本發(fā)明涉及生產(chǎn)適合于治療應(yīng)用的高質(zhì)量抗體的方法。

背景技術(shù)：

基于生物制品的新型免疫調(diào)節(jié)藥物對(duì)于患有嚴(yán)重的慢性疾病例如各種類(lèi)型的癌癥和炎性疾病的許多患者而言代表了一種革命。

許多生物藥物是以抗體為基礎(chǔ)的。因而在本領(lǐng)域中需要用于提供極高純度的高質(zhì)量治療性抗體的方法。使用蛋白A親和色譜法、離子交換色譜法和疏水作用色譜法純化IgG是已知的(EP 746398)。使用蛋白A色譜法從錯(cuò)誤折疊的抗體種類(lèi)中分離單體IgG也是已知的(US 5429746)。由US 5641870得知，使用具有極低pH(2.5-4.5)的緩沖液通過(guò)HIC純化抗體適合于F(ab′)₂抗體的純化。

關(guān)于一些抗體的純化，可形成諸如抗體二聚體或高階聚集體的抗體聚集體，并且在一些情況下，它們可能難以使用分析方法來(lái)分離。因而在本領(lǐng)域中需要用于去除抗體聚集體的改進(jìn)方法。特別是，在本領(lǐng)域中需要用于提供來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的高質(zhì)量(單體)抗體例如重組治療性抗體的有效方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了優(yōu)選地在(單體)抗體產(chǎn)率沒(méi)有顯著降低的情況下用于純化/分離抗體的改進(jìn)的方法，特別是用于從含有單體抗體的溶液中去除不需要的抗體聚集體和/或抗體二聚體和/或抗體前單體(pre-monomer)的方法。

本發(fā)明涉及用于從重組抗體水溶液中去除不需要的抗體聚集體和/或抗體二聚體和/或抗體前單體的方法，其中所述方法包括使用疏水作用 色譜法(HIC)純化(單體)抗體的步驟。本發(fā)明還涉及由這樣的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物及其用途。

說(shuō)明

本文所述的方法適合于從(單體)抗體水溶液中去除抗體聚集體和/或抗體二聚體和/或抗體前單體。優(yōu)選地，本文所述的方法導(dǎo)致具有更高純度和/或更均一的性質(zhì)的重組治療性抗體。特別是，本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用疏水作用色譜法純化步驟可顯著降低抗體聚集體和/或抗體二聚體和/或抗體前單體的水平。本文提供的方法對(duì)于從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化重組抗體的過(guò)程尤其有用。

附圖說(shuō)明

圖1：顯示各種抗IL-21化合物(單體和聚集體)的SEC-HPLC色譜圖。

圖2：包含兩條重鏈(HC)和三條輕鏈(LC)的抗體前單體雜質(zhì)，其中一條輕鏈?zhǔn)欠枪矁r(jià)連接的(LC2HC2：LC)?；贚C2HC2：LC的生物物理學(xué)、光譜學(xué)和功能特征，提出了所示的分子結(jié)構(gòu)，即這樣一種抗體，其中額外的輕鏈占據(jù)了在正常情況下被HC占據(jù)的位置。該額外的LC僅僅經(jīng)由非共價(jià)相互作用與另一LC結(jié)合，該另一LC又與HC共價(jià)結(jié)合。通過(guò)與谷胱甘肽或半胱氨酸形成二硫鍵，非共價(jià)連接的LC中的C末端半胱氨酸被加帽。

圖3：圖3A和圖3B顯示了如實(shí)施例3中所述對(duì)來(lái)自抗體組分的兩種HIC分離的洗脫液級(jí)分(eluate fraction)的分析。左側(cè)刻度表示抗體含量，而右側(cè)刻度表示抗體聚集體的相對(duì)量。首先洗脫出單體，然后是抗體制劑的前單體(hmwp3)和二聚體(hmwp2)組分。最后洗脫出更高階的聚集體(hmwp1)。

定義和序列信息

“生物制品”：生物藥物是在諸如微生物或植物或動(dòng)物細(xì)胞等生命系 統(tǒng)中制備的。大多數(shù)生物制品是大的復(fù)雜分子或分子的混合物。許多生物制品使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室中可用的測(cè)試方法表征復(fù)雜的生物藥物可能是困難的，并且有時(shí)是不可能的，并且制成的生物藥物的一些元素可能是未知的?？贵w是生物藥物的實(shí)例。

“抗體”：如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”、“單克隆抗體”、“單體抗體”和“mAb”旨在表示具有與抗原特異性結(jié)合的能力的免疫球蛋白分子及其片段。本文使用單體和單體抗體來(lái)描述常規(guī)形式的抗體，例如由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的抗體。本文的抗體優(yōu)選地是重組抗體。全長(zhǎng)抗體包含四條多肽鏈：通過(guò)二硫鍵互相連接的兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在此縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域：CL。VH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，被稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中散布著被稱(chēng)為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。每個(gè)VH和VL包含三個(gè)CDR和四個(gè)FR，從氨基末端至羧基末端以下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4?？贵w可以為不同同種型的形式；例如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgGA1、IgA2、IgD和IgE。全長(zhǎng)抗體通常是二價(jià)的/雙價(jià)的，即，它具有用兩只“臂”結(jié)合抗原的能力。相反，單價(jià)抗體(例如Fab片段)僅包含一個(gè)對(duì)抗原具有特異性的結(jié)合位點(diǎn)。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“人抗體”意指具有來(lái)源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體?！叭嗽椿贵w”包含移植到人類(lèi)骨架上的來(lái)自非人來(lái)源(例如小鼠)的CDR序列。

“抗體聚集體”：聚集體是分子量不同于單體抗體的抗體或抗體部分的復(fù)合物。

抗體聚集體的實(shí)例包括大聚集體，其包含3個(gè)或更多個(gè)非共價(jià)結(jié)合的抗體分子。就圖1而言，這樣的聚集體被稱(chēng)為HMWP1或更高階的聚集體。抗體二聚體被稱(chēng)為HMWP2，并且表示兩個(gè)非共價(jià)結(jié)合的抗體的復(fù)合物。本文所述的非傳統(tǒng)聚集體被稱(chēng)為HMWP3或前單體，并且其被表征為抗體單體和非共價(jià)結(jié)合的輕鏈的復(fù)合物。

“疏水作用色譜法(HIC)”是指依賴于物質(zhì)對(duì)液體移動(dòng)介質(zhì)和對(duì)它們所通過(guò)的固定吸附介質(zhì)如紙、明膠或氧化鎂的差異親和力來(lái)分離復(fù)雜混合物的各種技術(shù)。以含有附接至骨架的芳香疏水基團(tuán)的材料為基礎(chǔ)的固定柱材料，例如具有共價(jià)偶聯(lián)的苯基基團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖，是優(yōu)選的。具有約2-15％、3-12％、4-10％、4-8％、5-7％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％交聯(lián)的瓊脂糖是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的柱材料是以苯基瓊脂糖(Phenyl Sepharose)或具有類(lèi)似性質(zhì)的材料為基礎(chǔ)的，例如“Phenyl Sepharose 6Fast(low sub和high sub)”和“Phenyl Sepharose High”以及Phenyl Sepharose它們均為GE-HealthCare.Life Science的商標(biāo)。

“IL-21”是一種I型細(xì)胞因子.它對(duì)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答均發(fā)揮多效性作用。其主要由活化的CD4+T細(xì)胞、濾泡T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生。此外，最近的證據(jù)表明，Th17細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的IL-21。IL-21增加CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并且可以在抗原的存在下促進(jìn)CD8+細(xì)胞的增殖。IL-21由IL-6誘導(dǎo)，IL-6是一種已知促進(jìn)Th17細(xì)胞的發(fā)育的細(xì)胞因子。IL-21以自分泌方式作用于T輔助細(xì)胞，促進(jìn)其自身的產(chǎn)生并支持T輔助細(xì)胞分化為T(mén)h17細(xì)胞。IL-21還作用于B細(xì)胞并增加抗體產(chǎn)量。IL-21增強(qiáng)免疫的能力已引起對(duì)IL-21的治療用途的極大興趣。動(dòng)物研究已證明了在IL-21與腫瘤特異性抗體之間的協(xié)同作用，這可能提示了未來(lái)IL-21作為抗腫瘤抗體的增效劑的治療用途。而且，IL-21在自身免疫病中發(fā)揮復(fù)雜的作用。IL-21促進(jìn)Th17發(fā)育的能力使其成為促炎性細(xì)胞因子，并且目前正在研究IL-21抑制劑在治療一系列不同的自身免疫病中的潛在用途。

SEQ ID No1：hIL-21(包括橫跨氨基酸1-29的信號(hào)肽-mAb 5表位以粗體顯示；IL-21Rα結(jié)合位點(diǎn)以下劃線顯示；形成mAb 14表位的氨基酸殘基用斜體小寫(xiě)字母表示)

“IL-21抗體”：IL-21特異性單克隆(重組)抗體在本領(lǐng)域中已知，例如由WO2007111714和WO2010055366(Zymo-Genetics，Inc.)可知。具體而言，WO2010055366描述了一種抗IL-21抗體，其由克隆號(hào)362.78.1.44命名(“mAb 5”)，它具有對(duì)其同源抗原的高親和力和其他所需性質(zhì)，顯示出對(duì)人和食蟹猴IL-21的特異性。其中描述的另一種抗體以克隆號(hào)366.328.10.63標(biāo)識(shí)(“mAb 14”)。本文優(yōu)選的IL-21抗體是那些能夠競(jìng)爭(zhēng)/干擾IL-21受體(IL-21R)與IL-21的結(jié)合的抗體——這類(lèi)抗體的實(shí)例在WO12098113中公開(kāi)，包括“mAb 5”。本文其他優(yōu)選的IL-21抗體是那些能夠競(jìng)爭(zhēng)/干擾普通γ鏈與IL-21的結(jié)合的抗體——這類(lèi)抗體的實(shí)例在WO201216402中公開(kāi)，包括“mAb 14”。因此，在WO12098113和WO2012164021中公開(kāi)的具有競(jìng)爭(zhēng)/干擾受體與IL-21結(jié)合的能力的抗體并入本文。

優(yōu)選地，本文的IL-21抗體與人IL-21的螺旋1和3結(jié)合。優(yōu)選地，該IL-21抗體與IL-21上的不連續(xù)表位結(jié)合，其中所述表位包含如SEQ ID NO 1所示的氨基酸137至Y52和N92至P108。優(yōu)選地，該IL-21抗體包含如SEQ ID NO 2所示的三個(gè)CDR序列和如SEQ ID NO 3所示的三個(gè)CDR序列。優(yōu)選地，該IL-21抗體與γC(γ鏈)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IL-21。優(yōu)選地，該IL-21抗體與人IL-21的螺旋2和4結(jié)合。優(yōu)選地，該IL-21抗體與包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp73、Lys 117、His 118、Arg 119、Leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150和His 151的表位結(jié)合。優(yōu)選地，該IL-21抗體包含如SEQ ID NO 4所示的三個(gè)CDR序列和如SEQ ID NO 5所示的三個(gè)CDR序列。

SEQ ID No2：“mAb 5”：輕鏈(省略信號(hào)肽-CDR序列以粗體/下劃線表示-恒定區(qū)以小寫(xiě)字母表示-可變區(qū)以大寫(xiě)字母表示)

SEQ ID No3：“mAb 5”：IgG1同種型的重鏈(省略信號(hào)肽-CDR序列以粗體/下劃線表示-恒定區(qū)以小寫(xiě)字母表示-可變區(qū)以大寫(xiě)字母表示)

SEQ ID No4：“mAb14”輕鏈(省略信號(hào)肽-CDR序列以粗體/下劃線表示，恒定區(qū)以小寫(xiě)字母表示)

SEQ ID No5：“mAb14”，IgG4同種型的重鏈(省略信號(hào)肽-CDR序列以粗體/下劃線表示，恒定區(qū)以小寫(xiě)字母表示)

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及用于從重組抗體水溶液中去除不需要的抗體聚集體和/或抗體二聚體和/或抗體前單體的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色譜法(HIC)純化單體抗體的步驟。本發(fā)明還涉及由這樣的方法產(chǎn)生的產(chǎn)物及其用途。應(yīng)當(dāng)明白，使用術(shù)語(yǔ)“去除”來(lái)描述抗體聚集體的量或濃度的減少，因?yàn)榧兓襟E很少能夠去除全部不需要的組分。

根據(jù)本發(fā)明的抗體產(chǎn)物例如是包含至多1％抗體前單體聚集體的組合物，尤其是包含至多1％抗體前單體聚集體的抗IL-21抗體的組合物。

如本文實(shí)施例所述，抗體組合物的制備需要多個(gè)步驟，其中大多數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明描述HIC從可能已在抗體的表達(dá)過(guò)程或初始純化過(guò)程中形成的抗體聚集體中分離單體抗體分子的特定用途。先前已使用疏水作用色譜法從二聚體和更高階的聚集體中分離單體抗體。如本文所述，本申請(qǐng)的發(fā)明人已鑒定了如上所述已經(jīng)被命名為前單體的抗體聚集體的另一種類(lèi)，其包括抗體單體和與之非共價(jià)結(jié)合的輕鏈。與單體抗體相比，輕鏈的附接僅略微改變了分子量，因此在純化單體抗體以供治療應(yīng)用方面代表了更大的挑戰(zhàn)。如圖1所見(jiàn)，當(dāng)通過(guò)SEC-HPLC分析時(shí)，前單體恰好在單體抗體的主峰之前(并且一起)洗脫下來(lái)，從而與抗體的二聚體和更高階的聚集體清晰地區(qū)分開(kāi)來(lái)。

抗體制劑是包含感興趣的單體抗體以及抗體聚集體如前單體(如本文所述)、抗體二聚體和更高階的抗體聚集體作為該制劑的組分的組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的抗體是全長(zhǎng)抗體，例如所述制劑應(yīng)當(dāng)包含大部分的該特定全長(zhǎng)抗體，而所述抗體聚集體被認(rèn)為是雜質(zhì)。

所述抗體制劑可以如前所述從重組來(lái)源中獲得，并通過(guò)一種或多種旨在至少部分地純化感興趣的抗體的方法處理。這樣的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括諸如蛋白A純化、過(guò)濾和其他色譜方法。

根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟；

i)獲得包含前單體組分的抗體制劑

ii)將所述抗體制劑加載至疏水作用色譜柱，以使抗體和前單體與柱材料結(jié)合

iii)順序洗脫所述制劑的抗體組分，和

iv)選擇不包含大量前單體的洗脫液級(jí)分。

上文描述了疏水作用色譜柱的合適類(lèi)型。HIC柱材料的結(jié)合容量?jī)?yōu)選為例如至少約50g抗體/L或至少60g抗體/L。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，柱材料包含4-8％含有共價(jià)偶聯(lián)的苯基基團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，HIC柱材料包含約15-35、15-30、20-35、20-30、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35μmol苯基/ml凝膠，或20/40μmol/ml。據(jù)估計(jì)，20-25μmol苯基/ml凝膠對(duì)應(yīng)于Sepharose High Performa的估算容量，而40μmol苯基/ml凝膠對(duì)應(yīng)于Sepharose 6的估算容量。

HIC柱的長(zhǎng)度可以影響HIC純化步驟的質(zhì)量，因此可優(yōu)選更長(zhǎng)的柱，諸如至少5cm的HIC柱，諸如至少8cm，諸如至少12cm。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，HIC柱為5-50cm，諸如8-25cm，諸如10-20cm，諸如8-15cm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在硫酸銨((NH₄)₂SO₄)的存在下進(jìn)行加載(步驟b)，例如硫酸銨的濃度為約0.8-1.5mol/kg，優(yōu)選1.2-1.0或1.1-0.9mol/kg。

在這樣的實(shí)施方案中，可通過(guò)降低硫酸銨濃度進(jìn)行洗脫，例如通過(guò)使用直到0mol/kg的線性梯度的硫酸銨。

HIC的使用已證明有分離所述制劑的抗體組分的能力，因?yàn)楦鞣N組分以順序方式洗脫下來(lái)。雖然洗脫被描述為順序的，但是當(dāng)洗脫的級(jí)分包含多于一種抗體組分時(shí)，可能存在一定的重疊，而大部分單獨(dú)的組分應(yīng)當(dāng)洗脫在不同的級(jí)分中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，單體抗體組分作為第一抗體組分洗脫下來(lái)。在這樣的實(shí)例中，通過(guò)收集在包含大部分前單體和抗體二聚體的級(jí)分之前洗脫的級(jí)分，可以獲得感興趣的抗體溶液。

在這樣的實(shí)施方案中，通過(guò)取消選擇(deselecting)后續(xù)的洗脫液級(jí)分，可以從抗體組合物中排除前單體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)僅選擇在大部分前單體之前洗脫的級(jí)分，從抗體溶液中去除前單體(和其他 聚集體)。

根據(jù)本發(fā)明選擇不包含大量前單體的洗脫液級(jí)分。大量是對(duì)于純化單體抗體的目的而言將被認(rèn)為是不可接受的量。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，取消選擇包含大量任何聚集體的洗脫液級(jí)分。同樣地，如果聚集體的總和是大量的，則應(yīng)當(dāng)取消選擇這樣的洗脫液級(jí)分。在大多數(shù)情況下，如果聚集體占蛋白質(zhì)含量的5％，則將會(huì)存在大量的聚集體(包括前單體)。

如實(shí)施例中所述，一種或多種抗體聚集體的閾值含量可以確定哪些洗脫液級(jí)分對(duì)于獲得感興趣的抗體組合物是有用的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體聚集體的總量為1％或更低。

一種根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法包括以下步驟：

a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼所述抗體的載體(或分別編碼重鏈和輕鏈的兩種載體)，

b)收集來(lái)自步驟(a)的包含所述抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基，

c)在蛋白A親和柱上結(jié)合來(lái)自在步驟(b)中獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基的抗體，并在約3.5(例如2.5-4.5、3-4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0)的pH下用約10mmol/kg甲酸(例如5-15、7-13、8-12、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mmol甲酸/kg)洗脫所述抗體，

d)任選地將在步驟(c)中獲得的洗脫液的pH調(diào)節(jié)至3.7，以便滅活任何病毒(還可以使用其他方法滅活病毒)，

e)按照需要調(diào)節(jié)pH后，將在步驟(c)或(d)中獲得的洗脫液加載在陽(yáng)離子交換色譜柱(CIEX)上，并任選地使用例如POPOS50HS用鹽梯度(例如NaCl梯度)洗脫所述抗體，并且任選地可以使用0.45μm的孔隙大小過(guò)濾洗脫液，任選地與pH調(diào)節(jié)相結(jié)合，

f)使用例如20N病毒過(guò)濾器，使在步驟(e)中獲得的洗脫液經(jīng)歷病毒過(guò)濾，

g)泵送在步驟(f)中獲得的經(jīng)過(guò)濾的洗脫液穿過(guò)流穿膜(flow through membrane)(諸如Q膜)，并且任選地在所述流穿膜上過(guò)濾之前調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)率，

h)在濃度為約0.8-1.5mol/kg，優(yōu)選1.0mol/kg的硫酸銨的存在下，將在步驟(g)中獲得的流穿產(chǎn)物加載在疏水作用色譜柱上，

i)用逐漸降低的硫酸銨梯度洗脫所述抗體，

j)通過(guò)超濾濃縮在步驟(i)中獲得的洗脫液中的所述抗體，

k)然后任選地在蔗糖的存在下滲濾并進(jìn)一步超濾。

如本文所述，可使用該方法來(lái)制備包含至多1％抗體聚集體(總HMWP)的抗體組合物，其中該方法包括通過(guò)使用疏水作用色譜法(HIC)從重組抗體水溶液中去除抗體前單體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使用疏水作用色譜法(HIC)將前單體和抗體二聚體均與(正確折疊的)單體抗體分離開(kāi)。如上文所述，該方法可由本文以上描述的單獨(dú)步驟的說(shuō)明進(jìn)一步描述。

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得(或可獲得)的藥物產(chǎn)品或制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種藥物產(chǎn)品，其中抗體聚集體的量為抗體總量的1％或更低。在大多數(shù)情況下，抗體聚集體如抗體二聚體和抗體前單體的量可通過(guò)SEC-HPLC來(lái)測(cè)量。檢測(cè)水平以下的聚集體的殘留水平是很難預(yù)計(jì)的，但當(dāng)然是有吸引力的實(shí)施方案。進(jìn)一步優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品不包含可檢測(cè)的病毒。可使用本領(lǐng)域公知的方法測(cè)量病毒計(jì)數(shù)。

所得的抗體組合物可被稱(chēng)為均質(zhì)抗體組合物，它可以直接用作藥物產(chǎn)品或用于制備藥物產(chǎn)品。最終的抗體產(chǎn)物可被稱(chēng)為藥物制劑。

根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)本文所述的方法獲得的抗體組合物、抗體產(chǎn)物、藥物組合物或藥物產(chǎn)品可用于在治療方法中使用。因此，所述組合物和產(chǎn)物可用于在炎性疾病的治療方法中使用。

本文公開(kāi)的抗體組合物和產(chǎn)物用于在炎性疾病和病狀的治療方法中使用，尤其是抗炎性疾病，例如銀屑病、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、炎性腸病(IBD)、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸 易激綜合征、多發(fā)性硬化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠狀動(dòng)脈疾病、慢性阻塞性肺疾病、間質(zhì)性肺病、自身免疫性甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、硬皮病、系統(tǒng)性硬化病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、移植物抗宿主病、舍格倫綜合征(syndrome)、自身免疫性腎炎、古德帕斯丘綜合征(Goodpasture’s syndrome)、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病、變態(tài)反應(yīng)、哮喘和其他自身免疫病。本文的抗體產(chǎn)物還適合于治療各種癌癥類(lèi)型，例如癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì)胞腫瘤和胚細(xì)胞瘤。

如本文所述的發(fā)明在下列實(shí)施方案中舉例說(shuō)明，但不受其限制：

實(shí)施方案

1.一種用于從重組抗體水溶液中去除抗體二聚體和/或抗體前單體的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色譜法(HIC)將二聚體和/或前單體與(正確折疊的)抗體分離的步驟。

2.一種用于從重組抗體水溶液中去除抗體前單體的方法，其中所述方法包括使用疏水作用色譜法(HIC)將前單體與單體(正確折疊的)抗體分離的步驟。

3.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述抗體為IL-21抗體。

4.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述抗體包含如SEQ ID NO 2所示的三個(gè)CDR序列和如SEQ ID NO 3所示的三個(gè)CDR序列?；蛘撸隹贵w包含SEQ ID NO 2+3所示的VH/VL序列。

5.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述抗體為全長(zhǎng)抗體。

6.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述HIC柱材料具有50g抗體/L(或更大)的結(jié)合容量，優(yōu)選60g抗體/L(或更大)。

7.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述HIC柱材料包含4-8％含有共價(jià)偶聯(lián)的苯基基團(tuán)的交聯(lián)瓊脂糖，優(yōu)選6％。

8.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述HIC柱材料包含約15-35、15-30、20-35、20-30、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34或35μmol苯基/ml凝膠，或20/40μmol/ml(20-25μmol苯基/ml凝膠對(duì)應(yīng)于Sepharose High的估算容量；40μmol苯基/ml凝膠對(duì)應(yīng)于Sepharose 6的估算容量)。

9.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述HIC柱的長(zhǎng)度為至少5cm，諸如至少8cm，諸如至少12cm。

10.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述HIC柱的長(zhǎng)度為5-50cm，諸如8-25cm，諸如10-20cm，諸如8-15cm。

11.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法包括以下步驟：在高濃度(約1mol/kg，或至少約0.8mol/kg，或至少約0.8mol/kg且不大于1.5mol/kg)的硫酸銨的存在下，將所述抗體加載在HIC柱上，隨后用逐漸降低的硫酸銨梯度從HIC柱上洗脫所述抗體。

12.根據(jù)任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中在當(dāng)硫酸銨濃度從約0.8mol/kg降低至0.4mol/kg時(shí)所得的洗脫液級(jí)分中獲得所述單體抗體。

13.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中通過(guò)在前單體的累積量達(dá)到約1％時(shí)取消選擇洗脫液級(jí)分來(lái)去除所述前單體。

14.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中在當(dāng)OD280在前沿0.2與后沿8.0之間時(shí)所得的洗脫液級(jí)分中獲得所述單體抗體。

15.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中在包含高含量的前單體和抗體二聚體的級(jí)分之前洗脫的級(jí)分中獲得感興趣的抗體組合物。

16.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中在包含高含量的前單體的級(jí)分之前洗脫的級(jí)分中獲得感興趣的抗體組合物。

17.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法導(dǎo)致病毒顆粒的減少。

18.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中進(jìn)行所述HIC純化，作為濃縮所述抗體之前，和/或滲濾之前和/或冷凍干燥之前和/或配制所述抗體之前的最后一步。

19.根據(jù)本發(fā)明的方法，其包括以下步驟；

i)獲得包含前單體組分的抗體制劑

ii)將所述抗體制劑加載至疏水作用色譜柱上

iii)使抗體和前單體與柱材料結(jié)合

iv)順序洗脫所述制劑的抗體組分，和

v)選擇不包含大量前單體的洗脫液級(jí)分。

20.根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述方法包括以下步驟：

a.在宿主細(xì)胞中表達(dá)抗體，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼所述抗體的載體(或分別編碼重鏈和輕鏈的兩種載體)，

b.收集來(lái)自步驟(a)的包含所述抗體的細(xì)胞培養(yǎng)基，

c.在蛋白A親和柱上結(jié)合來(lái)自在步驟(b)中獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基的抗體，并在約3.5(例如2.5-4.5、3-4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0)的pH下用約10mmol/kg甲酸(例如5-15、7-13、8-12、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mmol甲酸/kg)洗脫所述抗體，

d.任選地將在步驟(c)中獲得的洗脫液的pH調(diào)節(jié)至3.7，以便滅活任何病毒(還可以使用其他方法滅活病毒)，

e.將在步驟(c)或(d)中獲得的洗脫液加載在陽(yáng)離子交換色譜柱(CIEX)上，并任選地使用例如POPOS 50HS用鹽梯度(例如NaCl梯度)洗脫所述抗體，并且任選地可以使用0.45μm的孔隙大小過(guò)濾洗脫液，任選地與pH調(diào)節(jié)相結(jié)合，

f.使用例如20N病毒過(guò)濾器，使在步驟(e)中獲得的洗脫液經(jīng)歷病毒過(guò)濾，

g.泵送在步驟(f)中獲得的經(jīng)過(guò)濾的洗脫液穿過(guò)流穿膜(例如Q膜)，并且任選地在所述流穿膜上過(guò)濾之前調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)率，

h.在濃度為約0.8-1.5mol/kg，優(yōu)選1.0mol/kg的硫酸銨的存在下，將在步驟(g)中獲得的流穿產(chǎn)物加載在疏水作用色譜柱上，

i.用逐漸降低的硫酸銨梯度洗脫所述抗體，

j.通過(guò)超濾濃縮在步驟(i)中獲得的洗脫液中的所述抗體，

k.然后任選地可能在蔗糖的存在下滲濾并進(jìn)一步超濾，以及

l.向在步驟(j)中獲得的濃縮的洗脫液中或步驟(k)的洗脫液中添加表面活性劑，并任選地過(guò)濾所述洗脫液，然后任選地冷凍干燥所述經(jīng)過(guò)濾的洗脫液。

21.一種用于制備包含至多1％抗體聚集體(總HMWP)的抗體組合物的方法，其包括通過(guò)使用疏水作用色譜法(HIC)從重組抗體水溶液中去除抗體前單體。

22.根據(jù)實(shí)施方案21所述的方法，其中使用疏水作用色譜法(HIC)將前單體和抗體二聚體與(正確折疊的)抗體分離開(kāi)。

23.根據(jù)實(shí)施方案21或22所述的方法，其包括實(shí)施方案3-20的一個(gè)或多個(gè)特征。

24.通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法獲得(或可獲得)的藥物產(chǎn)品。

25.根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，其中抗體聚集體的量為抗體總量的1％或更低。

26.根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，其中不存在可檢測(cè)的病毒?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的方法測(cè)量病毒計(jì)數(shù)。

27.一種包含根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品的藥物制劑。

28.根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑在治療炎性疾病中的用途。

29.根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑在治療選自1型糖尿病、炎性腸病、克羅恩病、銀屑病、移植物抗宿主病和SLE的炎性疾病中的用途。

30.根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑在治療癌癥中的用途。

31.根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，其用于在炎性疾病的治療方法中使用。

32.根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，其用于在選自1型糖尿病、炎性腸病、克羅恩病、銀屑病、移植物抗宿主病和SLE的炎性疾病的治療方法中使用。

33.根據(jù)本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，其用于在癌癥的治療方法中使用。

實(shí)施例

實(shí)施例1

純化過(guò)程已經(jīng)證明對(duì)于在工業(yè)規(guī)模上從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化各種重組抗體是有用的。這一過(guò)程可以扼要表示如下：

這一相對(duì)簡(jiǎn)單的純化過(guò)程導(dǎo)致極高純度的高抗體產(chǎn)率，并且因此對(duì)于在工業(yè)規(guī)模上純化不同的重組治療性抗體是非常有效的，關(guān)于具體實(shí)例的進(jìn)一步的信息也參見(jiàn)WO2009/138484。

然而，關(guān)于IL-21抗體-尤其是在WO2010055366中公開(kāi)的具有克隆362.78.1.44的CDR序列的抗體(mAb 5”)-的純化，所得到的純化的IL-21抗體出乎意料地含有約2-3％的量的不需要的高分子量蛋白質(zhì)(HMWP)。結(jié)果還證明HMWP含量隨時(shí)間累積/增加——尤其是二聚體濃度。在不顯著降低抗體產(chǎn)率的情況下，這些聚集體中的一些顯然難以分離。在不顯著降低抗體產(chǎn)率的情況下，采用了多種純化方法來(lái)試圖去除HMWP(包括抗體二聚體和抗體前單體)，以達(dá)到約為或低于1％的量(各種陽(yáng)離子交換法，如HS 50，所研究的參數(shù)，如流速、載量、梯度長(zhǎng)度、切割標(biāo)準(zhǔn)，EMD COO，EMD SO₃， Capto^TM Adhere，Capto^TM MMC，和某些HIC樹(shù)脂，Phenyl-5PW)。這些方法均導(dǎo)致抗體產(chǎn)率的顯著(且不可接受的)降低。聚集體的SEC HPLC分析揭示了它們包含抗體二聚體和抗體前單體。

因此希望提供具有改善的純度的抗IL-21組合物，所述抗體具有含量降低的不需要的聚集體，如二聚體和/或前單體。如本文所述，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了這一問(wèn)題的解決方案。已知HIC在一些情況下對(duì)于在抗體純化過(guò)程中減少抗體二聚體和高階聚集體是有用的。因此，結(jié)合在高硫酸銨濃度下的結(jié)合以及在到零硫酸銨的梯度中的洗脫，研究了各種樹(shù)脂。

在例如抗IL-21過(guò)程中的一些雜質(zhì)是被統(tǒng)稱(chēng)為聚集體的HMWP(高分子量蛋白質(zhì))。它們包含HMWP1＝更高階的聚集體，HMWP2＝抗體二聚體，HMWP3＝抗體前單體(圖2)。HMWP1在CIEX步驟過(guò)程中得以去除，但通常的過(guò)程并不會(huì)導(dǎo)致前單體和二聚體的充分減少。CIEX(POROS 50HS或Fractogel COO)似乎對(duì)前單體(HMWP3)完全沒(méi)有選擇性(也參見(jiàn)實(shí)施例4)。

實(shí)施例2

根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使用包含Phenyl Sepharose^TM FF和/或Phenyl Sepharose^TM HP的柱材料進(jìn)行HIC純化步驟出乎意料地證明了對(duì)前單體和二聚體的所需要的選擇性——前單體在單體峰的后部與其他聚集體一起洗脫下來(lái)(參見(jiàn)圖3和以下描述)。具有逐漸降低的硫酸銨濃度的梯度優(yōu)選用于HIC洗脫步驟。Phenyl Sepharose^TM HP材料具有高結(jié)合容量(大于60g mAb/L填充材料)的優(yōu)勢(shì)。這種類(lèi)型的柱材料具有相對(duì)較低密度的苯基基團(tuán)(25μmol/ml)，因此令人驚訝的是，與例如苯基密度為40μmol/ml的Phenyl Sepharose^TM FF high sub相比，該材料具有與Ab結(jié)合容量相關(guān)的優(yōu)越的性能。

HIC步驟優(yōu)選地在最終UF/DF步驟之前(在配制活性藥物成分一在這種情況下為重組治療性抗體一之前)發(fā)生。該HIC步驟優(yōu)選地作為最終步驟之一在冷凍干燥和/或制備抗體的藥物制劑之前發(fā)生，以避免在純化過(guò)程中二聚體的累積。可在HIC之后使用緩沖液更換，如滲濾步驟， 以確?？贵w在適合于冷凍干燥的溶液中。

IL-21抗體的二聚體形成在生產(chǎn)過(guò)程中明顯地自發(fā)地發(fā)生。因此，HIC步驟/HIC純化過(guò)程可用于純化具有形成聚集體的傾向的抗體。

除了減少與該蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(和純化)相關(guān)的二聚體形成之外，HIC步驟還可能導(dǎo)致病毒清除/減少，從而還可能提高純化的抗體產(chǎn)物的安全性。

在抗IL-21純化中的HIC純化步驟：

溶劑：

方法

柱(直徑為1cm，長(zhǎng)度為13cm)用10ml Phenyl Sepharose HP填充，用5個(gè)柱體積(CV)的S1平衡，流速為15CV/h。

通過(guò)將AmSO₄添加至從前一陽(yáng)離子交換步驟中獲得的抗體溶液中，制備加載溶液。向110ml的起始抗體制劑(6.6g/L)中添加16.72g AmSO₄，得到5.57g/L的抗體濃度。以流速9CV/h加載105ml的加載溶液。所得的載量為58g抗體/L樹(shù)脂。

加載之后，用5CV的S1(流速為15CV/h)洗柱，并通過(guò)100％S1至100％S2的梯度以15CV(流速為15CV/h)、然后用5CV的S2(流速為15CV/h)實(shí)現(xiàn)洗脫。根據(jù)OD收集級(jí)分，從前沿OD 0.2開(kāi)始至后沿8.0。最后用2CV的S3以流速3CV/h對(duì)柱進(jìn)行清理(sanitise)。使用OD280測(cè)量蛋白質(zhì)含量，OD280被定義為在280nm處在1cm上的UV吸光度。為了最小化前單體(和其他聚集體)的量，使截?cái)嘀档陀?％HMWP，這樣可通過(guò)收集在前沿0.2的OD280時(shí)從柱上洗脫的級(jí)分 連同后沿直到8.0的OD280時(shí)洗脫的級(jí)分來(lái)獲得感興趣的抗體產(chǎn)物。

分析了所得洗脫液的單體和聚集體的百分比。分析程序?yàn)槌叽缗抛枭V法(SE-HPLC)試驗(yàn)，其中使用TSK G3000SWx1柱分析樣品，使用磷酸鈉/異丙醇緩沖液進(jìn)行等度洗脫，隨后在280nm下進(jìn)行UV檢測(cè)。相對(duì)于總積分面積計(jì)算％HMWP。結(jié)果包含在下表中，表明HIC步驟去除了大多數(shù)的聚集體，使聚集體的總濃度降低至0.96％。

實(shí)施例3

為了進(jìn)一步分析HIC的效果以及進(jìn)一步分析收集洗脫液中的哪些級(jí)分才能在最大化抗體產(chǎn)率的同時(shí)最小化前單體的含量，如上所述使用Phenyl Sepharose HP和46g/L的蛋白質(zhì)載量進(jìn)行純化。

使用36.8ml蛋白A病毒滅活的抗體制劑(濃度為6.6g/L)通過(guò)添加5.6g AmSO₄制備加載溶液。

向長(zhǎng)度為3.4cm且直徑為1cm的柱中填充2.7ml Phenyl Sepharose HP，并用5CV的S1b平衡，并加載26.33ml的加載溶液(4.77g抗體/L)，其相當(dāng)于46g抗體(抗IL-21)/L樹(shù)脂的總載量。

將該柱用5CV的S1b洗滌，并用100％S1b至100％S2的線性梯度以10CV、然后用6CV的S2進(jìn)行洗脫。在洗脫過(guò)程中收集2ml級(jí)分。將抗體制劑加載在包含1mol/kg(NH₄)₂SO₄的緩沖液中。通過(guò)線性降低(NH₄)₂SO₄濃度以在級(jí)分15時(shí)達(dá)到0mol/kg，在級(jí)分3-15中獲得蛋白質(zhì)的洗脫。表2顯示了每一級(jí)分中的蛋白質(zhì)濃度以及HMWP1、HMWP2和HMWP3的百分比。圖3A中示出了該純化過(guò)程，并且HMWP1和HMWP2顯示出與單體抗體很好地分離的清晰的峰，而前單體(HMWP3)在各個(gè)級(jí)分中洗脫出來(lái)。

表2：來(lái)自Phenyl Sepharose HP純化的HIC級(jí)分的蛋白質(zhì)分析

以類(lèi)似的方式進(jìn)行并分析使用Phenyl Sepharose 6FF和37g/L的蛋白質(zhì)載量的純化。

向長(zhǎng)度為11cm且直徑為0.5cm的柱中填充2.1ml Phenyl Sepharose6FF，并用5CV的S1b平衡。

通過(guò)使14.2ml上述蛋白A純化且病毒滅活的抗體制劑(6.6g/L)與5.8ml的3M AmSO4(pH 7)混合，由該抗體制劑制備加載溶液。將13.7ml的加載溶液(4.77g/L)加載到柱上，相當(dāng)于30g抗體/L樹(shù)脂的載量。

加載之后，將柱用5CV的S1b洗滌，并用100％S1b至100％S2的線性梯度以10CV、然后用10CV的S2進(jìn)行洗脫。在洗脫過(guò)程中，收集2ml級(jí)分。在級(jí)分2至12之間采用在25mmol/kg Na₂HPO₄(pH 7)中從1.2mol/kg至0mol/kg(NH₄)₂SO₄的梯度。表3顯示了獲得的洗脫級(jí)分的蛋白質(zhì)分析。

表3：來(lái)自Phenyl Sepharose 6FF純化的HIC級(jí)分的蛋白質(zhì)分析

為了最小化前單體的量，使截?cái)嘀档陀谥T如與約0.4mol/kg的(NH₄)₂SO₄濃度相關(guān)聯(lián)的1％累積的HMWP2和HMWP3。因此，如前所述，可通過(guò)獲得在前沿0.2的OD280時(shí)從柱上洗脫的級(jí)分連同在后沿最高8.0的OD280時(shí)洗脫的級(jí)分來(lái)收集感興趣的產(chǎn)物，從而排出具有高含量的前單體和二聚體的級(jí)分。

實(shí)施例4

進(jìn)行了大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。從在陰離子交換色譜法之后獲得的抗體制劑開(kāi)始。

向在總重量為391kg的組合物中的總計(jì)1411g的抗體中添加59.58kg固體(NH4)₂SO₄，用1.0mol/kg NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.0。

向填充有10.73lPhenyl Sepharose HP(長(zhǎng)度為15.6cm，直徑為29.6cm)且采用3.8CV的S1以流速80l/h平衡的柱上以流速60l/h加載201.8l的上述加載溶液，相當(dāng)于62.9g抗IL-21抗體/L樹(shù)脂。將該柱用5CV的S1以80l/h洗滌，并用100％S1至100％S2的線性梯度以15CV、80L/h、然后用5CV的S2以流速80L/h進(jìn)行洗脫。將該柱用2CV的S3以流速20l/h進(jìn)行清理，并最終用2CV的水以流速80l/h沖洗。從前沿0.2至后沿8.0的OD280收集抗體產(chǎn)物。相比于加載溶液的2.9％HMWP的純度，所得純度為0.8％HMWP。

基于以上所述，還應(yīng)當(dāng)指出，柱的長(zhǎng)度以這樣一種方式影響所獲得的結(jié)果，即較長(zhǎng)的柱(如本實(shí)驗(yàn)中使用的)比實(shí)施例3中使用的較短的 柱提供更好的分辨率。

實(shí)施例5

最初，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估CIEX POROS 50HS對(duì)于獲得不含前單體的抗體組合物的可用性。

緩沖液A：25mmol/kg乙酸鈉，pH 5，緩沖液B：25mmol/kg乙酸鈉+300mmol/kg NaCl，pH 5。

用加載有20g aIL21/l樹(shù)脂的5ml柱(1cmD x20cmL)進(jìn)行純化。將該柱用5CV的緩沖液A進(jìn)行平衡，加載，并用100％緩沖液A至100％緩沖液B的梯度以20CV、然后用5CV的緩沖液B進(jìn)行洗脫。在級(jí)分25與37之間使用50％-72.5％的緩沖液B的梯度獲得單體抗體的洗脫。如上分析所述分離，并且從圖4中可以看出，前單體(HMWP3)在單體峰的前面洗脫下來(lái)，而二聚體在單體峰的尾部洗脫下來(lái)。由于HMWP3較早洗脫，因此只可能獲得極少的具有低含量聚集體(前單體、二聚體和/或高階聚集體)的級(jí)分，這導(dǎo)致極差的產(chǎn)率。

表4

實(shí)施例6

包括HIC步驟的抗體純化過(guò)程的整體描述。

進(jìn)行蛋白A衍生步驟以濃縮澄清化的培養(yǎng)肉湯，并且該步驟充當(dāng)mAb的極具特異性的親和捕獲步驟。而且，該步驟包括通過(guò)調(diào)節(jié)pH至3.7進(jìn)行的病毒滅活(包膜病毒)。

CIEX是采用50HS樹(shù)脂的陽(yáng)離子交換步驟。將來(lái)自前一蛋白A步驟的病毒滅活的洗脫液調(diào)節(jié)至pH 5.0，并且可能在加載到柱上之前過(guò)濾。在用平衡溶劑洗滌之后，采用鹽梯度洗脫產(chǎn)物。減少了HCP、培養(yǎng)基污染物和聚集體。

在Planova 20N病毒過(guò)濾器上進(jìn)行作為死端過(guò)濾的病毒過(guò)濾，以去除來(lái)自其中表達(dá)mAb的CHO細(xì)胞的潛在病毒。

Q膜步驟是一種流穿步驟，其中在加載過(guò)程中使稀釋的產(chǎn)物通過(guò)，并且主要減少了DNA、內(nèi)毒素、HCP和其他雜質(zhì)。

引入HIC步驟以減少二聚體和前單體含量。向來(lái)自Q膜步驟的產(chǎn)物中添加硫酸銨，并將該產(chǎn)物加載到HIC柱上。通過(guò)從高至低硫酸銨濃度的梯度實(shí)現(xiàn)洗脫。

最后的步驟為UF/DF，其中將產(chǎn)物通過(guò)TFF進(jìn)行濃縮，并用包含蔗糖的API制劑緩沖液進(jìn)行滲濾。添加吐溫80并使API產(chǎn)物通過(guò)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾。

總結(jié)

以下表5中概括了來(lái)自各個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其顯示在所有試驗(yàn)中，HIC步驟均能夠降低抗體聚集體的濃度，從而提供了適合于在藥物產(chǎn)品或制劑中進(jìn)一步使用的抗體組合物。

表5結(jié)果的比較