透明質(zhì)酸衍生物凝膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠的方法，特別涉及通過在低溫下使用零段交聯(lián)劑制備交聯(lián)高濃度透明質(zhì)酸凝膠的方法。通過階段低溫反應(yīng)避免了零段交聯(lián)劑與輔助交聯(lián)劑在較高溫度下發(fā)生副反應(yīng)而導(dǎo)致凝膠的抗降解力、凝膠品質(zhì)的降低，還能提高交聯(lián)程度。所制備的凝膠粘彈性提高，避免了凝膠由于硬度較大導(dǎo)致填充的困難以及病人體內(nèi)的不適應(yīng)，降低了紅腫發(fā)炎等癥狀。在本發(fā)明中，采用復(fù)合攪拌方式更能充分地?cái)嚢栎^高濃度的反應(yīng)液，既避免了剪切攪拌器破壞交聯(lián)物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，又解決了其他類型的攪拌器難以攪動(dòng)高濃度反應(yīng)液的問題，從而使產(chǎn)物的粘彈性增大，交聯(lián)程度提高，所制備的凝膠交聯(lián)程度高、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粘彈性好。
【專利說明】透明質(zhì)酸衍生物凝膠及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠的方法，特別涉及通過在低溫下使用零段交聯(lián)劑制備交聯(lián)高濃度透明質(zhì)酸凝膠的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]可注射的凝膠在體內(nèi)與修復(fù)組織之間嵌合性好，實(shí)現(xiàn)原位注射達(dá)到微創(chuàng)目的，成為軟組織修復(fù)、重建、填充的熱點(diǎn)。因此，可注射的凝膠材料的應(yīng)用具有顯著的優(yōu)勢(shì)?？勺⑸涞奶畛浜托迯?fù)材料是一種智能高分子材料，是近十年來發(fā)展起來的一個(gè)較新的研究領(lǐng)域，是智能高分子材料的一個(gè)非常熱門的研究課題。
[0003]在已有的可注射填充物及其制備方法的技術(shù)中，常采用的注射填充物是交聯(lián)的透明質(zhì)酸及其鹽的凝膠。玻尿酸(又名透明質(zhì)酸、HA)是一種廣泛存在于生物和組織類型的多聚糖，是由(1-4)-β-D葡萄糖醛酸2-乙酰氨基-β-D葡萄糖結(jié)合而成的雙糖組織。由于其不具有種屬與臟器的特異性，并展現(xiàn)良好的生物相容性，從而被廣泛應(yīng)用于美容、醫(yī)療等方面。但是純透明質(zhì)酸由于其易溶于水、吸收迅速和在組織中停留時(shí)間短等物理和生物特性，使用受到限制，因此需要使用化學(xué)交聯(lián)修飾，以增大其分子量、延長(zhǎng)降解時(shí)間和提高穩(wěn)定性。
[0004]CN1774450A和CN1970094A公開了使用1，4-丁二醇二環(huán)氧甘油醚(BDDE)作為交聯(lián)劑制備透明質(zhì)酸交聯(lián)產(chǎn)物。但是由于BDDE的毒性很難從凝膠中去除，短期無法徹底去除其殘留，會(huì)對(duì)生物體造成紅腫、發(fā)炎、不適等狀況，因此必須通過長(zhǎng)時(shí)間的透析、純化以減少BDDE的殘留。
[0005]CN1893989A公開了使用1-乙基_3_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)作為交聯(lián)劑制備透明質(zhì)酸交聯(lián)產(chǎn)物。EDC與其他交聯(lián)劑相比，具有僅作交聯(lián)反應(yīng)的催化劑，而不引入最終產(chǎn)物中的優(yōu)點(diǎn)。通過EDC制備的凝膠彈性高，并且交聯(lián)形成的透明質(zhì)酸凝膠水分比用其他交聯(lián)劑低。此外所制備的透明質(zhì)酸凝膠還具有抗降解性，能滿足一些特殊性能的生物醫(yī)學(xué)材料的要求。但是，該專利中的交聯(lián)透明質(zhì)酸的濃度較低，造成透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)量低，該透明質(zhì)酸的分子鏈自由度高導(dǎo)致凝膠較為柔軟，難以得到優(yōu)異粘彈性的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。
[0006]CN1694903A也公開了使用零段交聯(lián)劑EDC與輔助交聯(lián)劑N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)交聯(lián)制備透明質(zhì)酸與脫乙酰糖類的復(fù)合凝膠，但是該方法無法得到較純的透明質(zhì)酸凝膠，并且該復(fù)合凝膠也不能用于美容行業(yè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將透明質(zhì)酸或其鹽溶于水中，使所得透明質(zhì)酸水溶液中透明質(zhì)酸的濃度為約10mg/ml?約200mg/ml,并將pH值調(diào)節(jié)為約I?約7 ;和
[0009](2)在約-80°C?約20°C的反應(yīng)溫度下，在零段交聯(lián)劑存在下使所述透明質(zhì)酸水溶液進(jìn)行交聯(lián)。
[0010]在一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述零段交聯(lián)劑是碳二亞胺類交聯(lián)劑，其選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(ETC)、1, Γ- 二硫-ρ-亞苯基雙(碳二亞胺)、叔丁基碳二亞胺和二異丙基碳二亞胺中的一種或多種。
[0011]在另一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述透明質(zhì)酸的交聯(lián)在輔助交聯(lián)劑的存在下進(jìn)行，所述輔助交聯(lián)劑選自N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸鈉中的一種或多種。
[0012]在又一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物中的所述碳二亞胺類交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸的重量比為約2%?約10%。
[0013]在又一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，在步驟(2)中通過復(fù)合攪拌裝置使反應(yīng)混合物交聯(lián)，所述復(fù)合攪拌方式是指采用交聯(lián)反應(yīng)器的自旋轉(zhuǎn)與攪拌反應(yīng)器采用上下?lián)v動(dòng)方式結(jié)合在一起的攪拌方式。
[0014]在又一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述制備方法還包括步驟(3):通過凝固浴使所得透明質(zhì)酸衍生物產(chǎn)物凝固。
[0015]在又一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述制備方法還包括步驟(4):將所得透明質(zhì)酸衍生物產(chǎn)物進(jìn)行卷繞。
[0016]在又一個(gè)本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述制備方法還包括步驟(5):將所得透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物造粒，并將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠顆粒進(jìn)行透析。
[0017]通過本發(fā)明的方法，可以制備得到高濃度、高粘彈性和抗降解的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本發(fā)明制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠的示意圖。
[0019]圖2是本發(fā)明實(shí)施例3制備的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的抗降解性示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020]除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。若存在矛盾，則以本申請(qǐng)?zhí)峁┑亩x為準(zhǔn)。
[0021]當(dāng)以范圍、優(yōu)選范圍、或者優(yōu)選的數(shù)值上限以及優(yōu)選的數(shù)值下限的形式表述某個(gè)量、濃度或其它值或參數(shù)的時(shí)候，應(yīng)當(dāng)理解相當(dāng)于具體揭示了通過將任意一對(duì)范圍上限或優(yōu)選數(shù)值與任意范圍下限或優(yōu)選數(shù)值結(jié)合起來的任何范圍，而不考慮該范圍是否具體揭示。除非另外指出，本文所列出的數(shù)值范圍旨在包括范圍的端點(diǎn)，和該范圍之內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。
[0022]當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”和“大約”用于描述數(shù)值或范圍的端值時(shí)，所公開的內(nèi)容應(yīng)理解為包括具體值或所涉及的端值。
[0023]除非另外說明，本文中所有的百分比、份數(shù)、比值等均是按重量計(jì)。
[0024]本文的材料、方法和實(shí)施例均是示例性的，并且除非特別說明，不應(yīng)理解為限制性的。
[0025]以下詳細(xì)描述本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備方法。
[0026]步驟(I)
[0027]1、誘明質(zhì)酸的來源
[0028]在本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠制備方法的步驟⑴中，術(shù)語(yǔ)“透明質(zhì)酸”是指具有不同分子量的酸性多聚糖，其由D-葡萄糖醛酸以及N-乙?；?D-葡萄糖胺酸殘基組成，其天然存在于細(xì)胞表面、脊椎動(dòng)物結(jié)締組織的堿性細(xì)胞外基質(zhì)、關(guān)節(jié)滑液、眼球內(nèi)液、人類臍帶組織和雞冠中。
[0029]一般通常將術(shù)語(yǔ)“透明質(zhì)酸”用作表示具有交替的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺酸殘基和可變分子量的多糖或甚至是其降解片段。
[0030]在此將“透明質(zhì)酸”定義為非硫酸化的氨基多糖，其由通過交替的β_1，4以及β-1，3糖苷鍵連接的N-乙?；咸烟前?GlcNAc)以及葡萄糖醛酸(GlcUA)的重復(fù)二糖單元組成。透明質(zhì)酸亦稱為透明質(zhì)素(hyaluronan)或HA。
[0031]本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸來源并非關(guān)鍵，例如可通過商購(gòu)獲得。例如，公雞冠是透明質(zhì)酸主要的商用來源之一。微生物是另一主要來源。例如W02003/054163中公開了通過芽孢桿菌屬細(xì)菌進(jìn)行重組而制備透明質(zhì)酸或其鹽，在此將其全文援引并入本文。所述芽孢桿菌宿主細(xì)胞可以是野生型的芽孢桿菌細(xì)胞或其突變型。在本發(fā)明中可使用的芽孢桿菌細(xì)胞包括但不限于:粘瓊脂芽孢桿菌(Bacillus agaraderhens)、嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌(bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽抱桿菌(Bacillus firmus)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis)以及蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞。在本發(fā)明中優(yōu)選使用解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞制備透明質(zhì)酸，特別優(yōu)選枯草芽孢桿菌細(xì)胞。
[0032]本發(fā)明中可使用透明質(zhì)酸本身或可使用透明質(zhì)酸鹽。在本發(fā)明中優(yōu)選使用透明質(zhì)酸鹽。在本發(fā)明中可使用的透明質(zhì)酸鹽包括但不限于透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀、透明質(zhì)酸銨、透明質(zhì)酸鈣或透明質(zhì)酸鎂。優(yōu)選使用透明質(zhì)酸鈉、透明質(zhì)酸鉀或透明質(zhì)酸銨，特別優(yōu)選使用透明質(zhì)酸鈉。
[0033]本發(fā)明中使用的透明質(zhì)酸及其鹽還可以是市售的，例如購(gòu)自江蘇潤(rùn)禾生物有限公司的產(chǎn)品(生物發(fā)酵，醫(yī)藥級(jí)，分子量50000?3000000Da)
[0034]用于本發(fā)明的透明質(zhì)酸或其鹽的分子量沒有特別的限制，優(yōu)選其具有約50000?約3000000Da，更優(yōu)選約100000?約lOOOOOODa，并且最優(yōu)選約300000?約600000Da的分子量。
[0035]2、DH倌的調(diào)節(jié)
[0036]在步驟(I)中，在將上述來源的透明質(zhì)酸溶于水之后將所得透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)節(jié)至約I?約7的范圍。pH值調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如可通過向透明質(zhì)酸水溶液中加入緩沖劑將pH值調(diào)節(jié)至所述范圍。本發(fā)明中可使用的緩沖劑包括但不限于鹽酸、乙酸和磷酸中的一種或多種，優(yōu)選使用鹽酸將透明質(zhì)酸水溶液的pH值調(diào)節(jié)至約I?約7,更優(yōu)選為約4?約6。
[0037]在步驟⑴中，所使用的水優(yōu)選是醫(yī)用水，并且步驟⑴優(yōu)選在常溫常壓下進(jìn)行。
[0038]步驟(2)
[0039]1、零段交聯(lián)劑
[0040]本發(fā)明中透明質(zhì)酸的交聯(lián)反應(yīng)可通過加入本領(lǐng)域中已知的零段交聯(lián)劑交聯(lián)劑或交聯(lián)劑體系進(jìn)行。
[0041]在本申請(qǐng)發(fā)明中，零段交聯(lián)劑是指通過交聯(lián)后得到的產(chǎn)品中沒有交聯(lián)劑成分的交聯(lián)劑。在零段交聯(lián)劑與交聯(lián)體(透明質(zhì)酸)的反應(yīng)過程中不會(huì)引入其他間隔臂，因此經(jīng)交聯(lián)的聚合物基質(zhì)中不包含零段交聯(lián)劑。
[0042]適用于本發(fā)明的零段交聯(lián)劑包括但不限于碳二亞胺類交聯(lián)劑，其優(yōu)選選自1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、1_乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(ETC)、1，I’ - 二硫-ρ-亞苯基雙(碳二亞胺)、叔丁基碳二亞胺和二異丙基碳二亞胺中的一種或多種，進(jìn)一步優(yōu)選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U-乙基-3-(3-三甲基氨基丙基)碳二亞胺(ETC)和1，I’ - 二硫-ρ-亞苯基雙(碳二亞胺)。
[0043]在本發(fā)明中，零段交聯(lián)劑與交聯(lián)體(透明質(zhì)酸)的反應(yīng)優(yōu)選在輔助交聯(lián)劑的存在下進(jìn)行。所述輔助交聯(lián)劑選自N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸鈉中的一種或多種。這些輔助交聯(lián)劑可有助于穩(wěn)定由碳二亞胺類交聯(lián)劑交聯(lián)產(chǎn)生的活性中間產(chǎn)物，并由此提高碳二亞胺類交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸的交聯(lián)效率。
[0044]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知零段交聯(lián)劑和輔助交聯(lián)劑的制備方法，并且零段交聯(lián)劑和輔助交聯(lián)劑也是市售可得的。
[0045]2、交聯(lián)劑含暈和配比
[0046]在本發(fā)明的交聯(lián)反應(yīng)中，透明質(zhì)酸水溶液中的透明質(zhì)酸濃度為約10mg/ml?約200mg/ml,優(yōu)選為約 40mg/ml ?約 100mg/ml。
[0047]透明質(zhì)酸的較高反應(yīng)濃度可使產(chǎn)品的產(chǎn)量增大，經(jīng)濟(jì)效益提高，其水分含量較少而使后續(xù)切割加工較容易，且不需使用大量乙醇等物質(zhì)使凝膠沉淀，有利于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。
[0048]根據(jù)使用的交聯(lián)劑，所述反應(yīng)混合物中的所述零段交聯(lián)劑與透明質(zhì)酸的重量比為約0.5%?約20%，優(yōu)選為約1%?約8%，更優(yōu)選為約4%?約7.5%。
[0049]所述反應(yīng)混合物中的所述零段交聯(lián)劑與輔助交聯(lián)劑的摩爾比為約1: 3?約5: 1，優(yōu)選為約3: I?約1: 2。
[0050]3、父聯(lián)反應(yīng)溫度與時(shí)間
[0051]在本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠制備方法中，透明質(zhì)酸的交聯(lián)反應(yīng)在約_80°C?約20°C的低溫下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸的交聯(lián)反應(yīng)在約_80°C?約20°C的二步溫度梯度下進(jìn)行，即先在約0°C?約20°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)約30min?約48h，再在約-80°C?約O°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)約12h?約6天。
[0052]出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過低溫反應(yīng)可避免零段交聯(lián)劑與輔助交聯(lián)劑在較高溫度下發(fā)生副反應(yīng)而導(dǎo)致凝膠的抗降解力、凝膠品質(zhì)的降低。此外，所述低溫反應(yīng)還能提高交聯(lián)程度。由此，所述低溫反應(yīng)可使凝膠的粘彈性提高，避免了凝膠由于硬度較大導(dǎo)致填充的困難以及病人體內(nèi)的不適應(yīng)，降低了紅腫發(fā)炎等癥狀。
[0053]4、復(fù)合攪拌方式
[0054]在本發(fā)明的交聯(lián)反應(yīng)中，所述交聯(lián)反應(yīng)采用在圖1所示的復(fù)合攪拌方式進(jìn)行。
[0055]在本發(fā)明中，復(fù)合攪拌方式是指采用交聯(lián)反應(yīng)器的自旋轉(zhuǎn)與攪拌反應(yīng)器采用上下?lián)v動(dòng)方式結(jié)合在一起的攪拌方式。所述復(fù)合攪拌方式更能充分地?cái)嚢栎^高濃度的反應(yīng)液，既避免了剪切攪拌器破壞交聯(lián)物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，又解決了其他類型的攪拌器難以攪動(dòng)高濃度反應(yīng)液的問題，從而使產(chǎn)物的粘彈性增大，交聯(lián)程度提高。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1所示，向配有攪拌器(2)、冷凝器(3)、真空泵
(4)、控溫裝置(6)、加熱套(7)的可旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器I的進(jìn)料口(5)中加入上述反應(yīng)原料，并通過反應(yīng)器(I)繞其縱軸方向上的自旋轉(zhuǎn)和攪拌器(2)沿反應(yīng)器I的縱軸方向的上下運(yùn)動(dòng)搗動(dòng)反應(yīng)器(I)中的反應(yīng)混合物，以進(jìn)行上述低溫反應(yīng)。所述自旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速?zèng)]有特別限制，其可以為O?約2000rpm。
[0057]步驟(3):交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的凝固
[0058]在步驟(2)之后，可通過凝固浴步驟使所得透明質(zhì)酸衍生物產(chǎn)物凝固為凝膠。
[0059]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種凝固浴的方法。本發(fā)明所述的凝固浴沒有特別限制，所使用的浴液包括但不限于乙醇、氫氧化鈉溶液、乙二醇、異丙醇和丁二醇中的一種或多種。
[0060]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1a所示，交聯(lián)后的產(chǎn)品從反應(yīng)器(I)擠出通過雙擴(kuò)散凝固裝置(9)而進(jìn)行凝固。
[0061]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在反應(yīng)器(I)的卸料口處設(shè)置多孔篩(8)，并以一定壓力將透明質(zhì)酸交聯(lián)產(chǎn)物壓出至雙擴(kuò)散凝固裝置(9)中，并使其凝固。
[0062]所述多孔篩⑶的目數(shù)為約10?約100,孔徑為約10 μ m?約5mm。所述壓力為約 I ?約 20kg/Cm20
[0063]步驟(4):凝膠產(chǎn)物的分子鏈拉伸
[0064]在本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備方法中，在步驟(3)之后還可通過卷繞處理步驟對(duì)所述透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行進(jìn)一步分子鏈拉伸處理。卷繞處理能夠在一定外力作用下使處于彎曲狀態(tài)的分子鏈轉(zhuǎn)為直鏈狀態(tài)，由此，卷繞處理可使凝膠的力學(xué)性能增強(qiáng)，從而提高其抗降解能力。
[0065]本發(fā)明所述的卷繞拉伸步驟可通過如紡絲領(lǐng)域中常用的卷繞裝置進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1a所示，將由雙擴(kuò)散凝固裝置(9)凝固后的產(chǎn)物通過卷繞設(shè)備
(10)進(jìn)行分子鏈拉伸，由此制備經(jīng)分子鏈拉伸的透明質(zhì)酸衍生物凝膠。
[0066]本發(fā)明的制備方法中適用的卷繞拉伸設(shè)備的速度為約50r/min?約300r/min。
[0067]步驟(5):分離和鈍化
[0068]在本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備方法中，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法對(duì)交聯(lián)后的透明質(zhì)酸衍生物產(chǎn)物進(jìn)行分離和/或純化。分離和純化的方法包括常壓或減壓蒸餾、重結(jié)晶、柱層析、離子交換層析、凝膠層析、薄層層析、溶劑萃取、透析、洗滌等。所述各分離和純化步驟可在任一個(gè)上述制備步驟之后進(jìn)行。
[0069]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在最后一個(gè)上述制備步驟之后對(duì)透明質(zhì)酸衍生物凝膠進(jìn)行分離和純化。更具體的，所述分離和純化步驟包括先用如飽和生理鹽水或PBS緩沖溶液將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)物浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)單體及其它雜質(zhì)，然后用球形切粒機(jī)切成球形結(jié)構(gòu)進(jìn)行造粒。然后將所得凝膠顆粒經(jīng)過生理鹽水或PBS緩沖溶液透析純化以得到純凈的透明質(zhì)酸凝膠的最終產(chǎn)物。
[0070]實(shí)施例
[0071]圖1透明質(zhì)酸衍生物凝膠的制備示意圖。
[0072]1-可旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器；2_攪拌器；3_冷凝器；4_真空泵；5_進(jìn)料口 ；6_溫度控制；7-加熱套；8_多孔篩；9_凝固??；10_卷繞裝置。
[0073]圖2本發(fā)明實(shí)施例3透明質(zhì)酸衍生物凝膠的降解率示意圖.
[0074]以下參照附圖，以實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明。
[0075]以下實(shí)施例僅以示例的方式描述本發(fā)明，而不是將本發(fā)明限制在所述實(shí)施例所明確的實(shí)施方案中，從說明書整體和權(quán)利要求而言，本發(fā)明的范圍是清楚的。
[0076]材料
[0077]透明質(zhì)酸鈉:購(gòu)自山東福瑞達(dá)公司
[0078]EDC:購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑
[0079]ETC:購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑
[0080]NHS:購(gòu)自上海化學(xué)試劑[0081 ] 磺化NHS:購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑
[0082]I，I’ - 二硫-P-亞苯基雙(碳二亞胺):購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑
[0083]琥珀酸酐:購(gòu)自上海化學(xué)試劑
[0084]實(shí)施例1
[0085]通過以下步驟制備透明質(zhì)酸衍生物水凝膠:
[0086]將原料透明質(zhì)酸納溶于去離子水配成透明質(zhì)酸濃度為30mg/ml的溶液。加入0.1N的鹽酸緩沖劑，調(diào)節(jié)PH值至4.75，然后將所得透明質(zhì)酸水溶液加入到如圖1所示的反應(yīng)器
(I)中，向透明質(zhì)酸水溶液滴加EDC和NHS的水溶液，在避光條件下，在0°C的溫度條件下，調(diào)節(jié)自旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為1rpm并采用圖示I所示的復(fù)合攪拌方式進(jìn)行反應(yīng)30min后，然后將反應(yīng)器溫度控制為_80°C進(jìn)行反應(yīng)24h。
[0087]EDC的量為透明質(zhì)酸濃度的10重量％。
[0088]EDC與NHS的摩爾比為1:1。
[0089]在經(jīng)過4h交聯(lián)反應(yīng)后，用8kg/cm2的壓力使反應(yīng)混合物通過卸料口處的100目多孔篩(孔徑為ΙΟΟμπι)，并推出至凝固裝置中通過乙醇凝固浴進(jìn)行凝固，然后通過轉(zhuǎn)速為500r/min的卷繞裝置對(duì)透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物進(jìn)行分子鏈拉伸處理。
[0090]將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)物浸泡在PBS緩沖液中進(jìn)行透析以去除未反應(yīng)的單體及其它雜質(zhì)。用球形切粒機(jī)切成球形結(jié)構(gòu)。然后將所得凝膠顆粒經(jīng)過飽和生理鹽水或PBS緩沖溶液透析純化3?10天。其后在_80°C?_40°C的溫度下將所得凝膠預(yù)冷凍，然后在-40°C?_20°C下冷凍干燥而得到純凈的最終凝膠產(chǎn)物。
[0091]將所得凝膠產(chǎn)物在室溫下用pH值為7.2的PBS緩沖液充分溶脹，配成注射液，并通過針管，以恒定速度推動(dòng)勻化，得到可注射的水凝膠。凝膠與緩沖液PBS的濃度為1mg/ml ο
[0092]實(shí)施例2
[0093]通過以下步驟制備透明質(zhì)酸衍生物水凝膠:
[0094]將原料透明質(zhì)酸納溶于去離子水配成透明質(zhì)酸濃度為50mg/ml的溶液。加入0.1N的鹽酸緩沖劑，調(diào)節(jié)PH值至4.75，然后將所得透明質(zhì)酸水溶液加入到如圖1所示的反應(yīng)器中，向透明質(zhì)酸水溶液滴加ETC和NHS的水溶液，在避光條件下，在8°C的溫度條件下，調(diào)節(jié)自旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為200rpm并采用復(fù)合攪拌方式進(jìn)行反應(yīng)12h。
[0095]EDC的量為透明質(zhì)酸濃度的4重量％。
[0096]EDC與NHS的摩爾比為3: I。
[0097]在經(jīng)過48h交聯(lián)反應(yīng)后，用8kg/cm2的壓力使反應(yīng)混合物通過卸料口處的100目多孔篩(孔徑為1mm)，并推出至氫氧化鈉溶液的凝固浴中進(jìn)行凝固，然后通過轉(zhuǎn)速為500r/min的卷繞裝置對(duì)透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物進(jìn)行分子鏈拉伸處理。
[0098]用無水乙醇將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)物浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)的單體及其它雜質(zhì)，用球形切粒機(jī)切成球形結(jié)構(gòu)。然后將所得凝膠顆粒經(jīng)過飽和生理鹽水或PBS緩沖溶液透析純化3?10天。其后在_80°C?_40°C的溫度下將所得凝膠預(yù)冷凍，然后在-40°C?_20°C下冷凍干燥而得到純凈的最終凝膠產(chǎn)物。將所得凝膠產(chǎn)物在室溫下用pH值為7.2的PBS緩沖液充分溶脹，配成注射液，并通過針管，以恒定速度推動(dòng)勻化，得到可注射的水凝膠。凝膠與緩沖液PBS的濃度為20mg/ml。
[0099]實(shí)施例3
[0100]通過以下步驟制備透明質(zhì)酸衍生物水凝膠:
[0101]將原料透明質(zhì)酸納溶于去離子水配成透明質(zhì)酸濃度為100mg/ml的溶液。加入0.1N的鹽酸緩沖劑，調(diào)節(jié)pH值至5.5，然后將所得透明質(zhì)酸水溶液加入到反應(yīng)釜中，向透明質(zhì)酸水溶液滴加I，I’ - 二硫-P-亞苯基雙(碳二亞胺)和NHS的水溶液，在避光條件下，在8 °C的溫度條件下，調(diào)節(jié)自旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為300rpm并采用復(fù)合攪拌方式進(jìn)行反應(yīng)。
[0102]所述1，I’ - 二硫-ρ-亞苯基雙(碳二亞胺)的量為透明質(zhì)酸濃度的1% ;
[0103]所述1，I’ - 二硫-ρ-亞苯基雙(碳二亞胺)與NHS的摩爾比為1:2。
[0104]在經(jīng)過72h交聯(lián)反應(yīng)后，用8kg/cm2的壓力使反應(yīng)混合物通過卸料口處的10目多孔篩(孔徑為5mm)，并推出至乙二醇凝固浴中進(jìn)行凝固，然后通過轉(zhuǎn)速為500r/min的卷繞裝置對(duì)透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物進(jìn)行分子鏈拉伸處理。
[0105]用無水乙醇將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)物浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)的單體及其它雜質(zhì)，用球形切粒機(jī)切成球形結(jié)構(gòu)。然后將所得凝膠顆粒經(jīng)過飽和生理鹽水或PBS緩沖溶液透析純化3?10天。其后在_80°C?_40°C的溫度下將所得凝膠預(yù)冷凍，然后在-40°C?_20°C下冷凍干燥而得到純凈的最終凝膠產(chǎn)物。將所得凝膠產(chǎn)物在室溫下用pH值為7.2的PBS緩沖液充分溶脹，配成注射液，并通過針管，以恒定速度推動(dòng)勻化，得到可注射的水凝膠。凝膠與緩沖液PBS的濃度為30mg/ml。
[0106]實(shí)施例4
[0107]通過以下步驟制備透明質(zhì)酸衍生物凝膠膜:
[0108]將原料透明質(zhì)酸納溶于去離子水配成透明質(zhì)酸濃度為100mg/ml的溶液。加入
0.1N的鹽酸緩沖劑，調(diào)節(jié)pH值?5.5，然后將所得透明質(zhì)酸水溶液加入到反應(yīng)釜中，向透明質(zhì)酸水溶液滴加EDC和琥珀酸酐的水溶液，在避光條件下，在4°C的溫度條件下，調(diào)節(jié)自旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為50rpm并采用復(fù)合攪拌方式進(jìn)行反應(yīng)。
[0109]所述EDC的量為透明質(zhì)酸濃度的1% ；
[0110]所述EDC與琥珀酸酐的摩爾比為1: 2。
[0111]在經(jīng)過120h交聯(lián)反應(yīng)后，用8kg/cm2的壓力使反應(yīng)混合物通過卸料口處的10目多孔篩(孔徑為5mm)推出至異丙醇凝固浴中進(jìn)行凝固，然后通過轉(zhuǎn)速為500r/min的卷繞裝置對(duì)透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物進(jìn)行分子鏈拉伸處理。
[0112]用無水乙醇將所得透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)物浸泡、洗滌、抽提，除去未反應(yīng)的單體及其它雜質(zhì)，用球形切粒機(jī)切成球形結(jié)構(gòu)。然后將所得凝膠顆粒經(jīng)過飽和生理鹽水或PBS緩沖溶液透析純化3?10天。其后在_80°C?_40°C的溫度下將所得凝膠預(yù)冷凍，然后在_40°C?_20°C下冷凍干燥而得到純凈的最終凝膠產(chǎn)物。取1g干燥的如上制備的透明質(zhì)酸衍生物凝膠，用10ml醫(yī)用水將其溶解后，倒入模具中進(jìn)行壓膜，得到具有一定力學(xué)性能的透明質(zhì)酸膜材料。
[0113]測(cè)試方法
[0114]溶脹比:本發(fā)明中的溶脹比是指所得透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物在室溫下用pH值為約7.2的PBS緩沖液充分溶脹后，經(jīng)溶脹的凝膠產(chǎn)物重量對(duì)未溶脹的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物重量的比值。通過本發(fā)明的制備方法得到的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物的溶脹比為約50?約300。
[0115]凝膠濃度:本發(fā)明中的凝膠濃度是指通過本發(fā)明的制備方法得到的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物中透明質(zhì)酸的含量，例如根據(jù)咔唑法(Bitter和Muir, 1962, Anal B1chem.4:330-334)可測(cè)定透明質(zhì)酸的含量。通過本發(fā)明的制備方法得到的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物的凝膠濃度為約lmg/ml?約30mg/ml。
[0116]交聯(lián)度:本發(fā)明中的透明質(zhì)酸凝膠的交聯(lián)度是指稱取參加交聯(lián)反應(yīng)的不能被水所溶解的透明質(zhì)酸的質(zhì)量與投入的透明質(zhì)酸總質(zhì)量的百分比。
[0117]粘彈性:本發(fā)明中的透明質(zhì)酸凝膠的粘彈性是指通過Brookfield旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測(cè)試得到的粘度。通過本發(fā)明的制備方法得到的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)物的粘度為約50000cPs?約 200000cPs。
[0118]試駘例
[0119]取本發(fā)明實(shí)施例3的凝膠產(chǎn)品lg，將其溶解于含有30u的透明質(zhì)酸酶的PBS溶液(pH = 7.2)中，然后在37°C的水浴中進(jìn)行模擬降解實(shí)驗(yàn)。在48h后使用分光光度計(jì)測(cè)定在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)該降解液中糖醛酸的濃度，從而計(jì)算透明質(zhì)酸的降解率，所得結(jié)果見圖2。
[0120]圖2中交聯(lián)后的透明質(zhì)酸衍生物凝膠具有良好的抗降解性，例如其48h的降解率為12.8%。而目前市售的透明質(zhì)酸凝膠產(chǎn)品在相同情況下的降解率為18.5% -約40%的水平(例如參見CN101244290A的表(I))，由此可見本發(fā)明的透明質(zhì)酸衍生物凝膠產(chǎn)品明顯具有更佳的抗降解能力。
[0121]本發(fā)明通過低溫反應(yīng)可避免零段交聯(lián)劑與輔助交聯(lián)劑在較高溫度下發(fā)生副反應(yīng)而導(dǎo)致凝膠的抗降解力、凝膠品質(zhì)的降低。此外，低溫反應(yīng)還有助于提高凝膠產(chǎn)物交聯(lián)程度，可使凝膠的粘彈性提高，避免凝膠由于硬度較大導(dǎo)致填充的困難以及病人體內(nèi)的不適應(yīng)，降低了紅腫發(fā)炎等癥狀。
【權(quán)利要求】
1.透明質(zhì)酸衍生物凝膠及其制備方法，其包括以下步驟: (1)將透明質(zhì)酸或其鹽溶于水中，使所得透明質(zhì)酸水溶液中透明質(zhì)酸的濃度為1mg/ml?200mg/ml,并將pH值調(diào)節(jié)為I?7配成均勻溶液； (2)向如圖(I)所示反應(yīng)器中加入上述反應(yīng)溶液，在_80°C?20°C的反應(yīng)溫度下，在零段交聯(lián)劑存在下使所述透明質(zhì)酸水溶液進(jìn)行交聯(lián)； (3)交聯(lián)后的產(chǎn)品從反應(yīng)器中擠出通過雙擴(kuò)散凝固裝置通過凝固液進(jìn)行凝固； (4)在步驟(3)之后的透明質(zhì)酸衍生物凝膠還可通過卷繞處理步驟對(duì)所述透明質(zhì)酸衍生物進(jìn)行進(jìn)一步分子鏈拉伸處理。 所述透明質(zhì)酸鹽選自透明質(zhì)酸的鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鈣鹽和鎂鹽中的一種或多種； 所述的透明質(zhì)酸或其鹽的分子量為50000?3000000Da ； 所述的零段交聯(lián)劑是碳二亞胺類交聯(lián)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中通過向所述透明質(zhì)酸水溶液中加入緩沖劑調(diào)節(jié)PH值，所述緩沖劑包含鹽酸、乙酸和磷酸中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1?2中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述反應(yīng)溫度為溫度梯度，即先在(TC?20°C的條件下進(jìn)行反應(yīng)30min?48h，然后在_80°C?O V的條件下進(jìn)行反應(yīng)12h?6天。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述碳二亞胺類交聯(lián)劑選自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(ETC)、1,1’- 二硫-p-亞苯基雙(碳二亞胺)、叔丁基碳二亞胺和二異丙基碳二亞胺中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述透明質(zhì)酸的交聯(lián)在輔助交聯(lián)劑的存在下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其中所述輔助交聯(lián)劑選自N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺(磺基-NHS)、琥珀酸酐和高碘酸鈉中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6所述的制備方法，其中所述零段交聯(lián)劑和所述輔助交聯(lián)劑的摩爾比為5:1?1: 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的制備方法，其中所述零段交聯(lián)劑與所述透明質(zhì)酸的重量比為2%?10%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的制備方法，其中在步驟(2)中通過復(fù)合攪拌方式使反應(yīng)混合物交聯(lián)而形成透明質(zhì)酸衍生物產(chǎn)物，所述復(fù)合攪拌方式是指采用交聯(lián)反應(yīng)器的自旋轉(zhuǎn)與攪拌反應(yīng)器采用上下?lián)v動(dòng)方式結(jié)合在一起的攪拌方式。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中所述凝固浴的浴液選自乙醇、氫氧化鈉溶液、乙二醇和異丙醇中的一種或多種。
【文檔編號(hào)】C08L5/08GK104231285SQ201310231005
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】馮淑芹 申請(qǐng)人:馮淑芹