鑒于化石能源成本、潛在的供應(yīng)問(wèn)題和環(huán)境影響，為產(chǎn)生生物燃料而提出的白色生物技術(shù)替代方案是重大挑戰(zhàn)。植物生物質(zhì)是可持續(xù)發(fā)展框架內(nèi)生產(chǎn)生物燃料的首選可再生原料。

背景

植物生物質(zhì)是指任何生物質(zhì)，其可以對(duì)應(yīng)農(nóng)業(yè)和農(nóng)工業(yè)作物，如玉米，甘蔗，小麥，高粱，木工業(yè)和家具用樹(shù)木的剩余或副產(chǎn)物，或?qū)?yīng)特定培養(yǎng)物，如芒(Miscanthus gigantheus)，柳枝稷(Panicum virgatum(switchgrass))以及短和很短輪伐期矮林。植物生物質(zhì)是富含己糖的纖維素，富含戊糖的半纖維素和木質(zhì)素(疏水性酚類化合物的聚合物)的混合物。通常來(lái)講，利用三個(gè)步驟說(shuō)明將植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物乙醇：

實(shí)施機(jī)械，化學(xué)和/或加熱過(guò)程預(yù)處理以優(yōu)化生物質(zhì)或生物質(zhì)組分隨后的水解；

在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值條件下，生物質(zhì)或生物質(zhì)組分在試劑、溶劑或酶的作用下水解。水解的目的是釋放主要的可發(fā)酵的單糖。使用的酶必須是穩(wěn)定且表現(xiàn)出可以接受的水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；

發(fā)酵可發(fā)酵的糖必須是強(qiáng)健，快速且使用所有可用的糖，即C6糖(己糖)和C5糖(戊糖)。

第一和第二步驟或第二步驟和第三步驟可以組合或分開(kāi)進(jìn)行。

具體地，實(shí)際發(fā)酵步驟之前先進(jìn)行實(shí)施發(fā)酵的微生物增殖，隨后蒸餾。增殖通常在酶促糖化所得液相中進(jìn)行，例如在兩個(gè)罐內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，第二罐明顯大于第一罐。這些參數(shù)取決于不同的工業(yè)過(guò)程，技能和習(xí)慣。

可通過(guò)組合各步驟和/或單獨(dú)改善它們以改進(jìn)整個(gè)過(guò)程，例如，優(yōu)化用于水解的酶或負(fù)責(zé)發(fā)酵的微生物。在后一種情況下，例如，特別地，通過(guò)允許轉(zhuǎn)化己糖和戊糖二者，和/或限制它們對(duì)存在于木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物或發(fā)酵溶液中的抑制劑的敏感性，如酸性或溫度，對(duì)于改善轉(zhuǎn)化糖類的適宜性是有用的。例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是生物乙醇生產(chǎn)中通常使用的酵母，其不能夠代謝D-木糖，但可以通過(guò)非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收它。它可以通過(guò)相比D-葡萄糖對(duì)D-木糖具有較低親和性的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)運(yùn)輸。因此，不僅在遺傳學(xué)上修飾細(xì)胞來(lái)賦予它代謝D-木糖的能力，而且轉(zhuǎn)化它以便它更有效吸收所述糖都是有吸引力的。

有關(guān)這些主題的綜述，參見(jiàn)，如la Grange等,2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.,87:1195-1208或Jordan等,2012,Biochem.J.,442:241-252。

本發(fā)明涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而解決代謝缺陷，還給予它轉(zhuǎn)化D-木糖的能力，以及，有利地，增強(qiáng)吸收此類糖的特性。

現(xiàn)有技術(shù)

在酵母轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，專利申請(qǐng)WO2010000464A1公開(kāi)了用于發(fā)酵C5糖特別是木糖的酵母，通過(guò)引入外源基因編碼功能性木糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化所述酵母。在這種情況下，木糖異構(gòu)酶源自梭菌(Clostridium phytofermentans)。

申請(qǐng)人的專利申請(qǐng)WO2012072793A1尋求優(yōu)化通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化木糖的過(guò)程，使之與工業(yè)應(yīng)用兼容。為了這個(gè)目的，該申請(qǐng)公開(kāi)了只在一個(gè)步驟中引入用于基因編碼能夠?qū)⑷魏翁妓衔?包括D-木糖)轉(zhuǎn)化為木酮糖(D-木酮糖)的酶的以及基因編碼能將所有五醇(包括木糖醇)轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶的表達(dá)盒。這使得由此修飾的任何菌株對(duì)木糖發(fā)酵和/或生長(zhǎng)特別有效。該文件描述了2011年10月5日保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)為I-4538的酵母菌株作為例子。

專利申請(qǐng)WO2013178915A1也由申請(qǐng)人提交，其通過(guò)轉(zhuǎn)化酵母以使它們既能夠發(fā)酵戊糖和也能耐受至少一種發(fā)酵抑制劑而進(jìn)一步改進(jìn)了工藝。所述申請(qǐng)描述了通過(guò)組合靶向功能方面(戊糖轉(zhuǎn)化)和篩選中間分離子的乙酸抗性的過(guò)程獲得雜交酵母。在這種情況下，由“乙酸抗性”標(biāo)準(zhǔn)選擇的細(xì)胞差異很小。

最后，專利申請(qǐng)WO2013178918A1也源自申請(qǐng)人的工作，其旨在確保該方法獲得改進(jìn)的酵母菌株，該方法通過(guò)在遺傳學(xué)連接于接合型表達(dá)基因座的區(qū)域整合至少一種感興趣基因，然后與感興趣的MATa分離子雜交，意味著該方法能夠提供所需的一種或多種感興趣表型性狀，并與連接雜交基因座的遺傳修飾相結(jié)合。因此，經(jīng)遺傳修飾的酵母菌株的孢子形成后，一種或多種遺傳改變一起分離且都在相應(yīng)的接合型分離子(MATα)內(nèi)。具體而言，使用所述過(guò)程構(gòu)建雜交種為該雜交種提供的給定性狀的確定性，例如，能夠“代謝戊糖”的特性。這種原始的方法更令人感興趣，因?yàn)樗m用于任何基因，用于任何類型可能的改進(jìn)和用于具有單倍孢子體周期的任何酵母菌株。單倍孢子體周期是在單倍體和二倍體相之間交替的生殖周期，且在此期間，所述的微生物無(wú)論在單倍體狀態(tài)還是在二倍體狀態(tài)能夠通過(guò)有絲分裂增殖。

按照類似的方法，Demeke等，2013年，用于生物燃料的生物技術(shù)(Biotechnology for Biofuels)，6：89穩(wěn)定地將能夠利用D-木糖和L-阿拉伯糖的基因的表達(dá)盒整合入酵母基因組。獲得的雜交體還經(jīng)受誘變，單一基因組改組周期，然后通過(guò)它們使用富含抑制劑的培養(yǎng)基中的D-木糖的能力進(jìn)行選擇。作者提出增殖問(wèn)題，報(bào)告他們已經(jīng)獲得的菌株具有普通的增殖速度。他們提出導(dǎo)致較慢增殖速度的遺傳改變?cè)谡T變和基因組改組期間出現(xiàn)。這不鼓勵(lì)采用誘變和/或基因組改組來(lái)提高菌株對(duì)增殖的適應(yīng)性。

雖然旨在改進(jìn)工業(yè)酵母菌株，現(xiàn)有技術(shù)的工作一直沒(méi)有關(guān)注用于生物燃料工業(yè)制造過(guò)程中的關(guān)鍵步驟：增殖。也被稱為繁殖，增生或生物質(zhì)生產(chǎn)，增殖先于實(shí)際的發(fā)酵階段。目的是系統(tǒng)地獲得最佳量的生物質(zhì)以供發(fā)酵。它是由制造商完成，制造商將發(fā)酵生產(chǎn)中產(chǎn)生的汁液，通常是在要進(jìn)行發(fā)酵的復(fù)合培養(yǎng)基上。因此增殖汁液可以是富含戊糖的汁液，己糖汁，或戊糖和己糖的混合物。發(fā)酵培養(yǎng)基可能會(huì)略被稀釋，富含營(yíng)養(yǎng)成分，充氣以允許快速和充分的生長(zhǎng)，從而系統(tǒng)地允許滿意的發(fā)酵。礦物養(yǎng)分如氮和磷源以及諸如礦物質(zhì)也通常被提供并且比發(fā)酵中的比例更大。避免供給化合物如維生素和例如氨基酸或嘌呤或嘧啶酸的有機(jī)化合物，因?yàn)樗嘿F。制造商通常依賴由培養(yǎng)基本身或通過(guò)回收發(fā)酵培養(yǎng)基的供給?？梢钥紤]僅供給維生素，以使來(lái)自工業(yè)培養(yǎng)基的供給可靠，因?yàn)樗鼈兛梢允强勺兊?，并?dǎo)致變異生長(zhǎng)的發(fā)生。

除了增殖期間獲得的增長(zhǎng)量，酵母生長(zhǎng)速度也是成功增殖的關(guān)鍵點(diǎn)。實(shí)際上，酵母的生長(zhǎng)速度將限制增殖長(zhǎng)度，并通過(guò)環(huán)境污染物如乳酸桿菌(Lactobacilli)或野生酵母限制培養(yǎng)基的相對(duì)富集。過(guò)度的增殖污染將導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)率降低。即使細(xì)胞抑制劑如或啤酒花的酸提取物可被用來(lái)限制細(xì)菌的生長(zhǎng)，具有快速和顯著增長(zhǎng)的酵母仍是增殖和增殖轉(zhuǎn)入的發(fā)酵成功的關(guān)鍵。

所以具有在增殖時(shí)快速和顯著增長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求盡可能低的酵母是確保整個(gè)工業(yè)過(guò)程并使它最終有利可圖的關(guān)鍵點(diǎn)。

根據(jù)他們的菌株之一增殖能力差的反饋，申請(qǐng)人尋求顯著改善酵母菌株增殖的能力，同時(shí)保持遺傳穩(wěn)定并保持使用D-木糖且抵抗通常存在于木素纖維素“汁液”中的抑制劑的良好能力。換言之，他們已經(jīng)試圖修復(fù)菌株的代謝缺陷。

在這方面，本發(fā)明為獲得酵母菌株的方法，該菌株適合于在低營(yíng)養(yǎng)潛力的培養(yǎng)基上有效增殖且抵抗發(fā)酵抑制劑，同時(shí)保持其代謝戊糖的能力?！坝行А睉?yīng)理解為在至少兩個(gè)菌株之間作比較，以認(rèn)為在給定時(shí)間不產(chǎn)生與工業(yè)方法兼容的足夠的生物質(zhì)的作參比。該方法包括以下步驟：

a)用沒(méi)有缺陷的野生酵母菌株和重組酵母菌株雜交，其中所述重組酵母菌株包括至少一個(gè)拷貝的外源性木糖異構(gòu)酶基因和至少一個(gè)額外拷貝的D-木酮糖激酶基因，摻入基因組并連接于菌株的配對(duì)特性之一；

b)通過(guò)隨機(jī)孢子形成和/或雜交進(jìn)行至少兩個(gè)周期的基因組重排；

c)根據(jù)菌株代謝木糖的適應(yīng)度的標(biāo)準(zhǔn)選擇步驟b)獲得的群體；

d)根據(jù)菌株在低含氮堿基(nitrogenous base)的培養(yǎng)基，低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的適應(yīng)度的標(biāo)準(zhǔn)選擇步驟c)獲得的群體，

注意，兩個(gè)選擇階段可以顛倒。

如現(xiàn)有技術(shù)所建議的，不選擇孢子形成后得到的中間分離子的，例如抑制劑耐受能力，但它們直接經(jīng)歷基因組重組的幾個(gè)階段，而不在混合間選擇。值得一提的是必要的代謝戊糖的能力通過(guò)由申請(qǐng)WO2013/178918A1所述方法插入感興趣基因而得到實(shí)質(zhì)性保留。本發(fā)明的最終選擇是在差增殖性能的起源解除營(yíng)養(yǎng)缺乏。

本發(fā)明還涉及本方法獲得菌株，于2013年5月16日保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)為I-4749。

有利的是，本發(fā)明的另一個(gè)菌株也呈現(xiàn)GAL2基因過(guò)表達(dá)，允許木糖更好地進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)加入額外拷貝的該基因可能進(jìn)行過(guò)表達(dá)，這還取決于組成型pADH1啟動(dòng)子。后者通?？刂艫DH1基因的表達(dá)。由此獲得的'子'菌株于2013年12月12日保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)為I-4829。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的菌株的應(yīng)用，將糖特別是己糖和戊糖轉(zhuǎn)化成乙醇。

為了確保根據(jù)本發(fā)明方法得到的菌株的有效增殖，發(fā)明人限定各種“基本”培養(yǎng)基。

基本培養(yǎng)基是包括碳(CxHyOz)源，礦物氮源，鉀源，磷源，硫源，鎂源，鈣源，鐵源，微量元素及水源的培養(yǎng)基。它是低營(yíng)養(yǎng)值的培養(yǎng)基。

下表I匯集發(fā)明人使用的各種培養(yǎng)基：低營(yíng)養(yǎng)潛力，低含氮堿基，本發(fā)明方法中使用的“優(yōu)選培養(yǎng)基”。該培養(yǎng)基可以是用于本發(fā)明菌株的基本培養(yǎng)基，但證實(shí)是不符合本發(fā)明的菌株的亞基本培養(yǎng)基。

表I：培養(yǎng)基

YE＝酵母提取物

還提及：

·優(yōu)選培養(yǎng)基補(bǔ)充有3g/L假絲酵母(Candida utilis)的RNA的水解產(chǎn)物，通過(guò)添加RNA酶A至30μg/L來(lái)水解，在以下文本和附圖中稱為“優(yōu)選+含氮堿基”；

·YFI2培養(yǎng)基含有：酵母提取物10g/kg，細(xì)菌用蛋白胨為10g/kg，葡萄糖55克/升，木糖45克/升，醋酸4g/L，調(diào)節(jié)至pH 4.4；

·YEG培養(yǎng)基包含：酵母提取物10g/L，葡萄糖為20g/L和瓊脂糖20g/L。

然后，假設(shè)是得到的菌株在將使用它來(lái)生產(chǎn)生物乙醇的生產(chǎn)者的復(fù)雜培養(yǎng)基中將具有有效增殖能力。

為了更好地理解本發(fā)明給出以下定義。

術(shù)語(yǔ)“酵母菌株”指的是相對(duì)均勻的酵母細(xì)胞群體。分離克隆獲得酵母菌株?？寺‘a(chǎn)生從單一酵母細(xì)胞獲得的細(xì)胞的群體。

分離對(duì)應(yīng)于這樣的情形，在其間，減數(shù)分裂結(jié)束時(shí)，倍性水平降低。通過(guò)擴(kuò)增，分離子是來(lái)自倍性水平大于1的細(xì)胞的減數(shù)分裂的活細(xì)胞。

術(shù)語(yǔ)“衍生的酵母菌株”是指通過(guò)一次或多次雜交和/或通過(guò)突變和/或通過(guò)基因轉(zhuǎn)化得到的酵母菌株。

通過(guò)雜交衍生的酵母菌株可以通過(guò)本發(fā)明的酵母菌株與相同的酵母菌株、與本發(fā)明的另一酵母菌株、或與任何其他的酵母菌株(前提是它可以被雜交，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，它對(duì)于MAT基因座是純合的，并且在STE基因沒(méi)有突變)雜交育種來(lái)獲得。

通過(guò)突變衍生的酵母菌株可以是這樣一種酵母菌株，在其基因組中有至少一種自發(fā)突變或誘變引起的至少一個(gè)突變。衍生菌株的突變可以是沉默或沒(méi)有。

表述“誘變”是指突變的出現(xiàn)過(guò)程。通常，兩種方法是可能的：隨機(jī)誘變，和插入或定向誘變。第一種方法包括應(yīng)用物理處理(如UV輻射)或化學(xué)誘變劑處理，其將在所研究生物體的基因組中隨機(jī)誘發(fā)突變。第二種方法將使用分子生物學(xué)方法在基因組區(qū)域或特定基因座產(chǎn)生特定的修飾(即啟動(dòng)子，基因，終止子等)?；蜃糜诒硎救旧w上特定和恒定的物理位置。

遺傳轉(zhuǎn)化衍生的酵母菌株是在其中引入DNA序列的酵母菌株，優(yōu)選通過(guò)質(zhì)粒提供或直接摻入基因組中。

己糖用來(lái)指作為碳源的含6個(gè)碳原子的糖，也被稱為C6糖或更簡(jiǎn)單C6。單體形式的己糖的主要代表是葡萄糖，果糖和半乳糖。通過(guò)類比，戊糖是具有5個(gè)碳原子的糖，也被稱為C5糖或C5糖。戊糖的主要單體代表是D-木糖和L-阿拉伯糖。

增殖是指繁殖，增生或生物質(zhì)產(chǎn)生，將有助于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。它可以在天然培養(yǎng)基上，例如從植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，或在富或貧合成培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)。通常，增殖在富培養(yǎng)基上較快，在貧培養(yǎng)基上不太有效，要求細(xì)胞具有強(qiáng)代謝能力從而克服培養(yǎng)基的低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(或不足)。來(lái)自植物生物質(zhì)轉(zhuǎn)化的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物是復(fù)雜的環(huán)境，它可以是主要包含戊糖的汁液，主要包含己糖的汁液或包含戊糖和己糖混合物的汁液。從工業(yè)的角度來(lái)看，“富”合成培養(yǎng)基當(dāng)然為增殖最有效的選擇，但它在經(jīng)濟(jì)上不可行?；九囵B(yǎng)基(即包括最低限度)將會(huì)更有效，但限定它的成分并不簡(jiǎn)單。出于這些原因以及工業(yè)過(guò)程連續(xù)的原因，增殖是在前一步驟得到的組合物上，換句話說(shuō)，在木質(zhì)纖維素汁液上最常進(jìn)行的。綜述可參見(jiàn)Bellissimi E,Richards C:酵母增殖(Yeast propagation)。醇教科書(shū)(The alcohol textbook)，飲料，燃料和工業(yè)酒精工業(yè)的參考。第5版。Ingledew WM,Kelsall DR,Austin GD,Kluhspies C編輯。諾丁漢：大學(xué)出版社；2009：145-159。

菌株的代謝不足被理解為一個(gè)或多個(gè)代謝途徑失效，導(dǎo)致酵母的生長(zhǎng)或發(fā)酵缺陷。營(yíng)養(yǎng)缺陷型被理解為在給定的培養(yǎng)基上無(wú)法產(chǎn)生代謝中間體和酵母發(fā)育的必要物質(zhì)，即代謝缺陷，意味著如果沒(méi)有外源提供于此必不可少的所有營(yíng)養(yǎng)，該菌株不會(huì)增長(zhǎng)。

原養(yǎng)型酵母菌株是能夠在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株。尤其是，根據(jù)本發(fā)明的原養(yǎng)型酵母菌株是能夠合成其生長(zhǎng)所必需的所有含氮堿基。

抑制劑被理解為在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中從頭存在的或在酒精發(fā)酵期間形成的抑制劑，其包括酚醛樹(shù)脂，糠醛和其衍生物，羥基-甲基糠醛和它的衍生物，或甚至弱酸如乙酸，甲酸或乳酸。還已知的是，這些抑制劑對(duì)酵母的性能或甚至存活是有害的。此外，滲透壓，pH值(特別是高酸性)，溫度(大于35℃)，或生產(chǎn)的乙醇也可以抑制或至少限制菌株的發(fā)酵能力。

能代謝木糖的酵母菌株是能夠轉(zhuǎn)化木糖為乙醇，即能夠發(fā)酵木糖的酵母菌株。

木糖轉(zhuǎn)化成乙醇是木糖到木酮糖的直接或間接異構(gòu)化的結(jié)果，隨后在戊糖磷酸通路上的非氧化部分使用這樣獲得的木酮糖。

在本發(fā)明的意義內(nèi)，能代謝木糖的酵母菌株是指在厭氧條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基(每千克培養(yǎng)基包括55克葡萄糖和45克木糖)中在60小時(shí)內(nèi)將至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的酵母菌株。

用于測(cè)量木糖轉(zhuǎn)化成乙醇百分比的酵母菌株的接種量?jī)?yōu)選為0.25克干物/千克發(fā)酵培養(yǎng)基。

從酵母菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基開(kāi)始計(jì)算60小時(shí)持續(xù)時(shí)間。

用于測(cè)量木糖轉(zhuǎn)化為乙醇百分比的發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)優(yōu)選是合成培養(yǎng)基。

合成培養(yǎng)基是其確切的化學(xué)組成已知的培養(yǎng)基。

發(fā)酵優(yōu)選在32℃，在培養(yǎng)基攪拌下進(jìn)行，例如90rpm。

攪拌適度以便不充氧。

培養(yǎng)基的pH值應(yīng)是可控制的，例如通過(guò)酸/堿對(duì)的緩沖能力，例如YFGX培養(yǎng)基中乙酸/乙酸鹽緩沖能力。

由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的手段測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中存在的乙醇的量。

可以直接測(cè)量所產(chǎn)生的乙醇，或通過(guò)相關(guān)的乙醇生產(chǎn)參數(shù)，如質(zhì)量損失間接測(cè)量。

例如，可以通過(guò)色譜法，包括HPLC(高效液相色譜法)，酶促試劑盒(例如勃林格試劑盒檢測(cè)乙醇)，或由重鉻酸鉀測(cè)定測(cè)量乙醇產(chǎn)量。

發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖的量由本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定，優(yōu)選通過(guò)色譜法，特別是HPLC。

通過(guò)使用同時(shí)含有葡萄糖和木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基，可評(píng)估各種酵母菌株從可比較量的生物質(zhì)將木糖向乙醇的轉(zhuǎn)化情況。實(shí)際上，酵母菌株首先從葡萄糖和木糖的混合物發(fā)酵葡萄糖，然后是葡萄糖和木糖，然后是木糖。

在有至少一種發(fā)酵抑制劑存在下代謝木糖的能力被稱為耐受所述發(fā)酵抑制劑。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出菌株I-4538(重組親株，2011年10月5日保藏在CNCM)，EGAc1，2014年3月13日保藏在CNCM，編號(hào)I-4839(野生親株)和I-4749(根據(jù)本發(fā)明的菌株，2013年5月16日保藏在CNCM)在具有低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的優(yōu)選+含氮堿基和優(yōu)選的培養(yǎng)基上的各自增殖。

圖2示出在模擬工業(yè)增殖培養(yǎng)基的合成培養(yǎng)基上，本發(fā)明的菌株I-4749的增殖和親本株I-4538的增殖之間的比較。

圖3示出由野生株EGAc1(I-4839)，重組親本株Ⅰ-4538和本發(fā)明的I-4749的菌株的乙醇產(chǎn)量。

發(fā)明詳述

首先，菌株I-4538看來(lái)有代謝缺陷，其不利地影響其在復(fù)雜培養(yǎng)基上的增殖效率。所述菌株I-4538是根據(jù)專利WO 2012072793A1所得菌株之一，包含至少一拷貝的編碼木糖異構(gòu)酶的外源性基因，和一拷貝的編碼木糖醇脫氫酶的外源性基因。它還包含用于戊糖磷酸通路的基因和XKS1基因的至少一拷貝。在實(shí)際應(yīng)用中，該菌株具有良好的能力以代謝木糖和耐受生物質(zhì)水解得到的抑制劑，如酚醛產(chǎn)品，糠醛及乙酸。因此，分析在另外含有木糖的貧含氮堿的培養(yǎng)基上的增殖階段以進(jìn)行后續(xù)的改善?？磥?lái)水解的RNA，或者稱為含氮堿基，非常有利于菌株I-4538的生長(zhǎng)。有趣的是，含有葡萄糖的培養(yǎng)基上不存在此營(yíng)養(yǎng)缺陷，這表明生物合成途徑是功能性的，但在含木糖的培養(yǎng)基內(nèi)調(diào)節(jié)不良。由于酵母天然不能夠代謝這種糖，有可能是含氮堿基合成所需的基因的表達(dá)不充分。此外，導(dǎo)致獲得該菌株的UV輻射和遺傳轉(zhuǎn)化的各個(gè)階段都可能導(dǎo)致這些缺陷。

作為第一步，菌株I-4538與沒(méi)有缺陷的野生株(實(shí)施例和附圖中的參比菌株EGAc1，2014年3月13日保藏在CNCM，編號(hào)I-4839)雜交。野生型菌株是指未作遺傳學(xué)修飾的菌株。此步驟獲得雜交種，它的代謝缺陷被部分修復(fù)，但其丟失快速發(fā)酵木糖的實(shí)質(zhì)性能力。

雜交步驟是根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如在第7章教導(dǎo)的那些，R.R.Fowell的“產(chǎn)孢和酵母的雜交”，參考工作“酵母菌”，第1卷，A.H.Rose和J.S.Harrison出版，1969年，學(xué)術(shù)出版社。

第二步驟是隨機(jī)基因組重組，更具體地，通過(guò)基因組重排的四個(gè)周期。這些周期在兩個(gè)步驟之間進(jìn)行，不作選擇。此步驟是根據(jù)改編自Hou,2009,Biotechnol.Lett.,31:671-677的方法完成。

根據(jù)代謝木糖的適宜性標(biāo)準(zhǔn)，然后根據(jù)在低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值培養(yǎng)基上的增殖能力，特別是在含氮堿基的增殖培養(yǎng)基上的擴(kuò)增能力的標(biāo)準(zhǔn)，選擇得到的群體。

兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)可以顛倒。即，有可能首先選擇在缺陷型培養(yǎng)基上繁殖的能力，然后選擇發(fā)酵木糖的能力，或首先選擇發(fā)酵木糖的能力，然后選擇在缺陷型培養(yǎng)基上繁殖的能力。

得到的菌株保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)I-4749。

有趣的是，在含有木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上對(duì)含氮堿基的營(yíng)養(yǎng)缺陷型的去除可以傳到菌株I-4749的直線遺傳菌株。以這種方式，各種菌株，包括保藏的菌株I-4829，獲自菌株I-4749。事實(shí)上，觀察到蛋白Gal2p是己糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其也能轉(zhuǎn)運(yùn)木糖(Hamacher等.2002,Microbiology,148:2783-2788)。因此，改善已經(jīng)能夠發(fā)酵木糖的酵母菌株，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)捕獲木糖的能力是有吸引力的。出于這個(gè)原因，將一拷貝的基因GAL2，取決于強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子(pADH1)，引入菌株的基因組中。它編碼促進(jìn)木糖進(jìn)入細(xì)胞的通道。該菌株是本發(fā)明的酵母菌株。通過(guò)這種額外遺傳修飾獲得的菌株已經(jīng)保藏于CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)為I-4829。

通過(guò)培養(yǎng)本發(fā)明的酵母菌株或本發(fā)明衍生的酵母菌株獲得酵母，特別如以下參考書(shū)籍：“酵母技術(shù)”，第2版，1991，G.Reed和T.W.Nagodawithana,Van Nostrand Reinhold出版,ISBN 0-442-31892-8。

在工業(yè)規(guī)模上，酵母的增殖通常包括下組步驟中的前兩個(gè)步驟：

-在幾個(gè)階段，首先在半?yún)捬蹼A段，然后在好氧階段增殖酵母菌株，

-如果酵母膏與滲透產(chǎn)物混合，為獲得包含約12至25％干物質(zhì)或甚至更高量的干燥材料的液體酵母膏，通過(guò)離心分離從酵母培養(yǎng)基中產(chǎn)生的酵母，

-通常采用旋轉(zhuǎn)真空過(guò)濾器過(guò)濾獲得的液體酵母膏，從而獲得包含26-35％干物質(zhì)的新鮮脫水酵母，

-混合所述新鮮脫水酵母以獲得均勻的團(tuán)塊，

-擠壓由此得到的酵母，以便獲得：

○壓榨酵母，新鮮塊狀酵母形式或弄碎的鮮酵母形式，含有約30％的干物質(zhì)，或

○顆粒形式的酵母，通常是粒狀，如果要干燥酵母的話，

-在熱空氣流中，例如通過(guò)流體化，可控干燥通過(guò)擠出獲得的酵母顆粒，以得到干酵母。

優(yōu)選地，干燥步驟是在乳化劑存在下的快速可控干燥。

在可以在干燥階段中使用的乳化劑中，可能選擇山梨醇單硬脂酸酯，例如，在約1.0％(以重量計(jì)，干酵母的重量)的濃度使用。

本發(fā)明的酵母可以以任何可能的形式使用。

例如，本發(fā)明的主題是如上述所定義的酵母，其特征在于它是酵母膏，壓榨酵母，干酵母或冷凍酵母的形式。

本發(fā)明的主題還是產(chǎn)生至少一種發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括在厭氧或半?yún)捬鯒l件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵酵母，例如以上定義的酵母的步驟。

發(fā)酵產(chǎn)物特別選自乙醇，乙醇獲得的代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝物。

本發(fā)明的一種優(yōu)選的發(fā)酵產(chǎn)物是乙醇。

乙醇產(chǎn)品獲自酒精發(fā)酵。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定酒精發(fā)酵的合適條件。

例如，可以參考以下參考書(shū)中描述的酒精發(fā)酵條件：“酵母技術(shù)”，第2版，1991，G.Reed和T.W.Nagodawithana,Van Nostrand Reinhold出版,ISBN 0-442-31892-8。

發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列元素：至少一可發(fā)酵碳源，至少一氮源，至少一硫源，至少一磷源，至少一維生素源和/或至少一礦物質(zhì)源。

例如，碳源以立即可用于酵母的糖，戊糖如木糖，甘油，乙醇或它們的組合的形式提供。

立即可用于酵母的糖是，例如葡萄糖，果糖或半乳糖型的單糖，蔗糖型二糖或這些糖的混合物。

碳源可以葡萄糖糖漿，果糖糖漿，蔗糖糖漿，糖蜜，廢糖蜜(第2次糖結(jié)晶廢母液)，全部或植物材料的水解產(chǎn)物或它們的混合物的形式提供。

氮源是，例如以硫酸銨，氫氧化銨，磷酸氫二銨，氨，尿素，或它們的組合的形式提供。

硫源是，例如以硫酸銨，硫酸鎂，硫酸，和/或它們的組合的形式提供。

磷源是，例如以磷酸，磷酸鉀，磷酸二氫銨，磷酸一銨和/或它們的組合的形式提供。

維生素源是，例如以糖蜜，酵母水解物，純的維生素溶液或純維生素的混合物和/或它們的組合的形式提供。

維生素源向酵母供應(yīng)的所有維生素的量至少等同于參考書(shū)所推薦的量。幾個(gè)來(lái)源的維生素可以組合。

礦物質(zhì)源是，例如以糖蜜，礦物鹽的混合物和/或它們的組合物的形式提供。

礦物質(zhì)源向酵母供應(yīng)常量營(yíng)養(yǎng)元素和微量礦物質(zhì)的量至少等同于參考書(shū)所推薦的量。幾個(gè)礦物質(zhì)源可以組合。

同一物質(zhì)可以提供多種不同的元素。

本發(fā)明的主題是如上限定的方法，用于生產(chǎn)至少一種發(fā)酵產(chǎn)品，優(yōu)選乙醇，包括在厭氧或半?yún)捬鯒l件下，通過(guò)例如以上定義的酵母在包括木糖和/或至少一種發(fā)酵抑制劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵的步驟。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基包括所有或部分植物材料的至少一種水解產(chǎn)物。

所有或部分植物材料的水解產(chǎn)物可通過(guò)預(yù)處理植物材料步驟獲得，例如，在高溫并在酸或有機(jī)溶劑的存在下，隨后通過(guò)酶和/或化學(xué)和/或熱途徑全部或部分水解糖聚合物。

因此，所有或部分植物材料的水解產(chǎn)物包括糖聚合物，如纖維素，半纖維素和淀粉的水解得到的糖的混合物。

發(fā)酵抑制劑例如選自有機(jī)酸，糠醛，HMF(羥基-甲基-糠醛)，一種或多種酚類化合物和滲透壓。

有機(jī)酸例如選自乙酸，乳酸，甲酸和乙酰丙酸。

本發(fā)明的主題還涉及如上述所定義的酵母的應(yīng)用，用于生產(chǎn)至少一種發(fā)酵產(chǎn)物，優(yōu)選在含有木糖和至少一種發(fā)酵劑的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。即，利用本發(fā)明的酵母能夠轉(zhuǎn)化和代謝含有木糖的植物來(lái)源的材料。

發(fā)酵產(chǎn)物如上所定義。

優(yōu)選地，發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)是乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基如上所定義。

下面的實(shí)施例旨在更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式進(jìn)行限制。

實(shí)施例

重組菌株與野生菌株雜交，然后產(chǎn)孢

保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)，編號(hào)為I-4538的重組菌株與野生菌株雜交，在這種情況下，是申請(qǐng)人的菌株EGAc1(I-4839)。這一步驟是根據(jù)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如由以下內(nèi)容教導(dǎo)：R.R.Fowell的"酵母的孢子形成和雜交(Sporulation and Hybridization of Yeast)"第7章，參考"酵母(The Yeasts)",第1卷,A.H.Rose和J.S.Harrison編輯,1969-學(xué)術(shù)出版社。

如此獲得2014年3月13日保藏在CNCM編號(hào)為I-4840的EGAc2菌株。該菌株表現(xiàn)出良好的代謝木糖性能，只有部分修復(fù)的缺陷。實(shí)際上，在基本包括木糖和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的低營(yíng)養(yǎng)價(jià)值培養(yǎng)基上，增殖質(zhì)量仍然很差。

孢子形成在液體介質(zhì)中進(jìn)行，無(wú)氮源，含有不可發(fā)酵的碳源，優(yōu)選乙酸鹽，理想地是乙酸鉀。

分離子富集的快速方法的建立

因?yàn)樗坪鯖](méi)有可能獲得100％的分離子，排除沒(méi)有完成減數(shù)分裂的二倍體是必要的。

要做到這一點(diǎn)，通常執(zhí)行子囊解剖方法，但非常耗時(shí)。因而，本申請(qǐng)人利用了孢子的不同特征，即它們對(duì)溫度(Williams,1936,J.Bacteriol.,32(6):589-597)，某些營(yíng)養(yǎng)素的缺乏(Ho和Miller,1978,Can.J.Microbiol.,24(3):312-320)或一些有機(jī)溶劑(Dawes和Hardie,1974,Mol.Gen.Genet.,131(4):281-289)的耐受能力更強(qiáng)而知名。

在這種情況下，使用基于由Dawes和Hardie(同上)描述的醚富集的方法。實(shí)際上，這種方法簡(jiǎn)單而有效。

事實(shí)上，由于分離子在二倍體的膜內(nèi)形成，它們不是由一個(gè)磷脂雙層，而是兩個(gè)包圍。另一方面，二倍體只有一個(gè)。當(dāng)在最佳的接觸時(shí)間(不同菌株之間有所不同)使用時(shí)，醚破壞二倍體膜。因此，醚由于兩個(gè)原因而有吸引力。首先，如果接觸時(shí)間不會(huì)太長(zhǎng)，它殺死二倍體而不影響分離子。另一方面，它降解維持四聯(lián)體形式的分離子的子囊的磷脂雙層，其結(jié)果是釋放它們，并允許它們出芽。

這種方法適用于本申請(qǐng)人的工業(yè)菌株。酵母懸浮液和醚之間的接觸時(shí)間必須被密切監(jiān)視。為做到這一點(diǎn)，2毫升乙醚與含大約2×10⁷孢子形成結(jié)構(gòu)的2毫升酵母懸浮液接觸。在孢子形成條件下5天后獲得孢子形成。然后在30秒至2分鐘的總接觸時(shí)間作整體渦旋攪拌。

含有每毫升1000個(gè)細(xì)胞的等份試樣以100μL/皿的水平立即散布到培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含有：

酵母提取物5g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂30g/L，水補(bǔ)充至1升。48小時(shí)增長(zhǎng)后，通過(guò)使用如申請(qǐng)WO2013/178918A1中描述的分別對(duì)應(yīng)Mat1、Mat2和Mat3引物的SEQ ID no.1、SEQ ID no.2和SEQ ID no.3引物將菌落用于做“菌落PCR”。該P(yáng)CR分析的目的是區(qū)分二倍體菌株與單倍體菌株。

不同接觸時(shí)間的試驗(yàn)表明，在菌株EGAc2(Ⅰ-4840)的情況下，暴露1分鐘足以富集超過(guò)98％的單倍體菌株。

批量雜交方法的建立

通過(guò)執(zhí)行批量相雜交從分離子富集的懸浮液產(chǎn)生新的雜交體。為做到這一點(diǎn)，1mL分離子懸浮液接種入50毫升YPG培養(yǎng)基，含酵母提取物10g/L，細(xì)菌用蛋白胨為20g/L，葡萄糖20g/L和蒸餾水補(bǔ)充至1升。在該培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)16小時(shí)后，顯微鏡觀察確認(rèn)接合子形成。為了促進(jìn)這些雜交體的發(fā)育，每24小時(shí)，將200微升培養(yǎng)物接種到50毫升新鮮YEG培養(yǎng)基。次培養(yǎng)5天后，在大孢子形成周期，新的雜交體可以被再引入。

為了確保這批量雜交步驟的效率，每個(gè)含有YEG的培養(yǎng)皿分布100個(gè)細(xì)胞。然后在DNAg上通過(guò)PCR分析構(gòu)成139形成菌落的細(xì)胞的再生特性。這些菌落被隨機(jī)地選擇。使用引物SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3(同上)實(shí)施PCR，顯示測(cè)試的139個(gè)菌落中僅2菌落是單倍體。

在所產(chǎn)生的雜交群體內(nèi)確認(rèn)基因組重排

起始雜交種的基因型的分析

驗(yàn)證基因組重排質(zhì)量的方法之一包括研究連接到基因GRE3的兩個(gè)基因座的等位基因的分布。實(shí)際上，在C5菌株內(nèi)進(jìn)行對(duì)應(yīng)于“gre 3空(gre3null)”基因型的基因GRE3的兩個(gè)拷貝的缺失，導(dǎo)致獲得菌株I-4538。這種破壞傳遞給菌株EGAc2(Ⅰ-4840)，因?yàn)镋GAc1(I-4839)內(nèi)沒(méi)缺失GRE3，因此它是雜合的。

已經(jīng)查找這一特點(diǎn)在菌株EGAc2(I-4840)的衍生分離子內(nèi)可能的傳遞。采用GRE3的pGRE3TAGTTGTCAGTGCAATCCTTC啟動(dòng)子特異性引物(SEQ ID NO：4)和tGRE3TATACACATATACAGCATCGGA終止子特異性引物(SEQ ID NO：5)完成PCR。結(jié)果表明，有可能區(qū)分獲得1200BP(堿基對(duì))片段的基因GRE3的野生拷貝和獲得200BP片段的缺失形式。

因此菌株EGAc2(I-4840)的一些分離子僅呈現(xiàn)缺失版本，而其他僅呈現(xiàn)GRE3野生拷貝。更令人驚訝地，第三類分離子有2拷貝的基因GRE3，一個(gè)野生型，而另一個(gè)缺失。這一結(jié)果由以下事實(shí)說(shuō)明，菌株EGAc1(I-4839)內(nèi)沒(méi)有兩個(gè)，但有四拷貝的GRE3基因。在這種情況下，在EGAc1分離子(I-4839)內(nèi)有兩拷貝的GRE3基因，其產(chǎn)生EGAc2(I-4840)。因此菌株EGAc2(I-4840)的基因型如下：

這樣的基因型是由于在菌株EGAc1(I-4839)中在兩個(gè)不同基因座存在GRE3，在菌株I-4538僅一個(gè)基因座。此外在菌株I-4538內(nèi)，GRE3基因已缺失。因此，在菌株EGAc2(I-4840)的第一輪基因組重排結(jié)束時(shí)獲得的137二倍體菌株中，GRE3基因和雜交體中等位基因的分布已被研究。

期望分離子的測(cè)定

相對(duì)于GRE3基因型，像EGAc2(I-4840)的雜交種因此可以獲得4種分離子。這些分離子列于下表II。具有基因型gre3Δ；；-和GRE3；GRE3的分離子稱為親本基因型，因?yàn)槿克鼈兊牡任换蛟醋詥斡H。與此相反，分離子GRE3；-和gre3Δ；GRE3稱為重組體。對(duì)于每一種情況，有MATa形和MATα形。

表II：各種可獲得分離子的基因型

分析基因組重排質(zhì)量的方法包括在分離子內(nèi)找尋親本雜交種的等位基因分布。因此，假設(shè)該基因座是獨(dú)立的，獲得親本分離子的概率等于獲得重組分離子的概率。

然而，該方法試圖不選擇分離子而工作。實(shí)際上，目的是檢測(cè)已實(shí)際參與雜交種的形成的孢子。因此從雜交種進(jìn)行基因分析。

分析得到的雜交種

可能在基因組重排結(jié)束時(shí)得到的雜交種示于表III。各類雜交種的基因型引用于相應(yīng)的框中。這些基因型根據(jù)利用pGRE3(SEQ ID NO：4)和tGRE3(SEQ ID NO：5)引物的PCR情況被分成3組：

組1：200BP大小(表中的白格)單一條帶

組2：200BP和1200的BP(在中淺灰格)的兩個(gè)條帶

組3：1200BP(表中深灰色格)單一條帶

表III：可以得到的各種雜交種的基因型。行2和列2，這些都是分離子，其他框是雜交種。

可以容易地識(shí)別組1雜交種，因?yàn)楫?dāng)使用pGRE3和tGRE3引物時(shí)，它們呈現(xiàn)出與I-4538菌株相當(dāng)?shù)腜CR圖。值得注意的是，具有這種基因型的全部雜交種是MATa；gre3Δ；-和MATα；gre3Δ；-分離子。假設(shè)遺傳獨(dú)立，這些雜交種應(yīng)占群體的1/16或6.25％。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，通過(guò)PCR分析前面提到的137個(gè)雜交種的基因型。結(jié)果示于下表IV。

表IV：所得雜交種的基因型的PCR分析結(jié)果

組1雜交種比例過(guò)高(11.6％而非6.25％)表明GRE3的兩基因座不是獨(dú)立的。換句話說(shuō)，這意味著在減數(shù)分裂中，具有親本型分離子的概率大于具有重組型分離子的概率。此外這導(dǎo)致可以檢測(cè)遺傳距離cM。通過(guò)下式獲得該遺傳距離：

在該分析中，分離子的總數(shù)是雜交種的數(shù)量乘以2(為274)。

通過(guò)從分離子的總數(shù)中減去親本分離子的數(shù)目得到重組分離子的數(shù)目。如上所示，組1雜交種僅由親本分離子構(gòu)成。這意味著具有g(shù)re3Δ；-親本分離子的概率等于具有組1的雜交種的概率的平方根。此外，減數(shù)分裂期間親本分離子是等概率的。因此重組分離子的數(shù)目可以由下面的等式確定：

重組分離子的數(shù)目＝分離子的總數(shù)-親本分離子的數(shù)目

以及：

因此，親本分離子數(shù)為186，且因此重組分離子數(shù)為88。這個(gè)結(jié)果表明兩基因座之間的遺傳距離為32cM。這個(gè)遺傳距離計(jì)算用于檢測(cè)具有各類分離子的概率。

最終群體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的起始細(xì)胞數(shù)量的估算

測(cè)量群體多樣化的質(zhì)量的相關(guān)重點(diǎn)是測(cè)定在整個(gè)處理過(guò)程存活下并留在最終群體內(nèi)的起始雜交種的數(shù)量。有可能基于GRE3基因型的檢測(cè)結(jié)果估算它們的數(shù)量。事實(shí)上，PCR圖存在兩個(gè)條帶(200BP和1200BP)的細(xì)胞為基因組重排獲得的雜交種，或?yàn)樵谝颐迅患^(guò)程中沒(méi)有被殺死的起始細(xì)胞。

組2的菌株＝組2的真實(shí)雜交種+存活起始細(xì)胞

前段得到的結(jié)果允許測(cè)定組2的真實(shí)雜交種的數(shù)量和組2的菌株的數(shù)量。

為檢測(cè)組2的真實(shí)雜交種的數(shù)量，必須將構(gòu)成該組的各類雜交種的比例加到一起。下表V列出各種雜交種，以及獲得它們的概率。獲得某類雜交種的概率是基于獲得進(jìn)入該類的兩分離子的概率的乘積。在前面的子章節(jié)表明親本分離子代表68％的分離子(或34％的各親本分離子)。因此，重組分離子示為32％的全部分離子(即16％各個(gè)重組分離子)。

表V：獲得各類雜交種的概率。對(duì)于組1，組2和3的雜交種的顏色代碼分別與表III和IV中相同。

表V中的結(jié)果表明組2雜交種的比例(淺灰)是63.4％。同時(shí)，組2的菌株的比例示為群體的64.5％。因此，看來(lái)在測(cè)試的群體中，約1％的雜交種是乙醚富集過(guò)程中沒(méi)有被殺死的起始菌株。

群體構(gòu)建總結(jié)

總之，有可能從單一的起始雜交種構(gòu)建菌株群體。結(jié)果表明，批量雜交和孢子形成的4階段后產(chǎn)生的這種新群體是廣泛基因組改組的產(chǎn)物。

所得群體內(nèi)所需個(gè)體的選擇

驗(yàn)證基因組重排質(zhì)量后，基于它們發(fā)酵木糖的同時(shí)抵抗抑制劑的能力選擇得到的酵母。

為做到這一點(diǎn)，在培養(yǎng)基YFI1上培養(yǎng)它們48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到Y(jié)FX培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)。(注意，培養(yǎng)基的組成示于表I(同上)或在表格后的文本中)。第二群體的樣本分散在YEG培養(yǎng)基(同上)上。這最后一步導(dǎo)致，除其他外，以編號(hào)I-4749保藏在CNCM(微生物培養(yǎng)物國(guó)家保藏中心，法國(guó)巴斯德研究所，博士魯街25號(hào)，巴黎75724郵箱15)的菌株的分離。

優(yōu)化增殖的驗(yàn)證

最初，在優(yōu)選培養(yǎng)基和優(yōu)選+含氮堿基培養(yǎng)基上測(cè)試菌株的增殖。示于圖1中。這些結(jié)果表明：

-菌株Ⅰ-4538，用于本發(fā)明的重組菌株，在優(yōu)選+含氮堿基培養(yǎng)基上有效增殖，但在優(yōu)選培養(yǎng)基上增殖非常差；

-菌株EGAc1(I-4839)，根據(jù)本發(fā)明野生型與菌株I-4538雜交，在優(yōu)選培養(yǎng)基或優(yōu)選+含氮堿基培養(yǎng)基上不能有效增殖；

-本發(fā)明的菌株I-4749在優(yōu)選培養(yǎng)基有效增殖。

工業(yè)型培養(yǎng)基上增殖的驗(yàn)證

YFC培養(yǎng)基(示于表I，同上)已被定義為模擬己糖(例如葡萄糖，半乳糖等)和戊糖(例如木糖，阿拉伯糖等)的工業(yè)培養(yǎng)基型混合物的條件。菌株I-4538(親本菌株)和I-4749(本發(fā)明的菌株)在該培養(yǎng)基上各自的增殖已經(jīng)被驗(yàn)證。圖2示出這些結(jié)果，并表明本發(fā)明的菌株增殖效率大于2。

發(fā)酵適用性驗(yàn)證

本發(fā)明的菌株已用于在接近實(shí)際培養(yǎng)基的培養(yǎng)基內(nèi)發(fā)酵。用于該目的的YF I2培養(yǎng)基包括葡萄糖和木糖，即，C6和C5糖。監(jiān)測(cè)發(fā)酵期間質(zhì)量損失的結(jié)果示于圖3。在實(shí)施的所有菌株的情況下，發(fā)酵是兩階段的。

在第一階段中，菌株EGAc1(Ⅰ-4839)和EGAc2(Ⅰ-4840)表現(xiàn)出相同的方式。這相同適用于本發(fā)明的菌株I-4749。然而，菌株I-4538在該第一階段較慢?？紤]由葡萄糖降解物阻遏的原理，很可能是發(fā)酵的該第一部分對(duì)應(yīng)于葡萄糖的消耗。

在發(fā)酵的第二階段，值得注意的是所有菌株顯著放緩。然而，最有效的菌株是菌株I-4538和I-4749。該第二階段可能對(duì)應(yīng)木糖的消耗，由菌株EGAc1(I-4839)([木糖-]表型的)不發(fā)酵的事實(shí)暗示。

記錄表明，所有實(shí)施菌株之間的最佳平衡是本發(fā)明獲得的I-4749。