聚合半抗原成為免疫原的方法
【專利摘要】本發(fā)明是將不具免疫原性的半抗原(hapten)直接聚合成為免疫原(immunogen)，并用于使動(dòng)物產(chǎn)生對(duì)應(yīng)抗體的技術(shù)方法。在半抗原分子含有胺基(NH2)及/或羧基(COOH)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的情況下，可利用特定的交聯(lián)劑將半抗原聚合成為大分子，并用作為免疫原注射于動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生標(biāo)的抗體。
【專利說(shuō)明】聚合半抗原成為免疫原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于一種將半抗原直接聚合形成免疫原的方法，尤其指一種將半抗原聚合成分子量為4000Da以上的大分子，以形成免疫原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫分析技術(shù)因其靈敏度高、專一性佳、省時(shí)、成本效益良好、以及操作方便等優(yōu)點(diǎn)，故常被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品檢測(cè)及環(huán)境檢測(cè)等用途。在該技術(shù)中，可專一辨識(shí)標(biāo)的物的抗體為核心成分，能否生產(chǎn)該抗體分子即為成功發(fā)展免疫分析技術(shù)的首要步驟。然而，許多檢測(cè)標(biāo)的物的分子量過小，無(wú)法直接激發(fā)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體的免疫反應(yīng)，故不具免疫原性(immunogenecity),而被稱為半抗原(hapten)。為了使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生能夠辨識(shí)半抗原的抗體，目前學(xué)界及業(yè)界多藉由學(xué)方法將半抗原與載體蛋白分子(carrier protein)進(jìn)行連結(jié)，形成半抗原-載體蛋白復(fù)合物(hapten-carrier protein complex),期盼通過載體蛋白的免疫原性，并聯(lián)激活動(dòng)物的免疫系統(tǒng)以產(chǎn)生辨識(shí)半抗原的抗體。然而此一策略仍有諸多限制，包括需選擇特定的載體蛋白、需考慮半抗原與載體蛋白的鍵結(jié)方式及鍵結(jié)距離等因素，故不盡然能成功產(chǎn)生標(biāo)的抗體；或者，即便動(dòng)物已被并聯(lián)激活能表現(xiàn)可辨識(shí)半抗原的抗體，但該抗體也僅占動(dòng)物所生成抗體的些許部分，因而標(biāo)的抗體的生成效率欠佳，也造成后續(xù)抗體分離與純化的困難，進(jìn)而升高標(biāo)的抗體的生產(chǎn)成本。[0003]以三聚氰胺(melamine)為例，由于其分子量?jī)H有126Da，并無(wú)法直接用來(lái)免疫注射動(dòng)物以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)抗體；因而現(xiàn)行生產(chǎn)三聚氰胺抗體的研究，都是先將三聚氰胺進(jìn)行化學(xué)修飾以增添額外的官能基，再將的與特定的載體蛋白進(jìn)行連結(jié)，以作為免疫注射的免疫原。此一產(chǎn)生免疫原的步驟不僅過程繁瑣、耗時(shí)冗長(zhǎng)、且需有專業(yè)訓(xùn)練的操作人員，因此不能被輕易達(dá)成或推廣普及；此外，以此種免疫原所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，也多數(shù)是辨識(shí)載體蛋白，若有并聯(lián)誘發(fā)成功的話，則僅有少許抗體會(huì)針對(duì)修飾過的三聚氰胺，因此標(biāo)的抗體的生產(chǎn)效能上仍有很大的改進(jìn)空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了使動(dòng)物能針對(duì)標(biāo)的半抗原產(chǎn)生專一性的抗體，本發(fā)明將不具免疫原性的半抗原直接聚合形成大分子的免疫原，如此不僅簡(jiǎn)化將半抗原轉(zhuǎn)化為免疫原的步驟，更可因免除載體蛋白的參與而顯著提升生產(chǎn)標(biāo)的抗體的效能。
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種將半抗原直接聚合形成免疫原的方法，其步驟包括:
[0006]A)提供含半抗原的反應(yīng)溶液，其中半抗原為含有兩個(gè)或兩個(gè)以上胺基的化學(xué)物質(zhì)、含有兩個(gè)或兩個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)、或含有一個(gè)或一個(gè)以上胺基以及含有一個(gè)或一個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)；
[0007]B)加入交聯(lián)劑至含半抗原的反應(yīng)溶液；以及
[0008]C)進(jìn)行聚合反應(yīng)得到免疫原。
[0009]步驟C中，當(dāng)半抗原為該含有兩個(gè)或兩個(gè)以上胺基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，交聯(lián)劑包含二醛類、多醛類、雙羧酸類或多羧酸類；當(dāng)半抗原為該含有兩個(gè)或兩個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，交聯(lián)劑包含二醇類、多醇類、雙胺類或多胺類；當(dāng)半抗原為該含有一個(gè)或一個(gè)以上胺基以及含有一個(gè)或一個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，交聯(lián)劑包含l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyI) -carbodiimide (EDC),或彼此以羧基胺基脫水聯(lián)結(jié)。
[0010]此外，步驟A中，該含半抗原的反應(yīng)溶液的濃度為lXl0.mM以上，其中又以I X l(TlclmM至半抗原可溶解的最大飽和濃度為較佳。
[0011]而步驟B中，該交聯(lián)劑的濃度為lX10_1(lmM以上，其中又以I X 至交聯(lián)劑的最大濃度為較佳，又以125mM至300mM為更佳。
[0012]反應(yīng)溫度對(duì)于半抗原的聚合反應(yīng)有顯著的影響，步驟C中的聚合反應(yīng)溫度是半抗原可承受的溫度范圍，較佳為37°C至80°C的溫度條件。
[0013]本發(fā)明中一較佳實(shí)施例，是將不具免疫原性的三聚氰胺半抗原直接聚合成為免疫原，并用以注射于動(dòng)物體內(nèi)，使動(dòng)物產(chǎn)生標(biāo)的抗體的技術(shù)方法。三聚氰胺具有三個(gè)胺基，利用交聯(lián)劑戊二醛進(jìn)行連結(jié)反應(yīng)，可將小分子的三聚氰胺聚合成為大分子的聚合物，該聚合反應(yīng)如下式所示。
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種將半抗原直接聚合形成免疫原的方法，其步驟包括: A)提供一含半抗原的反應(yīng)溶液，其中，該含半抗原的反應(yīng)溶液中的一半抗原為一含有兩個(gè)或兩個(gè)以上胺基的化學(xué)物質(zhì)、一含有兩個(gè)或兩個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)、或一含有一個(gè)或一個(gè)以上胺基以及一個(gè)或一個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)； B)加入一交聯(lián)劑至該含半抗原的反應(yīng)溶液；以及 C)進(jìn)行聚合反應(yīng)得到分子量大于4000Da的免疫原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)該半抗原為該含有兩個(gè)或兩個(gè)以上胺基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，該交聯(lián)劑是至少一選自二醛類、多醛類、雙羧酸類、以及多羧酸類所組成的群組。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)該半抗原為該含有兩個(gè)或兩個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，該交聯(lián)劑是至少一選自二醇類、多醇類、雙胺類、以及多胺類所組成的群組。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)該半抗原為該含有一個(gè)或一個(gè)以上胺基以及一個(gè)或一個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，該交聯(lián)劑包含EDC。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，當(dāng)該半抗原為該含有一個(gè)或一個(gè)以上胺基以及一個(gè)或一個(gè)以上羧基的化學(xué)物質(zhì)時(shí)，由彼此的胺基以及羧基行脫水反應(yīng)而聯(lián)結(jié)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟A的該含半抗原的反應(yīng)溶液的濃度為lXl(T1QmM 以上。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟B的該交聯(lián)劑的濃度為lX10_1(lmM以上。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟A的該半抗原為三聚氰胺。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟B的該交聯(lián)劑為戊二醛。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟C的聚合反應(yīng)溫度為0°C至80°C。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，三聚氰胺的反應(yīng)溶液的濃度為ΙΧΙΟ,πιΜ至24mM。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，戊二醛的濃度為IX 10_1CI至300mM。
【文檔編號(hào)】C08G12/32GK103665286SQ201210355280
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】林哲雄, 王玉麒 申請(qǐng)人:王玉麒