一種青霉素g酰化酶突變體及其編碼基因和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青霉素G?；竿蛔凅w及其編碼基因和應用，所述青霉素G?；竿蛔凅w的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明還提供了所述的青霉素G?；竿蛔凅w在合成頭孢類抗生素中的應用。本發(fā)明提供了一種新的青霉素G酰化酶突變體，與野生型相比，青霉素G?；竿蛔凅w在合成頭孢類抗生素如頭孢丙烯、頭孢克洛或頭孢羥氨芐時具有更高的活性，尤其是在催化7-APRA與側鏈2-羥基乙基對羥基苯甘氨酸酯合成頭孢丙烯時，酶活力極大提高，比活力由原先1.5U/mg提升到35U/mg，且合成水解活力比沒有下降，合成水解比可達1.8。
【專利說明】一種青霉素G酰化酶突變體及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物催化領域，尤其涉及一種青霉素G?；竿蛔凅w及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]目前越來越多的藥物或其中間體是通過一種生物酶催化合成的方式，而非化學合成。很明顯，酶催化相比于傳統(tǒng)的化學合成有極大的優(yōu)勢:(1)生物反應中可更好地避免有毒的反應試劑或溶劑；(2)酶具有高效率、底物特異性等特點；(3)更好的避免副反應的發(fā)生。
[0003]?；甘且活惔呋０匪獬上鄳人岬乃饷福鋪碓词謴V泛且作用底物譜廣，可以廣泛作用于水解脂肪、芳香、雜環(huán)氨基酰胺類酰胺，但是酶活差別巨大。當?shù)孜餅榉枷?、雜環(huán)類酰胺，尤其是存在鄰位取代基時，酰化酶的活力受到顯著干擾，這種干擾與空間位阻和電子效應有關。
[0004]立體選擇性?；甘且环N重要的手性合成工具酶，在制備手性羧酸及其衍生物方面具有廣闊的應用前景，日益受到重視。近幾年來腈化合物的生物催化技術迅速發(fā)展，?；附Y合腈水合酶能有效地水解腈化合物生產(chǎn)多種酰胺和羧酸，應用于醫(yī)藥農(nóng)藥食品及飼料行業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，在腈水合酶/?；傅碾p酶體系中，立體選擇性主要產(chǎn)生于酰胺水解這一步，尤其是對位為手性中心的底物，?；妇哂泻芎玫牧Ⅲw選擇性，這使得它在制備手性中間體及光學純的氨基酸方面具有巨大的潛力而日益受到工業(yè)界的重視。
[0005]青霉索G?；笇儆谒饷讣易澹饔糜陔逆I以外的碳-氮鍵，特別是直鏈酰胺鍵，其系統(tǒng)的名字是青霉素水解酶，別名包括青霉素酰`化酶，脂肪酶，內(nèi)酰胺水解酶，氨芐青霉素?；?。青霉索G酰化酶不僅可以水解青霉素或頭孢菌素，分別生成β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中的母核6-ΑΡΑ (6-氨基青霉烷酸)和7-ACA (7-氨基頭孢烷酸)，而且能夠催化?；鶄孺溑c內(nèi)酰胺之間的縮合反應，合成諸如阿莫西林、頭孢羥氨芐、頭孢克洛、頭孢丙烯等內(nèi)酰胺類抗生素。
[0006]國內(nèi)外對于生物催化合成內(nèi)酰胺類抗生素的研究越來越多，其中一個關鍵問題是所用的酶往往不能完全滿足實際工業(yè)化生產(chǎn)的要求，酶的穩(wěn)定性、活性、手性選擇性等欠佳，如本申請中涉及的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示的青霉素G?；福m然其能夠催化縮合7-APRA與側鏈2-羥基乙基對羥基苯甘氨酸酯合成頭孢丙烯，但是酶活力較低，僅為1.5U/mg左右，因此，有必要對其進行改造，提高酶活力。在野生型酶的基礎上設計點突變的構建新的突變體酶是一種常用的改善酶特性的方法。構建突變體酶的方法主要可分為三種類:非理性突變，半理性突變，理性突變。
[0007]非理性突變:首先對基因隨機突變，獲得基因文庫后進行篩選出有利的突變體，其中，體外隨機突變的技術多種多樣，主要有易錯PCR技術(error-prone PCR)，DNA重排技術(DNA rearrangement method),基因家方矣重排技術(gene family rearrangement method)等。這種方法工作程序簡單明了，可能會出現(xiàn)突變極好的突變體，但也可能不會。突變庫容量較大，篩選出有利突變體的概率較低。
[0008]半理性突變:組合活性位點測試(CASTing)就是其中的一種?；疽c是:通過同源建模或晶體結構確定酶底物口袋中側鏈朝向位點的氨基酸殘基，同時選擇可以與其相互作用的另一個殘基，構建飽和突變體庫，以達到減少突變庫容量的同時增加篩選出有益突變的概率。其構庫依據(jù)一般為選定底物口袋8A范圍內(nèi)的所有氨基酸殘基，將側鏈朝向底物口袋的選出，根據(jù)其所在的位點的二級結構(α螺旋為η+4，β折疊為n+2，loop為η+1)選定另一個氨基酸，針對這兩個氨基酸構建飽和突變進行篩選。這種策略構建的突變庫庫容量小，有效性高。
[0009]理性突變:在酶-底物三維建模和底物對接的基礎上，加以軟件分析，通過化學量子計算、熱能計算、分子動力學分析等，在酶活性中心區(qū)域選擇有效的點進行定向突變，直接獲得有益的突變體。這種方法突變庫的量極小，篩選出優(yōu)突變的概率基本上達到100%。然而，前期的計算工作量極大，時間長需要知識的較多前期積累，現(xiàn)階段還無法達到通過先計算再進行定點定向突變的程序。
[0010]無論采用何種方法，只有使酶在適宜的突變位置發(fā)生特定方向的突變才有可能改善酶的催化特性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明提供了一種青霉素G?；竿蛔凅w，用于合成頭孢類抗生素，且酶催化活力提聞。
[0012]一種青霉素G酰化酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]本發(fā)明通過定點突變，在野生型青霉素G?；傅幕A上引入突變位點，將其621位絲氨酸(Ser)突變?yōu)楦拾彼?Gly)，獲得了本發(fā)明的青霉素G酰化酶突變體，其中，野生型青霉素G?；傅陌被嵝蛄腥鏢EQ ID N0.3所示，核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0014]本發(fā)明還提供了編碼如所述的青霉素G酰化酶突變體的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0015]本發(fā)明又提供了包含所述基因的表達盒、重組載體和重組轉化子。
[0016]所述重組載體的原始載體具體可以為Pet_28a。
[0017]所述重組轉化子的宿主細胞為大腸桿菌，具體可以為大腸桿菌JM109。
[0018]本發(fā)明還提供了所述的青霉素G?；竿蛔凅w在合成頭孢類抗生素中的應用。
[0019]本領域普通技術人員根據(jù)本發(fā)明提供的青霉素G?；竿蛔凅w的氨基酸序列，可以方便的進行重組獲得基因工程菌，以基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體細胞或菌體細胞破碎后的上清液或者純化后的酶液作為酶源，可用于催化合成頭孢類抗生素，其中，所述頭孢類抗生素為頭孢丙烯、頭孢克洛或頭孢羥氨芐，優(yōu)選為頭孢丙烯。
[0020]在合成上述頭孢類抗生素的過程中，合成頭孢丙烯的原料優(yōu)選為7-氨基-3- [ (Z)-烯丙基-1-基]-3-頭孢環(huán)-4-羧酸(7-APRA)和對羥基苯甘氨酸酯(或其鹽酸鹽)，其中對羥基苯甘氨酸酯可以為2-羥基乙基對羥基苯甘氨酸酯、對羥基苯甘氨酸乙酯、對羥基苯甘氨酸甲酯等；合成頭孢克洛的原料優(yōu)選為7-氨基-3-氯-頭孢烯酸(7-ACCA)和苯甘氨酸甲酯(或其鹽酸鹽);合成頭孢羥氨芐的原料優(yōu)選為7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)和對羥基苯甘氨酸甲酯(或其鹽酸鹽)。[0021]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0022]本發(fā)明提供了一種新的青霉素G?；竿蛔凅w，與野生型相比，青霉素G?；竿蛔凅w在合成頭孢類抗生素如頭孢丙烯、頭孢克洛或頭孢羥氨芐時具有更高的活性，尤其是在催化7-APRA與側鏈2-羥基對羥基苯甘氨酸乙酯合成頭孢丙烯時，突變特定位置的氨基酸生成的突變體同野生型酶相比，酶活力極大提高，比活力由原先1.5U/mg提升到35U/mg，且合成水解活力比沒有下降，合成水解比可達1.8。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為采用本發(fā)明青霉素G?；竿蛔凅w催化反應的反應液的高效液相色譜圖。
[0024]圖2為實施例3的反應原理圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。
[0026]實施例1定點突變
[0027]將青霉素G?；傅腟er621突變?yōu)镚ly，因此利用oligo7軟件設計平末端引物，然后進行PCR定點突變。本次PCR突變采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶試劑盒(購買來自東洋紡科技有限公司，上海)，引物的堿基序列為:
【權利要求】
1.一種青霉素G?；竿蛔凅w，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種編碼如權利要求1所述的青霉素G酰化酶突變體的基因。
3.一種包含如權利要求2所述基因的表達盒。
4.一種包含如權利要求2所述基因的重組載體。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于，原始載體為Pet-28a。
6.一種包含如權利要求2所述基因的重組轉化子。
7.如權利要求7所述的重組轉化子，其特征在于，宿主細胞為大腸桿菌。
8.如權利要求1所述的青霉素G?；竿蛔凅w在合成頭孢類抗生素中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述頭孢類抗生素為頭孢丙烯、頭孢克洛或頭孢輕氨節(jié)。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，合成頭孢丙烯的原料為對羥基苯甘氨酸酯或其鹽酸鹽、7-氨基-3- [ (Z)-烯丙基-1-基]-3-頭孢環(huán)-4-羧酸和對羥基苯甘氨酸酯；合成頭孢克洛的原料為苯甘氨酸甲酯或其鹽酸鹽、7-氨基-3-氯-頭孢烯酸和；合成頭孢羥氨芐的原料為對羥基苯甘酸甲 酯或其鹽酸鹽、7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸。
【文檔編號】C12P35/04GK103834631SQ201410058390
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權日:2014年2月20日
【發(fā)明者】陳亮, 陳振明, 付玲燕, 周碩, 賴敦岳, 任紅陽, 陳治, 李蘭杰 申請人:浙江普洛得邦制藥有限公司, 杭州師范大學