相關申請為2014年5月28日遞交的US62/004,142非臨時申請，出于所有目的，該申請的全部內容通過引用并入本申請中。序列表的引用序列表命名為446849SEQLIST.txt，共有16618字節(jié)，創(chuàng)建于2014年5月28日，該序列表通過引用并入本申請中。
背景技術：
：TAT-NR2B9c(也稱為NA-1)是一種抑制PSD-95的試劑，從而破壞PSD-95與N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDARs)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)的結合，以及降低由腦缺血誘發(fā)的興奮毒性。治療可減少梗塞體積和功能缺失。TAT-NR2B9c已成功通過II期試驗(參見WO2010144721和Aarts等,Science298,846-850(2002)；Hill等,LancetNeurol,11:942-950(2012))。由于TAT-NR2B9c無嚴重的副作用，在疑似中風或其他缺血性或出血性狀況但還尚未根據(jù)本領域已認可的標準作出確認不存在出血的診斷時可以施用TAT-NR2B9c。例如，TAT-NR2B9c可在中風或神經(jīng)創(chuàng)傷發(fā)生地點(比如患者家中)被施用或在運送受試者去往醫(yī)院的救護車上被施用。TAT-NR2B9c之前已經(jīng)被描述為生理鹽水的液體組合物、磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的凍干組合物(WO2010144721)。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種肽的氯鹽，所述肽是TAT-NR2B9c(SEQIDNO:6)，或與TAT-NR2B9c相比至多有5個氨基酸替換、插入或缺失，或是本文中作為活性劑公開的任何其他肽。所述氯鹽可以通過在TAT-NR2B9c的三氟醋酸鹽中將三氟醋酸鹽交換為氯而制備。所述氯鹽也可以通過先將起始TAT-NR2B9c的三氟醋酸鹽中的三氟醋酸鹽交換為醋酸鹽，然后將醋酸鹽交換為氯鹽而制備?？蛇x的，所述鹽中大于99％的陰離子是氯。本發(fā)明進一步提供了包含如上所述的氯鹽、緩沖劑和糖的預凍干制劑(prelyophilizedformulation)?？蛇x地，所述氯鹽是TAT-NR2B9c的氯鹽?？蛇x地，所述緩沖劑是組氨酸，所述糖是海藻糖，其pH為6-7?？蛇x地，在制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于1％的陰離子。可選地，在制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于0.1％的陰離子。可選地，所述肽的氯鹽的濃度為70-120mg/ml，所述組氨酸的濃度為15-100mM，以及所述海藻糖的濃度為80-160mM?？蛇x地，所述肽的氯鹽的濃度為70-120mg/ml，所述組氨酸的濃度為20-100mM，以及所述海藻糖的濃度為100-140mM?？蛇x地，所述TAT-NR2B9c的濃度為70-120mg/ml，所述組氨酸的濃度為20-50mM，以及所述海藻糖的濃度為100-140mM。可選地，所述組氨酸的濃度為20mM，所述海藻糖的濃度為100-200mM，優(yōu)選為120mM，所述TAT-NR2B9c的濃度為90mg/ml。本發(fā)明進一步提供了一種凍干制劑，其通過將任一上述預凍干制劑凍干而制備。可選地，在制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于1％的陰離子?？蛇x地，在制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于0.1％的陰離子。本發(fā)明進一步提供了一種復原制劑(reconstitutedformulation)，所述復原制劑通過將上述任一凍干制劑和水溶液結合而制備?？蛇x地，所述水溶液為水或生理鹽水?？蛇x地，所述復原制劑的體積是所述預凍干制劑的體積的3-6倍。本發(fā)明進一步提供了一種復原制劑，所述復原制劑包含濃度為15-25mg/ml的TAT-NR2B9c或本文所述的其他活性劑，緩沖劑和糖?？蛇x地，所述緩沖劑是濃度為4-20mM的組氨酸，所述糖是濃度為20-30mM的海藻糖，其pH為6-7?？蛇x地，在如權利要求19所述的復原制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于1％的陰離子。可選地，在制劑中，醋酸鹽和三氟醋酸鹽各自包含重量百分比少于0.1％的陰離子。本發(fā)明進一步提供了一種制備制劑的方法，該方法包括：在至少為20℃的室溫下將上述的凍干制劑樣品儲存至少一周；以及復原所述凍干制劑?？蛇x地，所述方法還包括給患者施用所述復原制劑，可選地，所述復原制劑在生理鹽水中進一步稀釋后施用?？蛇x地，所述制劑儲存至少一年?？蛇x地，所述制劑儲存在室溫下。可選地，儲存包括溫度超過37℃的時期。在某些方法中，所述患者患有中風或CNS創(chuàng)傷。在某些方法中，所述凍干樣品被儲存在救護車上。在某些方法中，所述患者患有蛛網(wǎng)膜下腔出血。在某些方法中，所述患者正在接受動脈瘤腔內修復術。附圖說明圖1：該圖顯示了3PVO中風后經(jīng)不同的TAT-NR2B9c制劑治療后的大鼠的腦梗塞面積。圖2A,B：A)柱狀圖顯示了不同的TAT-NR2B9c制劑在-20℃和40℃下的穩(wěn)定性。Y軸表示在儲存溫度下儲存一周后的TAT-NR2B9c的純度，該純度使用RP-HPLC測定，以總面積％表示。B)與A相同的數(shù)據(jù)，但按緩沖液和pH歸類。圖3：該柱狀圖顯示了在不同的填充劑和鹽的存在下，在pH6.5的組氨酸緩沖液中的20mg/mlTAT-NR2B9c在-20℃和40℃下的穩(wěn)定性(通過HPLC測定)。圖4A,B：在甘露醇(A)或甘露醇和NaCl(B)的存在下，在pH6.5的組氨酸緩沖液中的20mg/mlTAT-NR2B9c的差示掃描量熱法(Differentialscanningcalorimetry)分析圖。圖5A,B：在海藻糖(A)或海藻糖和NaCl(B)的存在下，在pH6.5的組氨酸緩沖液中的20mg/mlTAT-NR2B9c的差示掃描量熱法分析圖。圖6A,B：在右旋糖酐-40(A)或右旋糖酐-40和NaCl(B)的存在下，在pH6.5的組氨酸緩沖液中的20mg/mlTAT-NR2B9c的差示掃描量熱法分析圖。圖7A,B：A)3mL在pH為6.5的100mM組氨酸和120mM海藻糖中的90mg/mlTAT-NR2B9c凍干后的蛋糕狀外觀。B)具有不同含量的組氨酸和海藻糖的選擇性的TAT-NR2B9c制劑的蛋糕狀外觀。定義除了活性成分，凍干制劑還包括一種或多種下列種類的成分。所述種類不是相互排斥的，換句話說，相同的試劑成分可能屬于多個種類?！疤畛鋭睘閮龈呻奶峁┝私Y構。所述填充劑包括：甘露醇、海藻糖、右旋糖酐-40、甘氨酸、乳糖、山梨醇和蔗糖等。除了提供藥物上美觀的蛋糕狀，填充劑也會在改善(蛋糕狀)塌陷溫度，提供凍干保護、玻璃化轉變溫度以及增強蛋白長期儲存穩(wěn)定性方面提供有益的效果。這些試劑也可用作滲透壓調節(jié)劑(tonicitymodifiers)。緩沖劑是一種在凍干前將溶液pH維持在可接受的范圍內的試劑。優(yōu)選的緩沖劑為組氨酸。其它的緩沖劑包括琥珀酸鹽(鈉或鉀)，組氨酸，檸檬酸鹽(鈉)，葡糖酸鹽，醋酸鹽，磷酸鹽，Tris等。優(yōu)選的緩沖劑在約5.5至7或約6至7.7的pH范圍內有效，優(yōu)選pH為約6.5。將pH控制在該范圍內的緩沖劑實例包括琥珀酸鹽(比如琥珀酸鈉)、葡糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽和其它的有機酸緩沖液?！袄鋬霰Ｗo劑(cryoprotectant)”為肽提供穩(wěn)定性以抵擋冷凍誘導的應力，推測應力是從蛋白表面優(yōu)先排除的。該試劑也可在初級和次級干燥期間及產(chǎn)品長期儲存期間內提供保護。冷凍保護劑的實例為：聚合物，例如右旋糖酐和聚乙二醇；糖類(包括糖醇)，例如蔗糖、海藻糖和乳糖；表面活性劑，例如聚山梨醇酯；以及氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸和絲氨酸。在干燥或脫水過程(初級和次級干燥周期)中，凍干保護劑(lyoprotectant)為肽提供了穩(wěn)定性，推測是通過提供無定形的玻璃狀基質，以及通過氫鍵與蛋白結合，取代干燥過程中被除去的水分子而提供穩(wěn)定性的。這有助于維持肽的構象，使肽在凍干周期的降解最小化，提高產(chǎn)品的長期穩(wěn)定性。實例包括多元醇或糖，例如蔗糖和海藻糖。上文中尚未提到的是，其它的穩(wěn)定劑或降解抑制劑也可包括脫酰胺作用抑制劑、表面活性劑，一些常見的為聚乙氧基失水山梨醇(sorbitanpolyethoxylates)脂肪酸酯(例如：聚山梨酯20或聚山梨酯80)/泊咯沙姆188和洗滌劑。術語“凍干(lyophilization)”、“凍干的(lyophilized)”和“冷凍干(freeze-dried)”涉及一種工藝，通過該工藝，待干燥的原料先被冷凍，然后在真空環(huán)境下通過升華而去除冰或凍結的溶劑?！八幬镏苿?pharmaceuticalformulation)”或組合物為一種制劑，該制劑使得活性試劑有效，而且沒有對將要被施用該制劑的受試者有毒的附加組分?！皬驮瓡r間(Reconstitutiontime)”是用溶液將凍干制劑再水化為肉眼看不到微粒的溶液所需的時間?！胺€(wěn)定的”凍干肽制劑是在20℃下觀察至少1個星期、1個月，或者更優(yōu)選為至少3個月、至少6個月或一年而無顯著變化的制劑。如果通過SEC-HPLC測定，不超過10％、優(yōu)選為不超過5％的肽被分解，則認為變化不顯著。通過視覺分析，上述再水化的溶液是無色的或清澈的至呈淡淡的乳白色。所述制劑的濃度、pH以及滲透壓在儲存后的變化不超過+/-10％。(制劑的)效力為新近制備的對照樣品的70-130％，優(yōu)選為80-120％，或有時為80-100％的范圍之內。可觀察到不超過10％，優(yōu)選為不超過5％的碎屑。形成了不超過10％，優(yōu)選為不超過5％的聚集物(aggregation)。可通過在PeptideandProteinDrugDelivery,247-301,VincentLeeEd.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,N.Y.,Pubs.(1991)以及Jones,A.Adv.DrugDeliveryRev.10:29-90(1993)中討論的多種方法來測定穩(wěn)定性。術語“等滲(isotonic)”是指目標制劑與人體血液具有基本相同的滲透壓。等滲制劑通常具有約270-328mOsm的滲透壓。稍低滲壓為250-269mOsm，稍高滲壓為328-350mOsm。滲透壓可以測量，例如，使用蒸汽壓滲壓計或冰凍型滲壓計(ice-freezingtypeosmometer)。滲透壓調節(jié)劑：鹽(NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2)可用作滲透壓調節(jié)劑從而調控滲透壓。此外，冷凍保護劑/凍干保護劑和/或填充劑也可用作滲透壓調節(jié)劑，例如，蔗糖、甘露醇或甘氨酸。例如濃度或pH的數(shù)值在反應測量該值時的精確度的誤差范圍內給出。除非文中另有要求，部分數(shù)值舍入至最接近的整數(shù)。除非文中另有要求，數(shù)值范圍的表述意味著可使用該范圍內的任何整數(shù)或子范圍。術語“疾病”和“狀況”使用時含義相同，指對象中的正常結構或功能的任何破壞或中斷。具體實施方式I.概述通過固相法合成的肽通常以三氟醋酸鹽的形式產(chǎn)生，因為三氟醋酸(TFA)用于肽的去保護和/或將肽從樹脂上脫下來。為了藥用，三氟醋酸鹽通常被相對離子醋酸鹽取代，因為醋酸鹽是無毒的，用醋酸鹽取代三氟醋酸鹽很簡單。到目前為止，合成的TAT-NR2B9c肽的例子在WO2010144721或PCT/US2013/071755和其他地方有描述。醋酸鹽是優(yōu)選的藥用肽的平衡離子，因為在固相法合成的肽的典型的純化過程進行很小的改變即可使得三氟醋酸鹽被醋酸鹽交換，在純化過程中，最后的洗滌用醋酸代替三氟醋酸進行，隨后用乙腈洗脫。偶爾也使用其他的平衡離子。例如，氯有時用于不溶性肽，因為它可以提高這些肽的溶解度。然而，三氟醋酸鹽或醋酸鹽轉換成氯鹽會導致?lián)p失一些肽。此外，據(jù)報道，氯交換而導致的HCl的存在會改變某些肽的結構，降低某些肽的熱穩(wěn)定性(Biochemistry，第5版，Berg等人主編,Freeman；2002)；JPeptSci.2007Jan；13(1):37-43)。以醋酸鹽存在的TAT-NR2B9c已經(jīng)是高度可溶的肽。因此，用氯取代三氟醋酸鹽或醋酸鹽看起來具有降低產(chǎn)量和可能降低穩(wěn)定性的缺點，且沒有任何補償性的益處。令人吃驚的是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在凍干形式中TAT-NR2B9c的氯鹽具有遠高于相同制劑的TAT-NR2B9c的醋酸鹽或由鹽凍干的TAT-NR2B9c的醋酸鹽的穩(wěn)定性。即使在室溫達到甚至超過37℃的夏季儲存數(shù)年，氯鹽依然可以保持足夠臨床使用的穩(wěn)定性。氯鹽遠超于醋酸鹽的穩(wěn)定性足以彌補替換三氟醋酸鹽所作出的任何努力或下降了的產(chǎn)量。本發(fā)明提供了一種活性劑，尤其是TAT-NR2B9c氯鹽的凍干制劑。該凍干制劑在室溫(例如，至少20℃)下非常穩(wěn)定，因此有助于維持制劑在救護車或者類似地點的供應，或有助于應急人員在疾病或事故現(xiàn)場或在此類現(xiàn)場與醫(yī)院的途中給藥。凍干制劑由預凍干制劑制備而來，所述預凍干制劑包含活性試劑、緩沖劑、填充劑和水。其他的組分，例如，低溫保護劑或凍干保護劑，張度劑(tonicityagent)、藥學上可接受的載體等可能存在也可能不存在。優(yōu)選的活性試劑為TAT-NR2B9c的氯鹽。優(yōu)選的緩沖劑為組氨酸。優(yōu)選的填充劑為海藻糖。海藻糖還可以作為低溫或凍干保護劑。預凍干制劑的示范例包含活性試劑(例如，TAT-NR2B9c的氯鹽)、組氨酸(10-100mM、15-100mM、15-80mM、40-60mM或15-60mM，如20mM，或可選為50mM或20-50mM)和海藻糖(50-200mM，優(yōu)選為80-160mM、100-140mM，更優(yōu)選為120mM)。pH為5.5-7.5，較優(yōu)選為6-7，更優(yōu)選為6.5。所述活性試劑(例如，TAT-NR2B9c的氯鹽)的濃度為20-200mg/ml，優(yōu)選為50-150mg/ml，更優(yōu)選為70-120mg/ml或90mg/ml。由此，預凍干制劑的示范例為20mM組氨酸、120mM海藻糖和90mg/mlTAT-NR2B9c的氯鹽?？蛇x地，乙?；宄齽?，例如，賴氨酸也可以被包括在內(如共同申請057769-446850中所述)，以進一步減少制劑中任何殘留的醋酸鹽或三氟醋酸鹽。凍干后，凍干制劑含水量低，按重量計，優(yōu)選含有大約0％-5％的水，更優(yōu)選為含有低于2.5％的水。凍干制劑可在冷凍箱中(例如，-20或-70℃)、冰箱中(0-4℃)或室溫下儲存(20-25℃)。將活性試劑在水溶液中復原，所述水溶液優(yōu)選為注射用水或可選為生理鹽水(0.8-1.0％生理鹽水，優(yōu)選為0.9％生理鹽水)。復原液可與預凍干制劑的體積相同，或者小于或大于預凍干制劑的體積。優(yōu)選地，復原之后的體積大于之前的體積(例如，大3-6倍)。舉例來說，3-5ml的預凍干制劑可復原為10ml、12ml、13.5ml、15ml，或20ml，或10ml-20ml之間的其他值。復原之后，組氨酸的濃度優(yōu)選為2-20mM，例如2-7mM、4.0-6.5mM、4.5mM或6mM；海藻糖的濃度優(yōu)選為15-45mM或20-40mM或25-27mM或35-37mM。速搜賴氨酸的濃度優(yōu)選為100-300mM，例如，150-250mM或150-170mM或210-220mM。所述活性試劑的濃度優(yōu)選為10-30mg/ml，例如，活性試劑(如TAT-NR2B9c)的濃度為15-30mg/ml、18-20mg/ml或20mg/ml，或活性試劑的濃度為25-30mg/ml、26-28mg/ml或27mg/ml。復原之后的示范例制劑含有4-5mM組氨酸、26-27mM海藻糖、150-170mM賴氨酸和20mg/mlTAT-NR2B9c(濃度舍入至最接近的整數(shù))。復原之后的第二個示范例制劑含有5-7mM組氨酸、35-37mM海藻糖、210-220mM賴氨酸和26-28mg/mlTAT-NR2B9c(濃度舍入至最接近的整數(shù))。所述復原制劑在施用前可作進一步稀釋，例如將其加入到含有靜脈輸液用的生理鹽水的液體袋中。“含有”或“包括”(或類似的術語)特定組分的制劑的任何描述應該被理解為可選擇性地或額外描述一種由那些特定組分構成或基本由那些特定組分構成的制劑。例如，在MethodsinEnzymology,Vol.22,Pages33-39,AcademicPress,NewYork(1971)以及Freeze-Drying,E.W.Flosdorf,Rheinhold,NewYork(1949)中闡述了冷凍干燥的方法。TAT-NR2B9c優(yōu)選地在與其復原時使用的同一個小瓶中被凍干。將TAT-NR2B9c的水溶液加入小瓶中，水溶液可選為經(jīng)消毒的過濾系統(tǒng)(如標準用于肽的0.22微米過濾器)過濾之后加入小瓶中。制劑可在控制周期內進行凍干，例如實施例中所描述的。預凍干制劑可放置在小瓶中，然后在降低的溫度和壓強下進行凍干。凍干后，將小瓶密封。用注射用水、生理鹽水或其它藥學上可接受的載體或稀釋劑將凍干產(chǎn)物復原，以供使用。多種容器可適用于凍干。當所述容器被密封且儲存在半真空下時，該容器需能夠承受外部壓強。所述容器應由可使熱量由外向內合理轉換的材料制成。根據(jù)當下普遍的容器容積USP推薦規(guī)范，所述容器的大小應該使得即將被凍干的溶液占據(jù)不超過20％的有效容積，或被過量的溶液裝滿。例如，0.5ml的溶液可裝在3ml的小瓶中。所述小瓶可由玻璃(如：硼硅玻璃)或塑料(如：聚丙烯)制成。可以使用通常用于凍干生物材料的玻璃瓶。其他適用的的容器為具有兩個腔室的注射器，其中一個腔室包含凍干的蛋糕狀TAT-NR2B9c肽，另一個腔室包含水性稀釋劑。完成凍干后，通過帶有惰性氣體的填充系統(tǒng)將小瓶或安瓿瓶抽成真空，使用標準設備原位加塞，之后壓緊密封(crimpsealed)。該種方法保證了最終產(chǎn)品無菌。也可采用其它“兩部分(two-part)”的解決方案，比如一種袋子，其在凍干藥物腔室和稀釋劑之間具有易破開的封膜。I.活性試劑盡管出于示范的目的許多描述是指活性試劑TAT-NR2B9c，以下描述的其他活性試劑也可以被制備成氯鹽，或根據(jù)針對TAT-NR2B9c所描述的原理進行制劑。針對TAT-NR2B9c所給出的特定濃度也可以適用于其他試劑，或轉換成其他試劑和TAT-NR2B9c的摩爾當量濃度?；钚栽噭┩ㄟ^與PSD-95結合而抑制PSD-95與一種或多種NMDARs(例如，2A、2B、2C或2D)或nNOS(例如，Swiss-ProtP29475)之間的相互作用。此類試劑可以用于減輕至少部分由NMDAR興奮性神經(jīng)毒性介導的中風和其它神經(jīng)病學狀況的損傷效應。這樣的試劑包括肽，所述肽具有包含或基于NMDA受體的PL基序或PSD95的PDZ結構域的氨基酸序列。這樣的肽也可以抑制PSD-95和nNOS以及其它谷氨酸受體(例如，鉀鹽鎂礬(kainite)受體或AMPA受體)，例如KV1.4和GluR6，之間的相互作用。優(yōu)選的肽抑制突觸后密度-95蛋白(PSD-95)的PDZ結構域1和2(人氨基酸序列由Stathakism提供，Genomics44(1)：71-82(1997))與一或多種NMDA受體2亞基的C末端PL序列之間的相互作用，所述NMDA受體2亞基包括神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸受體的NR2B亞基(Mandich等，Genomics22，216-8(1994))。NMDAR2B的GenBankID為4099612，其具有C末端20個氨基酸FNGSSNGHVYEKLSSIESDV(SEQIDNO：11)和PL基序ESDV(SEQIDNO：12)。優(yōu)選的肽抑制人PSD-95和人NMDAR受體。然而，對于這些蛋白質的物種變體，也能夠顯示出抑制作用?？梢允褂玫腘MDA和谷氨酸受體的列表顯示如下：具有PL序列的NMDA受體肽可以包括或基于來自任何以上亞基的C末端的PL基序，并具有包含[S/T]-X-[V/L]的氨基酸序列。該序列優(yōu)選存在于本發(fā)明的肽的C末端。優(yōu)選的肽具有在其C末端包含[E/D/N/Q]-[S/T]-[D/E/Q/N]-[V/L](SEQIDNO：38)的氨基酸序列。示例性肽包括作為C末端氨基酸的ESDV(SEQIDNO：12)，ESEV(SEQIDNO：29)，ETDV(SEQIDNO：39)，ETEV(SEQIDNO：40)，DTDV(SEQIDNO：41)和DTEV(SEQIDNO：42)。兩個特別優(yōu)選的肽是KLSSIESDV(SEQIDNO：5)和KLSSIETDV(SEQIDNO：43)。這樣的肽通常具有3-25個氨基酸(在沒有內化肽的情況下)，優(yōu)選的肽長度為5-10個氨基酸，特別是9個氨基酸(也在沒有內化肽的情況下)。在一些這樣的肽中，所有的氨基酸都來自NMDA受體的C末端(不包括來自內化肽的氨基酸)。本發(fā)明中的肽和擬肽可包括修飾的氨基酸殘基，例如，N-烷基化的殘基。N-端烷基化修飾可包括，例如，N-甲基、N-乙基、N-丙基、N-丁基、N-環(huán)己基甲基、N-環(huán)己基乙基、N-芐基、N-苯乙基、N-苯丙基、N-(3,4-二氯苯基)丙基、N-(3,4-二氟苯基)丙基和N-(萘-2-基)乙基。Bach,J.Med.Chem.51,6450-6459(2008)和WO2010/004003中描述了一系列NR2B9c(SEQIDNO:6)的類似物。具有僅3個C末端氨基酸(SDV)的肽顯示出PDZ結合活性。Bach同時報道了具有包含X1tSX2V(SEQIDNO:68)或由X1tSX2V(SEQIDNO:68)組成的氨基酸序列的類似物，其中t和S為可替代的氨基酸，X1選自E、Q和A或它們的類似物，X2選自A、Q、D、N、N-Me-A、N-Me-Q、N-Me-D和N-Me-N或它們的類似物?？蛇x地，所述肽在P3位置(從C-末端數(shù)起的第三個氨基酸，即由tS占據(jù)的位置)被N-烷基化。所述肽可以被環(huán)己烷或芳香族取代基N-烷基化，并進一步地在取代基和肽或肽類似物的末端氨基之間包含間隔基團，其中間隔基團為烷基，優(yōu)選地選自亞甲基、亞乙基、亞丙基和亞丁基。所述芳香族取代基可以是萘-2-基基團，或者被一個或兩個鹵素原子和/或烷基取代的芳環(huán)。還可能包括對活性無不利影響的其它修飾，這些修飾包括以D異構體形式的氨基酸替代一個或多個天然L異構體形式的氨基酸。因此，任何天然以L異構體形式存在的氨基酸(根據(jù)該化學實體的結構，其也可以被稱為R或S)均可以被手性相反但化學結構類型相同的氨基酸或肽模擬物(通常被稱為D型氨基酸，但可以另外被稱為R或S型)替代。因此，擬肽可能包括1、2、3、4、5個或至少50％的D-氨基酸殘基，或全部為D-氨基酸殘基。包括一部分D殘基或全部為D殘基的擬肽有時被稱作“反向(inverso)”肽。擬肽也包括逆向(retro)肽。逆向肽具有逆向的氨基酸序列。擬肽還包括逆向反向(retroinverso)肽，其氨基酸順序是反向的，因此原始的C-端氨基酸出現(xiàn)在N末端，且用D-氨基酸取代L-氨基酸。WO2008/014917描述了TAT-NR2B9c的逆向反向類似物，所述逆向反向類似物具有氨基酸序列vdseisslk-rrrqrrkkrgyin(SEQIDNO:69)(小寫字母表示D氨基酸)，并報道了其可有效地抑制腦缺血。本文中所描述的另一種有效的肽為Rv-TAT-NR2B9c(RRRQRRKKRGYKLSSIESDV；SEQIDNO:70)。連接體(linker)，例如，聚乙二醇連接體，可用來二聚化所述肽或所述擬肽的活性部分，從而增強它對包含串聯(lián)PDZ結構域的蛋白的親和力以及選擇性。參見：例如，Bachetal.,(2009)Angew.Chem.Int.Ed.48:9685-9689和WO2010/004003。包含PL基序的肽優(yōu)先通過連接兩個這樣的分子N-端而被二聚化，而使C末端處于游離狀態(tài)。Bach進一步報道了五聚體肽IESDV(SEQIDNO:71)可有效抑制NMDAR2B與PSD-95的結合，所述五聚體肽來自NMDAR2B的C-末端。IETDV(SEQIDNO:73)可用來代替IESDV。可選地，可串聯(lián)加入大約2-10個拷貝的PEG(聚乙二醇)作為連接體?？蛇x地，所述連接體也可以附著于內化肽上或被脂化以增強細胞攝取。說明性的二聚體抑制劑實例如下所示(參見：Bach等，PNAS109(2012)3317-3322)。本文公開的任何PSD-95抑制劑都可以代替IETDV，且任何內化肽或脂化部分都可用來代替tat。也可以使用所示出的其它連接體。IETAV為SEQIDNO:26，YGRKKRRQRRR為SEQIDNO:2，rrrqrrkkr,為SEQIDNO:10，小寫字母表示D-氨基酸。如果需要的話，在以本申請描述的靈長類動物和臨床試驗進行測試之前，可以使用以前描述的大鼠中風模型來確認肽、肽模擬物或其它試劑的適當?shù)乃幚韺W活性。也可以使用描述于例如US20050059597(通過引入而并入本文)中的分析方法，對肽或肽模擬物抑制PSD-95和NMDAR2B之間相互作用的能力進行篩選。在這樣的分析中，可用的肽通常具有不超過50μM，25μM，10μM，0.1μM或0.01μM的IC50值。優(yōu)選的肽通常具有介于0.001至1μM之間的IC50值，更優(yōu)選地為0.05至0.5或0.05至0.1μM。當肽或其它試劑被表征為抑制一種相互作用(例如，PSD-95與NMDAR2B之間的相互作用)的結合時，這樣的描述不排除該肽或試劑也抑制另外的相互作用，例如抑制PSD-95與nNOS的結合?？梢匀芜x地對肽，例如，剛才所描述的肽進行衍生化(例如，乙酰化、磷酸化、豆蔻?；?、香葉基化(geranylated)、聚乙二醇化和/或糖基化)，以提高該抑制劑的結合親和力、提高抑制劑跨細胞膜運輸?shù)哪芰蛱岣叻€(wěn)定性。作為具體的實例，對于其中自C末端起第3個殘基為S或T的抑制劑，在使用該肽之前，該殘基可以被磷酸化。藥劑可被連接到內化肽上，從而促進細胞攝取和/或穿越血大腦屏障。眾所周知，內化肽是一類相對較短的肽，其可以使許多細胞的或病毒的蛋白質穿過膜。內化肽(也被稱為細胞膜轉導肽或細胞穿透肽)可以具有，例如，5-30個氨基酸。這樣的肽通常具有陽離子電荷，所述陽離子電荷來自高于正常值(相對于普通蛋白質)的精氨酸和/或賴氨酸殘基，這被認為可以促進穿膜。一些這樣的肽具有至少5，6，7或8個精氨酸和/或賴氨酸殘基。其實例包括觸角足蛋白(Bonfanti，CancerRes.57，1442-6(1997))(及其變體)、人類免疫缺陷病毒的tat蛋白、VP22蛋白(單純皰疹病毒1型的UL49基因的產(chǎn)物)、穿透素(Penetratin)、SynB1和3、轉運素(Transportan)、兩性分子(Amphipathic)、gp41NLS、聚精氨酸以及幾種植物和細菌蛋白質毒素，例如蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴蓮根毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、炭疽毒素、熱不穩(wěn)定毒素和綠膿假單胞菌外毒素A(ETA)。下列參考文獻以及附錄中(皆通過引用并入本文)描述了其它的例子，參見：Temsamani,DrugDiscoveryToday,9(23):1012-1019,2004；DeCoupade,BiochemJ.,390:407-418,2005；SaalikBioconjugateChem.15:1246-1253,2004；Zhao,MedicinalResearchReviews24(1):1-12,2004；Deshayes,CellularandMolecularLifeSciences62:1839-49,2005)；Gao,ACSChem.Biol.2011,6,484-491,SG3(RLSGMNEVLSFRWL(SEQIDNO:9)；StalmansPLoSONE2013,8(8)e71752,1-11；Figueiredoetal.,IUBMBLife66,182-194(2014)；Copolovicietal.,ACSNano,8,1972-94(2014)；LukanowskiBiotechJ.8,918-930(2013)；Stockwell,Chem.Biol.DrugDes.83,507-520(2014)；Stanzletal.Accounts.Chem.Res/46,2944-2954(2013)。優(yōu)選的內化肽為來自HIV病毒的tat。在以前的工作中報道的tat肽包含在HIVTat蛋白中發(fā)現(xiàn)的標準氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQIDNO：2)或由其組成。如果在這樣的tat基序的側翼存在額外的殘基(除了該藥劑以外)，這些殘基可以為例如來自tat蛋白的位于該片段側翼的天然氨基酸；或為典型地用來連接兩個肽結構域的間隔區(qū)或連接體氨基酸，例如gly(ser)4(SEQIDNO:44)，TGEKP(SEQIDNO:45)，GGRRGGGS(SEQIDNO:46)或LRQRDGERP(SEQIDNO:47)(參見：例如，Tang等(1996),J.Biol.Chem.271,15682-15686；Hennecke等(1998),ProteinEng.11,405-410))；或可以為不顯著降低在無側翼殘基的情況下賦予變體的攝取能力的任何其它氨基酸。優(yōu)選地，在YGRKKRRQRRR(SEQIDNO：2)的任一側，除了活性肽以外的側翼氨基酸的數(shù)量不超過10個。一個包含位于YGRKKRRQRRR(SEQIDNO：2)C末端側翼的額外氨基酸殘基的合適tat肽為YGRKKRRQRRRPQ(SEQIDNO：48)。然而，優(yōu)選地，不存在側翼氨基酸。其它可以利用的tat肽包括GRKKRRQRRRPQ(SEQIDNO：4)和GRKKRRQRRRP(SEQIDNO：72)。WO/2008/109010中描述了與N型鈣通道結合能力減弱的以上tat肽的變體。這樣的變體可以包含氨基酸序列XGRKKRRQRRR(SEQIDNO：49)或由其組成，其中X為除了Y以外的氨基酸、或為空缺(在此情況下，G為游離的N末端殘基)。優(yōu)選的tat肽的N末端Y殘基被F替換。因此，優(yōu)選包含F(xiàn)GRKKRRQRRR(SEQIDNO：3)或由其組成的tat肽。另一個優(yōu)選的變體tat肽由GRKKRRQRRR(SEQIDNO：1)組成。另一個優(yōu)選的tat肽包含RRRQRRKKRG或RRRQRRKKRGY(SEQIDNO:70的第1-11或1-10位氨基酸)或由其組成。促進藥劑的吸收而不抑制N型鈣通道的其它tat衍生肽包括列于以下表中的那些肽。X可以表示游離的氨基末端、一個或多個氨基酸或綴合的部分。可以以反向或逆向或逆向向的形式使用內化肽，其中連接的肽或肽模擬物是或不是這樣的形式。例如，優(yōu)選的嵌合肽具有包括YGRKKRRQRRR-KLSSIESDV(SEQIDNO:6，又名TAT-NR2B9c或TAT-NR2B9c)或YGRKKRRQRRR-KLSSIETDV(SEQIDNO:7)或由該序列組成的氨基酸序列。其他優(yōu)選的嵌合肽跟SEQIDNO:6或NO:7相比具有至多5個氨基酸替換、缺失或添加(在內部或末端)。其它優(yōu)選肽包括RRRQRRKKRGY-KLSSIESDV(SEQIDNO:70，又名RvTAT-NR2B9c，或者具有包括RRRQRRKKRGYKLSSIETDV(SEQIDNO:37)或由該序列組成的氨基酸序列)?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法將內化肽連接到藥劑上。例如，可以通過化學連接(例如通過偶聯(lián)或綴合劑)將藥劑連接到內化肽上。許多這樣的化學試劑在市場上有售，S.S.Wong,ChemistryofProteinConjugationandCross-Linking,CRCPress(1991)中論述了這些試劑。交聯(lián)試劑的一些實例包括J-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯(SPDP)或N，N′-(1，3-亞苯基)雙馬來酰亞胺；N，N′-亞乙基-雙-(碘代乙酰胺)或其它具有6至11個碳亞甲基橋的試劑(其對巰基基團相對特異)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其與氨基和酪氨酸基團形成不可逆的連接)。其它的交聯(lián)試劑包括p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯基砜(其與氨基和酚基形成不可逆連接)；己二酰亞氨酸二甲基酯(其對氨基基團特異)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要與氨基基團起反應)；六亞甲基二異氰酸酯或二異硫氰酸酯，或偶氮苯基-p-二異硫氰酸酯(其主要與氨基基團起反應)；戊二醛(其與幾種不同的側鏈起反應)和重氮對二氨基聯(lián)苯(disdiazobenzidine)(其主要與酪氨酸和組氨酸起反應)。當藥劑為肽時，可以通過產(chǎn)生融合蛋白來實現(xiàn)與內化肽的連接，所述融合蛋白包含融合到，優(yōu)選地在其N末端融合到，內化肽的肽序列。除了將抑制PSD-95的肽(或其它試劑)與內化肽連接，抑制PSD-95的肽還可以與脂類連接(脂化(lipidation))，從而僅增加與該肽相關的綴合物的疏水性，從而促進連接肽跨越細胞膜和/或血腦屏障。脂化優(yōu)選在N末端氨基酸上進行，但也可以在內部氨基酸上進行，只要肽抑制PSD-95和NMDAR2B相互作用的能力沒有降低到50％以上。優(yōu)選地，脂化是在除了C末端最后四個氨基酸的氨基酸上進行的。脂類是溶于乙醚而不溶于水的有機分子，包括脂肪酸，甘油酯和甾醇類。合適的脂化形式包括豆蔻?；?，棕櫚?；?，或添加其它脂肪酸(優(yōu)選具有10-20個碳原子的鏈長度，例如，月桂酸和硬脂酸)以及香葉基化(geranylation)、耗牛兒基化(geranylgeranylation)和異戊二烯化。發(fā)生在天然蛋白翻譯后修飾中的脂化類型為優(yōu)選。將脂肪酸通過氨基連接到肽N末端氨基酸的α-氨基基團而實現(xiàn)的脂化同樣是優(yōu)選的。脂化也可能是通過含有預脂化(prelipidated)氨基酸的肽合成進行的(在體外酶促進行)，或通過重組表達、化學交聯(lián)或肽化學衍生進行。被豆蔻?；推渌|修飾的氨基酸可以商業(yè)獲取。脂化優(yōu)選促進聯(lián)合肽(例如，KLSSIESDV(SEQIDNO:5)或KLSSIETDV(SEQIDNO:43))穿過細胞膜和/或血腦屏障，而不引起血壓的瞬間下降，如與標準tat肽被高劑量給藥時(例如，等于或大于3mg/kg)出現(xiàn)的血壓瞬間下降情況一樣，或至少比連接到標準tat肽的相同肽引起更輕微的血壓下降。藥理學肽(可選地，與tat肽融合)可以通過固相合成或重組方法來合成。可以使用多種描述于科學和專利文獻中的程序和方法合成擬肽，這些文獻，例如，OrganicSynthesesCollectiveVolumes,Gilman等(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.,NY,al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1:114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27；Ostresh(1996)MethodsEnzymol.267:220-234。III.鹽上述類型的肽通常是由固相法合成的。由于固相法使用三氟醋酸鹽(TFA)去除保護基團或者或將肽從樹脂上脫下來，肽通常主要以三氟醋酸鹽的形式制備。三氟醋酸鹽通常被其他陰離子取代，例如，通過將肽結合到固體支撐物(例如，柱子)上，洗滌該柱子以去除現(xiàn)有的平衡離子，用含有新的平衡離子的溶液平衡該柱子，然后洗脫肽(例如，引入疏水性溶劑(例如，乙腈)到柱子上)即可使三氟醋酸鹽被其他陰離子取代。在另一種常規(guī)的固相合成法中，在肽被洗脫前的最后一個步驟上用醋酸鹽洗滌即可實現(xiàn)三氟醋酸鹽被醋酸鹽取代。用氯化銨洗滌，然后洗脫，即可實現(xiàn)三氟醋酸鹽或醋酸鹽被氯取代。優(yōu)選使用疏水性支撐物，離子交換尤其優(yōu)選反相制備型HPLC。三氟醋酸鹽可以直接被氯取代，或者先被醋酸鹽取代，然后用氯取代醋酸鹽。平衡離子，無論是三氟醋酸離子、醋酸離子還是氯離子，結合到TAT-NR2B9c帶正電的原子上，尤其是N-末端氨基酸基團和氨基側鏈精氨酸和賴氨酸殘基。盡管本發(fā)明的實踐不依賴于理解TAT-NR2B9c鹽中肽與陰離子的精確的化學計量學，相信每個鹽分子至多存在9個平衡離子分子。盡管用一種平衡離子取代另一種平衡離子能夠有效地發(fā)生，但最終的平衡離子的純度可能小于100％。因此，TAT-NR2B9c或其他活性試劑的氯鹽是指，在鹽的制備中，氯是主要的陰離子，其總體重量(或者摩爾數(shù))超過鹽中的所有其他陰離子。換句話說，以重量計或摩爾計，氯含量大于鹽中所存在的所有陰離子的50％，優(yōu)選大于75％，95％，99％，99.5％或99.9％。Ⅳ.疾病所述凍干制劑用于治療多種疾病，尤其是神經(jīng)疾病，特別是部分由興奮毒性引起的疾病。該類疾病包括中風、癲癇、低氧、蛛網(wǎng)膜下腔出血、CNS創(chuàng)傷(與中風不關聯(lián)，例如，創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷)、其它的腦缺血、阿爾茨海默病和帕金森氏病?？刹捎帽景l(fā)明藥劑治療的其它神經(jīng)性疾病包括焦慮和疼痛，其與興奮毒性是否相關尚未知。無論何種原因，中風是由CNS區(qū)域血流量受損引起的癥狀。潛在的原因包括栓塞、腦出血和血栓形成。由于血流量受損，一些神經(jīng)細胞立即死亡。這些細胞釋放包括谷氨酸在內的組分分子，谷氨酸進而激活NMDA受體，導致細胞內鈣水平和胞內酶水平增加，從而導致進一步的神經(jīng)細胞死亡(興奮毒性級聯(lián)反應，excitotoxicitycascade)。CNS組織的死亡被稱為梗塞(infarction)。梗塞體積(即，大腦中由中風所導致的死亡神經(jīng)細胞的體積)可作為由中風所引起的病理損傷程度的一項指標。癥狀結果取決于梗塞體積和梗塞在大腦中的位置。殘疾指數(shù)可用于衡量癥狀損傷，例如，Rankin中風結果量表(RankinStrokeOutcomeScale)(Rankin,ScottMedJ；2:200-15(1957))和Barthel指數(shù)(BarthelIndex)。Rankin量表是基于直接評估受試者的整體狀況，如下：0:毫無癥狀。1:盡管有癥狀，但無明顯殘疾；能夠進行所有平常的活動。2:輕微的殘疾；無法進行所有之前的活動，但是生活能夠自理。3:中度殘疾；需要一些幫助，但走路不需要幫助。4:中度到重度殘疾；沒有幫助時無法行走,沒有幫助時生活無法自理。5:重度殘疾；臥床不起，大小便失禁，需要持續(xù)的護理和照看。Barthel指數(shù)基于一系列關于患者執(zhí)行10項基本日常生活活動的能力的問題，產(chǎn)生0到100的得分，較低的分值表示更大程度的殘障(Mahoney等，MarylandStateMedicalJournal14：56-61(1965))。可選地，中風嚴重程度/結果也可以利用NIH中風量表進行評估，該量表可以在萬維網(wǎng)www.ninds.nih.gov/doctors/NIHStrokeScaleJBooklet.pdf獲取。該量表是基于受試者進行11項功能的能力，包括評估受試者的意識、運動、感官和語言能力水平。更確切地說，缺血性中風是指一類由于流向大腦的血液堵塞引起的中風。這種類型的堵塞的根本情況是最常見的在血管壁形成脂肪沉積。這種情況被稱為動脈粥樣硬化。這些脂肪沉積會導致兩種類型的梗阻。腦血栓癥是指血栓(血塊)在血管阻塞部分的形成?！澳X栓塞”通常是指在循環(huán)系統(tǒng)另一個位置形成的血凝塊，通常是心臟、上胸部大動脈和頸部。一部分血凝塊隨后脫落，進入血液中，穿過大腦的血管，直到到達太小而無法讓其過的血管。栓塞的第二個重要原因是心律不齊，被稱為房顫。房顫創(chuàng)造了條件，凝塊可以在心臟形成，排出，移動到腦部。缺血性中風的其他潛在原因是腦出血、血栓形成、動脈或靜脈解剖、心臟驟停、任何原因(包括腦出血)的休克以及醫(yī)源性原因，例如，腦部血管或流向腦部的血管的直接手術損傷或心臟手術)。缺血性中風約占所有中風病例的83％。短暫性缺血發(fā)作(TIAs)是較輕微或警示性中風。在TIA中，存在指示缺血性中風的情況，并出現(xiàn)典型的中風警示信號。然而，梗死(血塊)短時間存在，并趨于通過正常機制而自身溶解。經(jīng)歷心臟手術的患者尤其具有短暫性腦缺血發(fā)作的風險。出血性中風占約17％的中風病例。其由破裂并導致血液流進周圍腦部的脆弱血管引起。血液積累并壓迫周圍的腦組織。兩類典型的出血性中風為腦內出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。出血性中風由脆弱血管的破裂引起。導致脆弱血管破裂的潛在原因包括高血壓性出血，其中高的血壓導致血管破裂；或其他導致脆弱血管的原因，例如破裂的腦血管的畸形，包括腦動脈瘤、動靜脈畸形(AVM)或海綿狀血管畸形。出血性中風也可以由缺血性中風的出血性轉化而引起，所述缺血性中風弱化了梗死中的血管；或由包含異常弱的血管的CNS中的原發(fā)性或轉移性腫瘤的出血引起。出血性中風也可以由醫(yī)源性原因引起，例如對腦部血管的直接手術損傷。動脈瘤是弱化的血管區(qū)域的膨脹。如果不進行治療，動脈瘤將繼續(xù)弱化直至其破裂并流血入腦部。動靜脈畸形(AVM)是一串異常形成的血管。海綿狀血管畸形是靜脈畸形，能夠導致從弱化的靜脈結構的出血。這些血管的任何一個都可能破裂，也導致血液流進腦部。出血性中風也可以由物理創(chuàng)傷引起。在腦的一個部分中的出血性中風可以通過血液的缺乏(在出血性中風中流失)而引起另一個部位的缺血性中風。一類適合接受治療的患者為經(jīng)歷手術的患者，所述手術涉及或可能涉及供應腦部、或位于腦部或CNS中的血管。一些例子為經(jīng)歷心肺轉流術、頸動脈支架置入術、腦部或主動脈弓冠狀動脈的診斷性血管造影術、血管手術或神經(jīng)手術的患者。這樣的患者的更多例子已在以上第IV部分討論過。特別適合的是患有腦動脈瘤的患者。可以通過多種手術對這樣的患者進行治療，所述手術包括剪掉動脈瘤以阻斷血液，或進行血管內手術以小線圈來封閉動脈瘤、或向出現(xiàn)動脈瘤的血管中植入支架、或置入微導管。血管內手術比剪掉動脈瘤具有較小的侵入性，與較好的患者結果相關，但該結果仍然包括高發(fā)生率的小梗死?？梢杂肞SD95與NMDAR2B相互作用的抑制劑、特別是以上所描述的化學劑，包括肽YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQIDNO：6，也被稱為TAT-NR2B9c)，對這樣的患者進行治療。相對于實施手術的用藥時間可以按以上在臨床試驗中所描述的進行。另一類適合接受治療的患者是患有帶有動脈瘤或不帶有動脈瘤的蛛網(wǎng)膜下腔出血的患者(參見US61/570264)。V.有效的用藥方案復原后，施用凍干制劑，從而使得所述活性試劑(例如，NR2B9c)以能夠使正在接受治療的患病患者的至少一種病兆或病癥被有效地治療、降低或抑制進一步惡化的劑量、頻率和用藥途徑被施用。有效治療的劑量是指，相對于未使用本發(fā)明藥劑進行治療的對照患病患者(動物模型)群體的損傷，所述活性試劑的劑量足以使患有疾病并以本發(fā)明化學劑治療的患者(或動物模型)群體的至少一種病兆或病癥被有效地治療、降低或抑制進一步惡化。相較于未使用本發(fā)明所述方法進行治療的對比患者的對照群體中的平均結果，如果接受治療的患者個體達到的效果更好，那么所述劑量也被認為是治療有效的。治療有效的方案(regime)包括按達到預期目的所需要的用藥頻率和途徑來施用治療有效的劑量。對于患有中風或其它缺血癥狀的患者，所述活性試劑的施用方案包括對降低中風或其它缺血性病癥的損傷效應有效的施用量、頻率和途徑。當需治療的疾病是中風時，可以通過梗死的體積或殘障指數(shù)，對結果進行確定，如果治療的患者個體的殘障在Rankin量表上表現(xiàn)為2或以下以及在Barthel量表上表現(xiàn)為75或以上，或如果治療患者群體比相當?shù)奈唇?jīng)治療的群體在殘障量表上顯示出顯著改善的分值分布(即，較少的殘障)，則劑量被視為治療上有效的，參見LeesetatL,NEnglJMed2006；354:588-600。單劑量的藥劑通常足以治療中風。本發(fā)明也提供用于在具有失調危險的受試者中預防該失調的方法和組合物。通常，與對照群體相比較，這樣的受試者出現(xiàn)失調(例如，病態(tài)、不適、失調或疾病)的可能性增加。對照群體例如可以包括隨機選自一般群體(例如，按年齡、性別、人種和/或種族進行匹配)、沒有被診斷的或具有該失調的家族史的一個或多個個體。如果發(fā)現(xiàn)受試者和失調相關“危險因素”間具有聯(lián)系，則受試者可以被認為具有失調的危險。危險因素可以包括，例如通過對受試者群體進行統(tǒng)計學或流行病學研究而得到的、與給定的失調相關的任何活動、性狀、事件或特性。即使鑒別潛在危險因素的研究沒有特別地包括該受試者，受試者也可以因此被分類為具有失調風險。例如，經(jīng)歷心臟手術的受試者具有短暫性腦缺血發(fā)作的風險，因為與沒有經(jīng)歷心臟手術的受試者群體相比較，經(jīng)歷了心臟手術的受試者群體中短暫性腦缺血發(fā)作的頻率增加。其它常見的中風危險因素包括年齡，家族史，性別，先前發(fā)生過中風，短暫性缺血發(fā)作或心臟病發(fā)作，高血壓，吸煙，糖尿病，頸動脈或其它動脈疾病，心房顫動，其它心臟疾病(例如心臟病、心力衰竭、擴張型心肌病、心臟瓣膜疾病和/或先天性心臟病)，高血膽固醇，以及高飽和脂肪、反式脂肪或膽固醇的飲食。在預防過程中，將復原后的凍干制劑以足以阻止、延遲或抑制所述疾病的至少一種病兆或病癥的發(fā)展的劑量、頻率和途徑給藥給具有患病風險但尚未患病的患者。有效預防的劑量是指，相較于具有患病風險但未使用本發(fā)明的嵌合劑進行治療的對照患者(或動物模型)群體，足以有效地預防、抑制或延遲具有患病的風險且使用所述試劑進行治療的患者(或動物模型)群體的至少一種病兆或病癥的試劑量。相較于未使用本發(fā)明所述方法進行治療的可比患者的對照群體中的平均結果，如果接受治療的個體患者達到的效果更好，那么所述劑量也被認為預防有效的。預防有效的方案包括在達到預期目的所需要的頻率和用藥途徑下以預防活性劑量給藥。對于處在緊迫的中風風險(比如，正在接受心臟手術的患者)中的患者的中風預防，單劑量藥劑通常是足夠的。根據(jù)所述試劑而定，給藥(方式)可以是腸胃外的、靜脈內的、經(jīng)鼻的、口服的、皮下的、動脈內的、顱內的、鞘內的、腹膜內的、局部的、鼻內的或肌內的。對于肽試劑，優(yōu)選為靜脈給藥。對于給人類用藥，優(yōu)選的活性試劑(例如，TAT-NR2B9c)劑量為2-3mg/kg，更優(yōu)選為2.6mg/kg。。所示劑量應被理解為包括在典型的醫(yī)院條件下可測定的劑量在精度上所固有的誤差幅度。這樣的量為用于單劑施用，即，每疾病發(fā)作期一劑?；钚栽噭?，例如TAT-NR2B9c，優(yōu)選為通過輸注進入血管進行輸送，更優(yōu)選為通過靜脈輸注輸送。輸液的時間可以影響副作用(例如由于肥大細胞脫粒和組胺的釋放)和功效。通常，對于給定的劑量水平，較短的輸液時間更有可能會導致組胺的釋放。然而，較短的輸液時間也可能導致改良的功效。盡管本發(fā)明的實施不依賴于對機制的理解，但后一種結果可以解釋為：相對于患者病狀的發(fā)展，延遲將是顯著的，以及相對于嵌合劑的血漿半衰期，延遲將是顯著的，由此嵌合劑達不到最佳的治療水平。對于嵌合劑TAT-NR2B9c，在這些因素之間提供平衡的優(yōu)選輸液時間為5-15分鐘，更優(yōu)選為10分鐘。所示時間應被理解為包括+/-10％的誤差。輸液時間不包括任何用于洗脫輸注(洗脫已經(jīng)完成的最初輸液的任何殘留液滴)的額外時間。用于TAT-NR2B9c的輸液時間也可以充當其它藥劑的指導。盡管為了便于清楚理解，本發(fā)明已被詳細描述，某些修改仍可在所附權利要求的范圍內實施。出于所有目的，本申請中引用的所有發(fā)表刊物、序列號和專利文獻的全部內容均以引用的方式并入本申請中，如同其單獨被引用的程度。某種程度上，在不同時間段，某個序列號不止與一條序列相關聯(lián)，與序列號相關聯(lián)的序列是指本申請有效遞交日時的序列。有效申請日是公開爭議序列號的最早優(yōu)先權申請的日期。除非上下文中另有明確說明，否則本發(fā)明的任何要素、具體實施例、步驟、特征或形式可以任意組合實施。具體實施例實施例1-7顯示了在組氨酸和海藻糖存在下TAT-NR2B9c的醋酸鹽可以以凍干形式制備。實施例10顯示了在另一種相同的凍干制劑中TAT-NR2B9c的氯鹽顯示出顯著高于醋酸鹽的穩(wěn)定性。實施例9顯示了在組氨酸和海藻糖中制備的TAT-NR2B9c的氯鹽相對于之前描述的來自于生理鹽水的TAT-NR2B9c凍干制劑也顯示出改善的穩(wěn)定性。實施例1：驗證標準緩沖液和賦形劑不會干擾TAT-NR2B9c在體內的效力制備5種TAT-NR2B9c濃度均為20mg/mL的液體毒理制劑。表1包括賦形劑組分、Lot編號以及制備時的效力、純度和pH。將大約5mL每種制劑裝入小瓶用以測試。-20℃冷凍小瓶，以模擬運輸或液體儲存條件。表1:TAT-NR2B9c制劑組合物在體內的效力試驗1效力和純度采用TFA方法通過RP-HPLC分析進行評估。2制劑#2的純度明顯低于其它制劑。3磷酸鹽緩沖的制劑的pH明顯偏離其初始緩沖pH(7.0)。需要注意的是，磷酸鹽緩沖的制劑不能像組氨酸緩沖液一樣維持制劑和試驗之間的pH，這表明組氨酸可能是更佳的制劑緩沖液。制劑1-5在大鼠3-軟腦膜血管阻塞(3PVO)中風模型中進行試驗?；加兄酗L的大鼠通過靜脈給藥被施用所述制劑中的一種，所述制劑進入股靜脈，然后，所述動物在中風24小時后被處死。收集大腦，固定，并使用氯化三苯基四氮唑(TTC)進行染色，以顯現(xiàn)出大腦的缺血部分。相對于僅僅注射生理鹽水的對照樣品，所有的試驗制劑都可以為動物提供顯著的神經(jīng)保護作用(圖1)。方法缺血性3-軟腦膜血管閉塞模型試驗在大鼠身上進行。如前所述實施永久性的3-軟腦膜血管閉塞(3PVO)(AngiogenicprotectionfromfocalischemiawithangiotensinIItype1receptorblockadeintherat.Forderetal.,AmJPhysiolHeartCircPhysiol.2005Apr；288(4):H1989-96)。簡而言之，以0.5ml/kg肌內注射氯胺酮(100mg/kg)、乙酰丙嗪(2mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)，對250g至350g的大鼠進行麻醉，需要時，輔以初始劑量的三分之一。插入肛門溫度探針，并且將動物置于溫度保持在約37℃的加熱墊上。顱骨經(jīng)正中切口被暴露出來，并被刮擦去掉組織。使用解剖顯微鏡和氣動牙鉆，通過穿過顱骨鉆一個矩形，保持硬腦膜完整的同時剝離顱骨塊，從而在右側體感皮質區(qū)上產(chǎn)生6-8mm的顱骨窗口(尾側2mm和外側至前囟5mm)。圍繞選定的桶狀皮層，燒灼3-軟腦膜小動脈大腦中動脈分支(3pialarteriolarmiddlecerebralarterybranches)，并穿過硬腦膜進行電灼燒。灼燒后，縫合頭皮。將每只大鼠放回各自的位于加熱燈下的籠子里，以維持體溫直到所述的大鼠完全恢復。提供食物和水。3PVO局部缺血一小時后，根據(jù)大鼠的體重，用溶在約0.45ml生理鹽水中的3nmol/g的TAT-NR2B9C制劑注射大鼠。給藥過程超過5分鐘。手術后24小時，快速收集上述大腦。通過大腦獲得冠狀切片(2mm)，并在37℃下，在2％氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma-AldrichSt.LouisMO)中溫育15分鐘。掃描圖像(CanoScan4200FCanon)且測定數(shù)量。實施例2：測定TAT-NR2B9C在不同的緩沖液中和不同pH下的穩(wěn)定性緩沖液的篩選制備10種1mg/mLTAT-NR2B9C的緩沖液，以篩選賦形劑。樣品被貯存在25℃/60％RH(相對濕度)和40℃/75％RH下。測試樣品在t＝0和t＝1周的穩(wěn)定性(純度),通過RP-HPLC(TFA和MSA方法)測試樣品的純度，結果如表2和表3所示。結果表明，在pH6.0和pH6.5之間的液體介質緩沖液中的TAT-NR2B9C的穩(wěn)定性提高。該范圍以外(低于或高于這個范圍)，降解增加。由MSA方法得到的數(shù)據(jù)顯示出明顯的降解模式，所述降解模式與pH和緩沖液種類均相關，該數(shù)據(jù)為未來的制劑制備提供了有價值的借鑒。表2提供了使用MSA方法測定的主峰純度結果，所述主峰純度以HPLC面積％表示，而表3提供了使用TFA方法測定的主峰純度結果，所述主峰純度以HPLC面積％表示。表2：通過MSA方法測定的TAT-NR2B9C主峰面積％樣品t＝0t＝1周25℃t＝1周40℃His，6.098.598.598.0His，6.598.598.697.3His，7.098.598.497.0磷酸鹽，6.098.598.297.0磷酸鹽，6.598.597.997.3磷酸鹽，7.098.597.996.0磷酸鹽，7.598.597.695.2檸檬酸鹽，5.598.598.394.4檸檬酸鹽，6.098.598.497.4檸檬酸鹽，6.598.598.797.7表3：通過TFA方法測定的TAT-NR2B9C主峰面積％結果表明，在pH6.0-6.5的緩沖介質中能夠最佳地維持TAT-NR2B9C的溶液穩(wěn)定性，且所述介質仍然能夠良好地耐受靜脈注射給藥。通常，即使被保持在加速穩(wěn)定性試驗的條件下(在25℃或40℃下保持一周)，組氨酸和檸檬酸鹽緩沖體系也能夠維持TAT-NR2B9C的完整形態(tài)。選擇緩沖液種類時需考慮的幾種因素是：在各種介質中出現(xiàn)的特定降解模式，以及在判斷特定的相關物質是否需要避免時，任何已確認的相關物質或毒理的數(shù)據(jù)可使判斷過程簡單化。在試驗期，pH6至pH6.5之間的組氨酸和檸檬酸鹽緩沖液出現(xiàn)很少的降解物。用于本試驗的組氨酸緩沖液本身含有雜質，所述雜質存在于沒有添加TAT-NR2B9C的組氨酸緩沖液中。因此，對不含此種雜質的組氨酸供應商的鑒別將會使分析更為簡單。表4從TAT-NR2B9C穩(wěn)定性方面給出了緩沖液種類的總結。表4：緩沖液種類的篩選實施例3：測定TAT-NR2B9C制劑在含有不同含量的氯化鈉的組氨酸和檸檬酸鹽緩沖液中以及在不同pH值下的穩(wěn)定性該研究的目的是論證氯化鈉(NaCl)對pH和液體制劑中的TAT-NR2B9C穩(wěn)定性的影響。具有1mg/mLTAT-NR2B9C的緩沖液制劑列于表5，pH的結果如表6所示。在整個研究期間，數(shù)據(jù)顯示出非常一致的結果。但加入NaCl的檸檬酸鹽中出現(xiàn)了明顯的變化，其緩沖能力受到影響，且pH降低約0.2個單位。選定的pH6.0和pH6.5處于檸檬酸鹽的理想緩沖范圍(pH2.5-5.6)的外邊界，因此在制備過程中，各種添加劑可能會導致干擾，在評估制劑的穩(wěn)健性時應考慮到這些干擾。表5：用于檢測鹽對pH的影響的緩沖液制劑介質#緩沖液目標pHNaCl150mM檸檬酸鹽6.0NA250mM檸檬酸鹽6.0200mM350mM檸檬酸鹽6.5NA450mM檸檬酸鹽6.5200mM550mM組氨酸6.0NA650mM組氨酸6.0200mM750mM組氨酸6.5NA850mM組氨酸6.5200mM表6：在冷凍和加速溫度條件下的TAT-NR2B9C制劑的pH穩(wěn)定性結果表明，不論是冷凍儲存一周還是在40℃的加速溫度下儲存一周，向組氨酸和檸檬酸鹽緩沖的TAT-NR2B9C溶液中添加200mMNaCl不會顯著影響所述溶液的pH。接著，我們檢測了在冷凍和加速溫度下儲存一周后TAT-NR2B9C在這些制劑中的穩(wěn)定性。表7顯示了采用RP-HPLC方法用MSA梯度測定的結果。所述數(shù)據(jù)同時示于圖2A和2B中。圖2A由左至右顯示了使用pH歸類的制劑的加速穩(wěn)定性(低穩(wěn)定性至高穩(wěn)定性)。圖2B顯示了使用緩沖液歸類的相對加速穩(wěn)定性。表7：純度(MSA方法)，TAT-NR2B9C這些結果表明，在pH6.5時能夠最佳地維持TAT-NR2B9C溶液的穩(wěn)定性，NaCl的添加對穩(wěn)定性有輕微的改善(圖2A和2B)。由于組氨酸緩沖液更好的緩沖能力和相當?shù)姆€(wěn)定性，尤其是去除了在相對保留時間(RRT)0.28遷移的雜質時(上表中包含了雜質面積，導致了對于TAT-NR2B9C峰面積來說較低的穩(wěn)定值)，因此pH6.5的組氨酸緩沖種類是應用于凍干研究的最佳劑型。pH6.5下的介質可很好地耐受通過注射給藥。實施例4：篩選使TAT-NR2B9C形成穩(wěn)定的凍干蛋糕狀的填充劑為了確定凍干后可產(chǎn)生漂亮的蛋糕狀和改善穩(wěn)定性的填充劑，我們按表8所示在50mM組氨酸緩沖液、填充劑和NaCl中配制了幾種20mg/mL的TAT-NR2B9C溶液。為了模擬TAT-NR2B9C制劑在凍干過程中暴露的時間和處理溫度，這些樣品被儲存在-20℃(對照)和40℃/75％RH(測試)下，儲存1周后，通過HPLC(MSA方法)分析純度以及分析pH值。pH穩(wěn)定性結果如表9所示，TAT-NR2B9C在不同的液體制劑中的穩(wěn)定性結果如表10和圖3所示。表8：填充劑樣品模板表9：pH，填充劑樣品介質目標pHpH，-20℃pH，40℃甘露醇6.56.56.5甘露醇+NaCl6.56.56.5海藻糖6.56.56.4海藻糖+NaCl6.56.56.4右旋糖酐-406.56.56.3右旋糖酐-40+NaCl6.56.56.4表10：由TAT-NR2B9C峰面積％所表示的純度，MSA方法填充劑液體制劑對TAT-NR2B9C穩(wěn)定性的結果甘露醇、海藻糖和右旋糖酐-40很好地將pH維持在6.5(表9)，當液體制劑在高溫下儲存超過一周時，純度約有1％的下降(表10)。就TAT-NR2B9C凍干填充溶液的化學穩(wěn)定性而言，與右旋糖酐溶液相比，由于甘露醇和海藻糖為TAT-NR2B9C提供了更好的穩(wěn)定性，因此甘露醇和海藻糖為優(yōu)選的填充劑(圖3)。實施例5：填充劑的熱分析，以便于凍干周期的設計作為TAT-NR2B9C凍干藥品的凍干周期改進的一部分，通過差示掃描量熱法評估了來自填充劑樣品模板(表8)的推薦的填充溶液的熱特性(包括制劑的玻璃化轉變溫度(Tg))。結果列于表11中，DSC跡線如圖4A-6B。表11：TAT-NR2B9C凍干填充溶液的玻璃化轉變溫度介質Tg50mM組氨酸，pH6.5，120mM甘露醇-37.25℃50mM組氨酸，pH6.5，120mM甘露醇，75mMNaCl-42.51℃50mM組氨酸，pH6.5，120mM海藻糖-28.25℃50mM組氨酸，pH6.5，120mM海藻糖，75mMNaCl-35.74℃50mM組氨酸，pH6.5，5％右旋糖酐-40-17.09℃50mM組氨酸，pH6.5，5％右旋糖酐-40，75mMNaCl-22.49℃在濃度為20mg/mL的TAT-NR2B9C中，測試的TAT-NR2B9C制劑顯示出的熱曲線具有以下特征：寬的熔融結果，帶有低溫起點。這種延伸的熔融結果掩蓋了常見于甘露醇制劑中的結晶化結果(crystallizationevent)，這可能表明，穩(wěn)固的凍干周期必須在產(chǎn)品沒有超過玻璃化轉變溫度下進行。在這種情況下，基于觀察到的所述TAT-NR2B9C藥品填充溶液的玻璃化轉變溫度，使用甘露糖醇作為填充劑需要低于-40℃的初級干燥溫度，是對可伸縮周期(scalablecycle)的可行性的典型限制。依據(jù)熱曲線，海藻糖和右旋糖酐-40更適合用作填充劑。但是，考慮到TAT-NR2B9C在含有海藻糖的液體制劑中的穩(wěn)定性比在含有右旋糖酐的液體制劑中的穩(wěn)定性更高，因此在測試過的這些填充劑中，海藻糖是優(yōu)選的填充劑。由于相對較低的Tg溫度，其需要較長的凍干周期進行干燥，我們考慮了各種不同的標準填充劑，并希望減少裝入容器密封系統(tǒng)內的填充體積，從而減少需要凍干的液體體積。為了努力減少填充體積且維持270mg/小瓶，進行了TAT-NR2B9C在組氨酸中(pH6.5)和組氨酸+海藻糖中(pH6.5)的溶解性研究。對35、50、75和100mg/mL的樣品進行肉眼分析。所有的溶液在t＝0和t＝24小時時是清澈的?；谠摂?shù)據(jù)，我們可采用低于3mL的填充體積，使用90mg/mL的TAT-NR2B9C制劑在目標小瓶中將有270mgTAT-NR2B9C?？赡芤笮∑恐芯哂泻艽蠓秶牧康腡AT-NR2B9C，但270mg將為一個100kg的患者提供2.6mg/kg的劑量。假設用于患者給藥的目標復原液的濃度仍為20mg/mL(但也可以是1mg/mL至100mg/mL)，那么含有270mgTAT-NR2B9C的20mL小瓶就可以有13.5mL的復原體積。因此，TAT-NR2B9C在小瓶中凍干的最佳液體體積在2.5mL和10mL之間。在進行凍干前，對各種不同的填充劑進行了測定，所得的Tg示于表12中。同時使用DSC對組氨酸(pH6.5)中的100mg/mLTAT-NR2B9C進行評估，所得數(shù)據(jù)列于表12中。表12：DSC數(shù)據(jù)，制劑基于表12中的DSC數(shù)據(jù)，對于活性藥品和無效對照劑均存在幾種制劑選擇。就Tg而言，通常制劑5和11對于活性產(chǎn)物是最理想的。任何填充劑都可適用于無效對照劑產(chǎn)物，但是如果退火，制劑4(甘露醇)具有最短的周期時間，如果外觀與活性制劑相匹配，制劑4可能是最令人滿意的。當我們確定最佳的活性制劑時，考慮溶液穩(wěn)定性、凍干周期穩(wěn)固性以及化學穩(wěn)定性是非常重要的。表12中的制劑5(海藻糖)在加速條件下表現(xiàn)出了良好的溶液穩(wěn)定性和低壓凍干(lyophile)化學穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)隨后顯示)，不過在13.5mL的填充配置(fillconfiguration)中需要較長的凍干周期。這種較長的周期時間不適合于將來的商業(yè)化生產(chǎn)。商業(yè)化生產(chǎn)期望更短的周期。表12中的制劑11(無填充劑，100mg/mLTAT-NR2B9C)相比制劑5具有更高的玻璃化轉變溫度，其允許更暖、更短的(凍干)周期。此外，減少填充體積將明顯縮短操作時間，因為每個小瓶中有更少的冰需要升華。實施例6：具有不同的填充劑、規(guī)格和凍干條件的TAT-NR2B9C的穩(wěn)定性加速穩(wěn)定性(acceleratedstability)的填充劑將小批量的TAT-NR2B9C藥品凍干，以評估其在25℃、40℃和60℃下存儲一周后的固體穩(wěn)定性。在三種不同的介質中配制活性濃度為20mg/mL的TAT-NR2B9C。對t＝0和t＝1周時的樣品進行外觀、復原、pH、數(shù)量以及純度(純度用HPLC(MSA方法)測定)方面的評估。只在t＝0時評估含水量。所有的TAT-NR2B9C藥品在t＝0和t＝1周時都呈白色、凍干蛋糕狀，并在少于10秒內被復原。藥品介質如表13所示，且列出了介質的各自玻璃化轉變溫度和含水量結果。pH、TAT-NR2B9C含量和TAT-NR2B9C純度結果如表14-16所述。表13：填充劑樣品模板(matrix)，Tg和含水量％表14：pH，填充劑(Lyo)小規(guī)模實驗#1表15：含量(mg/小瓶)，填充劑(Lyo)小規(guī)模實驗#1填充劑t＝0t＝1周25℃t＝1周40℃t＝1周60℃海藻糖20.620.320.720.7右旋糖酐-4019.419.819.519.11:1海藻糖:右旋糖酐-4020.320.820.220.2表16：純度(由HPLC測定面積％)，填充劑(Lyo)小規(guī)模實驗#1填充劑t＝0t＝1周25℃t＝1周40℃t＝1周60℃海藻糖98.898.898.898.4右旋糖酐-4098.998.998.696.51:1海藻糖:右旋糖酐-4098.998.898.697.5海藻糖、右旋糖酐-40以及海藻糖：右旋糖酐-40，這三種填充劑皆可將pH維持在6.5(表14)，在60℃下一周后，純度有0.5-2.5％幅度的下降。含有右旋糖酐-40的藥物產(chǎn)品和60℃下儲存的藥物產(chǎn)品都在保留時間(RT)～6.0顯示出了相關物質的增長。這些相關物質不存在于海藻糖樣品中，這表明海藻糖在凍干的藥品中具有穩(wěn)定效應，而右旋糖酐-40可產(chǎn)生特定的降解產(chǎn)物。在填充劑中包含右旋糖酐-40可允許更暖的初級干燥溫度，但右旋糖酐-40作為填充劑顯示出最差的穩(wěn)定性。海藻糖和右旋糖酐-40(1:1)的組合導致玻璃化轉變溫度與單獨的海藻糖約暖了10℃。但是，在60℃時，組合的穩(wěn)定性介于單獨的海藻糖和單獨右旋糖酐樣品之間，所以海藻糖為優(yōu)選的填充劑。凍干TAT-NR2B9C制劑的制備：小型實驗#2將小批量的TAT-NR2B9C藥品凍干以評估初級干燥期間將擱板溫度設置為5℃的情況。以27mg/mL的活性濃度將TAT-NR2B9C混合在pH6.5的50mM組氨酸和120mM海藻糖中。周期參數(shù)如表17所示。4個20mL的玻璃凍干瓶被裝入了10mL混合液。使用溫度探針對兩個小瓶進行探測。表17：小型實驗2，TAT-NR2B9C制劑的制備1初級干燥溫度是基于大的瓶尺寸和填充體積，與玻璃化轉變溫度不直接關聯(lián)。由于大的填充體積，則需要將擱板溫度設置得比玻璃化轉變溫度暖得多，以彌補蒸發(fā)冷卻。初級干燥期間的溶液溫度為-29℃，該溫度接近由DSC熱分析得出的玻璃化轉變溫度-28℃。低壓凍干的90mg/mLTAT-NR2B9C的加速穩(wěn)定性(小型實驗3)在配制小型實驗3的填充溶液之前，測定在緩沖液(50mM組氨酸，pH6.5)中的90mg/mLTAT-NR2B9C的pH。所述溶液的pH為6.04。確定的是隨著TAT-NR2B9C濃度的增大，緩沖能力也需要增強。在150mM、100mM和75mM的組氨酸緩沖液中以及水中制備溶液，并測定pH。pH如表18所示。在pH6.5的100mM組氨酸緩沖液中配制小型實驗3溶液，在加入TAT-NR2B9C之后重新調整pH至6.5。表18：pH，90mg/mLTAT-NR2B9C在pH6.5的組氨酸緩沖液中緩沖液pH水5.3950mM6.0475mM6.04100mM6.29150mM6.14將小批量的TAT-NR2B9C藥品凍干，以評估其在25℃和60℃下儲存一周后的固體穩(wěn)定性。配制兩種90mg/mL的TAT-NR2B9C制劑(緩沖液和帶有海藻糖的緩沖液)。對t＝0和t＝1周時的樣品進行外觀、復原、含水量以及純度(純度用HPLC(MSA方法)測定)方面的評估。所有的TAT-NR2B9C藥品都呈白色、凍干蛋糕狀。某些蛋糕破裂。無效對照劑與活性制劑肉眼看起來很相似。相對于前述制劑少于10秒的復原時間，(此處所述)復原時間約為1.5分鐘。復原時間增加最有可能是因為TAT-NR2B9C和組氨酸的濃度增大引起的。進一步的試驗表明，在濃度為50mM和75mM的組氨酸緩沖液中的TAT-NR2B9C的穩(wěn)定性良好，且再懸浮時間縮短。另外，由于本實驗采用2mL體積的小瓶，因此低壓凍干中僅能加入1mL水。該小型實驗配置中的實際復原體積為4.5mL。當采用較大的稀釋體積時，復原時間最有可能得到改善。將小瓶置于25℃和60℃下儲存一周后，測定其穩(wěn)定性。根據(jù)肉眼所觀察的外觀數(shù)據(jù)，海藻糖樣品提供了更優(yōu)良的蛋糕狀。凍干周期保守地運行超過5天，初級干燥溫度為-32℃?；跍囟忍结様?shù)據(jù)，該周期可被縮短，這表明隨著濃度增加和填充體積減小，優(yōu)化周期將會縮短。純度結果列于表19。表19：純度(由HPLC測定的面積％)，小型實驗3根據(jù)該加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，海藻糖對TAT-NR2B9C制劑顯示出穩(wěn)定效應，所述穩(wěn)定效應提高了低壓凍干的化學穩(wěn)定性。令人意外的是，海藻糖能夠提供這種穩(wěn)定效應，而其它的標準填充劑(例如用于其它肽的右旋糖酐和甘露醇)不能提供這種穩(wěn)定效應。減少填充體積可使周圍小瓶的蒸發(fā)冷卻最小化，且最大限度地減少水升華的阻力。凍干周期的進行-小型實驗4(無效對照劑和活性劑)開始凍干周期的小型實驗4，以測定3mL填充量時的蛋糕狀外觀和凍干條件。測試的樣品為帶有120mM海藻糖的100mM組氨酸(pH6.5)和90mg/kgTAT-NR2B9C或者是去除海藻糖的相同樣品。如表20中所述，進行了保守的為期4天的周期。具有3mL填充配制的無效對照劑和活性劑被加入到20mL的玻璃凍干瓶中，而不是前述實驗使用的較小的小瓶。有效溫度探針用于確定凍干周期期間的溫度。所得的活性劑小瓶示于圖7A。表20：小型實驗4的凍干參數(shù)4天的周期里，濃度為90mg/mL的制劑在20mL的瓶子中形成優(yōu)良的蛋糕狀，溫度探針的數(shù)據(jù)表明周期可縮短至3天。無效對照劑和活性劑的含水量為0.01％和0.00％。凍干周期的進行-小型實驗5(無效對照劑和活性劑)為了開發(fā)適用于臨床試驗的匹配無效對照劑小瓶(matchingplacebovial)和潛在商業(yè)規(guī)模下的制劑(270mg/瓶)的再懸浮時間，進行了小型實驗5。評估了10種無效對照制劑和1種活性制劑的外觀和再懸浮時間?；钚詣┑案鉃閮?yōu)良的白色蛋糕狀，伴有輕微的收縮，導致瓶壁表面周圍有裂紋。無效對照劑蛋糕為白色，含有海藻糖的量越高，裂紋就越多。使用13.5mL的水對小瓶(制劑)進行復原。溶解時間列在表21中。低壓凍干的活性劑立刻重新懸浮，但在變?yōu)榍宄簾o色的溶液之前活性劑有17.6秒的渾濁。所有的無效對照劑都為清澈無色的溶液。表21：無效對照劑和活性劑的復原(SS5)根據(jù)上述穩(wěn)定性、再懸浮時間和凍干時間，TAT-NR2B9C預凍干的優(yōu)選商用配方為20-100mM組氨酸、120mM海藻糖，pH為6.5。在不損失穩(wěn)定性或蛋糕狀的美觀性但減少再懸浮時間的情況下，可增大海藻糖的濃度。通過肉眼觀察和懸浮時間檢測增加的海藻糖對蛋糕形成和匹配的無效對照劑的影響為了更好地匹配無效對照劑，在TAT-NR2B9C存在和TAT-NR2B9C不存在，填充體積為3mL或5mL的情況下，對不同濃度的海藻糖進行測試，。首先，對活性制劑和無效對照制劑進行概述。然后，對3mL填充和5mL填充來說，將主要的視覺上匹配性狀標記出來。目前，分析樣品(填充溶液和一種效力樣品)正在被分析。表22和23顯示了測試制劑的一部分。表22：活性制劑制劑填充體積組分13-mL270mg/瓶，在120mM海藻糖+100mM組氨酸中，pH6.523-mL270mg/瓶，在500mM海藻糖+20mM組氨酸中，pH6.535-mL270mg/瓶，在120mM海藻糖+50mM組氨酸中，pH6.5圖7B顯示了上列活性制劑的外觀。表23：無效對照制劑無效對照制劑活性制劑(～270mg/瓶)500mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝7)500mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝2)400mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝3)400mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝1)300mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝3)300mM海藻糖+20mM組氨酸(n＝1)表24給出了上述樣品的凍干周期條件。表24：周期參數(shù)表25：主要的匹配性狀概述實施例7：凍干的270mgTAT-NR2B9C在pH6.5的20mM組氨酸緩沖液和120mM海藻糖中的穩(wěn)定性凍干藥品的制備在pH6.5的20mM組氨酸和120mM海藻糖中制備濃度為90mg/mL的小批量TAT-NR2B9C藥品，然后將其凍干以評估所述藥品在-20℃、40℃和60℃下儲存4周后的固態(tài)穩(wěn)定性。表25顯示了凍干條件。表25：實施例7的凍干周期條件樣品被儲存在恒溫箱中，在0周、1周、2周和4周后，對13.2mL(相對于13.5的最終體積)(樣品)的純度、效力和復原時間進行評估。各個儲存溫度和時間的數(shù)據(jù)示于表26A-C中。表26A：-20℃下的穩(wěn)定性表26B：40℃下的穩(wěn)定性表26C：60℃下的穩(wěn)定性該TAT-NR2B9C制劑在-20℃下是穩(wěn)定的。采用MSAHPLC分析發(fā)現(xiàn)，對于40℃和60℃的儲存溫度，潛在的雜質在相對保留時間(RRT)1.07、1.1和1.29時緩慢增長，在RRT1.07時出現(xiàn)了最大程度的增長。對于40℃的儲存溫度，所述雜質在一個月內從0.09％增長至0.27％；對于60℃的儲存溫度，所述雜質從0.09％增長至0.59％。在-20℃下未觀察到雜質。使用Arrnehius方程發(fā)現(xiàn)，25℃下16個月或5℃下123個月后摻入的雜質少于0.5％，室溫下超過60個月以及5℃下多年后摻入的雜質小于2％。因此，該制劑及相關制劑適合于凍干藥品的室溫下儲存。使降解實驗再進行一個月，以確定在60℃下觀察到的降解產(chǎn)物在40℃下也出現(xiàn)了。這三種雜質在更低的溫度下看起來的確發(fā)生了，這表明它們可能就是降解產(chǎn)物，這些降解產(chǎn)物并不是高溫特異性的。這些物質的鑒定是由LC/MS/MS實驗確定的，發(fā)現(xiàn)均包括全長TAT-NR2B9c化合物的乙?；?。該乙?；饔眉仍陔牡腘末端發(fā)生，也在賴氨酸側鏈發(fā)生。因此，TAT-NR2B9c的穩(wěn)定性可以通過添加清除劑或其他的賦形劑(減少TAT-NR2B9c在凍干狀態(tài)的乙?；?而提高，也可以通過減少或去除醋酸鹽從而減少乙酰化發(fā)生的機會而提高?？偨Y論根據(jù)上述穩(wěn)定性、再懸浮時間以及凍干時間，TAT-NR2B9c的優(yōu)選商用制劑為20-100mM組氨酸、120mM海藻糖，pH為6.5。在不損失穩(wěn)定性或蛋糕的美觀性的情況下，可增大海藻糖的濃度，但再懸浮時間會隨海藻糖濃度增大而增加。實施例8：TAT-NR2B9c氯鹽(TAT-NR2B9c-CI)的發(fā)展和穩(wěn)定性凍干藥物的制備由于之前發(fā)展的TAT-NR2B9c鹽制劑不穩(wěn)定，且觀察到在凍干制劑中發(fā)生了TAT-NR2B9c醋酸鹽的乙?；?，醋酸鹽被更換成氯鹽。更換是利用氯化銨通過制備型RP-HPLC進行的。該方法的目標在于鑒定新的相關化合物和新的制劑，這些化合物和制劑可以改善TAT-NR2B9c的穩(wěn)定性，優(yōu)選改善TAT-NR2B9c在室溫和37℃下的穩(wěn)定性。由于TAT-NR2B9c在被施用給潛在的中風和其他神經(jīng)障礙的受害者時是有效的，TAT-NR2B9c在這些障礙的早期治療具有非常高的價值，在醫(yī)療條件不具備的情形下穩(wěn)定的制劑是非常有價值的，每年可以幫助數(shù)百萬受該類疾病影響的人。例如，該類藥物可以被儲存在救護車上，或小的診所里，醫(yī)生的辦公室里，甚至還可以被儲存在個人那里，如果那些具有神經(jīng)障礙，例如，中風或其他需要神經(jīng)保護劑的疾病的對象需要被運到醫(yī)院進行治療的話，該類藥物可以被更早地提供給這些對象。一般的處理方法：緩沖劑A:水緩沖劑B:乙腈柱子：DaisogelODSC-18(1Kg),15m,10cm(柱床體積:～1L)流速:250mL/min.波長:230nm梯度:用20％B擠出(kitout)(1)柱子用2柱床體積(BV)80％CH3OH洗滌；(2)流過2BV0.025％HCl水溶液或0.1％TFA水溶液，其更優(yōu)質(3)裝樣:將30gTAT-NR2B9c醋酸鹽(PPL-NA11301)溶解在1.5LUSP水中(20g/L)，在該情形下，TAT-NR2B9c結合到柱子上；(4)用200mLUSPwater(也裝載到柱子上)洗滌，去除存在的醋酸平衡離子；(5)流過3BV0.1M氯化銨(NH4Cl)，以提供新的氯平衡離子；(6)流過2BV2％(7)流過20％B(乙腈)，洗脫產(chǎn)物；(8)當產(chǎn)物峰洗脫時，收集成分；(9)用分析型HPLC分析成分；(10)柱子用3BV80％CH3OH洗滌還原。分析型HPLCYMCODS-AC18柱,5μm,流速:1.5mL/min.；波長:210nm；溫度:50℃；梯度:15min內20％～35％B；緩沖液A＝0.1MNaClO4pH3.1；緩沖液B＝100％ACN。綜合結果和分析：將色譜運行(run)中收集的兩個主要的池(pool)混合在一起，凍干(～5L)。收集到23.4g終產(chǎn)物，純度為99.01％。殘留的醋酸鹽少于1％。該方法的標準精度(Standardrefinements)能夠將產(chǎn)量從78％上升到大于95％。類似地，該方法也可以用于將TAT-NR2B9c的TFA鹽轉換成氯鹽，因為TFA鹽在第3步中會類似地結合到柱子上。TAT-NR2B9c-Cl的凍干形式制劑和穩(wěn)定性測試將TAT-NR2B9c-Cl混合到20mM組氨酸和120mM海藻糖中,pH6.5,在相同的凍干條件下(270mg/瓶，活性重量)與之前優(yōu)選的的凍干制劑進行直接比較。將該制劑的穩(wěn)定性也與之前討論的TAT-NR2B9c重懸在鹽水(saline)中凍干的制劑比進行比較。對于后者，小批量的TAT-NR2B9c醋酸鹽藥物以在鹽水(saline)中90mg/ml制備(沒有其他賦形劑)，以270mg/瓶凍干。在-20℃(對照)，40℃和60℃下4周后，評估在凍干狀態(tài)下的制劑的穩(wěn)定性。表27：TAT-NR2B9c-Cl(20mM組氨酸和120mM海藻糖)VSTAT-NR2B9c-Ac鹽水(saline)的穩(wěn)定性表28：TAT-NR2B9c-Cl(20mM組氨酸和120mM海藻糖)VSTAT-NR2B9c-Ac鹽水(saline)在第11個月的穩(wěn)定性表27顯示了儲存1個月后每個溫度下和每個相對保留時間下的每次HPLC分析中觀察到的每個峰值的相對面積，以進行直接的比較。對于這兩種方法和兩種制劑來說，起始純度非常類似(在TFA方法中，TAT-NR2B9c-Cl98％vsTAT-NR2B9c-Ac97.93％,在甲磺酸(MSA)方法中，99.3％vs99.13％)。來看60℃下的數(shù)據(jù)，TAT-NR2B9c-Cl組氨酸海藻糖在兩種方法中均比TAT-NR2B9c鹽水制劑穩(wěn)定。對于TFA方法，在60℃下儲存一個月后，TAT-NR2B9c氯鹽仍然保持98.6％的主要峰，而TAT-NR2B9c-Ac鹽水制劑僅僅保持了96.8％的起始物質。對于MSA方法，差異更加顯著，TAT-NR2B9c氯鹽仍然保持了99.4％的起始物質，而TAT-NR2B9c-Ac鹽水制劑僅僅保持了97.2％的起始物質。表28顯示了儲存11個月后在不同的儲存溫度下相同的樣品在每次HPLC分析中觀察到的每個峰值的相對面積。這些數(shù)據(jù)支持在氯中NA-1氯鹽制劑相對于NA-1-Ac制劑具有改善的穩(wěn)定性。比較在40℃下(這是由ICH指導的加速條件，以支持凍干藥物的室溫儲存)TFA分析中的主要的NA-1峰的面積，NA-1氯鹽的保持了98.14％的純度(起始純度為98.58％)，而NA-1-Ac鹽水的純度從98.57下降到了96.48，低于97％的純度規(guī)范，不能認為其在約1年后是穩(wěn)定的。在MSA方法中觀察到了相同的趨勢，NA-1-Cl的純度從99.3％到98.71％，而NA-1-Ac鹽水的純度從99.3％到97.08％。檢測在60℃下11個月的純度結果(表28)，差異更加顯著，NA-1-Cl穩(wěn)定性明顯高于NA-1-Ac。從臨床的角度來看，假設在額定條件下用于人體的藥物的純度限制為97％，沒有注釋的雜質不超過0.5％。利用Arrenhius方程，可以利用40℃和60℃的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)來預測在不同的儲存溫度下(例如，25℃或37℃VS所觀察到的40℃或60℃下的數(shù)據(jù))主峰純度的下降或所觀察到的雜質的增加。假若藥物將在室溫下儲存，這些數(shù)據(jù)可以用于證明在37℃下的穩(wěn)定性，因為在許多環(huán)境下無法制冷，夏天的室溫就在該范圍內。假設在37℃下的純度要求為97.0％，且利用來自TFA分析的典型穩(wěn)定性數(shù)據(jù)分析主峰純度(因為其是最敏感的)(例如，在40℃和60℃下純度顯示最大程度下降的數(shù)據(jù))，預測到鹽水制劑的貯藏壽命為29.8個月(或超過2年一點點)，然而TAT-NR2B9c-Cl制劑的貯藏壽命為約500個月，或約41年。這在穩(wěn)定性方面是一個顯著改善。從最大雜質(除了在TFA方法中相對保留時間(RTT)1.02處的純度之外，其是一種確定的雜質)的增長方面來看，TAT-NR2B9c-Cl制劑1個月后最大的雜質增長為0.17到0.43(TFA方法，RTT0.99)，然而，TAT-NR2B9c-Ac鹽水制劑最大的雜質增長為0.05到0.72(TFA方法，RTT1.13)。假定37℃下雜質限度為0.5％，利用Arrenhius方程以及40℃和60℃下每一種雜質的數(shù)據(jù)，預測到鹽水制劑在37℃下的貯藏壽命為4.8個月，而TAT-NR2B9c-Cl組合物的貯藏壽命大于10年。因此，無論從TAT-NR2B9c的總體水平的角度來看還是從最大雜質的角度來看，TAT-NR2B9c-Cl組合物的穩(wěn)定性相當于鹽水制劑而言均具有顯著改善。實施例9：在組氨酸海藻糖制劑中TAT-NR2B9c-Cl比TAT-NR2B9c-Ac更穩(wěn)定TAT-NR2B9c-Cl和TAT-NR2B9c-Ac均在20mM組氨酸,120mM海藻糖，pH6.5下以90mg/mL制劑。每一種的3毫升等分在如之前所說的相同的程序下凍干，完成后分別放置在-20℃(對照)，40℃，60℃恒溫恒濕箱中。4周后，利用兩種正交HPLC方法(一種用TFA作為載體，另一種用MSA作為載體)測試每種制劑的穩(wěn)定性。表29顯示了儲存1個月后每個溫度下和每個相對保留時間(RPT，峰值識別)下的兩次HPLC分析中觀察到的每個峰值的相對面積，以進行直接的比較。左欄代表TAT-NR2B9c-Ac制劑，右欄顯示TAT-NR2B9c-Cl制劑的結果。在RPT為1時的峰值對應在每次分析每個柱子中的未受損的TAT-NR2B9c肽。對于兩種方法和兩種制劑來說，起始純度非常類似(在TFA方法中，TAT-NR2B9c-Cl98％vsTAT-NR2B9c-Ac98.3％,在MSA方法中，99.3％vs99.2％)。來看60℃下的數(shù)據(jù)，TAT-NR2B9c-Cl組合物在兩種方法中均比TAT-NR2B9c制劑穩(wěn)定。對于TFA方法，在60℃下儲存一個月后，TAT-NR2B9c氯鹽仍然保持98.6％的主要峰(96.64％除以起始98％)，而TAT-NR2B9c-Ac制劑僅保持了96％的起始物質(94.44％除以起始98.3％)。對于MSA方法，差異更加顯著，TAT-NR2B9c氯鹽仍然保持了99.4％(98.68％/99.3％)的起始物質，而TAT-NR2B9c-Ac制劑僅僅保持了95.6％(94.81％/99.2％)的起始物質。當人們看到各種組合物的最大雜質時，非常清楚無論是在40℃還是在60℃的加速穩(wěn)定條件下，TAT-NR2B9c的醋酸鹽都具有更多的雜質，更低的穩(wěn)定性。TAT-NR2B9c的氯鹽的穩(wěn)定性顯著高于相同條件下的醋酸鹽。表30顯示了儲存11個月后在不同的儲存溫度下相同的樣品在每次HPLC分析中觀察到的每個峰值的相對面積。這些數(shù)據(jù)支持在完全相同的緩沖液(20mM組氨酸，120mM海藻糖，pH6.5)中制備的NA-1氯鹽制劑相對于NA-1-Ac制劑具有改善的穩(wěn)定性。比較在40℃下(這是由ICH指導的加速條件，以支持凍干藥物的室溫儲存)TFA分析中的主要的NA-1峰的面積，NA-1氯鹽的保持了98.14％的純度(起始純度為98.58％)，而NA-1-Ac的純度從98.57下降到了96.48，低于97％的純度規(guī)范，不能認為其在約1年后是穩(wěn)定的。在MSA方法中觀察到了相同的趨勢，NA-1-Cl的純度從99.3％到98.71％，而NA-1-Ac的純度從99.3％到97.08％。檢測在60℃下11個月的純度結果(表30)，差異更加顯著，NA-1-Cl穩(wěn)定性明顯高于NA-1-Ac(在兩種方法中，氯鹽約95％的純度VS醋酸鹽約83％的純度)。因此，可以預測在相同的緩沖液中NA-1氯鹽相對于醋酸鹽具有顯著和令人吃驚的穩(wěn)定性。表29：在20mM組氨酸和120mM海藻糖中(pH6.5)，TAT-NR2B9c-Ac制劑VSTAT-NR2B9c-Cl制劑4周后的穩(wěn)定性表30：在20mM組氨酸和120mM海藻糖中(pH6.5)，TAT-NR2B9c-Ac制劑VSTAT-NR2B9c-Cl制劑11個月后的穩(wěn)定性序列表<110>諾諾公司喬納森·戴維·加曼<120>TAT-NR2B9C的氯鹽<130>057769/446849<160>73<170>FastSEQ版本4.0<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>1GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>2TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>3<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>3PheGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>4GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgProGln1510<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>5LysLeuSerSerIleGluSerAspVal15<210>6<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>6TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgLysLeuSerSerIle151015GluSerAspVal20<210>7<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>7TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgLysLeuSerSerIle151015GluThrAspVal20<210>8<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>8XaaPheGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>9<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>9ArgLeuSerGlyMetAsnGluValLeuSerPheArgTrpLeu1510<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>10ArgArgArgGlnArgArgLysLysArg15<210>11<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>11PheAsnGlySerSerAsnGlyHisValTyrGluLysLeuSerSerIle151015GluSerAspVal20<210>12<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>12GluSerAspVal1<210>13<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>13HisProThrAspIleThrGlyProLeuAsnLeuSerAspProSerVal151015SerThrValVal20<210>14<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>14ArgArgAlaIleGluArgGluGluGlyGlnLeuGlnLeuCysSerArg151015HisArgGluSer20<210>15<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>15ThrGlnGlyPheProGlyProCysThrTrpArgArgIleSerSerLeu151015GluSerGluVal20<210>16<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>16AlaValSerArgLysThrGluLeuGluGluTyrGlnArgThrSerArg151015ThrCysGluSer20<210>17<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>17LeuAsnSerCysSerAsnArgArgValTyrLysLysMetProSerIle151015GluSerAspVal20<210>18<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>18GlyGlyAspLeuGlyThrArgArgGlySerAlaHisPheSerSerLeu151015GluSerGluVal20<210>19<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>19GlnProThrProThrLeuGlyLeuAsnLeuGlyAsnAspProAspArg151015GlyThrSerIle20<210>20<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>20MetGlnSerIleProCysMetSerHisSerSerGlyMetProLeuGly151015AlaThrGlyLeu20<210>21<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>21GlnAsnPheAlaThrTyrLysGluGlyTyrAsnValTyrGlyIleGlu151015SerValLysIle20<210>22<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>22GlnAsnTyrAlaThrTyrArgGluGlyTyrAsnValTyrGlyThrGlu151015SerValLysIle20<210>23<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>23HisThrGlyThrAlaIleArgGlnSerSerGlyLeuAlaValIleAla151015SerAspLeuPro20<210>24<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>24SerPheThrSerIleLeuThrCysHisGlnArgArgThrGlnArgLys151015GluThrValAla20<210>25<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>25GluValIleAsnMetHisThrPheAsnAspArgArgLeuProGlyLys151015GluThrMetAla20<210>26<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>26IleGluThrAlaVal15<210>27<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>27SerThrValVal1<210>28<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>28HisArgGluSer1<210>29<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>29GluSerGluVal1<210>30<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>30ThrCysGluSer1<210>31<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>31GlyThrSerIle1<210>32<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>32AlaThrGlyLeu1<210>33<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>33SerValLysIle1<210>34<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>34SerAspLeuPro1<210>35<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>35GluThrValAla1<210>36<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>36GluThrMetAla1<210>37<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>37ArgArgArgGlnArgArgLysLysArgGlyTyrLysLeuSerSerIle151015GluThrAspVal20<210>38<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=E,D,N,或Q<220><221>變體<222>2<223>Xaa=S或T<220><221>變體<222>3<223>Xaa=D,E,Q,或N<220><221>變體<222>4<223>Xaa=V或L<400>38XaaXaaXaaXaa1<210>39<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>39GluThrAspVal1<210>40<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>40GluThrGluVal1<210>41<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>41AspThrAspVal1<210>42<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>42AspThrGluVal1<210>43<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>43LysLeuSerSerIleGluThrAspVal15<210>44<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>44GlySerSerSerSer15<210>45<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>45ThrGlyGluLysPro15<210>46<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>46GlyGlyArgArgGlyGlyGlySer15<210>47<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>47LeuArgGlnArgAspGlyGluArgPro15<210>48<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>48TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgProGln1510<210>49<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意非Y的氨基酸<400>49XaaGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>50<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>50XaaGlyLysLysLysLysLysGlnLysLysLys1510<210>51<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>51XaaArgLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>52<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>52XaaGlyAlaLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>53<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>53XaaAlaLysLysArgArgGlnArgArgArg1510<210>54<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>54XaaGlyArgLysAlaArgArgGlnArgArgArg1510<210>55<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>55XaaArgLysAlaArgArgGlnArgArgArg1510<210>56<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>56XaaGlyArgLysLysAlaArgGlnArgArgArg1510<210>57<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>57XaaArgLysLysAlaArgGlnArgArgArg1510<210>58<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>58XaaGlyArgLysLysArgArgGlnAlaArgArg1510<210>59<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>59XaaArgLysLysArgArgGlnAlaArgArg1510<210>60<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>60XaaGlyArgLysLysArgArgGlnArgAlaArg1510<210>61<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>61XaaArgLysLysArgArgGlnArgAlaArg1510<210>62<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>62XaaArgArgProArgArgProArgArgProArgArg1510<210>63<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>63XaaArgArgAlaArgArgAlaArgArgAlaArgArg1510<210>64<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>64XaaArgArgArgAlaArgArgArgAlaArgArg1510<210>65<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>65XaaArgArgArgProArgArgArgProArgArg1510<210>66<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>66XaaArgArgProArgArgProArgArg15<210>67<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=空白或任意氨基酸<400>67XaaArgArgAlaArgArgAlaArgArg15<210>68<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<220><221>變體<222>1<223>Xaa=E,Q,A,或其類似物<220><221>變體<222>2<223>Xaa=T或S<220><221>變體<222>3<223>Xaa=A,Q,D,N,N-Me-A,N-Me-Q,N-Me-D,N-Me-N,或其類似物<400>68XaaXaaXaaVal1<210>69<211>22<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>69ValAspSerGluIleSerSerLeuLysArgArgArgGlnArgArgLys151015LysArgGlyTyrIleAsn20<210>70<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>70ArgArgArgGlnArgArgLysLysArgGlyTyrLysLeuSerSerIle151015GluSerAspVal20<210>71<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>71IleGluSerAspVal15<210>72<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>72GlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArgPro1510<210>73<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>73IleGluThrAspVal15當前第1頁1 2 3