本發(fā)明的方面涉及利用多個生物反應(yīng)器階段將含c1基質(zhì)進(jìn)行微生物發(fā)酵成終產(chǎn)物的方法。在代表性的方法中，將所述含c1基質(zhì)并行地在所述階段之間分配以進(jìn)行氣相處理，而將液體產(chǎn)物連續(xù)地從一個階段通到下一個連續(xù)階段以進(jìn)行液相處理。

背景技術(shù)：

對化石燃料溫室氣體(ghg)排放的環(huán)境關(guān)注已經(jīng)引起對可再生能源的日益重視。因此，乙醇正迅速成為全世界主要的富氫液體運輸燃料。基于在歐洲、日本、和美國以及幾個發(fā)展中國家中對乙醇生產(chǎn)的重視增加，在可預(yù)見的未來，預(yù)期燃料乙醇行業(yè)的全球市場持續(xù)增長。舉例來說，在美國，使用乙醇生產(chǎn)e10，即10％乙醇在汽油中的混合物。在e10共混物中，乙醇組分充當(dāng)補氧劑，從而提高燃燒效率并且減少空氣污染物的產(chǎn)生。在巴西，乙醇作為在汽油中共混的補氧劑以及其本身作為純?nèi)剂蠞M足了約30％的運輸燃料需求。此外，歐盟(europeanunion，eu)已經(jīng)為它的成員國中的每一個規(guī)定了消費諸如生物質(zhì)衍生的乙醇之類的可持續(xù)運輸燃料的目標(biāo)。

絕大多數(shù)的燃料乙醇是經(jīng)由傳統(tǒng)的基于酵母的發(fā)酵工藝生產(chǎn)的，這些發(fā)酵工藝使用作物衍生的碳水化合物，如從甘蔗提取的蔗糖或從糧食作物提取的淀粉，作為主要的碳源。然而，這些碳水化合物原料的成本會受到它們的競爭用途(即作為人類和動物這兩者的食物來源)在市場中的價值的影響。此外，用于生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)生淀粉或蔗糖的作物的種植并非在所有地區(qū)均是經(jīng)濟上可持續(xù)的，這是因為這會隨著當(dāng)?shù)赝恋貎r值和氣候這兩者而變化。出于這些原因，特別關(guān)注的是，開發(fā)使更低成本和/或更豐富的碳資源轉(zhuǎn)化成燃料乙醇的技術(shù)。在這方面，一氧化碳(co)是諸如煤、石油以及石油衍生產(chǎn)品之類的有機材料不完全燃燒的主要富含能量的副產(chǎn)物。富含co的廢氣由多種工業(yè)過程產(chǎn)生。舉例來說，據(jù)報道，澳大利亞的鋼鐵工業(yè)每年產(chǎn)生并且向大氣中釋放超過500,000公噸的co。

最近，用于在工業(yè)規(guī)模上由co生產(chǎn)乙醇的基于微生物(細(xì)菌)的工藝替代方案已經(jīng)成為商業(yè)利益和投資的主題。微生物培養(yǎng)物能夠在co是唯一碳源的情況下生長的能力最初是在1903年被發(fā)現(xiàn)的。這一特征隨后被確定為在于生物體對自養(yǎng)生長的乙酰輔酶a(乙酰coa)生化途徑(也被稱為伍茲-揚達(dá)爾途徑(woods-ljungdahlpathway)和一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶a合酶(codh/acs)途徑)的使用。包括一氧化碳營養(yǎng)型生物體、光合生物體、產(chǎn)甲烷型生物體以及產(chǎn)乙酸型生物體在內(nèi)的很多厭氧生物體從此被證實代謝co。已知厭氧細(xì)菌，如來自梭菌屬(clostridium)的那些厭氧細(xì)菌經(jīng)由乙酰輔酶a生化途徑由co、co2以及h2產(chǎn)生乙醇。舉例來說，由氣體產(chǎn)生乙醇的揚氏梭菌(clostridiumljungdahlii)的各種菌株描述于wo00/68407；ep1117309a1；us5,173,429；us5,593,886；us6,368,819；wo98/00558；以及wo02/08438中。細(xì)菌自產(chǎn)乙醇梭菌(clostridiumautoethanogenum)菌種也已知可由氣體產(chǎn)生乙醇(abrini等,archivesofmicrobiology161:345-351(1994))。

由于生物體的每一種酶以基本上完全的選擇性促進(jìn)它的指定生物轉(zhuǎn)化，因此與常規(guī)的催化途徑相比，微生物合成途徑可以用更低的能量成本實現(xiàn)更高的收率。舉例來說，可以減少將由非選擇性副反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物與所期望的產(chǎn)物分離的能量需求。此外，減少對由于反應(yīng)介質(zhì)中的雜質(zhì)所造成的催化劑中毒的擔(dān)憂。然而，盡管有這些明顯的優(yōu)勢，但是本領(lǐng)域必須解決目前與從co進(jìn)行的乙醇的微生物合成相關(guān)的某些挑戰(zhàn)，特別是在確保生產(chǎn)速率可與其它技術(shù)競爭的方面。當(dāng)使用co作為它們的碳源時，上文所述的厭氧細(xì)菌通過發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，但是它們還產(chǎn)生至少一種代謝產(chǎn)物，例如co2、甲烷、正丁醇、和/或乙酸。這些代謝產(chǎn)物中的任一種的形成有可能顯著影響給定工藝的生產(chǎn)率和整體經(jīng)濟可行性，這是因為可用碳損失到一種或多種代謝產(chǎn)物中并且所期望的終產(chǎn)物的生產(chǎn)效率受損。此外，除非代謝產(chǎn)物(例如乙酸)本身在微生物發(fā)酵過程的時間和地點具有價值，否則它可能引起廢物處理問題。用于解決在制備乙醇的含有co的氣體的厭氧發(fā)酵中除所期望的終產(chǎn)物以外的產(chǎn)物的形成的各種提案論述于wo2007/117157、wo2008/115080以及wo2009/022925中。

乙醇生產(chǎn)速率是關(guān)于給定發(fā)酵工藝是否在經(jīng)濟上具有吸引力的關(guān)鍵決定因素，它高度取決于對細(xì)菌生長的適當(dāng)條件進(jìn)行管理。舉例來說，從wo2010/093262已知的是，含co基質(zhì)必須以引起最佳的微生物生長和/或所期望的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的速率向微生物培養(yǎng)物提供。如果提供不足的基質(zhì)，那么微生物生長減慢并且發(fā)酵產(chǎn)物收率以乙醇作為代價朝向乙酸偏移。如果提供過量的基質(zhì)，那么可能導(dǎo)致不佳的微生物生長和/或細(xì)胞死亡。關(guān)于這些工藝中操作參數(shù)之間的關(guān)系的更多信息見于wo2011/002318中。

用于從co，并且特別是含有co的廢物流，如鋼鐵生產(chǎn)中排放的氣態(tài)排放物生產(chǎn)乙醇的生物學(xué)方法的技術(shù)正不斷尋求改進(jìn)過程經(jīng)濟學(xué)并且因此提高行業(yè)競爭力的解決方案。根據(jù)常規(guī)做法，用于實現(xiàn)所期望的轉(zhuǎn)化的微生物的分離和再循環(huán)被認(rèn)為對在連續(xù)過程中實現(xiàn)可接受的生產(chǎn)率來說是必要的。已知在生物反應(yīng)器內(nèi)部或外部的合適的膜分離系統(tǒng)有效用于這一目的。然而，膜和它們相關(guān)的外殼、閥門、儀器、以及控制顯著增加了總體資金和操作成本。更換膜和“就地清洗”(cip)選擇方案(無論是手動還是自動)一般需要大量的操作時間、化學(xué)品、以及加熱(在手動操作的情況下)或非常高的資金成本(在自動操作的情況下)。舉例來說，一些生物反應(yīng)器系統(tǒng)需要昂貴的酶溶液來清洗細(xì)胞再循環(huán)膜，這是因為在實踐中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用苛性堿(naoh)溶液進(jìn)行簡單的清洗是無效的。

總體而言，生物co轉(zhuǎn)化工藝中的重要考慮因素涉及發(fā)現(xiàn)提高操作靈活性、提高乙醇生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量和/或更高效利用co的改進(jìn)方案。在這些領(lǐng)域中的任一個中實現(xiàn)即使是不太大的進(jìn)步而基本上不影響資金和操作費用就能夠?qū)I(yè)規(guī)模的操作具有顯著的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的方面涉及用于產(chǎn)生諸如乙醇的有用的終產(chǎn)物的生物學(xué)方法和相關(guān)系統(tǒng)的改進(jìn)，所述終產(chǎn)物是經(jīng)由利用來自諸如工業(yè)廢氣的含c1基質(zhì)的c1碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)的c1固定微生物的代謝途徑產(chǎn)生的。代表性的方法和系統(tǒng)涉及使用互連生物反應(yīng)器的多個階段的替代類型的操作，并且特別是如下的操作，其中有可能規(guī)避分離一氧化碳營養(yǎng)型微生物以再循環(huán)到在整個過程中使用的階段中的至少一個(例如所述階段中的至少一個生物反應(yīng)器)，一般大多數(shù)階段(例如除第一階段和/或最后一個階段或最終階段之外的所有階段)，并且常常是所有階段的費用和復(fù)雜性。驚人的是，使用這樣的系統(tǒng)，并且特別是其中將含c1基質(zhì)并行地供給到多個生物反應(yīng)器中，而連續(xù)地供給液體產(chǎn)物的系統(tǒng)已經(jīng)被證實會產(chǎn)生高的總體乙醇生產(chǎn)率，而諸如乙酸的不期望的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率相應(yīng)較低。還實現(xiàn)了其它優(yōu)勢，包括高效的總體c1碳源利用以及提高的工藝靈活性和控制。

本發(fā)明的實施方案涉及用于將c1碳源轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物的多階段方法。代表性的方法包括將氣態(tài)含c1基質(zhì)并行地供給到所述方法的第一生物反應(yīng)器階段和至少第二生物反應(yīng)器階段中，這是例如通過將所述含c1基質(zhì)在所述生物反應(yīng)器階段之間分配來實現(xiàn)的，以使得在每一個階段接收的氣體組成是相同的或基本上相同的并且代表所述被輸入到所述方法中的含c1基質(zhì)的氣體組成。這樣的方法還包括將第一階段液體產(chǎn)物的至少一部分連續(xù)地從所述第一生物反應(yīng)器階段供給到所述第二生物反應(yīng)器階段中。以這種方式，所述在每一個階段接收的液體產(chǎn)物或至少其不含生物質(zhì)的液體級分(例如不含c1固定微生物的液體發(fā)酵液的級分)的組成可以代表從先前的上游階段所接收的輸出物。因此，不同于氣體組成，所述在每一個階段所接收的液體產(chǎn)物的組成一般不相同并且實際上可以在所期望的終產(chǎn)物和其它代謝產(chǎn)物的濃度方面有顯著差異。舉例來說，所期望的終產(chǎn)物的濃度可以沿從上游階段到連續(xù)的下游階段的方向在至少一些階段，并且優(yōu)選地所有階段上逐漸增加。可替代地或組合地，其它代謝產(chǎn)物可以在這些階段中的一些或全部上逐漸減少。本發(fā)明的實施方案涉及用于將來自含c1基質(zhì)的c1碳源轉(zhuǎn)化成所期望的終產(chǎn)物的多階段方法，其中所述多階段方法提高了所述系統(tǒng)對所述所期望的終產(chǎn)物的特異性。

此外，根據(jù)如上文所述的代表性方法，在所述生物反應(yīng)器階段中的至少一個中有利地避免了c1固定微生物的分離和再循環(huán)。這與常規(guī)的連續(xù)“恒化器”生物學(xué)方法直接形成對比，所述生物學(xué)方法被理解為需要細(xì)胞再循環(huán)以獲得可接受的生產(chǎn)率水平。因此，被供給到至少一個階段的液體產(chǎn)物(例如被供給到第二階段的第一階段液體產(chǎn)物)可以包含在先前(例如第一)上游生物反應(yīng)器階段中使用的并且例如在這一上游階段中沒有被分離或過濾的c1固定微生物。該液體產(chǎn)物一般還包含從所述先前上游階段接收的培養(yǎng)基、所期望的終產(chǎn)物、以及其它代謝產(chǎn)物。因此，根據(jù)優(yōu)選的實施方案，將至少一個生物反應(yīng)器階段的液體產(chǎn)物(例如第一階段液體產(chǎn)物)供給到后續(xù)階段而沒有涉及以下各項的附加費用和復(fù)雜性：(1)分離c1固定微生物(例如使用膜分離)，繼而(2)將所述分離的微生物再循環(huán)到它被抽出的同一個階段。在優(yōu)選的實施方案中，執(zhí)行方法而不進(jìn)行任何將c1固定微生物從所述生物反應(yīng)器階段中的任一個中分離和/或再循環(huán)到所述生物反應(yīng)器階段中的任一個，盡管通常以這種方式分離從最終階段中抽出的液體產(chǎn)物來回收不含細(xì)胞的液體中的一種或多種最終產(chǎn)物。因此，根據(jù)一些實施方案，可以將c1固定微生物和/或細(xì)胞培養(yǎng)基從最終階段液體產(chǎn)物中分離并且返回到所述方法(例如所述生物反應(yīng)器階段中的一個或多個)中。

本發(fā)明的其它實施方案涉及多階段系統(tǒng)，所述多階段系統(tǒng)包括多個生物反應(yīng)器。所述生物反應(yīng)器包括第一端處的氣體入口和與所述第一端相對的第二端處的氣體出口，以使得所述氣體入口和氣體出口允許并行地將氣態(tài)含c1基質(zhì)供給到所述多個生物反應(yīng)器中以及去除包括未轉(zhuǎn)化的c1碳源的氣態(tài)產(chǎn)物。不包括第一生物反應(yīng)器和最終生物反應(yīng)器(即，不是最上游的生物反應(yīng)器，這是因為它不被供給來自另一個生物反應(yīng)器的液體產(chǎn)物；或最下游的生物反應(yīng)器，這是因為從這個生物反應(yīng)器抽出的液體產(chǎn)物不被供給到另一個生物反應(yīng)器)的生物反應(yīng)器包括單獨的液體入口和液體出口，以用于連續(xù)地從相鄰的上游生物反應(yīng)器接收包括c1固定微生物(生物質(zhì))的液體產(chǎn)物以及將包括c1固定微生物(細(xì)胞或生物質(zhì))的液體產(chǎn)物輸送到相鄰的下游生物反應(yīng)器。

一般來說，液體入口和液體出口這兩者都靠近第一端(即接收氣態(tài)含c1基質(zhì)的末端)，以使得液體產(chǎn)物可以被供給到生物反應(yīng)器的底部附近并且從生物反應(yīng)器的底部附近抽出，例如反應(yīng)器長度的底部25％內(nèi)、或底部10％內(nèi)。用于從最終生物反應(yīng)器接收最終液體產(chǎn)物的液體產(chǎn)物出口同樣靠近最終生物反應(yīng)器的第一端。在限定各種特征相對于“反應(yīng)器長度”的位置時，這一長度指的是容納反應(yīng)器內(nèi)容物(反應(yīng)物和反應(yīng)產(chǎn)物的混合物)的區(qū)段的長度，該區(qū)段通常被認(rèn)為是“反應(yīng)器容積”或“反應(yīng)器工作容積”并且這一長度不包括可以延伸到反應(yīng)器容積上方或下方的工藝管線(例如進(jìn)料入口管線或產(chǎn)物出口管線)或容納反應(yīng)器，但是不容納任何反應(yīng)器內(nèi)容物的塔或其它容器的區(qū)段。舉例來說，在圓柱形反應(yīng)器的情況下，反應(yīng)器長度指的是圓柱形的軸線的長度。反應(yīng)器長度的“底部10％”指的是高度的范圍，所述范圍從反應(yīng)器的底部開始并且向上延伸反應(yīng)器長度的10％。反應(yīng)器長度的“頂部10％”指的是高度的范圍，所述范圍從反應(yīng)器的頂部開始并且向下延伸反應(yīng)器長度的10％。同樣，反應(yīng)器長度的“底部1％-10％”指的是高度的范圍，所述范圍從比反應(yīng)器的底部高了反應(yīng)器長度的1％的高度開始并且向上延伸到比反應(yīng)器的底部高了反應(yīng)器長度的10％的高度。反應(yīng)器長度的“頂部25％-45％”指的是高度的范圍，所述范圍從比反應(yīng)器的頂部低了反應(yīng)器長度的25％的高度開始并且向下延伸到比反應(yīng)器的頂部低了反應(yīng)器長度的45％的高度。

本發(fā)明的另外的實施方案涉及用于將c1轉(zhuǎn)化成所期望的終產(chǎn)物的多階段生物學(xué)方法。所述方法包括(i)將氣態(tài)含c1基質(zhì)并行地在所述多階段方法的多個生物反應(yīng)器階段之間分配；以及(ii)將包含c1固定微生物的液體產(chǎn)物連續(xù)地從第一生物反應(yīng)器階段依次供給到下游生物反應(yīng)器階段。在最終階段中，從最終生物反應(yīng)器階段抽出最終階段液體產(chǎn)物。在某些實施方案中，從不含生物質(zhì)的液體級分(例如不含c1固定微生物/生物質(zhì)的液體級分)抽出最終階段液體產(chǎn)物。

在具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于將一氧化碳(co)轉(zhuǎn)化成乙醇的多階段生物學(xué)方法。所述方法包括(i)將含co基質(zhì)并行地在所述多階段方法的多個階段之間分配；(ii)將包含一氧化碳營養(yǎng)型微生物的液體產(chǎn)物連續(xù)地從第一生物反應(yīng)器階段依次供給到下游生物反應(yīng)器階段。從最終生物反應(yīng)器階段抽出的最終階段液體產(chǎn)物可以包含至少約50克/升(g/l)的乙醇并且具有至少約50:1的乙醇:乙酸重量比。在某些實施方案中，從不含生物質(zhì)的液體級分中抽出最終階段液體產(chǎn)物。具體方法可以包括至少四個生物反應(yīng)器階段。與這種并行氣體/連續(xù)液體操作方式相關(guān)的這些代表性方法可以有利地實現(xiàn)高水平的生產(chǎn)率而有最低限度的副產(chǎn)物形成。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于將一氧化碳轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇的多階段生物學(xué)方法，該方法具有降低的乙醇生產(chǎn)率。在某些實施方案中，所述一氧化碳營養(yǎng)型微生物選自由以下各項組成的組：自產(chǎn)乙醇梭菌、拉氏梭菌(clostridiumragsdalei)以及揚氏梭菌。

在替代性實施方案中，本發(fā)明涉及一種用于將一氧化碳(co)轉(zhuǎn)化成生長依賴性終產(chǎn)物(例如異丙醇)的多階段生物學(xué)方法。所述方法包括(i)將含co基質(zhì)并行地在所述多階段方法的多個階段之間分配；(ii)將包含一氧化碳營養(yǎng)型微生物的液體產(chǎn)物連續(xù)地從第一生物反應(yīng)器階段依次供給到下游生物反應(yīng)器階段。從最終生物反應(yīng)器階段抽出的最終階段液體產(chǎn)物或至少其不含生物質(zhì)的液體級分可以包含至少約10g/l的異丙醇。在某些實施方案中，異丙醇生產(chǎn)方法中所用的一氧化碳營養(yǎng)型微生物是重組自產(chǎn)乙醇梭菌菌株，所述菌株具有異丙醇生物合成途徑中的至少一種異源酶。與傳統(tǒng)的雙反應(yīng)器發(fā)酵系統(tǒng)相比，使用本發(fā)明的多階段方法提供了用于提高生長依賴性終產(chǎn)物的生產(chǎn)率的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，生長依賴性終產(chǎn)物選自由以下各項組成的組：異丙醇、丁醇、丙酮、2-羥基丁酸(2-hiba)、以及異丁烯。

總體而言，如下文所更詳細(xì)論述，如本文所述的多階段生物學(xué)方法可以提高生物轉(zhuǎn)化操作的穩(wěn)定性并且提供更大的靈活性以針對具體目標(biāo)調(diào)控在每一個階段所實現(xiàn)的性能(例如終產(chǎn)物和其它代謝產(chǎn)物的滴度)。即使相對于常規(guī)方法，在反應(yīng)器容積基礎(chǔ)上生產(chǎn)率較低，相對更簡單的構(gòu)造和控制系統(tǒng)也可以從經(jīng)濟角度，經(jīng)由在商業(yè)規(guī)模上實現(xiàn)的資金成本和/或操作成本降低來有效地彌補這一點。此外，在“每個反應(yīng)器”基礎(chǔ)上生產(chǎn)率的降低允許在生物反應(yīng)器尺寸方面的靈活性提高，以使得可以使用相對更短和更寬的容器，所述容器具有與可用儲罐的尺寸更一致的尺寸。舉例來說，一個或多個階段(例如第一生物反應(yīng)器階段和第二生物反應(yīng)器階段中的至少一個、至少四個生物反應(yīng)器階段、或所有生物反應(yīng)器階段)的生物反應(yīng)器可以具有小于約15:1(例如約2:1至約15:1)，如小于約10:1(例如約5:1至約10:1)的長度與寬度(例如直徑)的比率。允許生產(chǎn)率降低進(jìn)而容許在如本文所述的方法/系統(tǒng)中使用更低的壓力。舉例來說，一個或多個階段(例如第一生物反應(yīng)器階段和第二生物反應(yīng)器階段中的至少一個、至少四個生物反應(yīng)器階段、或所有生物反應(yīng)器階段)的生物反應(yīng)器可以在小于約500千帕(kpa)表壓(即高于大氣壓)，如小于約200kpa表壓或甚至小于約100kpa表壓的壓力操作。對于給定的質(zhì)量傳遞系數(shù)，如本文所述的多階段方法和系統(tǒng)還可以相對于這些常規(guī)方法有利地實現(xiàn)更大的氣體利用率。

在多階段方法中，本文所述的生物反應(yīng)器階段或其某一部分可以是單個容器內(nèi)分開的區(qū)段。舉例來說，這樣的容器(它可以是具有50,000升-3,000,000升的容積的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)罐)可以包括內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所述內(nèi)部結(jié)構(gòu)將單個生物反應(yīng)器階段分開并且引導(dǎo)如本文所述的蒸氣流和液體流。舉例來說，所述內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以被配置成使氣體和液體分別并行地和連續(xù)地流過所述階段。使用容器內(nèi)的生物反應(yīng)器階段可以促進(jìn)本文所述的某些操作實施方案，例如使用離開生物反應(yīng)器階段的包括未轉(zhuǎn)化的c1碳源的共用氣態(tài)產(chǎn)物流進(jìn)行的操作。根據(jù)一個實施方案，容器內(nèi)的生物反應(yīng)器階段可以按堆疊關(guān)系定向，其中第一生物反應(yīng)器階段在高程上是最高的并且最終生物反應(yīng)器階段在高程上是最低的，從而利用重力來幫助液體產(chǎn)物轉(zhuǎn)移通過所述階段。在單個容器內(nèi)可以包括生物反應(yīng)器的全部連接的生物反應(yīng)器階段在數(shù)量上可以在一定范圍內(nèi)，并且在示例性實施方案中，容器可以包括約4個至約12個生物反應(yīng)器階段。內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以包括本文參考圖1和圖2所述的相關(guān)管道和/或其它設(shè)備(例如氣體入口和液體入口以及它們的連接部、蒸氣和液體分配器、提升管、下降管、外部液體再循環(huán)回路、液體培養(yǎng)基和其它添加劑的入口等)。這樣的內(nèi)部結(jié)構(gòu)因此可以提供所述階段之間的總體流體連通以實現(xiàn)所期望的流動配置，包括所引起的內(nèi)部循環(huán)和/或使用再循環(huán)回路的外部循環(huán)，如下文更詳細(xì)描述的那樣，從而形成實現(xiàn)高度質(zhì)量傳遞和以所設(shè)計的氣體流速混合所需的流體動力學(xué)條件。這樣的容器可以配有在整個容器外部的另外的液體循環(huán)回路，例如以用于不一定相鄰(即彼此緊鄰的上游或下游)的生物反應(yīng)器階段之間的液體循環(huán)。在一些實施方案中，給定生物轉(zhuǎn)化方法所需的生物反應(yīng)器階段的總數(shù)可以超過容器內(nèi)階段的數(shù)目，以使得所述方法可以利用兩個或更多個容器，其中一個或這兩者容納多個(例如兩個或更多個)生物反應(yīng)器階段。

使用如本文所述的多階段生物學(xué)方法提供了對發(fā)酵參數(shù)和過程控制的更大控制。所述多階段方法的階段中的每一個可以在不同的工藝條件下操作以提供所期望的最終結(jié)果。舉例來說，某些階段可以被操作以促進(jìn)生長，并且其它階段可以針對生產(chǎn)率來優(yōu)化。使用多階段生物學(xué)方法可以產(chǎn)生更好的產(chǎn)物滴度、對所期望的終產(chǎn)物的更大的特異性、提高的氣體吸收、以及對具有各種組成的含c1基質(zhì)的更大的靈活性。

根據(jù)以下具體實施方式，與本發(fā)明有關(guān)的這些和其它實施方案、方面、以及優(yōu)勢是顯而易見的。

附圖說明

對本發(fā)明的示例性實施方案和其優(yōu)勢的更完全的了解可以通過在考慮到附圖的情況下參考以下說明來獲得，其中相似的特征由相似的附圖標(biāo)記來標(biāo)識(例如圖1的生物反應(yīng)器100a和圖2的生物反應(yīng)器100)。

圖1描繪了利用至少兩個上游生物反應(yīng)器和兩個下游生物反應(yīng)器的代表性方法，其中為了簡單起見，省略了相似的居間生物反應(yīng)器。

圖2描繪了如圖1中所示的代表性生物反應(yīng)器的特寫視圖，并且提供了與內(nèi)部結(jié)構(gòu)和液體循環(huán)有關(guān)的另外的細(xì)節(jié)。

圖3是示出了在40+天的操作期間，利用六個生物反應(yīng)器階段的本文所述的生物學(xué)方法的最終液體產(chǎn)物的所取樣品中，乙醇和一氧化碳營養(yǎng)型微生物以及副產(chǎn)物代謝產(chǎn)物乙酸和2,3-丁二醇的濃度的圖表。

圖4是在40+天的操作期的第23天，在來自六個生物反應(yīng)器階段中的每一個的液體產(chǎn)物的所取樣品中，乙醇以及副產(chǎn)物代謝產(chǎn)物乙酸和2,3-丁二醇的測量濃度的圖表，其中最終液體產(chǎn)物濃度描繪于圖3中。

圖5a是示出了異丙醇發(fā)酵的代謝產(chǎn)物譜的圖表。

圖5b是示出了異丙醇生產(chǎn)速率的圖表。

圖1-5應(yīng)當(dāng)被理解成呈現(xiàn)了本公開和/或所涉及的原理的圖示。為了便于說明和理解，簡化的工藝流程方案和設(shè)備描繪于圖1和圖2中，并且這些圖不一定按比例繪制。對于理解本公開來說并非必要的包括閥門、儀器、以及其它設(shè)備和系統(tǒng)在內(nèi)的細(xì)節(jié)沒有被示出。如對于了解本公開的本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的那樣，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案的用于含c1基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化的方法將具有如下的配置和部件，所述配置和部件是部分地由它們的具體用途來確定的。

具體實施方式

本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生所期望的終產(chǎn)物的方法，所述方法是通過將氣態(tài)含c1基質(zhì)中的c1碳源并行地供給到多個生物反應(yīng)器階段中來實現(xiàn)的，所述生物反應(yīng)器階段進(jìn)而被用于連續(xù)地處理這些階段的液體產(chǎn)物。在操作中，所述生物反應(yīng)器中的每一個包括含有c1固定微生物的液體培養(yǎng)基。除了所期望的終產(chǎn)物之外，如本文所述的方法另外還產(chǎn)生不期望的或不太期望的代謝產(chǎn)物。代表性的c1固定微生物是來自穆爾氏菌屬(moorella)、梭菌屬、瘤胃球菌屬(ruminococcus)、醋酸桿菌屬(acetobacterium)、真桿菌屬(eubacterium)、丁酸桿菌屬(butyribacterium)、產(chǎn)醋桿菌屬(oxobacter)、甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)、甲烷八疊球菌屬以及脫硫腸狀菌屬(desulfotomaculum)的那些微生物。梭菌屬微生物的具體實例包括揚氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌、拉氏梭菌、以及拜氏梭菌(c.beijerenckei)。

代表性的含c1基質(zhì)廣泛地包括任何含有c1碳源的氣體，其中選自由co、co2以及ch4組成的組的至少一種c1碳源可以被提供給c1固定微生物的一種或多種菌株以進(jìn)行生長和/或發(fā)酵。這樣的含c1基質(zhì)優(yōu)選地不包括達(dá)到這樣的程度的污染物，在所述程度下，這些污染物可能對c1固定微生物的生長有不利影響(例如一種或多種污染物不以如下的濃度或量存在，與在相同的條件下，但是在沒有所述一種或多種污染物的情況下的生長速率相比，所述濃度或量會使得在給定的一組條件下生長速率降低超過10％)。

代表性的如本文所述的含c1基質(zhì)廣泛地包括任何c1碳源。c1碳源指的是用作本發(fā)明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。舉例來說，c1碳源可以包含co、co2、ch4中的一種或多種。優(yōu)選地，c1碳源包含co和co2中的一種或這兩者。所述基質(zhì)還可以包含其它非碳組分，如h2、n2或電子。

所述含c1基質(zhì)可以含有顯著比例的co，優(yōu)選地至少約5體積％至約99.5體積％的co。這樣的基質(zhì)常常是作為工業(yè)過程，如鋼鐵制造過程或非鐵產(chǎn)品制造過程的廢產(chǎn)物產(chǎn)生的。其中產(chǎn)生氣態(tài)含co基質(zhì)的其它過程包括石油煉制過程、生物燃料生產(chǎn)過程(例如熱解過程和脂肪酸/甘油三酯加氫轉(zhuǎn)化過程)、煤和生物質(zhì)的氣化過程、電力生產(chǎn)過程、炭黑生產(chǎn)過程、氨生產(chǎn)過程、甲醇生產(chǎn)過程以及焦炭制造過程。許多化學(xué)工業(yè)排放物以及由多種基質(zhì)產(chǎn)生的合成氣(含有co和h2這兩者)同樣可以用作潛在的含co基質(zhì)。具體實例包括來自磷酸鹽和鉻酸鹽的生產(chǎn)的排放物。有利的是，可以如本文所述使用來自這些過程的廢物(例如廢氣)來有益地生產(chǎn)諸如乙醇的有用終產(chǎn)物。

所述基質(zhì)和/或c1碳源可以是或可以衍生自作為工業(yè)過程的副產(chǎn)物或從某種其它來源，如從汽車尾氣或生物質(zhì)氣化獲得的廢氣或尾氣。在某些實施方案中，所述工業(yè)過程選自由以下各項組成的組：鐵金屬產(chǎn)品制造(如鋼廠制造)、非鐵產(chǎn)品制造、石油煉制過程、煤的氣化、電力生產(chǎn)、炭黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)、以及焦炭制造。在這些實施方案中，所述基質(zhì)和/或c1碳源可以在將它排放到大氣中之前，使用任何簡便的方法從工業(yè)過程捕集。

所述基質(zhì)和/或c1碳源可以是或可以衍生自合成氣，如通過煤或煉油廠殘渣的氣化、生物質(zhì)或木質(zhì)纖維素材料的氣化、或天然氣的重整所獲得的合成氣。在另一個實施方案中，所述合成氣可以由城市固體廢物或工業(yè)固體廢物的氣化而獲得。

關(guān)于基質(zhì)和/或c1碳源，術(shù)語“衍生自”指的是以某種方式改性或共混的基質(zhì)和/或c1碳源。舉例來說，所述基質(zhì)和/或c1碳源可以經(jīng)過處理以添加或去除某些組分或可以與其它基質(zhì)和/或c1碳源的物流共混。

所述基質(zhì)的組成可能對反應(yīng)的效率和/或成本具有顯著的影響。舉例來說，氧氣(o2)的存在可能會降低厭氧發(fā)酵過程的效率。根據(jù)所述基質(zhì)的組成，可能期望處理、洗滌、或過濾基質(zhì)以去除任何不期望的雜質(zhì)，如毒素、不期望的組分、或塵粒、和/或提高所期望的組分的濃度。

所述基質(zhì)一般包含至少一定量的co，如約1摩爾％、2摩爾％、5摩爾％、10摩爾％、20摩爾％、30摩爾％、40摩爾％、50摩爾％、60摩爾％、70摩爾％、80摩爾％、90摩爾％、或100摩爾％的co。所述基質(zhì)可以包含一定范圍的co，如約20摩爾％-80摩爾％、30摩爾％-70摩爾％、或40摩爾％-60摩爾％的co。優(yōu)選地，所述基質(zhì)包含約40摩爾％-70摩爾％的co(例如鋼廠氣或高爐氣)、約20摩爾％-30摩爾％的co(例如堿性氧氣轉(zhuǎn)爐氣)、或約15摩爾％-45摩爾％的co(例如合成氣)。在一些實施方案中，所述基質(zhì)可以包含相對低量的co，如約1摩爾％-10摩爾％或1摩爾％-20摩爾％的co。本發(fā)明的微生物通常將基質(zhì)中co的至少一部分轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述基質(zhì)不含或基本上不含co。

所述基質(zhì)可以包含一定量的h2。舉例來說，所述基質(zhì)可以包含約1摩爾％、2摩爾％、5摩爾％、10摩爾％、15摩爾％、20摩爾％、或30摩爾％的h2。在一些實施方案中，所述基質(zhì)可以包含相對高量的h2，如約60摩爾％、70摩爾％、80摩爾％、或90摩爾％的h2。在另外的實施方案中，所述基質(zhì)不含或基本上不含h2。

所述基質(zhì)可以包含一定量的co2。舉例來說，所述基質(zhì)可以包含約1摩爾％-80摩爾％或1摩爾％-30摩爾％的co2。在一些實施方案中，所述基質(zhì)可以包含少于約20摩爾％、15摩爾％、10摩爾％、或5摩爾％的co2。在另一個實施方案中，所述基質(zhì)不含或基本上不含co2。

盡管所述基質(zhì)通常是氣態(tài)的，但是所述基質(zhì)也可以替代形式提供。舉例來說，可以使用微泡分散發(fā)生器將基質(zhì)溶解在用含co氣體飽和的液體中。還舉例來說，可以使基質(zhì)吸附到固體載體上。

“微生物”是微觀生物體，特別是細(xì)菌、古菌、病毒、或真菌。本發(fā)明的微生物通常是細(xì)菌。如本文所用的表述“微生物”應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為涵蓋“細(xì)菌”。

本發(fā)明的微生物可以基于功能特征被進(jìn)一步分類。舉例來說，本發(fā)明的微生物可以是或可以衍生自c1固定微生物、厭氧菌、產(chǎn)乙酸菌、產(chǎn)乙醇菌、一氧化碳營養(yǎng)菌、和/或甲烷營養(yǎng)菌。表1提供了微生物的代表性列表并且標(biāo)識了它們的功能特征。

¹伍氏醋酸桿菌可以由果糖產(chǎn)生乙醇，但是不能由氣體產(chǎn)生乙醇。

²已經(jīng)報道伍氏醋酸桿菌可以依靠co生長，但是方法是有問題的。

³尚未研究馬氏梭菌是否可以依靠co生長。

⁴熱醋穆爾氏菌的一種菌株穆爾氏菌屬菌種huc22-1已經(jīng)被報道由氣體產(chǎn)生乙醇。

⁵尚未研究卵形鼠孢菌是否可以依靠co生長。

⁶尚未研究銀醋鼠孢菌是否可以依靠co生長。

⁷尚未研究球形鼠孢菌是否可以依靠co生長。

“c1”指的是一碳分子，例如co、co2、ch4、或ch3oh?！癱1含氧化合物”指的是還包含至少一個氧原子的一碳分子，例如co、co2或ch3oh?！癱1碳源”指的是用作本發(fā)明的微生物的部分或唯一碳源的一碳分子。舉例來說，c1碳源可以包含co、co2、ch4中的一種或多種。優(yōu)選地，c1碳源包含co和co2之一或這兩者。“c1固定微生物”是具有由c1碳源產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物的能力的微生物。通常，本發(fā)明的微生物是c1固定細(xì)菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的c1固定微生物。

“厭氧菌”是不需要氧氣來生長的微生物。如果存在高于一定閾值的氧氣，那么厭氧菌可能起不利反應(yīng)或甚至死亡。通常，本發(fā)明的微生物是厭氧菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的厭氧菌。

“產(chǎn)乙酸菌”是產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生乙酸鹽(或乙酸)作為厭氧呼吸產(chǎn)物的微生物。通常，產(chǎn)乙酸菌是專性厭氧細(xì)菌，它們使用伍德-揚達(dá)爾途徑作為它們用于能量保存以及合成乙酰輔酶a和乙酰輔酶a衍生產(chǎn)物，如乙酸鹽的主要機制(ragsdale,biochimbiophysacta,1784:1873-1898,2008)。產(chǎn)乙酸菌使用乙酰輔酶a途徑作為(1)從co2還原性合成乙酰輔酶a的機制；(2)末端電子接受、能量保存過程；(3)在細(xì)胞碳的合成中固定(同化)co2的機制(drake,《產(chǎn)乙酸原核生物(acetogenicprokaryotes)》,《原核生物(theprokaryotes)》,第3版,第354頁,紐約州紐約(newyork,ny),2006)。所有天然存在的產(chǎn)乙酸菌均是c1固定的、厭氧的、自養(yǎng)的、以及非甲烷營養(yǎng)的。通常，本發(fā)明的微生物是產(chǎn)乙酸菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的產(chǎn)乙酸菌。

“產(chǎn)乙醇菌”是產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生乙醇的微生物。通常，本發(fā)明的微生物是產(chǎn)乙醇菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的產(chǎn)乙醇菌。

“自養(yǎng)菌”是能夠在不存在有機碳的情況下生長的微生物。相反，自養(yǎng)菌使用無機碳源，如co和/或co2。通常，本發(fā)明的微生物是自養(yǎng)菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的自養(yǎng)菌。

“一氧化碳營養(yǎng)菌”是能夠利用co作為唯一碳源的微生物。通常，本發(fā)明的微生物是一氧化碳營養(yǎng)菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自表1中所標(biāo)識的一氧化碳營養(yǎng)菌。

“甲烷營養(yǎng)菌”是能夠利用甲烷作為碳和能量的唯一來源的微生物。在某些實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自甲烷營養(yǎng)菌。

更廣泛來說，本發(fā)明的微生物可以衍生自表1中所標(biāo)識的任何屬或菌種。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物衍生自包括菌種自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、以及拉氏梭菌的梭菌屬的集群。這些菌種是由abrini,archmicrobiol,161:345-351,1994(自產(chǎn)乙醇梭菌)；tanner,intjsystembacteriol,43:232-236,1993(揚氏梭菌)；以及huhnke,wo2008/028055(拉氏梭菌)首先報道和表征的。

這三種菌種具有許多相似性。具體來說，這些菌種均是梭菌屬的c1固定的、厭氧的、產(chǎn)乙酸型、產(chǎn)乙醇型、以及一氧化碳營養(yǎng)型成員。這些菌種具有相似的基因型和表型以及能量保存和發(fā)酵代謝的模式。此外，這些菌種聚集在具有大于99％同一的16srrnadna的梭菌rrna同源組i中；具有約22摩爾％-30摩爾％的dnag+c含量；是革蘭氏陽性的；具有相似的形態(tài)和尺寸(0.5-0.7×3-5μm的對數(shù)生長細(xì)胞)；是嗜溫的(在30℃-37℃最佳生長)；具有約4-7.5的相似的ph值范圍(最佳ph值是約5.5-6)；缺乏細(xì)胞色素；并且經(jīng)由rnf復(fù)合物保存能量。此外，已經(jīng)證實在這些菌種中羧酸被還原成它們相應(yīng)的醇(perez,biotechnolbioeng,110:1066-1077,2012)。重要的是，這些菌種還均顯示出依靠含co氣體的強自養(yǎng)生長，產(chǎn)生乙醇和乙酸鹽(或乙酸)作為主要發(fā)酵產(chǎn)物，并且在某些條件下產(chǎn)生少量的2,3-丁二醇和乳酸。

然而，這三種菌種也具有許多差異。這些菌種是從不同的來源分離的：自產(chǎn)乙醇梭菌來自兔腸道，揚氏梭菌來自雞舍廢物，并且拉氏梭菌來自淡水沉積物。這些菌種在對各種糖(例如鼠李糖、阿拉伯糖)、酸(例如葡萄糖酸鹽、檸檬酸鹽)、氨基酸(例如精氨酸、組氨酸)、以及其它基質(zhì)(例如甜菜堿、丁醇)的利用率方面有所不同。此外，這些菌種在對某些維生素(例如硫胺素、生物素)的營養(yǎng)缺陷方面有所不同。這些菌種在伍德-揚達(dá)爾途徑基因和蛋白質(zhì)的核酸序列和氨基酸序列上具有差異，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些基因和蛋白質(zhì)的一般組織和數(shù)量在所有菌種中是相同的(curropinbiotechnol,22:320-325,2011)。

因此，綜上所述，自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、或拉氏梭菌的特征中有許多不是該菌種特有的，而相反是梭菌屬的這一群c1固定的、厭氧的、產(chǎn)乙酸型、產(chǎn)乙醇型、以及一氧化碳營養(yǎng)型成員的一般特征。然而，由于這些菌種實際上是不同的，因此對這些菌種之一的遺傳修飾或操縱在這些菌種中的另一種中可能沒有相同的效果。舉例來說，可以觀測到生長、性能、或產(chǎn)物產(chǎn)生的差異。

本發(fā)明的微生物還可以衍生自自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、或拉氏梭菌的分離株或突變株。自產(chǎn)乙醇梭菌的分離株和突變株包括ja1-1(dsm10061)(abrini,archmicrobiol,161:345-351,1994)、lbs1560(dsm19630)(wo2009/064200)、以及l(fā)z1561(dsm23693)。揚氏梭菌的分離株和突變株包括atcc49587(tanner,intjsystbacteriol,43:232-236,1993)、petct(dsm13528、atcc55383)、eri-2(atcc55380)(us5,593,886)、c-01(atcc55988)(us6,368,819)、o-52(atcc55989)(us6,368,819)、以及ota-1(tirado-acevedo,《使用揚氏梭菌從合成氣體產(chǎn)生生物乙醇(productionofbioethanolfromsynthesisgasusingclostridiumljungdahlii)》,phdthesis,北卡羅來納州立大學(xué)(northcarolinastateuniversity),2010)。拉氏梭菌的分離株和突變株包括pi1(atccbaa-622、atccpta-7826)(wo2008/028055)。

可以培養(yǎng)本發(fā)明的微生物以產(chǎn)生一種或多種產(chǎn)物。舉例來說，自產(chǎn)乙醇梭菌產(chǎn)生或可以被工程化以產(chǎn)生乙醇(wo2007/117157)、乙酸鹽(wo2007/117157)、丁醇(wo2008/115080和wo2012/053905)、丁酸鹽(wo2008/115080)、2,3-丁二醇(wo2009/151342)、乳酸鹽(wo2011/112103)、丁烯(wo2012/024522)、丁二烯(wo2012/024522)、甲基乙基酮(2-丁酮)(wo2012/024522和wo2013/185123)、乙烯(wo2012/026833)、丙酮(wo2012/115527)、異丙醇(wo2012/115527)、脂質(zhì)(wo2013/036147)、3-羥基丙酸鹽(3-hp)(wo2013/180581)、異戊二烯(wo2013/180584)、脂肪酸(wo2013/191567)、2-丁醇(wo2013/185123)、1,2-丙二醇(wo2014/0369152)、以及1-丙醇(wo2014/0369152)。除了一種或多種目標(biāo)產(chǎn)物之外，本發(fā)明的微生物還可以產(chǎn)生乙醇、乙酸鹽、和/或2,3-丁二醇。在某些實施方案中，微生物生物質(zhì)本身可以被認(rèn)為是產(chǎn)物。

在酸性代謝產(chǎn)物是乙酸的背景下，術(shù)語“乙酸”或“乙酸鹽”指的是培養(yǎng)基中存在的總乙酸鹽，其呈它的陰離子(解離)形式(即作為乙酸根離子或ch3coo^-)或呈游離分子乙酸(ch3cooh)的形式，其中這些形式的比率取決于系統(tǒng)的ph值。如下文所述，可以使用堿性中和劑，如氫氧化鈉(naoh)水溶液通過中和乙酸來控制給定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)基的ph值(例如達(dá)到ph值設(shè)定點值，該ph值設(shè)定點值可以是ph值＝4.5至ph值＝8.0的任何特定的ph值)。生物反應(yīng)器被維持以進(jìn)行本文所述的方法的代表性的ph值范圍是約4.0至約8.0，如約5.0至約6.5。

如本文所用的“液體產(chǎn)物”指的是被供給到多階段方法的至少一個階段的液流(例如被供給到第二階段的第一階段液體產(chǎn)物)。液體產(chǎn)物含有(i)含有c1固定微生物的培養(yǎng)基；(ii)所期望的終產(chǎn)物；以及(iii)其它代謝產(chǎn)物。所述液體產(chǎn)物還可以含有溶解的含c1基質(zhì)。如本文所用的“最終階段液體產(chǎn)物”是從多階段方法的最終反應(yīng)器階段中抽出的液體產(chǎn)物。最終階段液體產(chǎn)物通常是從最終階段的液體級分的不含生物質(zhì)的部分中抽出的。

如本文所用的“終產(chǎn)物”或“所期望的終產(chǎn)物”指的是由本發(fā)明的微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物?？梢耘囵B(yǎng)本發(fā)明的微生物以產(chǎn)生選自由以下各項組成的組的一種或多種產(chǎn)物：以產(chǎn)生乙醇、乙酸鹽、丁醇、丁酸鹽、2,3-丁二醇、乳酸鹽、丁烷、丁二烯、甲基乙基酮(2-丁酮)、乙烯、丙酮、異丙醇、脂質(zhì)、3-羥基丙酸鹽(3-hp)、異戊二烯、脂肪酸、2-丁醇、1,2-丙二醇、以及1-丙醇。如本文所用的“生長依賴性產(chǎn)物”指的是表現(xiàn)出與生物質(zhì)的產(chǎn)生速率成正比的產(chǎn)生速率的代謝產(chǎn)物。生長依賴性產(chǎn)物的實例包括但不限于異丙醇、乙酸鹽、丙酮、2-羥基丁酸(2-hiba)以及異丁烯。

所述多階段反應(yīng)器方法的益處之一是能夠朝向至少一種所期望的終產(chǎn)物調(diào)控發(fā)酵過程的能力。應(yīng)當(dāng)了解的是，根據(jù)所提供的工藝參數(shù)，在一個發(fā)酵過程中所期望的終產(chǎn)物可能是在不同的工藝條件下操作的不同發(fā)酵過程中不期望的代謝產(chǎn)物。舉例來說，在針對乙醇生產(chǎn)的多階段方法中，乙醇是所期望的終產(chǎn)物，然而，在針對異丙醇生產(chǎn)的多階段方法中，異丙醇是所期望的終產(chǎn)物，并且乙醇是副產(chǎn)物代謝產(chǎn)物。

如下文所述，在實施本發(fā)明中特別有用的特定類型的生物反應(yīng)器是循環(huán)回路反應(yīng)器，所述反應(yīng)器依賴于提升管內(nèi)相對低密度區(qū)段與一個或多個內(nèi)部或外部下降管內(nèi)相對高密度區(qū)段之間的密度梯度。提升管區(qū)段和下降管區(qū)段這兩者在連續(xù)液相區(qū)域中包括液體培養(yǎng)基，但是氣態(tài)含co基質(zhì)通常被分配(例如噴射)到提升管區(qū)段的底部中。上升的氣泡在它們向上移動穿過連續(xù)液相區(qū)域期間被局限于這一區(qū)段，直到任何未消耗和未溶解的氣體被釋放到液位上方的連續(xù)氣相區(qū)域(即蒸氣空間或頂部空間)中為止。通過內(nèi)部或外部液體下降管的向下液體循環(huán)可以由回路泵引起或輔助。然而，在一些情況下，多個生物反應(yīng)器中的至少一個不使用回路泵，并且常常，大部分或甚至全部的生物反應(yīng)器不使用回路泵，從而僅僅依賴于密度引起的循環(huán)并且有利地節(jié)約能量成本。

術(shù)語“生物反應(yīng)器”以及可以作為“生物反應(yīng)器階段”的一部分包括的任何生物反應(yīng)器不限于循環(huán)回路反應(yīng)器，而是更廣泛地包括用于維持具有可以用于進(jìn)行本文所述的生物學(xué)方法的一氧化碳營養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基的液體體積的任何合適的容器、或容器內(nèi)的區(qū)段，就所述生物學(xué)方法一般是在厭氧條件下進(jìn)行來說，它們也可以被稱為發(fā)酵方法。特定類型的生物反應(yīng)器可以包括適用于兩相(氣體-液體)接觸的任何容器，例如逆流流動反應(yīng)器(例如具有向上流動的氣相和向下流動的液相)或順流流動反應(yīng)器(例如具有向上流動的氣相和液相)。在這樣的兩相接觸容器中，液相有可能是連續(xù)相，如在氣泡流過移動的液體柱的情況下那樣。除此以外，氣相有可能是連續(xù)相，如在分散的液體(例如呈液滴的形式)流過蒸氣空間的情況下那樣。在一些實施方案中，如下文更充分描述的那樣，生物反應(yīng)器的不同區(qū)域可以用于容納連續(xù)液相和連續(xù)氣相。

生物反應(yīng)器的具體實例包括連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器(cstr)、固定化細(xì)胞反應(yīng)器(icr)、滴流床反應(yīng)器(tbr)、移動床生物膜反應(yīng)器(mbbr)、鼓泡塔、氣升式發(fā)酵罐、以及膜反應(yīng)器，如中空纖維膜生物反應(yīng)器(hfmbr)。合適的生物反應(yīng)器可以包括靜態(tài)混合器、或適用于使氣態(tài)含c1基質(zhì)與液體細(xì)菌培養(yǎng)基接觸(例如具有對于進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化有利的溶解和質(zhì)量轉(zhuǎn)移動力學(xué))的其它容器和/或裝置(例如塔或管道布置)。短語“多個生物反應(yīng)器”或可以被包括在“多個生物反應(yīng)器階段”中的生物反應(yīng)器意在包括多于單一類型的生物反應(yīng)器，盡管在一些情況下，多個生物反應(yīng)器可以是一種類型(例如循環(huán)回路反應(yīng)器)。

用于本文所述的生物學(xué)方法中的一些合適的工藝物流、操作參數(shù)、以及設(shè)備描述于美國專利申請公開號us2011/0212433中，該美國專利申請公開在此以引用的方式整體并入本文。

本發(fā)明更具體地說與利用多個生物反應(yīng)器階段將c1碳源轉(zhuǎn)化成有價值的終產(chǎn)物的生物學(xué)方法的發(fā)現(xiàn)相關(guān)，所述生物學(xué)方法涉及如本文所述的并行氣體、連續(xù)液體處理配置。有利的是，可以避免用于細(xì)胞(微生物或生物質(zhì))分離和再循環(huán)到給定的生物反應(yīng)器階段的一個或多個膜系統(tǒng)，同時實現(xiàn)所期望的終產(chǎn)物的高總體生產(chǎn)率(例如經(jīng)過兩個或更多個生物反應(yīng)器)，而有非常低的總體副產(chǎn)物形成。

在具體實施例中，本發(fā)明與使用如本文所述的多階段方法將co轉(zhuǎn)化成乙醇的方法有關(guān)。在某些實施方案中，c1固定微生物是一氧化碳營養(yǎng)型微生物。更確切地說，所述一氧化碳營養(yǎng)型微生物選自由以下各項組成的組：自產(chǎn)乙醇梭菌、拉氏梭菌、以及揚氏梭菌。在具體實施方案中，所述一氧化碳營養(yǎng)型微生物是自產(chǎn)乙醇梭菌菌株dsm23693。從被定位在其它階段下游的生物反應(yīng)器階段(例如最終生物反應(yīng)器階段)中抽出的中間階段液體產(chǎn)物或最終階段液體產(chǎn)物中代表性的乙醇濃度一般是至少約每升40克(克/升或g/l)(例如約40g/l至約95g/l)，通常至少約50g/l(例如約50g/l至約80g/l)，并且常常至少約60g/l(例如約60g/l至約75g/l)。在這樣的中間階段液體產(chǎn)物或最終階段液體產(chǎn)物中代表性的乙醇:乙酸重量比一般是至少約50:1(例如約50:1至約1000:1)，通常至少約75:1(例如約75:1至約500:1)，并且常常至少約100:1(例如約100:1至約250:1)。液體產(chǎn)物的這些特征更具體地說可以指從中間階段生物反應(yīng)器或最終階段生物反應(yīng)器中抽出并且在分離(例如膜過濾)以去除一氧化碳營養(yǎng)型微生物(細(xì)胞或生物質(zhì))之后的液體產(chǎn)物。一般來說，用于確定代謝產(chǎn)物濃度的分析方法(例如氣相色譜(gc)或高壓液相色譜(hplc)需要不含細(xì)胞的樣品。

除了實現(xiàn)高的總體乙醇生產(chǎn)率而有最低限度的總體副產(chǎn)物形成之外，如本文所述的多階段方法還可以提供有利的總co利用率?？俢o利用率指的是被輸入到多階段過程中(例如被輸入到生物反應(yīng)器中的總co)并且被用于轉(zhuǎn)化成微生物的一種或多種所期望的產(chǎn)物(例如乙醇)和其它代謝產(chǎn)物的co的百分比。如果離開所述過程的所有氣流(即氣態(tài)產(chǎn)物)的組合組成是已知的或可以計算(例如基于離開所使用的生物反應(yīng)器中的每一個的一個或多個單獨氣流的流速和組成)，則總co利用率可以被計算為：

1-(離開所述多階段過程的co的速率)/(被輸入到所述多階段過程中的co的速率)

總co利用率是在“每次通過”或“單程”基礎(chǔ)上確定的，而不說明可以提供更高的總利用率值的氣態(tài)產(chǎn)物再循環(huán)(和附加費用)的使用。根據(jù)代表性實施方案，一氧化碳營養(yǎng)型微生物的co利用率一般是至少約35％(例如約35％至約85％)，通常至少約50％(例如約50％至約80％)，并且常常至少約60％(例如約60％至約75％)。在一些情況下，co利用率可以是至少約70％。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，調(diào)整所述多階段方法的發(fā)酵參數(shù)以提高至少一種生長依賴性產(chǎn)物的產(chǎn)量。在一個實施方案中，調(diào)整所述多階段方法的發(fā)酵參數(shù)以提高所述方法對異丙醇的特異性。在具體實施例中，本發(fā)明與使用如本文所述的多階段方法將co轉(zhuǎn)化成異丙醇的方法有關(guān)。在某些實施方案中，c1固定微生物是重組自產(chǎn)乙醇梭菌菌株。在某些實施方案中，所述重組微生物被適配成表達(dá)或過表達(dá)異丙醇生物合成途徑中的至少一種酶。

本發(fā)明的實施方案涉及用于提高代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)率的方法，所述代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出與生物質(zhì)的產(chǎn)生速率成正比的產(chǎn)生速率(例如生長依賴性產(chǎn)物)。如圖5a和5b中所示，丙酮和/或異丙醇的生產(chǎn)速率與發(fā)酵的生長階段相關(guān)。如圖表中所示的那樣。圖5a示出了在cstr中發(fā)酵過程中乙酸鹽濃度與異丙醇濃度之間的強相關(guān)性。乙酸鹽濃度和異丙醇濃度這兩者在發(fā)酵的初始生長階段(第1天和第2天)期間均增加。隨著生長階段開始平緩，乙酸鹽濃度和異丙醇濃度這兩者均下降。圖5b示出了異丙醇的生產(chǎn)率與生長速率之間的關(guān)系。清楚地表明，異丙醇在最高的生長速率下達(dá)到它的最高生產(chǎn)率。

已經(jīng)證實酶ctfab通過將輔酶a部分從乙酰乙酰輔酶a轉(zhuǎn)移到乙酸鹽，從而引起乙酰乙酸鹽和乙酰輔酶a的形成來催化乙酰乙酸鹽的形成。這一酶活性取決于乙酸鹽的可用性。已經(jīng)報道ctfab對乙酸鹽的km值是24mm(1.4g/l)至1200mm(71g/l)。km值是酶以它的最大速率的一半起作用時的底物濃度。因此，為了使ctfab具有活性以達(dá)到它的最大速率的一半，需要1.4g/l-71g/l的乙酸鹽。本申請的發(fā)明人估計在細(xì)胞中需要至少14g/l的乙酸鹽，以確保乙酸鹽不是異丙醇發(fā)酵過程中的限制性底物。

如本發(fā)明所提供的多階段生物反應(yīng)器方法提供了所述方法的更大適應(yīng)性。通過對所述多階段方法的各個階段進(jìn)行工藝參數(shù)調(diào)整，可以改變所期望的結(jié)果。舉例來說，可以調(diào)控所述多階段方法以對所期望的終產(chǎn)物(例如乙醇、或2,3-丁二醇、或生長依賴性產(chǎn)物，如異丙醇)具有更大的產(chǎn)物特異性。在整個多階段生物反應(yīng)器方法中可以控制或調(diào)整的工藝參數(shù)的實例包括含c1基質(zhì)組成、含c1基質(zhì)流速、溫度、壓力、細(xì)菌稀釋率、以及液體培養(yǎng)基組成。

合適的操縱的實例包括以不同的流速向多階段方法的不同階段提供含c1基質(zhì)；向多階段方法的不同階段提供具有不同組成的含c1基質(zhì)；向多階段方法的不同階段提供具有不同組成的液體培養(yǎng)基(例如向多階段方法的至少階段提供具有有限組成的液體培養(yǎng)基)；改變多階段系統(tǒng)的不同階段之間的溫度(例如從第一反應(yīng)器階段和后續(xù)反應(yīng)器階段降低溫度)；改變多階段反應(yīng)器方法的階段之間的細(xì)菌稀釋率；改變多階段方法的每一個階段內(nèi)的混合速率(例如通過改變液體分配裝置的泵速、或通過修改內(nèi)部反應(yīng)器設(shè)計或尺寸)。

重要的是，如上文所述，上述性能參數(shù)可以在多階段生物反應(yīng)器方法中實現(xiàn)，其中不需要如在常規(guī)的連續(xù)生物轉(zhuǎn)化方法中所實施的那樣，分離和再循環(huán)在一個(上游)生物反應(yīng)器的液體產(chǎn)物中抽出并且供給到另一個(下游)生物反應(yīng)器中的一氧化碳營養(yǎng)型微生物。一般來說，因此，從上游生物反應(yīng)器階段中抽出并且供給到給定生物反應(yīng)器階段中的液體產(chǎn)物可以包含上游(先前)生物反應(yīng)器階段中所用的一氧化碳營養(yǎng)型微生物，這是因為不將該微生物從正連續(xù)地從一個階段轉(zhuǎn)移到下一個階段的液體產(chǎn)物中的一個或多個，并且優(yōu)選地全部中分離。被供給到給定生物反應(yīng)器階段中的液體產(chǎn)物一般還包含從上游(先前)階段接收的培養(yǎng)基、所期望的終產(chǎn)物、以及其它代謝產(chǎn)物。

因此，根據(jù)本文所述的有利地避免使用常規(guī)的細(xì)胞分離和再循環(huán)(例如膜)系統(tǒng)的實施方案，從上游生物反應(yīng)器階段中抽出的液體產(chǎn)物不經(jīng)受一氧化碳營養(yǎng)型微生物的分離以及所分離的一氧化碳營養(yǎng)型微生物向從中它被抽出的上游生物反應(yīng)器階段中的再循環(huán)。然而，本文所述的方法和系統(tǒng)的這一表征性特征并不排除在從上游階段中抽出液體產(chǎn)物之后并且在將它供給到給定的生物反應(yīng)器階段中之前使用各種中間步驟，這些步驟可能影響或可能不影響液體產(chǎn)物的組成。這些中間步驟包括例如(i)分離液體產(chǎn)物的一部分(例如用于取樣目的)，任選地與過濾所述分離的部分(例如，如執(zhí)行分析方法所需)組合；(ii)將液體產(chǎn)物(例如與培養(yǎng)基、特定營養(yǎng)物質(zhì)、或工藝添加劑，如表面活性劑)混合；和/或(iii)使液體產(chǎn)物反應(yīng)(例如與中和劑，如nh4oh或naoh反應(yīng)以提高ph值)。然而，在一些實施方案中，可以將從給定的生物反應(yīng)器階段中抽出的液體產(chǎn)物供給到給定的生物反應(yīng)器階段中而不經(jīng)歷上文所述的(i)、(ii)、和/或(iii)，或不經(jīng)歷這些的某種組合。

圖1描繪了根據(jù)本公開的一個具體實施方案的代表性的多階段生物轉(zhuǎn)化方法，該方法包括至少四個互連的生物反應(yīng)器階段(10a、10b、……、10y、10z)，第二階段(10a)與第三階段(10y)之間的虛線用于指示一個或多個另外的中間階段可以按類似方式并且用相似的設(shè)備和連接并入到給定的多階段系統(tǒng)中。如下文更充分描述的那樣，可以將氣態(tài)含c1基質(zhì)并行地供給到所述階段中，而可以將可以包括生物質(zhì)的液體產(chǎn)物從第一生物反應(yīng)器階段(10a)依次供給到最終生物反應(yīng)器階段(10z)，可以從所述最終生物反應(yīng)器階段中抽出最終階段液體產(chǎn)物，所述最終階段液體產(chǎn)物具有如上文所述的這一液體產(chǎn)物或至少其不含生物質(zhì)的級分的代表性特征。

根據(jù)代表性的方法，將氣態(tài)含c1基質(zhì)經(jīng)由氣體入口(12a、12b、12y、12z)供給到生物反應(yīng)器階段中，所述氣體入口被定位在每一個生物反應(yīng)器階段的垂直延伸的生物反應(yīng)器(100a、100b、100y、100z)的底端附近。舉例來說，氣體入口可以在它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器的長度的底部25％內(nèi)，并且優(yōu)選地底部10％內(nèi)延伸到它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器中。氣體入口通常將延伸到它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器中，延伸到氣體分配裝置，所述氣體分配裝置可以在生物反應(yīng)器內(nèi)居中設(shè)置在一般對應(yīng)于反應(yīng)器長度的這些百分比內(nèi)的高度處。特定的氣體分配裝置包括噴射器(14a、14b、14y、14z)，所述氣體入口可以與所述噴射器處于流體連通，所述噴射器在所述生物反應(yīng)器中的一個或多個內(nèi)，靠近它們對應(yīng)的第一端。包括在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中沒有被利用的未轉(zhuǎn)化的c1碳源和含c1基質(zhì)的任何氣態(tài)雜質(zhì)(例如h2)的氣態(tài)產(chǎn)物從每一個生物反應(yīng)器中抽出并且經(jīng)由氣體出口(16a、16b、16y、16z)離開，所述氣體出口被定位在生物反應(yīng)器的與底端相對的頂端附近。所述氣體出口可以在它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器的長度的頂部25％內(nèi)，并且優(yōu)選地頂部10％內(nèi)延伸到它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器中，或相反，氣態(tài)產(chǎn)物可以從它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器的頂部抽出，而完全沒有延伸到它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器中的氣體出口。

中間生物反應(yīng)器(100b、100y)各自包括液體入口(18b、18y)和液體出口(20b、20y)，它們可以接收從緊鄰的上游生物反應(yīng)器中抽出的液體產(chǎn)物并且將液體產(chǎn)物輸送到緊鄰的下游生物反應(yīng)器中。舉例來說，第二階段的生物反應(yīng)器100b具有用于接收從第一階段的生物反應(yīng)器100a(例如經(jīng)由它的液體出口20a)中抽出的液體產(chǎn)物的液體入口18b以及用于將液體產(chǎn)物輸送到第三階段的生物反應(yīng)器(未示)(例如經(jīng)由它的液體入口(未示))中的液體出口20b。生物反應(yīng)器100a(即第一階段10a的生物反應(yīng)器)沒有上游生物反應(yīng)器，并且因此沒有特定用于從相鄰的上游生物反應(yīng)器接收液體產(chǎn)物的液體入口。生物反應(yīng)器100z(即最終階段10z的生物反應(yīng)器)沒有下游生物反應(yīng)器，并且因此沒有特定用于將液體產(chǎn)物輸送到相鄰的下游生物反應(yīng)器中的液體出口。然而，最終生物反應(yīng)器100z包括用于抽出最終階段液體產(chǎn)物的液體產(chǎn)物出口50，所述最終階段液體產(chǎn)物例如具有如上文所述的它的組成方面的代表性特征?？梢越?jīng)由與這些入口和出口處于流體連通的小口徑開管(例如具有約1mm至約12mm的內(nèi)徑)將液體產(chǎn)物(或“發(fā)酵液”)經(jīng)由入口和出口(20a……20y和18a……18z)轉(zhuǎn)移到連續(xù)階段中/從連續(xù)階段中轉(zhuǎn)移出。

如同中間階段的生物反應(yīng)器的液體出口(20b、20y)的情況一樣，最終階段的生物反應(yīng)器100z的液體產(chǎn)物出口50被定位在生物反應(yīng)器的底端附近。在從生物反應(yīng)器100z中抽出最終階段液體產(chǎn)物之后，可以將在液體產(chǎn)物出口50中抽出的最終階段液體產(chǎn)物通到高度h并且任選地延伸到高度h上方，所述高度h對應(yīng)于工作無氣液位(即將在沒有氣體滯留的情況下存在的液位)。也就是說，最終階段液體產(chǎn)物延伸到的最高高程e可以等于或高于高度h。高度h可以是可調(diào)的，并且可以基本上對應(yīng)于虹吸截斷器75或其它類型的液體分支點的高度h。在圖1的實施方案中，因此，液體產(chǎn)物出口50與虹吸截斷器75處于流體連通，該虹吸截斷器75相對于多階段方法的生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)在高度上是可調(diào)的。可以調(diào)節(jié)高程e和高度h以控制最終階段的生物反應(yīng)器100z以及優(yōu)選地其它生物反應(yīng)器的液位或液壓頭達(dá)到這樣的程度以使得它們可以液壓連接，而不破壞將液體產(chǎn)物連續(xù)地從一個階段轉(zhuǎn)移到下一個階段的液體入口和液體出口(20a……20y和18a……18z)中的液體充滿(或連續(xù)液相)狀態(tài)。高程e和/或高度h因此可以控制一個或多個，并且優(yōu)選地所有生物反應(yīng)器(100a……100z)中的液位，并且特別可以控制它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器中的氣體/液體界面(22a……22z)的液位。

在圖1中所描繪的具體實施方案中，液體入口(18b、18y)和液體出口(20b、20y)優(yōu)選地被定位在對應(yīng)的氣體入口(12b、12y)和噴射器(14b、14y)下方的靜止區(qū)段中以允許液體被供給到給定的生物反應(yīng)器階段的這一區(qū)段或反應(yīng)器位置以及從該區(qū)段或反應(yīng)器位置抽出。然而，入口和出口也有可能沿著它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器的長度被定位在別處，這取決于用于供給和抽出液體產(chǎn)物的所期望的位置。在一個替代性實施方案中，例如，液體出口可以被定位在氣體/液體界面(22a、22b、22y、22z)的液位處或附近，或者否則可能破壞生物反應(yīng)器階段之間的虹吸效應(yīng)或液體充滿狀態(tài)，以允許一個或多個生物反應(yīng)器中獨立的液位控制。

也如圖1中所示，一個或多個，例如所有生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)可以包括外部液體再循環(huán)回路(25a、25b……25y、25z)(即在它們對應(yīng)的生物反應(yīng)器外部)以提高給定生物反應(yīng)器內(nèi)的混合/均勻性和/或提高氣液質(zhì)量傳遞的速率。使用外部液體再循環(huán)回路(25a、25b……25y、25z)，包括培養(yǎng)基和c1固定微生物的液體產(chǎn)物可以從給定生物反應(yīng)器的底部區(qū)段(例如從生物反應(yīng)器的長度的底部10％內(nèi)；從氣體分配裝置，如噴射器(14a、14b、14y或14z)下方；和/或從液體入口或液體出口下方)抽出，并且在生物反應(yīng)器外部再循環(huán)到生物反應(yīng)器的頂部區(qū)段(例如到生物反應(yīng)器的頂部10％內(nèi)和/或到界定連續(xù)氣相區(qū)域與連續(xù)液相區(qū)域之間的邊界的氣體/液體界面(22a、22b、22y、或22z)上方)。外部反應(yīng)器液體再循環(huán)回路可以包括對應(yīng)的外部液體再循環(huán)泵(30a、30b、30y、30z)以例如在能量使用與質(zhì)量傳遞速率提高之間的最佳折衷下按所期望的速率提供外部液體循環(huán)。

方便的是，外部液體再循環(huán)回路(25a、25b……25y、25z)可以提供生物反應(yīng)器液體取樣/分析的位置，并且還被配置用于生物反應(yīng)器控制。舉例來說，第一階段和第二階段的生物反應(yīng)器100a和100b包括對應(yīng)的外部液體再循環(huán)回路25a和25b，可以經(jīng)由堿性中和劑入口35a和35b將堿性中和劑(例如堿水溶液，如nh4oh或naoh)添加到所述回路中。向一個或多個給定的生物反應(yīng)器，例如生物反應(yīng)器100a、100b中添加堿性中和劑可以使用合適的反饋控制回路來單獨控制，所述反饋控制回路包括例如測量(例如連續(xù)地或間歇地)外部液體再循環(huán)回路25a和25b內(nèi)生物反應(yīng)器液體的ph值的ph值分析儀40a、40b。這樣的控制回路還包括必要的硬件(例如控制閥或可變速率進(jìn)料泵(未示))和軟件(例如計算機程序)以將測量的ph值與給定生物反應(yīng)器的設(shè)定點值比較，然后控制堿性中和劑的流動以實現(xiàn)或維持設(shè)定點。因此，所述生物反應(yīng)器中的一個或多個(例如全部)的外部再循環(huán)回路可以與對應(yīng)的一個或多個(例如所有)堿性中和入口處于流體連通并且包括用于獨立地控制一個或多個(例如所有)對應(yīng)的生物反應(yīng)器內(nèi)的ph值的儀器。

此外，一個或多個生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)的外部液體再循環(huán)回路(25a、25b……25y、25z)可以包括溫度變送器(41a、41b、41y、41z)，所述溫度變送器測量(例如連續(xù)地或間歇地)對應(yīng)的生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)的外部液體再循環(huán)回路25a和25b內(nèi)液體的溫度，這樣的溫度代表了生物反應(yīng)器的操作溫度。因此可以使用控制回路來實現(xiàn)單獨的生物反應(yīng)器溫度控制，除了溫度變送器(41a、41b、41y、41z)之外，所述控制回路還包括加熱器或熱交換器(42a、42b、42y、42z)和必要的軟件(例如計算機程序)以將測量的溫度與給定的生物反應(yīng)器的設(shè)定點溫度比較，然后控制加熱器或熱交換器(42a、42b……42y、42z)的操作以實現(xiàn)或維持設(shè)定點。特定類型的熱交換器包括具有管中管和蜂窩夾套構(gòu)造的那些熱交換器。此外，一個或多個生物反應(yīng)器(例如如圖1中所描繪的第一階段和第二階段的生物反應(yīng)器100a和100b)的外部液體再循環(huán)回路(25a、25b……25y、25z)可以包括液體培養(yǎng)基入口45a和45b、或用于獨立地以相同的或不同的速率將其它液體稀釋劑、試劑(例如表面活性劑)、和/或營養(yǎng)物質(zhì)引入到一個或多個生物反應(yīng)器中的入口。因此，所述生物反應(yīng)器中的一個或多個(例如全部)的外部再循環(huán)回路可以與對應(yīng)的一個或多個加熱器或熱交換器處于流體連通并且包括用于獨立地控制一個或多個對應(yīng)的生物反應(yīng)器內(nèi)的溫度的儀器。

所述生物反應(yīng)器階段中的兩個或更多個(例如第一生物反應(yīng)器階段和第二生物反應(yīng)器階段10a、10b)因此可以具有可獨立控制的工藝操作變量，包括需要在外部液體再循環(huán)回路上對生物反應(yīng)器液體產(chǎn)物進(jìn)行取樣/分析的那些變量，如上文所述。代表性的工藝操作變量包括液體培養(yǎng)基添加速率、氣態(tài)含co基質(zhì)進(jìn)料速率、反應(yīng)器溫度、反應(yīng)器ph值、以及其組合。如本文所述的多階段方法的一個重要優(yōu)勢源于在將c1固定微生物轉(zhuǎn)移到連續(xù)生物反應(yīng)器階段中時獨立地控制它的生長的能力。對細(xì)菌生長以及終產(chǎn)物和其它代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生的管理可以通過將給定的生物反應(yīng)器階段的條件(例如上文所述的工藝操作變量)調(diào)控到給定的處理目標(biāo)來實現(xiàn)。舉例來說，根據(jù)一個實施方案，將相對高速率的液體培養(yǎng)基添加到第一階段的生物反應(yīng)器中以促進(jìn)高細(xì)菌生長速率并且還為多階段生物反應(yīng)器系統(tǒng)的其余部分建立穩(wěn)定的均勻培養(yǎng)物?？梢詫⑾鄬Ω退俾实囊后w培養(yǎng)基添加到下游生物反應(yīng)器中，所述下游生物反應(yīng)器具有更確定的細(xì)胞培養(yǎng)物，適用于實現(xiàn)終產(chǎn)物的高生產(chǎn)速率。以這種方式，可以有利地將細(xì)菌生長與產(chǎn)物產(chǎn)生分開或脫離。總體而言，可以更一般了解的是，本文所述的系統(tǒng)在控制c1固定微生物在它在每一個連續(xù)反應(yīng)器中經(jīng)歷不同的生長階段時的代謝方面提供了高自由度數(shù)。這些控制特征允許所述多階段生物轉(zhuǎn)化過程被操作而有具有如上文所述的特征的最終階段液體產(chǎn)物。

以相同方式，可以在一個或多個生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)中，經(jīng)由使用獨立的液位控制設(shè)備和儀器(例如控制閥、液位傳感器、以及變送器)來獨立地控制氣體/液體界面(22a、22b……22y、22z)的液位或高度。然而，也有可能有利地避免實施這樣的設(shè)備和儀器的附加費用和復(fù)雜性，這是通過進(jìn)行多階段方法以使得至少一個生物反應(yīng)器中的液位取決于它對應(yīng)的下游生物反應(yīng)器中的液位，例如通過具有控制所述系統(tǒng)的所有生物反應(yīng)器中的液位的單一液位控制來實現(xiàn)。根據(jù)操作圖1的生物反應(yīng)器(100a、100b……100y、100z)的系統(tǒng)的特定模式，將液體培養(yǎng)基經(jīng)由入口45a添加到第一階段的生物反應(yīng)器100a中并且它通過溢流或以其它方式流過所有的反應(yīng)器，如由流體靜壓頭所控制，例如，所述流體靜壓頭可以通過改變最終階段液體產(chǎn)物達(dá)到或延伸到的最高高程e來控制。

根據(jù)開始所述方法的一種可能的程序，最初可以向第一階段的生物反應(yīng)器100a中接種或加入c1固定微生物，所述微生物在培養(yǎng)中分批生長期之后，實現(xiàn)足夠高的濃度，以使得可以開始液體培養(yǎng)基的連續(xù)添加。然后將第一階段液體產(chǎn)物輸送到連續(xù)階段，這例如是通過從第一階段溢流到第二階段，繼而從第二階段溢流到第三階段等等來實現(xiàn)的。系統(tǒng)的液位最終可以由抽出最終階段液體產(chǎn)物的液位(也被稱為從最終生物反應(yīng)器階段“排放”的液位)來決定。分別將氣態(tài)含c1基質(zhì)添加到每一個反應(yīng)器中，盡管共用的頂部空間是可能的，并且根據(jù)一些實施方案，可以減少發(fā)泡，在所述頂部空間中，離開連續(xù)液相區(qū)域的蒸氣組合(例如在單個容器內(nèi)，諸如以堆疊的布置設(shè)置多于一個生物反應(yīng)器階段的情況下)。從最終階段液體產(chǎn)物中回收發(fā)酵的所期望的終產(chǎn)物以及其它代謝產(chǎn)物，所述最終階段液體產(chǎn)物是從最終生物反應(yīng)器階段中抽出的?？梢栽谠摶厥罩胺蛛x(例如通過膜過濾)最終階段液體產(chǎn)物以去除終產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物，然后去除c1固定微生物和可能的其它固體?？梢詫⒂稍摲蛛x回收的液體滲透物(或基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中的一些或全部再循環(huán)以用于生物反應(yīng)器階段中，例如，可以將它添加到第一階段生物反應(yīng)器中，任選地在添加營養(yǎng)物質(zhì)之后添加到第一階段生物反應(yīng)器中。

圖2描繪了一種可能類型的生物反應(yīng)器100，即循環(huán)回路生物反應(yīng)器，它可以被并入多階段方法的生物反應(yīng)器階段10中，所述方法包括圖1中所描繪的方法。許多相同的特征如圖1中所示(并且使用相同的附圖標(biāo)記來標(biāo)識)，除了可以特定用于促進(jìn)所期望的蒸氣和液體流動特征、循環(huán)、以及相間的分配/質(zhì)量傳遞的一些反應(yīng)器內(nèi)部結(jié)構(gòu)之外。如圖2中更清楚示出的那樣，生物反應(yīng)器100用兩個區(qū)域操作，這兩個區(qū)域可通過它們的連續(xù)相和分散相來區(qū)分。連續(xù)氣相區(qū)域a具有分散的液相，這是因為液體產(chǎn)物經(jīng)由一個或多個液體分配裝置，如噴淋頭110進(jìn)入這個區(qū)域(也被稱為頂部空間)中，所述噴淋頭110具有多個開口以用于分散從外部液體再循環(huán)回路25供給的向下流動的液體產(chǎn)物(例如呈向下膨脹錐形輪廓)。

連續(xù)液相區(qū)域b具有分散的氣相，這是因為含c1基質(zhì)經(jīng)由一個或多個氣體分配裝置，如噴射器14進(jìn)入這個區(qū)域中，所述噴射器14具有多個開口以用于分散從氣體入口12供給的向上流動的含c1基質(zhì)。氣體/液體界面22界定了連續(xù)氣相區(qū)域a與連續(xù)液相區(qū)域b之間的邊界。連續(xù)液相區(qū)域b可以占據(jù)生物反應(yīng)器100的大部分容積，并且例如它可以被完全設(shè)置在反應(yīng)器長度的底部90％、底部80％、或底部75％內(nèi)。因此，氣體/液體界面22可以位于反應(yīng)器長度的頂部25％、頂部20％、或頂部10％內(nèi)。在一些情況下，泡沫層(未示)可能存在于氣體/液體界面上方，并且為了本公開的目的，存在于連續(xù)氣相區(qū)域a中。

因此，根據(jù)圖2的具體實施方案，將經(jīng)由外部液體再循環(huán)回路25再循環(huán)的液體產(chǎn)物(或“發(fā)酵液”)引入連續(xù)氣相區(qū)域a中?？梢詫⒃撘后w產(chǎn)物從生物反應(yīng)器的底部區(qū)段(如上文所述從其抽出液體產(chǎn)物)通到生物反應(yīng)器的頂部區(qū)段(例如通到生物反應(yīng)器100的長度的頂部10％內(nèi)以及通到用于引入所述液體產(chǎn)物的一個或多個液體分配裝置(如噴淋頭110)上方)。如上文關(guān)于圖1所述，除了提高液體循環(huán)和液相與氣相之間的質(zhì)量傳遞之外，外部液體再循環(huán)回路25還可以被配置成執(zhí)行工藝控制功能。舉例來說，可以使經(jīng)由外部再循環(huán)回路25再循環(huán)的液體產(chǎn)物通過外部熱交換器42(例如，在引入連續(xù)氣相區(qū)域a中之前)以控制生物反應(yīng)器100的溫度。此外，可以例如經(jīng)由堿性中和劑入口35將堿性中和劑添加到該液體產(chǎn)物中，以控制生物反應(yīng)器100的ph值。在如圖1中所示的多個生物反應(yīng)器的情況下，所述生物反應(yīng)器中的一個或多個(例如全部)的外部再循環(huán)回路可以用于將在生物反應(yīng)器的一個或多個對應(yīng)的第一端附近抽出的液體產(chǎn)物再循環(huán)到一個或多個對應(yīng)的連續(xù)氣相區(qū)域中靠近一個或多個對應(yīng)的第二端(與第一端相對設(shè)置)的液體分配器中。

可以將經(jīng)由噴射器14引入的含c1基質(zhì)供給到提升管120中，該提升管120被設(shè)置在連續(xù)液相區(qū)域b內(nèi)，例如相對于生物反應(yīng)器100同心設(shè)置，并且將上升的氣泡局限于該區(qū)域的中央?yún)^(qū)域。在離開提升管120的頂部之后，在連續(xù)液相區(qū)域b中沒有溶解或利用的剩余氣體繼續(xù)向上流動并且在氣體/液體界面22處脫離該區(qū)域。由于提升管120中的氣體滯留，因此提升管120內(nèi)的總體密度小于下降管130中的密度，氣泡基本上脫離該下降管130。如圖2中所示，下降管130可以相對于提升管120環(huán)狀地設(shè)置，盡管其它配置也可能用于提供連續(xù)液相區(qū)域b內(nèi)具有不同密度的區(qū)域。舉例來說，多個垂直延伸的下降管可以分布在整個該區(qū)域中，從反應(yīng)器長度的底部1％-10％內(nèi)延伸到反應(yīng)器長度的頂部25％-45％內(nèi)。如還在該區(qū)域中使用箭頭指示整體液體流動方向所示，生物反應(yīng)器100在連續(xù)液相區(qū)域b中以內(nèi)部液體循環(huán)來操作，該液體循環(huán)就是由密度差所引起的，并且引起提升管120中向上的液體流動和下降管130中向下的液體流動，這兩者均在生物反應(yīng)器100的內(nèi)部。根據(jù)一些實施方案，可以使用多于一個提升管和/或多于一個下降管來控制液體循環(huán)。

在氣體/液體界面22處脫離的氣體繼續(xù)向上流動(整體上)穿過連續(xù)氣相區(qū)域a，其中它與經(jīng)由噴淋頭110或其它液體分配裝置引入該區(qū)域中的液體產(chǎn)物接觸。以這種方式，生物反應(yīng)器100在該區(qū)域中以逆流的氣體流動和液體流動(向上流動的氣體和向下流動的液體)來操作，該區(qū)域被設(shè)置在如上文所述以內(nèi)部液體循環(huán)操作的連續(xù)液相區(qū)域b上方。這兩個區(qū)域均可以包括氣液接觸裝置。由于在這些區(qū)域中實現(xiàn)相間質(zhì)量傳遞的方式的差異，因此區(qū)域a中的氣液接觸裝置125a可以不同于區(qū)域b中的氣液接觸裝置125b，例如就它們的幾何形狀(例如直徑和/或厚度)和/或它們開口的配置(例如在尺寸、形狀、間距、和/或總數(shù)方面)來說。根據(jù)一些實施方案，在不同的區(qū)域中可以使用完全不同類型的氣液接觸裝置(例如穿孔板和散堆填料，如拉西環(huán)(raschigring))。同樣，在單個區(qū)域內(nèi)可以使用不同或完全不同類型的氣液接觸裝置。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解的那樣，考慮到本說明書，本文所述的多階段方法和系統(tǒng)與許多操作優(yōu)勢有關(guān)，包括以下各項中的任一個、任何組合、或全部：(1)穩(wěn)健的發(fā)酵(厭氧生物轉(zhuǎn)化)而復(fù)雜性降低：相對于常規(guī)方法，如本文所述的多階段方法是操作更簡單的并且具有顯著更大的“操作范圍”或操作可行的條件范圍。這是因為對每一個單獨的生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率要求相對較低，以及所有反應(yīng)器(除第一階段的生物反應(yīng)器以外)從緊鄰的上游反應(yīng)器接收連續(xù)進(jìn)料，從而使發(fā)酵穩(wěn)定。這有利地解決了本領(lǐng)域的主要目標(biāo)之一，即如長期穩(wěn)定的商業(yè)操作所需的規(guī)模上的操作穩(wěn)健性。(2)顯著的自由度數(shù)：這允許在細(xì)菌培養(yǎng)物在每一個生物反應(yīng)器中經(jīng)歷不同的生長階段時對它的代謝進(jìn)行更大的控制。可以調(diào)控每一個階段的條件(例如氣體供應(yīng)速率、溫度、和/或ph值設(shè)定點)以控制發(fā)酵輸出，如代謝產(chǎn)物比率。這可以產(chǎn)生高并且穩(wěn)定的終產(chǎn)物滴度。舉例來說，本申請的發(fā)明人已經(jīng)證實高并且穩(wěn)定的乙醇滴度(在連續(xù)實驗室測試中，是>60克/升)、非常有利并且穩(wěn)定的最終液體產(chǎn)物乙醇:乙酸鹽重量比(在連續(xù)實驗室測試中，是100+)。因此，可以實現(xiàn)可能非常大的成本節(jié)約，這與培養(yǎng)基和水再循環(huán)系統(tǒng)的使用有關(guān)，其中乙酸鹽副產(chǎn)物是直接再循環(huán)的主要障礙。(3)將生長與產(chǎn)物產(chǎn)生分開的能力：這對于在其中可以在生長之后的隨后階段添加誘導(dǎo)劑的方法中，由遺傳工程細(xì)胞產(chǎn)生生物終產(chǎn)物來說是一個顯著的益處。益處是因為有可能使用高稀釋率(即添加液體培養(yǎng)基的速率)在第一生物反應(yīng)器階段中具有高生長速率，這為系統(tǒng)的其余部分建立穩(wěn)定的均勻培養(yǎng)物。(4)在不需要細(xì)胞再循環(huán)系統(tǒng)的情況下大量節(jié)約資金成本：在這方面，膜、外殼、閥門以及相關(guān)的儀器和控制占生物反應(yīng)器的總成本的顯著部分，特別是在商業(yè)規(guī)模上。還顯著降低了細(xì)菌細(xì)胞再循環(huán)要求(例如再循環(huán)泵輸送量)，并且可能僅需要操作外部再循環(huán)回路所需的適度能量(例如經(jīng)由如上文所述的噴淋頭或其它液體分配器)。(5)以降低的成本進(jìn)行的簡化和更穩(wěn)健的操作：這是因為在每一個生物反應(yīng)器階段不需要膜分離和分離的細(xì)胞的再循環(huán)。與更換膜和手動就地清洗(cip)相關(guān)的在操作時間、cip化學(xué)品、以及加熱方面的成本是顯著的。在這方面，自動cip選擇方案具有非常高的資金成本，用于清洗細(xì)胞再循環(huán)膜的酶溶液也是昂貴的，并且簡單的naoh清洗程序常常無效。(6)更大容積、更短的、和更矮胖的氣升式回路反應(yīng)器設(shè)計：這樣的設(shè)計可以容易地通過配有內(nèi)部零件的現(xiàn)有工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)集液罐來實現(xiàn)。這是因為對生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率要求較低，并且允許在生物反應(yīng)器制造中大量節(jié)約成本的可能性。根據(jù)一些實施方案，如本文所述的方法和系統(tǒng)可以單獨依靠氣升循環(huán)效應(yīng)來有效操作，而不使用外部再循環(huán)或回路泵，并且因此還規(guī)避了相關(guān)的外部再循環(huán)管道和設(shè)備。在每一個階段之間利用簡單的溢流/液壓頭液位控制的實施方案中，控制閥和管道的資金支出的進(jìn)一步減少是可能的。(7)使用低的操作壓力：這是對單獨的生物反應(yīng)器的生產(chǎn)率要求較低的另一個益處。在這一點上，除非對氣體加壓，否則高氣體滯留限制了生物反應(yīng)器的氣體流速。降低操作壓力的能力有降低壓縮成本的作用。

以下實施例作為本發(fā)明的代表被闡述。這些實施例不應(yīng)當(dāng)被視為限制本發(fā)明的范圍，這是因為鑒于本公開和所附權(quán)利要求書，這些和其它等同實施方案將是顯而易見的。

實施例1

實驗設(shè)置

使用具有包括生物反應(yīng)器的六個階段的測試裝備來對如本文所述的多階段生物轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行長期評價，所述階段各自具有1.5升的工作容積(所述系統(tǒng)的總反應(yīng)器容積是9升)。確切地說，這些方法使用逆流液體下流回路反應(yīng)器，所述反應(yīng)器具有具約1.2米高度和50毫米直徑并且由透明pvc塑料構(gòu)建以用于觀測流體動力學(xué)的主塔。第五階段和第六階段具有略微更高的主塔。在每一個塔的底部處使用塑料的低壓離心泵(水族箱，泵輸送量：500l//h-2000l//h)將液體再循環(huán)到塔頂部處的全錐形噴淋頭液體分配器?？缑恳粋€噴淋頭的壓降是低的，約為20kpa-40kpa。

氣體分別并且在塔底部附近，經(jīng)由燒結(jié)不銹鋼噴射器進(jìn)入每一個生物反應(yīng)器階段中。未利用的和未溶解的氣體在每一個塔的頂部處，在噴淋頭上方離開。所有六個階段都是在接近大氣壓下運行的。每一個階段通過小口徑不銹鋼管線(1.5mm內(nèi)徑的管)與下一個階段進(jìn)行流體連接(用于轉(zhuǎn)移液體產(chǎn)物)，所述管線附接在每一個主塔的底部處，在它們對應(yīng)的噴射器正下方。將液體培養(yǎng)基供給到第一階段，并且僅僅通過液壓頭轉(zhuǎn)移穿過生物反應(yīng)器階段的系統(tǒng)。使用最終階段或第六階段來使用在高程上可調(diào)的液體分支點控制整個系統(tǒng)中的反應(yīng)器液位。每一個階段都裝備有獨立的定量化學(xué)品管線和溫度控制。除了最后兩個階段(即第五階段和第六階段)之外，所述階段還裝備有ph值測量和控制系統(tǒng)。

實施例2

初始試用操作

初始操作被設(shè)計成測試多階段生物反應(yīng)器系統(tǒng)在含有自產(chǎn)乙醇梭菌的細(xì)菌培養(yǎng)基存在下，將氣態(tài)含co基質(zhì)中的co生物轉(zhuǎn)化成乙醇和其它代謝產(chǎn)物的有效性。使用如實施例1中所述的測試裝備的簡化型式，它沒有頂部空間噴頭，即連續(xù)氣相區(qū)域是開管。也不使用任何噴射器，即將氣體經(jīng)由開放的3mm內(nèi)徑的管引入連續(xù)液相區(qū)域中。沒有對第五階段和第六階段的生物反應(yīng)器的溫度控制，并且使用簡單的溢流液體系統(tǒng)(共用的氣體出口)來維持液位控制。基于從第六階段的生物反應(yīng)器中抽出的最終階段液體產(chǎn)物，生物轉(zhuǎn)化操作在2周內(nèi)實現(xiàn)了穩(wěn)定的細(xì)菌生長，最終達(dá)到>43克/升的乙醇產(chǎn)量的操作點，而乙酸鹽產(chǎn)量<2克/升。穩(wěn)定階段稀釋率、或液體培養(yǎng)基的添加量是每分鐘約2.5毫升(或每一個生物反應(yīng)器每天約2.3倍反應(yīng)器容積)。這些結(jié)果驗證了用于溢流液位控制的系統(tǒng)，盡管觀測到一些質(zhì)量傳遞產(chǎn)生表面活性劑在塔頂液位中從初始生物反應(yīng)器階段中被去除，從而減少了質(zhì)量傳遞。

實施例3

基于流體動力學(xué)觀測的改動操作

在第二次操作中，進(jìn)行改動以得到基本上如實施例1中所述的測試裝備。這些改動是基于實施例2中測試的流體動力學(xué)評價，包括使用附接在塔的底部處的1.5mm內(nèi)徑的不銹鋼管在階段之間建立“僅液體”連接。該直徑被確定為小到足以防止在培養(yǎng)基添加的操作速率(稀釋率)下發(fā)生回混。鑒于反應(yīng)器的底部處的這些液體連接，添加用于離開第六生物反應(yīng)器的最終階段液體產(chǎn)物的可調(diào)高度出口以在整個系統(tǒng)中進(jìn)行液位控制。此外，將全錐形頂部空間噴頭添加到所有的生物反應(yīng)器中以進(jìn)行液體分配，并且在最后兩個反應(yīng)器階段的外部液體再循環(huán)回路上添加溫度控制系統(tǒng)。為六個生物反應(yīng)器中的每一個提供單獨的氣體排放，而不是如實施例2中所述，具有組合的含有未利用的co的氣態(tài)產(chǎn)物。

以穩(wěn)定操作進(jìn)行實施例2中所述的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的48天測試。在連續(xù)條件下，生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量都是非常有利的。舉例來說，在10天的時間內(nèi)，穩(wěn)態(tài)操作參數(shù)(例如壓力、溫度、流速、ph值等)實現(xiàn)平均大于61克/升的最終階段液體產(chǎn)物乙醇滴度和平均僅0.6克/升的乙酸鹽(乙酸)滴度(約100:1w/w的乙醇/乙酸比率或更大)。2,3-丁二醇滴度平均為8.4克/升。這些結(jié)果是用每分鐘約2.5毫升的液體培養(yǎng)基添加量(或每一個生物反應(yīng)器每天約2.3倍反應(yīng)器容積的稀釋率)實現(xiàn)的。重要的是，在33天的連續(xù)操作期間，乙醇滴度始終高于50克/升，其中有3天達(dá)到高于70克/升的驚人高的滴度，并且甚至在操作期間，峰值滴度是76克/升。當(dāng)增加向第二生物反應(yīng)器階段、第三生物反應(yīng)器階段、以及第四生物反應(yīng)器階段的培養(yǎng)基添加速率以獲得最終生物反應(yīng)器中每天3.5倍反應(yīng)器容積的稀釋率時，在最終階段液體產(chǎn)物中獲得超過50克/升的乙醇。在這一長期操作期間實現(xiàn)的性能圖示于圖3中，該圖3提供了最終階段液體產(chǎn)物中乙醇和其它代謝產(chǎn)物，即乙酸和2,3-丁二醇的濃度以及微生物(生物質(zhì))濃度?；谠谶\轉(zhuǎn)23天時取出的液體產(chǎn)物樣品，每一個階段的液體產(chǎn)物的代謝產(chǎn)物譜(乙醇、乙酸、以及2,3-丁二醇濃度)圖示于圖4中。圖4具體來說示出了在連續(xù)階段獲得的快速增加的乙醇濃度，以及同時，2,3-丁二醇濃度只有非常少量的增加和乙酸鹽(乙酸)濃度的降低。來自該操作的結(jié)果包括在48天測試開始時在穩(wěn)定操作期間65％-75％的單個生物反應(yīng)器階段co利用率，它在隨后的時間段內(nèi)在實現(xiàn)更高的乙醇產(chǎn)物滴度時增加到80％-90％。這些結(jié)果表明了這一規(guī)模的塔/回路反應(yīng)器的非常高的質(zhì)量傳遞系數(shù)。

有利的是，實現(xiàn)了終產(chǎn)物乙醇的高滴度和非常穩(wěn)定的操作，這至少部分地是經(jīng)由將液體輸送管線定位在反應(yīng)器的底部處并且在反應(yīng)器頂部空間中添加液體分配器來實現(xiàn)的。這具有減少與泡沫積聚和優(yōu)先將化學(xué)添加劑從液相的頂部轉(zhuǎn)移出相關(guān)的一些缺點的作用?？傮w而言，由于在實施例2和實施例3中進(jìn)行的測試之間作出的改動，因此質(zhì)量傳遞和操作控制這兩者得到顯著提高。此外，氣液界面液位始終處在它們對應(yīng)的塔/反應(yīng)器的頂部處，并且更容易控制，無論實際的液體存量(實際液體體積)如何。因此，滯留量可以直接通過液體存量來控制，該液體存量在實施例3中所用的多階段生物反應(yīng)器系統(tǒng)的情況下進(jìn)而使用外部排放管線來調(diào)節(jié)。用于抽出最終生物反應(yīng)器階段液體產(chǎn)物的這一管線連接到可調(diào)高度虹吸截斷器，從而允許塔內(nèi)的液相被設(shè)定到任何所期望的液位。使用大約延伸到反應(yīng)器長度的頂部30％-50％的液壓頭高度(例如，標(biāo)稱40％的滯留量)獲得了特別好的結(jié)果。

基于實施例2和實施例3中所獲得的結(jié)果，如本文所述的方法和系統(tǒng)具有提高氣液質(zhì)量傳遞的非常高的潛能，而在額外的能量輸入和/或資金支出方面有相對低的要求，或甚至無要求。操作被簡化，并且可以實現(xiàn)成本節(jié)約，這例如是通過規(guī)避與至少一些膜分離系統(tǒng)和/或液位控制系統(tǒng)(和相關(guān)的流量計、泵、控制閥、以及其它儀器和設(shè)備)相關(guān)的費用來實現(xiàn)的。

總體而言，本發(fā)明的方面涉及利用如上文所述的特定蒸氣和液體流動配置的多階段生物反應(yīng)器方法，所述方法產(chǎn)生許多工藝優(yōu)勢，特別是在實現(xiàn)所期望的終產(chǎn)物的高生產(chǎn)率聯(lián)同相關(guān)系統(tǒng)的制造的簡單性方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員在擁有從本公開獲得的知識的情況下將認(rèn)識到可以作出各種改變而不脫離本發(fā)明的范圍。