專(zhuān)利名稱(chēng)：一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著人口老齡化程度的提高，心腦血管疾病已經(jīng)成為人類(lèi)健康的最大威脅。據(jù)報(bào)道心腦血管疾病是老年人的三大主要死亡原因之一，目前因心腦血管疾病死亡者占總死亡人數(shù)的34%，在存活中約有3/4左右的患者有不同程度的勞動(dòng)能力和生活自理能力的喪失。而缺血性中風(fēng)是心腦血管中最常見(jiàn)的一種疾病，占腦血管病的43飛5%，該疾病發(fā)病率高、病死率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重的危害著人類(lèi)生存和生活質(zhì)量。中風(fēng)病世界人口標(biāo)化發(fā)病率為239. 4/10萬(wàn)，其中缺血性中風(fēng)占53. 6%。隨著人口老齡化和人類(lèi)生活方式的變化，其發(fā)病率還有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。心腦血管疾病已成為人類(lèi)死亡的頭等原因，因此積極開(kāi)展預(yù)防該疾病的藥物研制和開(kāi)發(fā)迫在眉睫。海洋是一個(gè)巨大的天然產(chǎn)物寶庫(kù)，豐富的海洋生物和海洋活性物質(zhì)為我們提供一個(gè)巨大的海洋藥物資源庫(kù)。特殊的海洋生態(tài)環(huán)境與生物鏈之間的密切相關(guān)性使得海洋生物次生代謝產(chǎn)物具有與陸生生物所不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特異高效的生物活性，因此對(duì)海洋生物多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重大意義。從海洋活性多糖中尋找具有抗凝血作用的有效藥物，已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界的密切關(guān)注。玉足海參糖胺聚糖(Holothurialeucospilota GlycosaminoGlycans, HG),舊稱(chēng)酸性粘多糖或粘多糖。玉足海參糖胺聚糖具有抗凝、纖溶、降低血粘度、調(diào)節(jié)血脂等活性，作用于缺血性中風(fēng)(腦梗死)的各個(gè)環(huán)節(jié)，從而達(dá)到治療缺血性中風(fēng)的目的。糖胺聚糖是海參中與中風(fēng)治療有關(guān)的主要藥效成分；但是，目前從玉足海參中提取的玉足海參糖胺聚糖為粗品(質(zhì)量純度僅為50%飛0%)，不能直接用于制成注射劑。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法，將玉足海參糖胺聚糖依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化，得到純度較高的玉足海參糖胺聚糖。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法，包括下列步驟步驟一玉足海參預(yù)處理；步驟二 堿解玉足海參體壁；步驟三雙酶酶解玉足海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化玉足海參糖胺聚糖；步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖。優(yōu)化的，所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。優(yōu)化的，所述緩沖液采用0. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. 0 6. 5。本發(fā)明中所述sephadex g_100為葡聚糖凝膠,本發(fā)明對(duì)采用的試劑、材料和儀器沒(méi)有特殊要求，其均為市售產(chǎn)品，可通過(guò)多種商業(yè)渠道購(gòu)得。本發(fā)明的有益效果在于建立了一種有效地制備高純度的玉足海參糖胺聚糖的方法，在堿法提取的同時(shí)，結(jié)合胰蛋白酶和胃蛋白酶的雙酶消化處理，即首先采用堿處理玉足海參組織，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增強(qiáng)玉足海參體壁組織匯總糖胺聚糖的釋放。為提高糖胺聚糖的純度，本發(fā)明依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化純化玉足海參糖胺聚糖粗糖。本發(fā)明的方法能夠平衡玉足海參糖胺聚糖的得率與純度的關(guān)系，提高了玉足海參糖胺聚糖的純度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1
本實(shí)施例的從玉足海參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一玉足海參預(yù)處理；步驟二 堿解玉足海參體壁；步驟三雙酶酶解玉足海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化玉足海參糖胺聚糖；步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為
步驟一玉足海參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗玉足海參，去除玉足海參體表粘附的異物，用長(zhǎng)形小刀自腹部?jī)H肛門(mén)向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱(chēng)量后將玉足海參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎玉足海參體壁；
步驟二 堿解玉足海參體壁往玉足海參體壁中加2倍重量的雙蒸水,然后加入2mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為0. 5mol/L, 4°C過(guò)夜消化；
步驟三玉足海參體壁的雙酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至8. 2，加入玉足海參體壁質(zhì)量0. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢?，并滴? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在8. 2 ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應(yīng)；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2之間，再添加玉足海參體壁質(zhì)量0.40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢?；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至300C以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；
步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；
步驟五乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至6. 8，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C過(guò)夜沉淀；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心lOmin，收集沉淀，用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制玉足海參糖胺聚糖；
步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡df30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。然后將40g sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過(guò)夜,脫氣后裝柱,用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到玉足海參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用0. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. O。步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖
將玉足海參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后待的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，精糖半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無(wú)定型粉末即為精制多糖。實(shí)施例2
本實(shí)施例的從玉足海參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一玉足海參預(yù)處理；步驟二 堿解玉足海參體壁；步驟三雙酶酶解玉足海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化玉足海參糖胺聚糖；步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為 步驟一玉足海參預(yù)處理；迅速用蒸餾水沖洗玉足海參，去除玉足海參體表粘附的異物，用長(zhǎng)形小刀自腹部?jī)H肛門(mén)向前解剖鮮參，立即剔除內(nèi)臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱(chēng)量后將玉足海參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎玉足海參體壁；
步驟二 堿解玉足海參體壁往玉足海參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的NaOH，邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為0. 5mol/L, 4°C過(guò)夜消化；
步驟三玉足海參體壁的雙酶酶解
胰蛋白酶酶解用冰醋酸調(diào)解PH值至9. 0，加入玉足海參體壁質(zhì)量0. 45%的胰蛋白酶，52°C水浴5h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢瑁⒌渭? mmol/L的NaOH溶液，維持pH在9. 0 ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應(yīng)；
胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調(diào)解pH值至2. 5之間，再添加玉足海參體壁質(zhì)量0. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續(xù)酶解4h，水浴過(guò)程中充分?jǐn)嚢?；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)溶液呈微混濁時(shí)，將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min終止酶解反應(yīng)；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；
步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；
步驟五乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調(diào)解上清液的pH值至7. 2，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C過(guò)夜沉淀；
步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心lOmin，收集沉淀，用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發(fā)，沉淀物半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到粗制玉足海參糖胺聚糖；
步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡df30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。然后將40g ·sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過(guò)夜,脫氣后裝柱,用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到玉足海參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用0. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. 5。步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖
將玉足海參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無(wú)水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后待乙醇和丙酮自然揮發(fā)，精糖半干燥時(shí)，用低溫真空干燥機(jī)進(jìn)一步干燥，得到的白色干燥無(wú)定型粉末即為精制多糖。本發(fā)明實(shí)施例中所實(shí)施的從玉足海參中提取糖胺聚糖的方法，均能夠平衡玉足海參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高玉足海參糖胺聚糖的純度。
權(quán)利要求
1.一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法，其特征在于包括下列步驟步驟一玉足海參預(yù)處理；步驟二 堿解玉足海參體壁；步驟三雙酶酶解玉足海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化玉足海參糖胺聚糖；步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法，其特征在于所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過(guò)夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用10mL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍(lán)比色法檢測(cè)各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法，其特征在于所述緩沖液采用0. 5mol/L 的 NaAC/HAC，其 pH 為 6. 0 6. 5。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)天然活性物質(zhì)提取領(lǐng)域，具體涉及一種玉足海參糖胺聚糖的制備方法。其包括下列步驟步驟一玉足海參欲處理；步驟二堿解玉足海參體壁；步驟三雙酶酶解玉足海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質(zhì)；步驟五用乙醇沉淀玉足海參糖胺聚糖；步驟六干燥玉足海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化玉足海參糖胺聚糖；步驟八干燥玉足海參糖胺聚糖精糖。本發(fā)明能夠平衡玉足海參糖胺聚糖得率與純度的關(guān)系，提高玉足海參糖胺聚糖的純度。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103044564SQ201210586200
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者宣世英, 李雪潔, 林中華, 姜曼, 姜相君, 辛永寧 申請(qǐng)人:青島市市立醫(yī)院