至約40體積%的助溶劑。介質(zhì)的ph將在約4至約11的范圍內(nèi)，或約5至約10的范圍內(nèi)，或約6.5至約9.5的范圍內(nèi)。ph將通常為任何特異性結(jié)合對(duì)的結(jié)合成員的最佳結(jié)合、該測(cè)定的其他試劑諸如信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的成員等等的最適宜ph之間的折中。各種緩沖劑可用來(lái)實(shí)現(xiàn)所需ph和在測(cè)定期間保持ph。說(shuō)明性緩沖劑包括例如硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、巴比妥、pipes、hepes、mes、aces、mops、bicine等。所采用的具體緩沖劑不是關(guān)鍵的，但在個(gè)別測(cè)定中，可以優(yōu)選一種或另一種緩沖劑。

測(cè)定方法中可以使用各種輔助材料。例如，除緩沖劑之外，介質(zhì)可以包含介質(zhì)和采用的試劑的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，除這些添加劑之外，可以包括蛋白諸如白蛋白；有機(jī)溶劑諸如甲酰胺；季銨鹽；聚陰離子諸如硫酸葡聚糖；結(jié)合增強(qiáng)劑，例如聚亞烷基二醇；多糖諸如葡聚糖、海藻糖等。介質(zhì)也可以包含用于防止形成血塊的試劑。此類試劑是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括例如edta、egta、檸檬酸鹽、肝素等。介質(zhì)也可以包含一種或多種如本領(lǐng)域已知的防腐劑，諸如疊氮化鈉、硫酸新霉素、proclin?300、鏈霉素等。如果采用，任何上述材料以足以獲得所需效果或功能的濃度或量存在。

根據(jù)采用的測(cè)定法的性質(zhì)，介質(zhì)可以包含一種或多種組分，諸如，例如，標(biāo)記是其部分的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的其他成員。

所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)可具有一種或多種組分，至少一種組分是標(biāo)記。所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生與樣品中疏水性半抗原分析物的存在相關(guān)的信號(hào)。所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)包括產(chǎn)生可測(cè)量的信號(hào)所需的所有試劑。所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的其他組分可以包括在顯影溶液中，并且可以包括但不限于例如底物、增強(qiáng)劑、活化劑、化學(xué)發(fā)光化合物、輔因子、抑制劑、清除劑、金屬離子和結(jié)合信號(hào)產(chǎn)生物質(zhì)所需的特異性結(jié)合物質(zhì)。所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的其他組分可以是例如輔酶、與酶產(chǎn)物反應(yīng)的物質(zhì)、其他酶和催化劑。所述信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)提供通過(guò)外部裝置，通過(guò)使用電磁輻射，理想地通過(guò)目測(cè)可檢測(cè)的信號(hào)。示例性的信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)描述于美國(guó)專利號(hào)5,508,178，其相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”包括聚(氨基酸)標(biāo)記和非聚(氨基酸)標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“聚(氨基酸)標(biāo)記部分”包括作為蛋白的標(biāo)記，例如但不限于例如酶、抗體、肽和免疫原。術(shù)語(yǔ)“非聚(氨基酸)標(biāo)記”包括不是蛋白的那些標(biāo)記。所述非聚(氨基酸)標(biāo)記能夠直接被檢測(cè)或可通過(guò)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的反應(yīng)檢測(cè)。所述非聚(氨基酸)標(biāo)記可以是同位素的或非同位素的，并且通過(guò)說(shuō)明而非限制的方式，可以是例如放射性同位素、發(fā)光化合物(其包括但不限于例如吖啶酯、熒光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物)、編碼催化劑的多核苷酸、促進(jìn)劑(promoter)、染料、輔酶、酶底物、放射性基團(tuán)和可擴(kuò)增的多核苷酸序列。在一些實(shí)例中，所述非聚(氨基酸)標(biāo)記為例如放射性同位素的，發(fā)光的(諸如，例如，吖啶酯)，微粒(諸如，例如，可以將結(jié)合物與未結(jié)合物分離的磁性顆粒，可以通過(guò)濁度和濁度測(cè)定法(nephelometry)測(cè)量的膠乳顆粒，和化學(xué)發(fā)光珠粒(例如loci化學(xué)發(fā)光珠粒(chemibeads))。

一些已知的測(cè)定法利用信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)(sps)，其采用第一和第二sps成員。sps成員可以是關(guān)聯(lián)的，因?yàn)閟ps的一個(gè)成員的活化產(chǎn)生產(chǎn)物(諸如，例如光)，其導(dǎo)致sps的另一個(gè)成員的活化。

在已知測(cè)定法的一些實(shí)施方案中，sps成員包含敏化劑諸如，例如光敏劑，和化學(xué)發(fā)光組合物，其中敏化劑的活化產(chǎn)生使化學(xué)發(fā)光組合物活化的產(chǎn)物。第二sps成員通常產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，所述可檢測(cè)信號(hào)與結(jié)合和/或未結(jié)合的sps成員的量(即與所檢測(cè)的分析物或與反映待檢測(cè)的分析物的量的試劑結(jié)合或未結(jié)合的sps成員的量)相關(guān)。在根據(jù)本文所述原理的一些實(shí)例中，敏化劑試劑或化學(xué)發(fā)光試劑之一是根據(jù)本文所述原理制備的綴合物試劑?？梢岳玫墓饷魟┖突瘜W(xué)發(fā)光試劑的實(shí)例是描述于美國(guó)專利號(hào)5,340,716和6,251,581(其相關(guān)公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)中的那些。

在一個(gè)具體實(shí)例中，通過(guò)說(shuō)明且非限制的方式，可以采用誘導(dǎo)發(fā)光免疫測(cè)定法。誘導(dǎo)發(fā)光免疫測(cè)定法在美國(guó)專利號(hào)5,340,716(ullman)(其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)中提及。該測(cè)定法采用光敏劑試劑和化學(xué)發(fā)光試劑。在一種方法中，該測(cè)定法使用標(biāo)記顆粒-綴合物作為光敏劑試劑，其中顆粒-綴合物的標(biāo)記是光敏劑?；瘜W(xué)發(fā)光試劑包含分析物的抗體。分析物與包含分析物類似物的顆粒-綴合物競(jìng)爭(zhēng)分析物的抗體。如果存在分析物，則較少數(shù)目的標(biāo)記的顆粒-綴合物的分子與化學(xué)發(fā)光化合物緊密接近。因此，測(cè)定信號(hào)將減小。當(dāng)兩種標(biāo)記緊密接近時(shí)，光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，并活化化學(xué)發(fā)光試劑。經(jīng)活化的化學(xué)發(fā)光試劑隨后產(chǎn)生光。所產(chǎn)生的光的量與所形成的復(fù)合物的量相關(guān)，其進(jìn)而與樣品中存在的分析物的量相關(guān)。

測(cè)定介質(zhì)中各種試劑的濃度將通常由分析物的目標(biāo)濃度范圍、測(cè)定的性質(zhì)等決定。然而，試劑各自的最終濃度通常憑經(jīng)驗(yàn)確定，以優(yōu)化測(cè)定法在目標(biāo)范圍的靈敏度。也就是說(shuō)，顯著的分析物的濃度變化應(yīng)當(dāng)提供可精確測(cè)量的信號(hào)差異?？剂恐T如信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)通常決定各種試劑的濃度。

如上所提及，在介質(zhì)中組合提供所述樣品和試劑。盡管可以改變添加至所述介質(zhì)的順序，但對(duì)于本文所述的測(cè)定形式的一些實(shí)施方案將存在某些優(yōu)選。最簡(jiǎn)單的添加順序當(dāng)然是同時(shí)添加所有材料，并測(cè)定所述測(cè)定介質(zhì)對(duì)信號(hào)具有的影響，如在均質(zhì)測(cè)定中。或者，可以相繼將每種試劑或試劑組組合。在一些實(shí)施方案中，在如下所討論的各個(gè)添加之后，可以涉及孵育步驟。在非均質(zhì)測(cè)定中，在一個(gè)或多個(gè)孵育步驟之后還可以采用洗滌步驟。

可以在添加上述各種試劑之間以一個(gè)或多個(gè)時(shí)間間隔包括任何時(shí)間間隔將一個(gè)或多個(gè)孵育期間應(yīng)用于介質(zhì)。該介質(zhì)通常以足以使試劑的各種組分的結(jié)合發(fā)生的溫度和時(shí)間進(jìn)行孵育。在測(cè)量期間過(guò)程中，適中的溫度通常用于實(shí)施測(cè)定，通常為恒定溫度，優(yōu)選室溫。孵育溫度通常范圍為例如約5℃至約99℃，或約15℃至約70℃，或約20℃至約45℃。孵育的時(shí)間段為例如約0.2秒至約24小時(shí)，或約1秒至約6小時(shí)，或約2秒至約1小時(shí)，或約1至約15分鐘。所述時(shí)間段取決于介質(zhì)的溫度和各種試劑的結(jié)合速率。測(cè)量期間的溫度通常范圍為例如約10℃至約50℃或約15℃至約40℃。

在測(cè)定方法的下一步驟中，檢查介質(zhì)的包含分析物和分析物的抗體的復(fù)合物的存在。復(fù)合物的量指示樣品中分析物的量。在許多實(shí)施方案中，介質(zhì)的檢查涉及從介質(zhì)檢測(cè)信號(hào)。信號(hào)的量與樣品中分析物的存在和/或量相關(guān)。檢測(cè)的特定模式取決于sps的性質(zhì)。如上所討論，存在許多方法，通過(guò)該方法，sps的標(biāo)記可以產(chǎn)生可通過(guò)外部裝置檢測(cè)的信號(hào)。信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)的活化取決于信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)成員的性質(zhì)。

測(cè)量期間的溫度通常范圍為約10℃至約70℃，或約20℃至約45℃，或約20℃至約25℃。在一種方法中，使用已知濃度的分析物形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。也可以使用校準(zhǔn)物和其他對(duì)照。

由任何標(biāo)記產(chǎn)生的發(fā)光或光可以目測(cè)、照相、光量測(cè)定(actinometrically)、分光光度測(cè)量，諸如通過(guò)使用光電倍增器或光電二極管，或通過(guò)測(cè)定其與介質(zhì)中分析物的量相關(guān)的量的任何其他方便的裝置。信號(hào)的存在和/或量的檢查還包括信號(hào)的檢測(cè)，這通常僅是其中閱讀信號(hào)的一個(gè)步驟。通常使用儀器閱讀信號(hào)，所述儀器的性質(zhì)取決于信號(hào)的性質(zhì)。所述儀器可以是但不限于例如分光光度計(jì)，熒光計(jì)，吸收分光計(jì)，光度計(jì)和化學(xué)光度計(jì)(chemiluminometer)。

如上所提及，對(duì)于校正因子的預(yù)先確定，樣品中疏水性半抗原分析物的濃度通過(guò)第一測(cè)定方法對(duì)樣品的一部分進(jìn)行，且通過(guò)參考方法對(duì)相同樣品的一部分進(jìn)行。對(duì)于根據(jù)本文所述的原理的校正公式的預(yù)先確定中使用的樣品各自實(shí)施這些確定。參考方法是用于測(cè)定分析物的方法，其不同于如上所討論的不同樣品各自中疏水性半抗原分析物的濃度的測(cè)量中采用的第一測(cè)定方法。參考方法應(yīng)當(dāng)是直接測(cè)量分析物或其衍生物特異性的特征(例如如通過(guò)質(zhì)譜法所測(cè)量的m/z比)的方法?？梢圆捎玫膮⒖挤椒ǖ膶?shí)例包括，通過(guò)說(shuō)明而非限制的方式，質(zhì)譜法、液相色譜法，包括高效液相色譜法，例如電泳、微流控、顯微鏡檢查、光譜學(xué)、化學(xué)測(cè)定、免疫測(cè)定及其兩種或更多種的組合。

一旦已對(duì)于采用的不同樣品各自通過(guò)至少第一測(cè)定方法和參考方法測(cè)量了疏水性半抗原分析物的濃度，則確定第一測(cè)定方法和參考方法之間的偏差。所述偏差是含有疏水性分析物的不同樣品各自的通過(guò)參考方法和第一測(cè)定方法測(cè)定的疏水性半抗原分析物的濃度之間的差異。

除了不同樣品各自中使用第一測(cè)定方法和參考方法測(cè)量疏水性半抗原分析物的濃度之外，還對(duì)不同樣品各自中的干擾物質(zhì)的濃度實(shí)施測(cè)量?？梢允褂糜糜跍y(cè)定干擾物質(zhì)的測(cè)定方法來(lái)實(shí)施不同樣品中的干擾物質(zhì)的濃度的測(cè)量。測(cè)定方法可以選自上面提及的第一測(cè)定方法或參考方法中任一種。分析的不同樣品應(yīng)當(dāng)涵蓋干擾物質(zhì)的寬范圍的濃度，使得根據(jù)本文所述的原理產(chǎn)生的校正公式可用于后來(lái)分析大患者群體遇到的干擾物質(zhì)的寬范圍的濃度。這可以例如通過(guò)分析超過(guò)用于產(chǎn)生校正公式所需的數(shù)目的多個(gè)樣品(參見(jiàn)上面關(guān)于用于產(chǎn)生校正公式的含有疏水性半抗原分析物的樣品的數(shù)目的討論)和從樣品選擇提供干擾物質(zhì)的寬范圍的濃度的那些樣品來(lái)實(shí)現(xiàn)。

通過(guò)使用不同樣品各自中的偏差和干擾物質(zhì)的濃度進(jìn)行回歸分析來(lái)確定校正公式。回歸分析是聚焦于因變量和一個(gè)或多個(gè)自變量之間的關(guān)系的回歸分析。可以采用任何合適的回歸分析，諸如但不限于例如線性回歸分析，多項(xiàng)式回歸的高階，普通最小二乘回歸，passing-bablok回歸和deming回歸(加權(quán)或非加權(quán))。

在通過(guò)說(shuō)明而非限制的實(shí)例中，回歸分析包括如線性回歸中形成回歸線，和從回歸線的斜率和截距開(kāi)發(fā)校正公式。在該實(shí)例中，對(duì)于各不同樣品，將如上所述獲得的偏差針對(duì)如上所述獲得的干擾物質(zhì)的濃度繪圖?？梢蚤_(kāi)發(fā)以下關(guān)系或校正公式：[an]=[man]+(ax[mis]+b)其中[an]是未知樣品中疏水性分析物的實(shí)際濃度，[man]是未知樣品中疏水性分析物的測(cè)量濃度，[mis]是未知樣品中干擾物質(zhì)的測(cè)量濃度，a是回歸線的斜率，且b是回歸線的截距。因此，用戶諸如實(shí)驗(yàn)室可以使用上述校正公式來(lái)使用預(yù)先確定校正公式的測(cè)定法來(lái)精確地測(cè)定疏水性半抗原分析物的濃度。進(jìn)行測(cè)定后，將未知樣品中的疏水性半抗原分析物的測(cè)量濃度和干擾物質(zhì)的測(cè)量濃度插入公式中，以獲得未知樣品中疏水性半抗原分析物的準(zhǔn)確濃度。例如，對(duì)于特異性疏水性半抗原分析物的具體測(cè)定，預(yù)先確定的校正公式被確定為[an]=[man]+(0.22x[mis]+(-28))；因此，如果[man]的值為36ng/ml且[mis]的值為130ng/ml，則方程變?yōu)閇an]=36+(0.22x130+(-28))或[an]=36+28.6–28=36.6ng/ml。

進(jìn)行測(cè)定的試劑盒

用于進(jìn)行具體測(cè)定的試劑可以存在于試劑盒中，所述試劑盒可用于方便地進(jìn)行用于測(cè)定疏水性半抗原分析物的測(cè)定法。在一個(gè)實(shí)例中，試劑盒在包裝組合中包含用于分析分析物的試劑，其性質(zhì)取決于具體測(cè)定形式。所述試劑可以包括例如分析物的結(jié)合配偶體。所述試劑可以各自在分開(kāi)容器中，或者各種試劑可以組合于一個(gè)或多個(gè)容器中，這取決于試劑的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性。該試劑盒可以進(jìn)一步包括用于進(jìn)行測(cè)定的其他分別包裝的試劑，諸如額外的結(jié)合成員和輔助試劑。

試劑盒中各種試劑的相對(duì)量可以在很大程度上變化，以提供顯著優(yōu)化本發(fā)明方法期間需要發(fā)生的反應(yīng)和進(jìn)一步顯著優(yōu)化測(cè)定靈敏度的試劑濃度。在適當(dāng)情形下，試劑盒中的一種或多種試劑可以作為通常凍干的干燥粉末(包括賦形劑)提供，其在溶解后將提供具有用于進(jìn)行方法或測(cè)定的適當(dāng)濃度的試劑溶液。該試劑盒可以進(jìn)一步包括根據(jù)如上文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的方法或測(cè)定以及校正公式的書面說(shuō)明書。

如本文所使用，短語(yǔ)“至少”意味著指定項(xiàng)的數(shù)目可以等于或大于所述數(shù)目。如本文所使用，短語(yǔ)“約”意味著所述數(shù)目可以相差±10%；例如“約5”意指4.5至5.5的范圍。

名稱“第一”和“第二”是完全任意的，且并不意在表明所標(biāo)識(shí)項(xiàng)目間的任何順序或排序或項(xiàng)目的任何添加順序。本文使用第一和第二的實(shí)例包括例如第一測(cè)定方法和第二測(cè)定方法以及第一sps成員和第二sps成員。

以下實(shí)施例通過(guò)實(shí)例說(shuō)明而非限制的方式進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案，并且意在描述，而非限制本發(fā)明的范圍。本文公開(kāi)的份和百分?jǐn)?shù)以體積計(jì)，除非另有說(shuō)明。

實(shí)施例

校正公式的確定

采用由11種不同血清樣品組成的集合，其中樣品集合的每個(gè)成員都獲得自不同個(gè)體。使用來(lái)自siemenshealthcarediagnosticsinc.(newarkde)的免疫測(cè)定法分析各樣品的一部分的25(oh)維生素d的濃度。在dimension?臨床化學(xué)系統(tǒng)(siemenshealthcarediagnosticsinc.)上進(jìn)行免疫測(cè)定。dimension?exl?25(oh)維生素d總測(cè)定法(vitd)是基于發(fā)光氧通道免疫測(cè)定(loci)技術(shù)的均質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。其測(cè)量血清和血漿兩者中總25(oh)維生素d濃度(25(oh)d2和25(oh)d3)。locivitd組分包括釋放試劑，兩種合成珠粒試劑和生物素化單克隆抗體。第一珠粒試劑(敏化珠粒(sensibeads))用鏈霉抗生物素蛋白包被且含有光敏染料，且使用類似于美國(guó)專利號(hào)6,153,442、7.022,529、7,229,842和美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)20050118727a中所述的方法的方法制備。所述光敏劑是雙-(三己基)-硅-叔丁基酞菁。第二珠粒試劑(化學(xué)發(fā)光珠粒(chemibeads))用25(oh)維生素d3類似物包被，且含有化學(xué)發(fā)光染料，且通過(guò)類似于美國(guó)專利號(hào)7,179,660中所述的程序的程序制備。所述化學(xué)發(fā)光化合物為2-(4-(n,n,二-十四烷基)-苯胺基-3-苯基二甲基噻吩(thioxene)與銪螯合物。將所述樣品與釋放試劑(苯胺基萘磺酸(ans))一起孵育以便從其結(jié)合蛋白釋放維生素d分子。然后將反應(yīng)混合物與生物素化的抗體孵育以形成25(oh)維生素d/生物素化的抗體復(fù)合物。添加化學(xué)發(fā)光珠粒以除去過(guò)量的游離生物素化抗體，然后添加敏化珠粒以觸發(fā)化學(xué)發(fā)光珠粒-類似物/抗體-生物素/鏈霉抗生物素蛋白-敏化珠粒復(fù)合物的形成。在680nm照射反應(yīng)混合物，從敏化珠粒產(chǎn)生單線態(tài)氧，其擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光珠粒并觸發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在612nm測(cè)量所得信號(hào)，并且其與樣品中的總25(oh)維生素d的濃度成反比。

使用id-lc/ms/ms(同位素-稀釋液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜法)作為參考方法分析各樣品的另一部分的維生素d濃度。

根據(jù)制造商的方案借助來(lái)自siemenshealthcarediagnosticsinc.的總膽固醇濃度測(cè)定(no.df27)分析各樣品的另一部分的膽固醇濃度。在測(cè)定中，膽固醇酯酶(ce)催化膽固醇酯的水解以產(chǎn)生游離膽固醇，其與預(yù)先存在的游離膽固醇一起在由膽固醇氧化酶(co)催化的反應(yīng)中被氧化以形成膽甾-4-烯-3-酮和過(guò)氧化氫。在辣根過(guò)氧化物酶(hpo)存在的情況下，因此形成的過(guò)氧化氫用于氧化n,n-二乙基苯胺-hcl/4-氨基安替比林(dea-hcl/aap)以產(chǎn)生在540nm吸收的發(fā)色團(tuán)。由于氧化的dea-hcl/aap導(dǎo)致的吸光度與總膽固醇濃度成正比，并使用多色(452nm、540nm、700nm)端點(diǎn)技術(shù)(nm為納米)測(cè)量。

從使用參考方法對(duì)各不同樣品獲得的維生素d的濃度減去使用免疫測(cè)定方法對(duì)各不同樣品獲得的維生素d的濃度，以獲得各不同樣品的偏差。將各不同樣品的偏差針對(duì)各不同樣品的膽固醇濃度作圖。結(jié)果描繪于圖1中，其中[vitd]是維生素d的濃度，lcms是使用參考方法測(cè)量的維生素d的濃度，dmexl是使用免疫測(cè)定法測(cè)量的維生素d的濃度，mg是毫克，dl是分升，y是標(biāo)準(zhǔn)變量，x是預(yù)測(cè)變量，且r²是相關(guān)系數(shù)的平方。

從上述結(jié)果開(kāi)發(fā)以下校正公式：

[an]=[man]+(ax[mis]+b)，其中[an]是未知樣品中維生素d的實(shí)際濃度，[man]是未知樣品中維生素d的測(cè)量濃度，[mis]是未知樣品中膽固醇的測(cè)量濃度，a是回歸線的斜率，其在本實(shí)施例中是0.2213，且b是回歸線的截距，其在本實(shí)施例中是-27.966。因此，所述校正公式是

[實(shí)際維生素d]=[測(cè)量的維生素d]+(0.2213x[膽固醇]-27.966)。

校正公式的驗(yàn)證

通過(guò)使用測(cè)量的維生素d濃度和上述校正公式計(jì)算與維生素d的實(shí)際濃度的偏差來(lái)進(jìn)行上述確定的校正公式的驗(yàn)證。將所述偏差針對(duì)不同樣品各自的膽固醇濃度作圖。結(jié)果描繪于圖2中，其中3e-5是3x10^-5。如可見(jiàn)，在應(yīng)用校正公式以測(cè)定樣品中的維生素d的實(shí)際濃度之后，偏差和膽固醇濃度之間的相關(guān)性不再存在。

如參考圖3和4可見(jiàn)，在應(yīng)用校正公式之后，相關(guān)系數(shù)(使用免疫測(cè)定法測(cè)定的維生素d濃度和使用id-lcms/ms方法測(cè)定的維生素d濃度之間的相關(guān)性的數(shù)據(jù)的分散)改善。在圖3和4中，r是相關(guān)系數(shù)，ng是納克，且ml是毫升。

本說(shuō)明書中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被明確且單獨(dú)指明通過(guò)引用并入一樣。

盡管已經(jīng)出于清楚理解的目的通過(guò)實(shí)例說(shuō)明和舉例的方式詳細(xì)描述了前述發(fā)明，但鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，在不脫離所附權(quán)利要求的精神或范圍的情況下，可以對(duì)其進(jìn)行某些變化和改變。此外，出于解釋的目的，上述說(shuō)明使用特定術(shù)語(yǔ)來(lái)提供本發(fā)明的透徹理解。然而，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的是，不需要具體細(xì)節(jié)來(lái)實(shí)施本發(fā)明。因此，呈現(xiàn)本發(fā)明的上述具體實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和描述的目的；它們并非意在窮舉或?qū)⒈景l(fā)明限制為所公開(kāi)的精確形式。鑒于上述教導(dǎo)，許多改變和變化是可能的。選擇并描述實(shí)施方案是為了解釋本發(fā)明的原則和其實(shí)際應(yīng)用，進(jìn)而使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠利用本發(fā)明。