專利名稱：頭孢氨芐的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種借助于固定在珠狀的、交聯(lián)的、親水性的、對帶有親核基團的配體具有結(jié)合活性的共聚物上的青霉素酰胺酶制備頭孢氨芐的方法。
現(xiàn)有技術(shù)通過在使用青霉素酰基轉(zhuǎn)移酶(青霉素酰胺酶)的條件下，酰化帶有活化側(cè)鏈如酰胺或酯的β-內(nèi)酰胺殘基(β-內(nèi)酰胺核)而合成半合成的β-內(nèi)酰胺抗菌素的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
多數(shù)情況下，酶在此結(jié)合到固態(tài)的、不溶于水的載體上，并且隨后在水溶液中與β-內(nèi)酰胺核和活化側(cè)鏈接觸。
目前公開的方法的缺點是，通過酶合成期望的化合物相對于活化側(cè)鏈水解為無價值的側(cè)鏈酸以及對期望產(chǎn)品的水解的比率，即所謂的S/H值，經(jīng)常是不利的，并且很難實現(xiàn)經(jīng)濟的生產(chǎn)。
由WO93/12250已知，在通過固定在Eupergit(Rhm GmbH & Co.KG，達姆斯塔特，德國，也參見比較實施例1)上的大腸桿菌青霉素酰胺酶合成半合成的β-內(nèi)酰胺抗菌素，頭孢羥氨芐和頭孢氨芐中，S/H值能夠通過選擇反應條件而受到有利的影響。然而，沒有教導載體材料性質(zhì)的影響。在WO93/12250中教導的方法的缺點特別是，需要從反應混合物中分離與β-萘酚絡合的頭孢氨芐，以至隨后的純化步驟是必須的，且出現(xiàn)產(chǎn)量降低。
因此，有嘗試開發(fā)最佳的載體材料。例如，WO97/04086公開了固定在由溶脹劑和含有游離氨基的聚合物組成的載體材料上的大腸桿菌青霉素酰胺酶，以及其用于制備β-內(nèi)酰胺衍生物的用途。然而，這種公開的制備頭孢氨芐的方法的缺點是，與活化側(cè)鏈D-苯基甘氨酰胺(PGA)相比，使用的β-內(nèi)酰胺核7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)摩爾過量3倍。如果使用化學計量過量的β-內(nèi)酰胺核，則為了能夠經(jīng)濟地運行，這些核必須以工業(yè)規(guī)?；厥?。這是昂貴的而且導致產(chǎn)率降低。另外，由于核是不穩(wěn)定的，所以環(huán)境也導致產(chǎn)品不純。
同樣，EP0 730 035教導了以可接受的產(chǎn)率在特殊的載體上制備頭孢氨芐的過程。然而，使用的載體材料(EmphazeTM)的粒度僅為60-80μm。這對工業(yè)應用來說有很大的缺點。例如，用這種材料裝填的色譜柱僅有低流動速率。
用于酶的載體材料描述在DE198 04 518中。它提到該材料可以用于酶催化合成羥氨芐青霉素和氨芐青霉素。沒有提及適合用于借助固定化的青霉素酰胺酶合成頭孢氨芐。
目的和解決方案鑒于上述討論的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明因此的目的是，提供一種改進的合成頭孢氨芐的方法，其克服了上述缺點。
本發(fā)明的方法特別應使得能夠?qū)崿F(xiàn)一個有利的S/H值。此外，使用的載體材料應具有對工業(yè)方法有利的粒度，為120-250μm。
此目的通過權(quán)利要求1中定義的方法得以實現(xiàn)。本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案在從屬于權(quán)利要求1的從屬權(quán)利要求中限定。
特別地，成功地以一種不可預見的技術(shù)上簡單的方式，通過珠狀的、交聯(lián)的、親水性的、對帶有親核基團的配體具有結(jié)合活性的載體聚合物材料實現(xiàn)了上述目的，該聚合物材料可通過由單體和稀釋劑組成的單體相的相反轉(zhuǎn)珠狀聚合而制備，其中含有的單體是(a)5-40％重量的親水性的帶有乙烯基的可自由基聚合的單體，其在室溫下形成至少10％的水溶液，(b)30-50％重量的帶有乙烯基和附加的能夠在與配體的親核基團發(fā)生類似聚合物的反應過程中產(chǎn)生共價鍵結(jié)合的官能團的可自由基聚合的單體，(c)20-60％重量的帶有兩個或多個烯屬不飽和可聚合基團的可交聯(lián)的可自由基聚合的單體，
條件是，a)、b)和c)的總和為100％重量，使用的稀釋劑是甲醇和水以1∶1.0-1∶4.0配比的混合物，其中單體相在具有5-7個碳原子的脂族烴有機溶劑組成的連續(xù)相中分布成滴狀，其中單體相與連續(xù)相的比為1∶2.0-1∶4.0，并以此形式在聚合引發(fā)劑和保護膠體的存在下進行自由基聚合，條件是，單體與稀釋劑的比為1∶1.7-1∶2.4，用青霉素酰胺酶涂覆，并將經(jīng)涂覆的載體與一種水溶液接觸，該水溶液含有(i)7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸和(ii)D-苯基甘氨酰胺，其比為1∶2-2∶1，優(yōu)選1.5∶1-1∶1.5，特別優(yōu)選為近似等摩爾比，即其比為1.2∶1-1∶1.2。
所用的載體材料和其制備方法描述于DE 19804518。
本發(fā)明的實施載體材料的制備單體為了保證單體混合物的親水性，它必須主要由親水性單體組成。親水性單體是指那些在室溫下形成至少10％的水溶液，并優(yōu)選不含有離子基團或者能夠由于加入酸或堿而被離子化的基團的單體。
單體a)是5-40％重量，8-35％重量，特別是9-12％重量的親水性的帶乙烯基的可自由基聚合的單體，其在室溫下形成至少10％的水溶液。
特別合適的單體a)是丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺，在此優(yōu)選甲基丙烯酰胺。其它的例子有不飽和可聚合羧酸的羥基烷基酯，例如丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸羥乙酯或N-乙烯基吡咯烷酮。
單體b)是30-50％重量，優(yōu)選35-45％重量的帶乙烯基和附加的能夠在與配體的親核基團發(fā)生類似聚合物的反應中產(chǎn)生共價鍵結(jié)合的官能團，優(yōu)選環(huán)氧乙烷基團(環(huán)氧基)的可自由基聚合的單體。環(huán)氧乙烷基團特別合適，以結(jié)合配體，獲得它們的生物活性。
優(yōu)選的單體b)是甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或烯丙基縮水甘油醚。特別優(yōu)選兩種單體已大約相等的量同時使用。
單體c)是20-60％重量，特別是25-55％重量，特別優(yōu)選40-55％重量的親水性、可交聯(lián)的、帶有兩個或多個烯屬不飽和可聚合基團的可自由基聚合的單體。優(yōu)選的單體c)是N，N′-亞甲基雙(丙烯酰胺)或N，N′-亞甲基雙(甲基丙烯酰胺)。特別優(yōu)選N，N′-亞甲基雙(甲基丙烯酰胺)。非必要地，還可使用0-10％重量的其他種可交聯(lián)的帶有兩個或多個烯屬不飽和可聚合基團的可自由基聚合的單體。合適的是親水性二(甲基)丙烯酸酯，例如聚環(huán)氧乙烷-二(甲基)丙烯酸酯。
每種情況下，單體a)、b)和c)的總和為100％重量。
稀釋劑單體相由單體a)-c)組成，它們?nèi)芙庠诒仨毷怯杉状己退?∶1.0-1∶4.0配比組成的混合物的稀釋劑中。甲醇和水的特別有利的混合比是1∶1.2-1∶2.5，特別是1∶1.3-1∶1.7。
單體與稀釋劑的比單體與稀釋劑的比特別關(guān)鍵。其必須在1∶1.7-1∶2.4的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在1.9-2.1的范圍內(nèi)。
連續(xù)相適合作為連續(xù)相的是具有4-7個碳原子的脂族烴有機溶劑。優(yōu)選正庚烷，特別優(yōu)選環(huán)己烷。
單體相/連續(xù)相的比單體相與通過有機溶劑形成的連續(xù)相的比必須是1∶2.0-1∶4.0，優(yōu)選1∶2.8-1∶3.3。
其它的工藝條件作為其它組分，懸浮的單體相以已知方式含有聚合引發(fā)劑，優(yōu)選無硫引發(fā)劑，特別優(yōu)選是4，4′-偶氮雙(4-戊酸)，以及保護膠體(乳化劑)，例如重均分子量為30000-80000的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-氯化三甲銨基乙酯生成的共聚物。
此外，珠狀聚合(也稱作懸浮聚合)按已知方式進行，通過例如先加入連續(xù)相和保護膠體，將也存在有引發(fā)劑的單體相，例如在40-60℃下借助攪拌分布在有機相中，然后加熱到60-70℃。水/甲醇混合物可以例如經(jīng)過6小時接近完全共沸地除去。混合物反應約3-5小時結(jié)束，然后冷卻到室溫。將形成的珠粒抽濾，真空干燥例如12小時?？蛇x擇也將珠狀聚合物過濾出來并水洗。優(yōu)選干燥在流化床干燥器中進行，因為以這種方式能夠特別有效地除去溶劑殘余物。所得的聚合物珠(＝載體聚合物材料)的尺寸為50-500μm，特別是120-250μm。所謂的結(jié)合能力是指這樣的酶催化活性，其可以在用某種酶最大加載載體聚合物材料時達到。結(jié)合能力以青霉素酰胺酶活性表示，以每克載體聚合物珠上的單位數(shù)[U/g濕態(tài)]計。本發(fā)明的載體聚合物珠的結(jié)合能力按此測量方法為至少220[U/g濕態(tài)]。
聚合物珠在水中的溶脹性通過溶脹指數(shù)[ml濕態(tài)/ml干態(tài)]表示。本發(fā)明的載體聚合物珠的溶脹指數(shù)不大于1.5。
可根據(jù)本發(fā)明使用的載體材料的涂覆在實施例中，載體材料在磷酸鉀緩沖液中在pH 7.5條件下涂覆。但是，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚的是，有非常大量的其它確保令人滿意的涂覆的方法。
頭孢氨芐的合成前體(i)7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸和(ii)D-苯基甘氨酰胺使用的濃度是10-500mM，優(yōu)選50-300mM和特別優(yōu)選150-950mM。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的方法使得能夠以有利的S/H比(合成/水解)合成頭孢氨芐。在本發(fā)明中有利的是，這一點通過使用粒度為50-500μm，特別是120-250μm的載體材料實現(xiàn)。由此達到更佳的應用技術(shù)性能，例如在固定床反應器中更高的流動速率。由更高的流動速率，導致更好的時空產(chǎn)率。較大的載體顆粒在分批法中也是有利的，因為它們能夠更快地過濾出來。這再一次提高了時空產(chǎn)率和由此提高了方法的經(jīng)濟性。
實施例(下面的測定方法對多孔載體聚合物材料領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是常用的，只是為了完整性而提及)
對大腸桿菌(Ec 3.5.1.11)的青霉素酰胺酶(＝青霉素G-?；D(zhuǎn)移酶)的結(jié)合能力的測定a)載體聚合物材料上青霉素酰胺酶的共價鍵結(jié)合將1g載體聚合物材料加到在5ml經(jīng)消毒的1M的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中的1530個單位的青霉素酰胺酶，并在23℃孵化48小時。
然后，將聚合物珠加到燒結(jié)玻璃漏斗(孔隙率為2或3)上，并用去離子水洗兩次，接著用0.1M的含有0.05％的4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，借助在漏斗上抽濾而洗兩次。測定所得的加載有青霉素?；D(zhuǎn)移酶的珠粒的濕重。
b)結(jié)合能力的測定將250-300mg濕的用青霉素酰胺酶偶聯(lián)的載體聚合物材料(聚合物珠)加入在37℃下的20ml，2％的青霉素G在0.05M，pH7.5的含有0.05％的4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖液中的溶液中。在均勻的攪拌下，用0.5M NaOH滴定釋放出的苯乙酸，保持pH值恒定在7.8約10分鐘，在此記錄NaOH的消耗量。
然后，聚合物珠如在a)中一樣經(jīng)過玻璃漏斗借助抽吸而從20ml，0.05M，pH7.5的含有0.05％的4-羥基苯甲酸乙酯的磷酸鉀緩沖液中獲得，這種測量重復兩次。
c)結(jié)合能力的計算測量曲線的線性范圍(通常此范圍為1-5分鐘)作為計算的基礎并外推10分鐘的間隔。結(jié)合能力以每克濕載體聚合物材料的青霉素酰胺酶單位數(shù)(U/g濕態(tài))形式來說明。一個單位相當于每分鐘1μmol水解的青霉素G(μmol/min)；這里1升0.5M NaOH與500μmol水解的青霉素G相當(載體聚合物材料的含水量大約恒定，因此可以忽略)。
比較實施例1將1530個單位的源自大腸桿菌的青霉素酰胺酶溶解于6ml消毒的1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)中。將此溶液加入到1g EupergitC(RhmGmbH & Co.KG，達姆斯塔特，德國)中，并將所得的懸浮液在23℃孵化72小時。聚合物珠在燒結(jié)玻璃漏斗上收集并用0.1M的磷酸鉀緩沖液洗滌。根據(jù)實施例5或6進行下面的頭孢氨芐合成和測定的S/H值。
EupergitC(一種由N，N′-亞甲基雙甲基丙烯酰胺、烯丙基縮水甘油醚和甲基丙烯酰胺生成的共聚物)及其制備方法在DE-C 2722751，US-A 4 90 713或US-A 45 11 694中描述。
比較實施例2根據(jù)WO97/04086，使用在該文獻中公開的A型酶或B型酶而如在實施例6中所述合成頭孢氨芐。
比較實施例3將大腸桿菌青霉素酰胺酶如比較實施例1中所述固定在SepabeadsFP-EP或SepabeadsFP-EP/G(Resindion S.R.I.，米蘭，意大利)上。根據(jù)實施例5或6進行下面的頭孢氨芐的合成和測定S/H值。
SepabeadsFP-EP或SepabeadsFP-EP/G是一種高度聚合的、交聯(lián)的、如Eupergit一樣帶有環(huán)氧乙烷基團的丙烯酸系共聚物。根據(jù)制造商的信息，平均粒度是150μm-300μm。
比較實施例4測量用EmphazeTM或可根據(jù)本發(fā)明使用的材料裝填的色譜柱的流動速率。
材料Emphaze UltralinkTM生物支持介質(zhì)，Lot#DC53515，Pierce，根據(jù)制造商的信息，平均粒度是50μm-80μm；根據(jù)本發(fā)明可以使用的材料，平均粒度是208μm。
對具有玻璃漏斗底部和聚丙烯管端蓋板的硼硅酸鹽玻璃色譜柱(柱尺寸1×20cm)空測可比較的流出速率。載體材料懸浮在水中過夜，然后用水沖洗入各個柱中，通過沉降和慢慢流出液體，得到高度為6.5cm的填充床。通過輕敲而趕走可能的空隙。此上部開口的柱子通過流入水形成23cm的恒定水柱。僅借助靜水壓獲得流動速率。借助秒表和10ml的量筒測定流動速率。
對于按本發(fā)明可使用的制劑測定的流動速率是4.25ml/分鐘。對EmphazeTM測定的流動速率是0.71ml/分鐘。流動速率越高(更高的時空產(chǎn)率)，球形顆粒對于固定床反應器中的操作的適應性越好。在固定床反應器中的壓力降也可以用數(shù)學方法計算K.Buchholz和B.Gdelmann，“固定化生物催化劑的表征“，Dechema專論，第84卷，編輯為K.Buchholz，VCH Weinheim，1979，第128-129頁)。
可明顯地看出，與EmphazeTM相比，按本發(fā)明可使用的材料對于在固定床反應器中的使用具有更好的應用技術(shù)性能。
實施例1-3實施例1-3中相一致的試驗條件在一個2升的帶有溫度計、水分離器、回流冷凝管、氮氣導管的攪拌燒瓶中，加入一種有機溶劑，3g作為保護膠體的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-氯化三甲銨基乙酯生成的共聚物，和5g干冰。攪拌并通入氮氣的條件下，在50℃下將由水和甲醇以1∶1.5配比(實施例1)或由甲酰胺(實施例2和3)組成的單體相作為稀釋劑，以及10g甲基丙烯酰胺，20g烯丙基縮水甘油醚，20g甲基丙烯酸縮水甘油酯和50g亞甲基雙甲基丙烯酰胺，以及2g 4，4′-偶氮雙(4-氰基戊酸)(作為聚合引發(fā)劑)，在有機相中分布，然后加熱到65-70℃下沸騰。將混合物孵化約6小時，再冷卻到室溫。將生成的聚合物珠吸濾，洗滌，并在流化床干燥器中干燥。接著測定青霉素酰胺酶的結(jié)合能力[U/g濕態(tài)]和溶脹指數(shù)[ml濕態(tài)/ml干態(tài)]。
下表中列出了實施例1-3的重要試驗參數(shù)和結(jié)果
實施例4頭孢氨芐的合成反應在固定床反應器中，在25℃和pH7.5下進行。將10ml由0.2M的7-ADCA和0.2M的D-苯基甘氨酰胺組成的混合物的水溶液導過含0.5ml的固定化青霉素酰胺酶的柱子。在反應過程中，通過添加在附設的攪拌下的儲備容器中的HCl而使pH值保持恒定。以一定的時間間隔取出樣品并如在實施例5所示借助HPLC分析。
實施例5對實施例4和比較實施例1-3的反應產(chǎn)物通過使用RP-8柱(MerckKGaA，達姆斯塔特，德國)的HPLC進行分析。使用的流動相是經(jīng)消毒的67mM的pH7.5的磷酸鉀緩沖液。頭孢氨芐用30％(體積/體積)的甲醇水溶液洗提。
頭孢氨芐的合成速率(VCeph)以及D-苯基甘氨酰胺的水解速率(VD-PhG)從HPLC分析測定，由此計算S/H值(合成速率/水解速率比(VCeph/VD-PhG))。結(jié)果在下表中列出。
本發(fā)明方法的值由7個平行實施的試驗系列組成，其得出下面的S/H值5.3，4.7，3.6，4.6，4.3，5.2，4.7；顯而易見，與比較實施例相比，用本發(fā)明方法能夠達到明顯提高約30％的S/H值。
權(quán)利要求
1.一種制備頭孢氨芐的方法，其特征在于，珠狀的、交聯(lián)的、親水性的、對帶親核基團的配體有結(jié)合活性的載體聚合物材料，其能夠通過由單體和稀釋劑組成的單體相的相反轉(zhuǎn)珠狀聚合而制備，其中含有的單體是(a)5-40％重量的親水性的帶有乙烯基的可自由基聚合的單體，其在室溫下形成至少10％的水溶液，(b)30-50％重量的帶有乙烯基和附加的能夠在與配體的親核基團發(fā)生類似聚合物的反應過程中產(chǎn)生共價鍵結(jié)合的官能團的可自由基聚合的單體，(c)20-60％重量的可交聯(lián)的帶有兩個或多個烯屬不飽和可聚合基團的可自由基聚合的單體，條件是，a)、b)和c)的總和為100％重量，使用的稀釋劑是由甲醇和水以1∶1.0-1∶4.0配比組成的混合物，其中單體相在具有5-7個碳原子的脂族烴有機溶劑組成的連續(xù)相中分布成滴狀，其中單體相與連續(xù)相的比為1∶2.0-1∶4.0，并以此形式在聚合引發(fā)劑和保護膠體的存在下進行自由基聚合，條件是，單體與稀釋劑的比為1∶1.7-1∶2.4，用青霉素酰胺酶涂覆，并將該經(jīng)涂覆的載體與一種水溶液接觸，該水溶液含有(i)7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸和(ii)D-苯基甘氨酰胺，其配比為1∶2-2∶1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，使用的單體是a)丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺，b)甲基丙烯酸縮水甘油酯和/或烯丙基縮水甘油醚，c)N，N′-亞甲基雙(丙烯酰胺)或N，N′-亞甲基雙(甲基丙烯酰胺)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，使用環(huán)己烷作為有機溶劑。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中至少一項的方法，其特征在于，青霉素酰胺酶源自大腸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的一項或多項的載體聚合物材料用于合成頭孢氨芐的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種借助固定在珠狀的、交聯(lián)的、親水性的、對帶有親核基團的配體具有結(jié)合活性的共聚物上的青霉素酰胺酶而制備頭孢氨芐的方法。
文檔編號C12P35/04GK1685059SQ200380100024
公開日2005年10月19日 申請日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者S·門茲勒, T·博勒, H－U·佩特雷特, C·梅爾 申請人:羅姆兩合公司