背景

本發(fā)明涉及用于確定懷疑含有維生素D分析物及其代謝物的樣品中其存在和/或量的組合物、方法和試劑盒。

許多小分子化合物或半抗原，諸如例如藥物和維生素，以同分異構(gòu)形式存在，其中只有一種形式是活性的。為了獲得分析物的活性形式的準(zhǔn)確測量，必須解決該分析物的非活性同分異構(gòu)體的存在。分析物的兩種同分異構(gòu)形式(即活性形式和非活性形式)的測量值可導(dǎo)致可能對個體不利(取決于分析物的活性形式的功能)的不準(zhǔn)確性。準(zhǔn)確地評價生物樣品中一對同分異構(gòu)分析物的每種的水平是重要的，尤其當(dāng)僅一種同分異構(gòu)體是活性的，并且包括非活性同分異構(gòu)體的量的測量值扭曲了樣品中分析物的水平。例如，測量生物樣品中的維生素D水平是重要的，因?yàn)榫S生素D缺乏與哺乳動物中許多病癥相關(guān)。在嬰兒中，例如，包括3-差向異構(gòu)體的量的維生素D測量值可導(dǎo)致嬰兒中維生素D水平的不準(zhǔn)確評價，這進(jìn)而可導(dǎo)致缺乏合適的補(bǔ)充。測量維生素D的活性形式是重要的，使得嬰兒可以接受適當(dāng)?shù)木S生素D療法(如果必要)。

術(shù)語“維生素D”是指一類脂溶性開環(huán)甾類化合物。在人類中，維生素D是獨(dú)特的，因?yàn)樗勺鳛槟戔}化甾醇(維生素D₃)或麥角鈣化甾醇(維生素D₂)被攝取，以及因?yàn)闄C(jī)體也可以在日照充足時(由膽甾醇)合成維生素D。由于此后一特性，一些人認(rèn)為維生素D是非必要膳食維生素，盡管大多數(shù)人認(rèn)為它是必要營養(yǎng)素。維生素D在鈣離子體內(nèi)平衡的正性調(diào)節(jié)中具有重要的生理作用。維生素D₃是由動物合成的維生素形式。其如同維生素D₂一樣也是添加至乳制品和某些食品的常見補(bǔ)充劑。

膳食和內(nèi)在合成的維生素D₃兩者都必須經(jīng)歷代謝活化來生成生物活性代謝物。在人類中，維生素D₃活化的初始步驟主要在肝臟中發(fā)生并涉及羥基化以形成中間代謝物25-羥基膽鈣化甾醇。鈣二醇是維生素D₃在循環(huán)系統(tǒng)中的主要形式。維生素D₂也經(jīng)歷類似的代謝活化，成為25-羥基維生素D₂。這些化合物共同地被稱作25-羥基維生素D(縮寫為25(OH)D)，并且它們是在血清中測量以確定維生素D狀態(tài)的主要代謝物；25(OH)D及其差向異構(gòu)體兩者都為需要被轉(zhuǎn)化成1,25(OH)D以發(fā)揮生物功能的前激素。1,25(OH)D的生物活性與3-差向-1,25(OH)D的生物活性的比較是復(fù)雜的。

維生素D化合物25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂在3-位是差向異構(gòu)的，其中所述差向異構(gòu)體分別被命名為25-羥基維生素D₃和3-差向-25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂和3-差向-25-羥基維生素D₂。只有這些差向異構(gòu)化合物的每種的一種差向異構(gòu)體，即分別25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂是活性的。25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂的差向異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)在圖1中闡述。

評價生物樣品中的維生素D水平是重要的，因?yàn)榫S生素D缺乏與哺乳動物中的許多疾病相關(guān)。需要用于準(zhǔn)確和靈敏測定樣品中的維生素D、維生素D的差向異構(gòu)形式和維生素D類似物及其代謝物的濃度的試劑和方法。

概述

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測定懷疑含有維生素D分析物的樣品中的維生素D分析物的量的方法。在測定介質(zhì)中提供組合，其包括樣品、對維生素D分析物的差向異構(gòu)體特異性的維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體(其中所述維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體不在任何可檢測的程度上結(jié)合維生素D分析物)和對維生素D分析物特異性的維生素D結(jié)合配偶體。在維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體與維生素D分析物的差向異構(gòu)體結(jié)合以及維生素D結(jié)合配偶體與維生素D分析物結(jié)合的條件下孵育測定介質(zhì)以形成維生素D結(jié)合配偶體結(jié)合的復(fù)合物。測定維生素D結(jié)合配偶體結(jié)合的復(fù)合物的量，并與樣品中的維生素D分析物的量相關(guān)。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及如上所闡述的方法，其中針對式I化合物產(chǎn)生所述維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體，例如，抗體：

(R¹)_p-(L)_q-Z，其中

或H，其中至少一個R¹不是H，

Y是O、S、CR或NR⁴，

X是-O-(CH₂)_n-C(O)-、-(CH₂)_w-C(O)-、-(CH₂)_w-C(O)-(CH₂)_x-C(O)-、-(CH₂)_w-C(O)-NH(CH₂)_y-C(O)-、-NR³-C(O)-，

R獨(dú)立地是H或烷基，

R²獨(dú)立地是H或烷基，

R³、R⁴、R⁵和R⁶獨(dú)立地是H或烷基，或者R⁴和R⁵可以一起形成鍵，或者R⁵和R⁶可以一起形成鍵，

R¹¹是H、烷基或?；?/p>

n是1至10的整數(shù)，

w是0至10的整數(shù)，

x是1至10的整數(shù)，

y是1至10的整數(shù)，

p是1至10的整數(shù)，

L是連接基團(tuán)，

q是0或1，且

Z是聚(氨基酸)免疫原性載體或非聚(氨基酸)免疫原性載體，

或其針對上述化合物中的兩種或更多種產(chǎn)生。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及如上所闡述的方法，其中針對式II化合物產(chǎn)生維生素D差向異構(gòu)體抗體：

NHR^1’-(CH₂)_r’-NR^1’’-((CH₂)_r’-NR^1’’’)_s’-(CH₂)_r’-NR^7’-Z’，其中

R^1’、R^1’’或R^1’’’各自獨(dú)立地選自

和H，

其中R^1’、R^1’’或R^1’’’中的至少一個不是H，

n’是1至10的整數(shù)，

r’獨(dú)立地是1至10的整數(shù)，

s’是1至10的整數(shù)，

R^7’是H或烷基，

R^11’是H、烷基或?；?，且

Z’是聚(氨基酸)免疫原性載體或非聚(氨基酸)免疫原性載體。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測定懷疑含有維生素D分析物的樣品中的維生素D分析物的量的方法。在測定介質(zhì)中以組合提供樣品、作為對維生素D分析物特異性的維生素D抗體的捕獲抗體和對維生素D分析物的差向異構(gòu)體特異性的維生素D差向異構(gòu)體抗體(其中所述維生素D差向異構(gòu)體抗體不在任何可檢測的程度上結(jié)合維生素D分析物)。在維生素D抗體結(jié)合維生素D分析物以形成維生素D抗體結(jié)合的復(fù)合物和維生素D差向異構(gòu)體抗體結(jié)合維生素D分析物的差向異構(gòu)體的條件下孵育所述測定介質(zhì)。將維生素D抗體結(jié)合的復(fù)合物與結(jié)合維生素D抗體結(jié)合的復(fù)合物中的維生素D分析物的檢測抗體組合，其中所述檢測抗體包含信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員。測量由信號產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生的信號，并與樣品中的維生素D分析物的量相關(guān)。

附圖簡述

本文提供的附圖不是按比例的，并且為了便于理解根據(jù)本文所述的原理的某些實(shí)例的目的而提供，并且通過說明而非限制所附權(quán)利要求的范圍的方式來提供。

圖1是25-羥基維生素D₃和25-羥基維生素D₂的差向異構(gòu)形式的化學(xué)式的描繪。

圖2是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖3是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖4是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖5是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖6是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖7是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖8是按照根據(jù)本文所述的原理的實(shí)施例的化合物的合成的示意圖。

圖9說明使用添加和不添加抗-3-差向異構(gòu)體-VD抗體的試劑產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。

圖10是用于使用抗-3-差向異構(gòu)體-VD抗體測定樣品中的3-差向-25(OH)D的免疫測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方案的詳述

根據(jù)本文所述的原理的結(jié)合配偶體諸如例如抗體可用于盡可能減少或消除維生素D分析物的非差向異構(gòu)形式的測定中的3-差向異構(gòu)體交叉反應(yīng)性。采用針對作為式I化合物(其中Z是免疫原性載體)的免疫原制備的抗體作為阻斷劑，可以實(shí)質(zhì)上避免由3-差向異構(gòu)體維生素D與維生素D分析物的抗體的交叉反應(yīng)性引起的總非差向異構(gòu)維生素D分析物的過度估計(jì)。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測定懷疑含有維生素D分析物的樣品中的維生素D分析物的量的方法。在測定介質(zhì)中提供組合，其包括樣品、對維生素D分析物特異性的維生素D結(jié)合配偶體和對維生素D分析物的差向異構(gòu)體特異性的維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體，其中所述維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體不在任何可檢測的程度上結(jié)合維生素D分析物。如下文更詳細(xì)討論，所述測定可以是均質(zhì)或非均質(zhì)的，競爭性或非競爭性的。在一些實(shí)例中，根據(jù)測定的性質(zhì)，包括作為維生素D類似物的試劑，并且在一些實(shí)例中，采用對維生素D分析物的結(jié)合配偶體特異性的第三結(jié)合配偶體。在維生素D差向異構(gòu)體結(jié)合配偶體與維生素D分析物的差向異構(gòu)體結(jié)合以及維生素D結(jié)合配偶體與維生素D分析物結(jié)合的條件下孵育測定介質(zhì)以形成維生素D結(jié)合配偶體結(jié)合的復(fù)合物。測定維生素D結(jié)合配偶體結(jié)合的復(fù)合物的量，并與樣品中的維生素D分析物的量相關(guān)。

維生素D的測定法的一般描述

如上所提及，根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測定懷疑含有維生素D分析物的樣品中的維生素D分析物的存在和量中的一者或兩者的方法，并且可以在本文中被稱為“維生素D的測定法”。在本文所討論的任何實(shí)例中，可以采用對維生素D的一種或多種差向異構(gòu)體特異性的結(jié)合配偶體諸如，例如根據(jù)本文所述的原理的抗體作為阻斷劑，以減少或消除維生素D分析物的測定法中來自維生素D的差向異構(gòu)體的干擾。

短語“維生素D”是指25-羥基維生素D；鈣二醇；1,25-二羥基維生素D₂；1,25-二羥基維生素D₃；1,25-二羥基維生素D₄；1,25-二羥基維生素D₅；和1,25-二羥基維生素D₆中的一種或多種；包括所有上述的差向異構(gòu)形式和代謝物。因此，維生素D分析物包括如上所定義的維生素D和維生素D的差向異構(gòu)體。根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及測定懷疑含有維生素D的差向異構(gòu)形式(例如3-差向-25-羥基維生素D₃或3-差向-25-羥基維生素D₂)的樣品中的維生素D的差向異構(gòu)形式的存在和量中的一者或兩者的方法，并且可以在本文中被稱為“維生素D的差向異構(gòu)體的測定法”。

通過說明而非限制的方式，在用于測定維生素D分析物的方法的一個實(shí)例中，提供了組合，其包含樣品，結(jié)合配偶體諸如例如根據(jù)本文所述的原理產(chǎn)生的維生素D的差向異構(gòu)體的抗體，結(jié)合配偶體諸如例如維生素D分析物的抗體和包含維生素D類似物和信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員的綴合物。

如上所提及，“在介質(zhì)中以組合”提供樣品和試劑。盡管添加至介質(zhì)以形成組合的順序可以變化，但對于本文所述的測定形式的一些實(shí)施方案，將存在特定優(yōu)先性。通過說明而非限制的方式，在一個實(shí)例中，添加順序是同時添加所有材料，并測定測定介質(zhì)對信號具有的影響，如在均質(zhì)測定法中。通過說明而非限制的方式，在另一個實(shí)例中，可以依次組合各試劑，或試劑組。在一些實(shí)施方案中，在如上所討論的各添加之后，可以涉及孵育步驟。在非均質(zhì)測定法中，在一個或多個孵育步驟之后還可以采用分離和洗滌步驟。

短語“維生素D類似物”是指與維生素D分析物競爭受體的化合物，諸如維生素D的抗體或維生素D的差向異構(gòu)體的抗體。維生素D類似物可以是修飾的維生素D，其中所述修飾提供方式將維生素D接合至另一分子諸如，但不限于，例如支持物、標(biāo)記、小分子或小分子的結(jié)合配偶體。維生素D類似物可以直接或通過連接基團(tuán)間接地連接至另一分子。維生素D類似物可以是例如與維生素D結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子或通過連接基團(tuán)與另一分子綴合的維生素D。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，維生素D類似物可以是式I化合物，其中Z是聚(氨基酸)標(biāo)記部分或非聚(氨基酸)標(biāo)記部分，或其中Z是免疫原性載體，其中此類式I化合物與維生素D分析物競爭結(jié)合維生素D抗體。

待分析的樣品是懷疑含有維生素D分析物的樣品。所述樣品可以是生物樣品或非生物樣品。生物樣品可以來自哺乳動物受試者或非哺乳動物受試者。哺乳動物受試者可以是，例如，人或其它動物物種。生物樣品包括生物體液，諸如全血、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道粘液、排泄物、尿、脊髓液、唾液、糞便、腦脊液、淚液、粘液等；生物組織，諸如毛發(fā)、皮膚、來自器官或其它機(jī)體部分的切片或切除組織；等等。在許多情況下，所述樣品是全血、血漿或血清。非生物樣品包括但不限于，例如廢物流，其也可以使用根據(jù)本文所述的原理的化合物進(jìn)行分析。

可以在任何適宜的介質(zhì)中制備樣品，所述介質(zhì)可以是例如，測定介質(zhì)，其在下文中更充分地討論。在一些情況下，可以對樣品施加預(yù)處理，諸如以裂解血細(xì)胞。在一些實(shí)例中，此類預(yù)處理在隨后不干擾測定的介質(zhì)中進(jìn)行。

介質(zhì)中的組合經(jīng)受使維生素D分析物和維生素D類似物與維生素D分析物的抗體結(jié)合以形成復(fù)合物的條件。測量復(fù)合物的量，其中復(fù)合物的量與樣品中維生素D分析物的存在和量中的一者或兩者相關(guān)。

維生素D分析物的測定可以在不分離(均質(zhì))或分離(非均質(zhì))任何測定組分或產(chǎn)物的情況下進(jìn)行。非均質(zhì)測定通常涉及一個或多個分離步驟，并且可以是競爭性或非競爭性的。免疫測定可以涉及標(biāo)記或未標(biāo)記的試劑。涉及未標(biāo)記的試劑的免疫測定通常包括形成相對大復(fù)合物，所述相對大復(fù)合物涉及由根據(jù)本文所述的原理的免疫原性綴合物制備的一種或多種抗體。對于抗體復(fù)合物的檢測，此類測定包括例如免疫沉淀素和凝集法，以及相應(yīng)的光散射技術(shù)例如，例如濁度測定法(nephelometry)和比濁法(turbidimetry)。標(biāo)記免疫測定包括但不限于例如化學(xué)發(fā)光免疫測定、酶免疫測定、熒光偏振免疫測定、放射免疫測定、抑制測定、誘導(dǎo)發(fā)光測定、以及熒光氧通道測定。

一種通常的免疫測定組包括使用有限濃度的根據(jù)本文所述的原理的抗體的免疫測定。另一組免疫測定涉及使用過量的一種或多種主要試劑，諸如例如過量的根據(jù)本文所述的原理的抗體。另一組免疫測定包括無分離均質(zhì)測定，其中在標(biāo)記的維生素D類似物與根據(jù)本文所述的原理產(chǎn)生的抗體結(jié)合、因此與樣品中可存在的維生素D分析物競爭后，來自標(biāo)記的維生素D類似物的信號被調(diào)節(jié)。

如上所提及，所述測定可以在不分離(均質(zhì))或分離(非均質(zhì))任何測定組分或產(chǎn)物的情況下進(jìn)行。均質(zhì)免疫測定由以下例舉：Rubenstein等人，美國專利號3,817,837，第3欄，第6行至第6欄，第64行中公開的EMIT?測定(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Deerfield，IL)；免疫熒光法，諸如Ullman等人，美國專利號3,996,345，第17欄，第59行至第23欄，第25行中公開的那些；酶通道免疫測定(“ECIA”)，諸如Maggio等人，美國專利號4,233,402，第6欄，第25行至第9欄，第63行中公開的那些；熒光偏振免疫測定(“FPIA”)，如例如尤其是美國專利號5,354,693中公開的那些；和酶免疫測定，諸如酶聯(lián)免疫吸附測定(“ELISA”)。非均質(zhì)測定的示例為放射免疫測定，其公開于Yalow等人，J. Clin. Invest. 39:1157 (1960)中。上述公開內(nèi)容的相關(guān)部分全部通過引用并入本文。

其它酶免疫測定是例如由Ngo和Lenhoff，F(xiàn)EBS Lett. (1980) 116:285-288討論的酶調(diào)節(jié)介導(dǎo)的免疫測定(“EMMIA”)；由Oellerich，J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904公開的底物標(biāo)記的熒光免疫測定(“SLFIA”)；由Khanna等人，Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240公開的組合酶供體免疫測定(“CEDIA”)；均質(zhì)顆粒標(biāo)記的免疫測定，諸如顆粒增強(qiáng)的比濁抑制免疫測定(“PETINIA”)，顆粒增強(qiáng)的比濁免疫測定(“PETIA”)；親和力二氧化鉻介導(dǎo)免疫測定(“ACMIA”)測定形式，其描述于美國專利號7,186,518、5,147,529、5,128,103、5,158,871、4,661,408、5,151,348、5,302,532、5,422,284、5,447,870和5,434,051中，其公開內(nèi)容以其整體并入本文。

其它測定包括吖啶酯標(biāo)記測定，諸如美國專利號6,355,803；6,673,560；7,097,995和7,319,041中討論的那些，其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文。吖啶酯標(biāo)記測定的一個具體實(shí)例為使用順磁性顆粒作為固相的吖啶酯標(biāo)記免疫測定(“ADVIA”免疫測定)。其它測定包括溶膠顆粒免疫測定(“SPIA”)，分散染料免疫測定(“DIA”)；金屬免疫測定(“MIA”)；酶膜免疫測定(“EMIA”)；和發(fā)光免疫測定(luminoimmunoassay)(“LIA”)。其它測定類型包括免疫傳感器測定，其涉及在結(jié)合維生素D分析物后，監(jiān)測存在的綴合物的光學(xué)、聲學(xué)和電學(xué)特性的變化。此類測定包括例如光學(xué)免疫傳感器測定、聲學(xué)免疫傳感器測定、半導(dǎo)體免疫傳感器測定、電化學(xué)換能器免疫傳感器測定、電位型免疫傳感器測定、電流型電極測定。

非均質(zhì)測定通常涉及一個或多個分離步驟，并且可以是競爭性或非競爭性的。各種競爭性和非競爭性非均質(zhì)測定形式公開于Davalian等人，美國專利號5,089,390，第14欄，第25行至第15欄，第9行，其通過引用并入本文。在競爭性非均質(zhì)測定的一個實(shí)例中，使具有與之結(jié)合的維生素D分析物的抗體的支持物與介質(zhì)接觸，所述介質(zhì)含有懷疑含有維生素D分析物的樣品和作為標(biāo)記的維生素D類似物的標(biāo)記的根據(jù)本文所述的原理的化合物。懷疑含有維生素D分析物的樣品已經(jīng)用分析物的差向異構(gòu)形式的抗體處理，以結(jié)合維生素D分析物的所有差向異構(gòu)形式。樣品中的維生素D分析物與標(biāo)記的維生素D類似物競爭結(jié)合維生素D分析物的抗體。將支持物和介質(zhì)分離之后，支持物或介質(zhì)的標(biāo)記活性通過常規(guī)技術(shù)測定，并且與樣品中的維生素D分析物的量相關(guān)。在上述競爭性非均質(zhì)測定的一個變型中，所述支持物包含維生素D類似物作為標(biāo)記的試劑，并且維生素D抗體包含標(biāo)記。

在一些實(shí)例中，待分析的樣品在測定介質(zhì)中與維生素D分析物的抗體和標(biāo)記的維生素D類似物組合。懷疑含有維生素D分析物的樣品已經(jīng)用分析物的差向異構(gòu)形式的抗體處理，以結(jié)合維生素D分析物的所有差向異構(gòu)形式。檢查介質(zhì)中包含標(biāo)記的維生素D類似物和維生素D分析物的抗體的復(fù)合物的存在和量中的一者或兩者，其中此類復(fù)合物的存在和/或量指示樣品中維生素D分析物的存在和/或量。

在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，待分析的樣品經(jīng)受預(yù)處理，以從內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)諸如例如結(jié)合維生素D的血漿或血清蛋白釋放維生素D分析物?？梢岳缤ㄟ^添加消化劑或釋放劑或依次使用的消化劑和釋放劑的組合，從內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)釋放維生素D分析物。所述消化劑為分解內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)、使得它們不再可以結(jié)合維生素D的試劑。此類試劑包括但不限于蛋白酶K，以及蛋白酶K和蛋白變性劑諸如，例如洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉)。通過說明而非限制的方式，用于從內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)釋放維生素D的釋放劑包括酸性變性劑諸如，例如水楊酸、華法林、磺酸類、甲苯磺酸類、萘磺酸、苯胺萘磺酸類(ANS)(包括例如1-苯胺基萘-8-磺酸(1,8-ANS)和8-苯胺基萘-1-磺酸(8-ANS))、水楊酸類和上述的衍生物。

用于進(jìn)行消化或釋放作用的條件諸如，例如持續(xù)時間、溫度、pH和介質(zhì)中釋放劑的濃度取決于例如內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)的性質(zhì)，樣品的性質(zhì)，以及釋放劑的性質(zhì)。通常，所述條件足以獲得所需的效果或功能。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，釋放劑的有效濃度為約0.01至約20 mg/mL，或約0.01至約10 mg/mL，或約0.01至約5 mg/mL，或約0.1至約20 mg/mL，或約0.1至約10 mg/mL，或約0.1至約5 mg/mL，或約0.1至約1 mg/mL。從內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)釋放維生素D分析物的樣品的預(yù)處理可以在進(jìn)行測定之前作為單獨(dú)的步驟，或在測定中作為第一個步驟進(jìn)行。在任一情況下，可能需要一種或多種試劑來停止消化劑和/或釋放劑的作用。

進(jìn)行測定的條件包括在通常提供最佳測定靈敏度的適度pH下在水性緩沖介質(zhì)中進(jìn)行測定。水性介質(zhì)可以僅為水，或可以包括0.1至約40體積%的助溶劑。介質(zhì)的pH將在例如約4至約11的范圍內(nèi)，或約5至約10的范圍內(nèi)，或約6.5至約9.5的范圍內(nèi)。pH將通常為任何特異性結(jié)合對的結(jié)合成員的最佳結(jié)合，該測定的其它試劑諸如信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員等等的pH最佳值之間的折中。各種緩沖劑可用來實(shí)現(xiàn)所需pH和在測定期間保持pH。通過說明而非限制的方式，說明性緩沖劑包括例如硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、TRIS、巴比妥、PIPES、HEPES、MES、ACES、MOPS和BICINE。所采用的具體緩沖劑不是關(guān)鍵的，但在個別測定中，可以優(yōu)選一種或另一種緩沖劑。

測定方法中可以使用各種輔助材料。例如，除緩沖劑之外，介質(zhì)可以包含采用的介質(zhì)和試劑的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，除這些添加劑之外，可以包括蛋白諸如，例如白蛋白；有機(jī)溶劑諸如，例如甲酰胺；季銨鹽；聚陰離子諸如，例如硫酸葡聚糖；結(jié)合增強(qiáng)劑，例如聚亞烷基二醇；多糖諸如，例如葡聚糖或海藻糖。介質(zhì)也可以包含用于防止形成血塊的試劑。此類試劑是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括但不限于例如EDTA、EGTA、檸檬酸鹽、肝素。介質(zhì)也可以包含一種或多種防腐劑，諸如但不限于例如疊氮化鈉、硫酸新霉素、PROCLIN? 300、鏈霉素。介質(zhì)可以另外包含一種或多種表面活性劑。如果采用，任何上述材料以足以獲得所需效果或功能的濃度或量存在。

可以以一個或多個時間間隔向介質(zhì)施加一個或多個孵育時段，所述時間間隔包括添加測定中采用的各種試劑(包括上述那些)之間的任何時間間隔。介質(zhì)通常在足以發(fā)生各種試劑組分的結(jié)合以及樣品中的維生素D的結(jié)合的溫度和時間下孵育。適度的溫度通常用于實(shí)施該方法，且測量時段期間通常為恒溫，優(yōu)選為室溫。在一些實(shí)例中，孵育溫度范圍為例如約5℃至約99℃，或約15℃至約70℃，或約20℃至約45℃。在一些實(shí)例中，孵育的時間段為例如約0.2秒至約24小時，或約1秒至約6小時，或約2秒至約1小時，或約1分鐘至約15分鐘。時間段取決于介質(zhì)的溫度和各種試劑結(jié)合的速率，這通過締合速率常數(shù)、濃度、結(jié)合常數(shù)和解離速率常數(shù)測定。

在用于測定懷疑含有維生素D分析物的樣品中的維生素D分析物的方法的實(shí)例中，在介質(zhì)中提供組合，其中該組合包括樣品、釋放劑(如果樣品未經(jīng)預(yù)處理以從內(nèi)源性結(jié)合物質(zhì)釋放維生素D分析物)，維生素D的抗體，和標(biāo)記的維生素D類似物，其中該標(biāo)記為聚(氨基酸)標(biāo)記或非聚(氨基酸)標(biāo)記。在其之前或與之同時，懷疑含有維生素D分析物的樣品用分析物的差向異構(gòu)形式的抗體處理，以結(jié)合維生素D分析物的所有差向異構(gòu)形式。檢查該介質(zhì)的包含維生素D和維生素D的抗體的復(fù)合物或包含標(biāo)記的化合物和維生素D的抗體的復(fù)合物中的一者或兩者的存在和/或量。復(fù)合物中的一者或兩者的存在和/或量指示樣品中維生素D分析物的存在和/或量。

一些已知的測定法利用信號產(chǎn)生系統(tǒng)(sps)，其采用第一和第二sps成員。名稱“第一”和“第二”是完全任意的，且并不意在暗示sps成員間的任何順序或排序，或在本方法中添加sps成員的任何順序。sps成員可以是關(guān)聯(lián)的，因?yàn)閟ps的一個成員的活化產(chǎn)生產(chǎn)物(諸如，例如光或活化產(chǎn)物)，其導(dǎo)致sps的另一個成員的活化。

在測定法的一些實(shí)施方案中，sps成員包含敏化劑諸如，例如光敏劑，和化學(xué)發(fā)光組合物，其中敏化劑的活化產(chǎn)生使化學(xué)發(fā)光組合物活化的產(chǎn)物。第二sps成員通常產(chǎn)生可檢測信號，所述可檢測信號與結(jié)合和/或未結(jié)合的sps成員的量(即與所檢測的維生素D分析物或與根據(jù)本文所述的原理的化合物結(jié)合或未結(jié)合的sps成員的量)相關(guān)。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，敏化劑試劑或化學(xué)發(fā)光試劑之一包含本化合物試劑。

在下文討論的測定法的實(shí)例中，懷疑含有維生素D分析物的樣品，在其之前或與之同時，用分析物的差向異構(gòu)形式的抗體處理，以結(jié)合維生素D分析物的所有差向異構(gòu)形式。

在一個具體實(shí)例中，可以采用誘導(dǎo)發(fā)光免疫測定法。誘導(dǎo)發(fā)光免疫測定法在美國專利號5,340,716 (Ullman)(其公開內(nèi)容通過引用并入本文)中提及。在一種方法中，該測定法使用具有與之締合的光敏劑的顆粒，其中維生素D類似物與該顆粒結(jié)合(顆粒-化合物試劑)?；瘜W(xué)發(fā)光試劑包含維生素D分析物的抗體。維生素D分析物與顆粒-化合物試劑競爭與維生素D的抗體結(jié)合。如果存在維生素D分析物，則較少數(shù)目的顆粒-化合物試劑分子與化學(xué)發(fā)光試劑緊密接近。因此，測定信號將減小。當(dāng)兩種標(biāo)記緊密接近時，光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，并活化化學(xué)發(fā)光試劑。經(jīng)活化的化學(xué)發(fā)光試劑隨后產(chǎn)生光。所產(chǎn)生的光的量與所形成的復(fù)合物的量相關(guān)，其進(jìn)而與樣品中存在的維生素D分析物的量相關(guān)。

在誘導(dǎo)發(fā)光免疫測定法的另一個具體實(shí)例中，該測定法使用具有與之締合的化學(xué)發(fā)光化合物的顆粒，其中維生素D類似物與顆粒結(jié)合(顆粒-化合物試劑)。光敏劑試劑包含維生素D的抗體。維生素D分析物與顆粒-化合物試劑競爭與維生素D的抗體結(jié)合。如果存在維生素D分析物，較少數(shù)目的顆粒-化合物試劑分子與光敏劑試劑緊密接近。因此，測定信號將減小。當(dāng)兩種標(biāo)記緊密接近時，光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧，并活化顆粒-化合物試劑的化學(xué)發(fā)光化合物。經(jīng)活化的化學(xué)發(fā)光化合物隨后產(chǎn)生光。所產(chǎn)生的光的量與所形成的復(fù)合物的量相關(guān)，其進(jìn)而與樣品中存在的維生素D分析物的量相關(guān)。

在誘導(dǎo)發(fā)光測定法的另一個具體實(shí)例中，采用光敏劑顆粒，其與小分子的結(jié)合配偶體諸如，例如抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白(其為生物素的結(jié)合配偶體)綴合。也采用包含生物素的維生素D類似物(化合物-生物素試劑)。包含維生素D分析物的抗體的化學(xué)發(fā)光試劑用作檢測系統(tǒng)的一部分。將反應(yīng)介質(zhì)孵育以允許光敏劑顆粒的抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白借助于抗生物素蛋白和生物素之間的結(jié)合而與化合物-生物素試劑結(jié)合，并且還允許作為化學(xué)發(fā)光試劑的一部分的維生素D分析物的抗體與維生素D分析物或與光敏劑顆?，F(xiàn)在連接的維生素D類似物結(jié)合。然后，用光輻照該介質(zhì)以激發(fā)光敏劑，其在其激發(fā)態(tài)能夠使氧活化為單線態(tài)。因?yàn)橛捎诖嬖诰S生素D分析物，現(xiàn)在較少的化學(xué)發(fā)光試劑與光敏劑緊密接近，所以單線態(tài)氧對化學(xué)發(fā)光試劑的活化較少，且發(fā)光較少。然后檢查介質(zhì)的發(fā)光或發(fā)射光的存在和/或量，其存在與維生素D分析物的存在和/或量相關(guān)，其中在維生素D分析物存在下，觀察到信號減小。

在誘導(dǎo)發(fā)光測定法的另一個具體實(shí)例中，采用光敏劑顆粒，其與小分子的結(jié)合配偶體諸如，例如抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白(其為生物素的結(jié)合配偶體)綴合。綴合試劑包含與生物素綴合的維生素D分析物的抗體。采用維生素D類似物，其中該化合物與化學(xué)發(fā)光顆粒連接(化學(xué)發(fā)光-化合物試劑)。將反應(yīng)介質(zhì)孵育以允許光敏劑顆粒的抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白借助于抗生物素蛋白和生物素之間的結(jié)合而與抗體-生物素試劑結(jié)合，并且還允許維生素D分析物的抗體與樣品中如果存在的維生素D分析物和與作為化學(xué)發(fā)光-化合物試劑的一部分的維生素D類似物結(jié)合。然后，用光輻照該介質(zhì)來激發(fā)光敏劑，其在其激發(fā)態(tài)能夠使氧活化為單線態(tài)。因?yàn)橛捎诖嬖诰S生素D分析物，現(xiàn)在較少的化學(xué)發(fā)光-化合物試劑與光敏劑緊密接近，所以單線態(tài)氧對化學(xué)發(fā)光試劑的活化較少，且發(fā)光較少。然后檢查介質(zhì)的發(fā)光或發(fā)射光的存在和/或量，其存在與維生素D分析物的存在和/或量相關(guān)，其中在維生素D分析物存在下，觀察到信號減小。

通過說明而非限制的方式，用于檢測維生素D分析物的測定形式的另一個實(shí)例為ACMIA測定形式。對于ACMIA測定形式，涂覆有維生素D類似物的二氧化鉻顆粒(二氧化鉻顆粒試劑)用作第一組分。第二組分為維生素D分析物的抗體。與報(bào)告酶(例如β-半乳糖苷酶)交聯(lián)以形成抗體-酶綴合物的該抗體，以過量(即大于結(jié)合樣品中可能存在的所有維生素D分析物所需的量)添加至反應(yīng)容器中。預(yù)先經(jīng)受用釋放劑處理的樣品用維生素D分析物的抗體來處理，所述抗體與樣品中的維生素D分析物結(jié)合?？贵w-酶綴合物與樣品在介質(zhì)中混合，以允許維生素D分析物與抗體結(jié)合。接下來，添加二氧化鉻顆粒試劑以結(jié)合盡(bind up)任何過量的抗體-酶綴合物。然后，施加磁鐵，其將所有二氧化鉻顆粒和過量抗體-酶從懸浮液中拉出，并將上清液轉(zhuǎn)移至最終的反應(yīng)容器。將報(bào)告酶的底物添加至最終的反應(yīng)容器中，并且將酶活性分光光度測量為吸光度隨時間的變化。該信號的量與樣品中維生素D分析物的量相關(guān)。

根據(jù)本文所述的原理的維生素D測定法的另一個實(shí)例為使用順磁性顆粒作為固相的吖啶酯標(biāo)記免疫測定法(ADVIA免疫測定法)。用于維生素D測定法的該實(shí)例的檢測系統(tǒng)包括作為小分子綴合物或捕獲綴合物的小分子-標(biāo)記的維生素D類似物(捕獲部分)，作為固相(SP)的小分子的結(jié)合配偶體涂覆的順磁性膠乳顆粒，和吖啶酯標(biāo)記的維生素D分析物的抗體(檢測抗體)。小分子可以是例如生物素或熒光素，且各個結(jié)合配偶體可以是鏈菌抗生物素蛋白或熒光素抗體。維生素D類似物可以與小分子直接連接，或者通過連接基團(tuán)諸如，例如蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)與小分子連接?；颊邩悠分械木S生素D分析物與捕獲部分的維生素D類似物競爭與吖啶酯標(biāo)記的檢測抗維生素D抗體結(jié)合。懷疑含有維生素D的樣品用1,8-ANS進(jìn)行預(yù)處理。該測定法可以根據(jù)隨之提供的制造商說明書，在Centaur?、Centaur? XP或Centaur? CP設(shè)備(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)上進(jìn)行。該信號的量與樣品中的差向異構(gòu)維生素D分析物的量相關(guān)。

根據(jù)本文所述的原理的維生素D分析物的測定法的另一個實(shí)例是使用順磁性顆粒作為固相的吖啶酯標(biāo)記免疫測定法(ADVIA免疫測定法)。用于維生素D測定法的該實(shí)例的檢測系統(tǒng)包括作為生物素綴合物或捕獲綴合物的小分子-標(biāo)記的維生素D分析物的抗體(捕獲抗體)，作為固相(SP)的鏈菌抗生物素蛋白涂覆的順磁性膠乳顆粒，和吖啶酯標(biāo)記的維生素D類似物(檢測半抗原)。吖啶酯標(biāo)記可以與維生素D類似物直接結(jié)合以形成檢測半抗原，或者可以使用連接基團(tuán)，包括例如蛋白諸如，例如BSA?；颊邩悠分械木S生素D分析物與吖啶酯標(biāo)記的檢測半抗原競爭與抗維生素D抗體結(jié)合。懷疑含有維生素D的樣品用1,8-ANS進(jìn)行預(yù)處理。該測定法可以根據(jù)隨之提供的制造商說明書，在Centaur?、Centaur? XP或Centaur?CP設(shè)備(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.，Newark DE)上進(jìn)行。在上述吖啶酯測定法的變型中，小分子可以是例如生物素或熒光素。該信號的量與樣品中的差向異構(gòu)維生素D分析物的量相關(guān)。

可以測定的樣品中維生素D分析物的濃度通常為例如約10^-5至約10^-17M，或約10^-6至約10^-14M。考量諸如測定法是定性、半定量還是定量的(相對于樣品中存在的維生素D分析物的量)，具體檢測技術(shù)，和維生素D分析物的預(yù)期濃度通常決定各種試劑的濃度。

一種或多種分析物的差向異構(gòu)形式的抗體的濃度取決于例如分析物的差向異構(gòu)形式的懷疑濃度和(非差向異構(gòu))維生素D分析物的預(yù)期濃度中的一種或多種。在一些實(shí)例中，一種或多種分析物的差向異構(gòu)形式的抗體的濃度足以結(jié)合樣品中的維生素D分析物的所有差向異構(gòu)形式。在一些實(shí)例中，基于樣品中的分析物的差向異構(gòu)形式的預(yù)期濃度，一種或多種分析物的差向異構(gòu)形式的抗體的濃度是過量的。

測定介質(zhì)中各種試劑的濃度將通常由維生素D分析物的目標(biāo)濃度范圍、測定的性質(zhì)等決定。然而，試劑各自的最終濃度通常憑經(jīng)驗(yàn)確定，以優(yōu)化測定法在目標(biāo)范圍的靈敏度。也就是說，顯著的維生素D分析物的濃度變化應(yīng)當(dāng)提供可精確測量的信號差異?？剂恐T如信號產(chǎn)生系統(tǒng)的性質(zhì)和分析物的性質(zhì)通常決定各種試劑的濃度。

如上所提及，樣品和試劑以組合提供于介質(zhì)中。盡管添加至介質(zhì)的順序可以變化，但對于本文所述的測定形式的一些實(shí)施方案，將存在特定優(yōu)先性。最簡單的添加順序當(dāng)然是同時添加所有材料，并測定測定介質(zhì)對信號具有的影響，如在均質(zhì)測定法中?；蛘?，可以依次組合各試劑，或試劑組。在一些實(shí)施方案中，在如上所述的各添加之后，可以涉及孵育步驟。在非均質(zhì)測定法中，在一個或多個孵育步驟之后還可以采用洗滌步驟。

化合物

如上所提及，根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及針對式I化合物且包括下述化合物中的兩種或更多種的混合物產(chǎn)生的結(jié)合配偶體諸如，例如適體和抗體：

(R¹)_p-(L)_q-Z，其中

或H，其中至少一個R¹不是H，

Y是O、S、CR或NR⁴，

X是-O-(CH₂)_n-C(O)-、-(CH₂)_w-C(O)-或-NR³-C(O)-，例如，在一些實(shí)例中，當(dāng)Y是NR⁴時，X是-O-(CH₂)_n-C(O)-，例如當(dāng)Y是O或S時，X是-(CH₂)_w-C(O)-、-(CH₂)_w-C(O)-(CH₂)_x-C(O)-或-(CH₂)_w-C(O)-NH(CH₂)_y-C(O)-，例如，或者，當(dāng)Y是CR 時，X是-NR³-C(O)-，

R獨(dú)立地是H或烷基，

R²獨(dú)立地是H或烷基，

R³、R⁴、R⁵和R⁶獨(dú)立地是H或烷基，或者R⁴和R⁵可以一起形成鍵，或者R⁵和R⁶可以一起形成鍵，

R¹¹是H、烷基或?；?，

n是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

w是例如0至10，1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

x是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

y是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

p是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

L是連接基團(tuán)，

q是0或1，且

Z是OR⁸，其中R⁸是H、烷基或NR⁹R¹⁰，其中R⁹和R¹⁰獨(dú)立地是H或烷基，聚(氨基酸)免疫原性載體部分，非聚(氨基酸)免疫原性載體部分，聚(氨基酸)標(biāo)記部分，非聚(氨基酸)標(biāo)記部分，非標(biāo)記聚(氨基酸)部分，非免疫原性載體聚(氨基酸)部分或支持物。

如本文所使用，術(shù)語“烷基”包括直鏈、支鏈，或環(huán)狀構(gòu)型的指定碳原子數(shù)的那些烷基。“烷基”的實(shí)例包括但不限于例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、己基、庚基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、降冰片基。在一些實(shí)例中，烷基含有1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10個碳原子，其可以是未取代的或其中的一個或多個可以被羥基，1至5、或1至4、1至3、或1至2、或2至5、或2至4、或2至3、或3至5、或3至4、或4至5個碳原子的烷氧基中的一個或多個取代。

如本文所使用，術(shù)語“?；币庵窻¹²C(O)-，其中R¹²是烷基或芳基。

如本文所使用，術(shù)語“芳基”意指通過去除一個原子衍生自芳族烴且含有一個或多個芳族環(huán)、通常一至四個芳族環(huán)的有機(jī)基團(tuán)，諸如例如苯基(衍生自苯)、萘基(衍生自萘)等，例如苯基、萘基、菲基。

如本文所使用，短語“連接基團(tuán)”是指化學(xué)部分，其可以包含約2至約50個原子或4至約30個原子(不計(jì)算氫)，并且可以包含2至約30個原子、或3至約20個原子的鏈，所述原子各自獨(dú)立地選自通常由碳、氧、硫、氮和磷組成的組。在一些實(shí)例中，部分或全部所述連接基團(tuán)可以是連接的分子的一部分，諸如但不限于，例如聚(氨基酸)上的氨基酸殘基。連接基團(tuán)中的雜原子的數(shù)目可以是0至約20、或1至約15、或約2至約10。所述連接基團(tuán)可以是脂族或芳族的。當(dāng)存在雜原子時，氧通常作為鍵合至碳、硫、氮或磷的氧代或氧基存在，氮通常作為通常鍵合至碳、氧、硫或磷的硝基、亞硝基或氨基存在；硫與氧相似；而磷通常作為膦酸單或二酯和磷酸單或二酯鍵合至碳、硫、氧或氮。在連接基團(tuán)和待綴合的分子之間形成共價鍵的常見官能團(tuán)為烷基胺、脒、硫代酰胺、醚、脲、硫脲、胍、偶氮、硫醚和羧酸酯、磺酸酯和磷酸酯、酰胺和硫酯。

在大多數(shù)情況下，當(dāng)連接基團(tuán)具有連接官能團(tuán)(用于與基團(tuán)反應(yīng)的官能團(tuán))，諸如例如，包括氮和硫類似物的非氧代羰基基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、氨基基團(tuán)，烷基化劑諸如鹵代或甲苯磺?；榛?，氧基(羥基或硫類似物、巰基)氧代羰基(例如，醛或酮)，或活性烯烴諸如乙烯基砜或α-、β-不飽和酯時，這些官能團(tuán)被連接至胺基團(tuán)、羧基基團(tuán)、活性烯烴、烷基化劑，例如溴乙酰基。當(dāng)連接胺和羧酸或其氮衍生物或磷酸時，形成酰胺、脒和磷酰胺。當(dāng)連接硫醇和活化烯烴時，形成硫醚。當(dāng)連接硫醇和烷基化劑時，形成硫醚。當(dāng)在還原條件下連接醛和胺時，形成烷基胺。當(dāng)連接酮或醛和羥胺(包括其衍生物，其中取代基取代羥基基團(tuán)的氫)時，形成肟官能團(tuán)(=N-O-)。當(dāng)連接羧酸或磷酸和醇時，形成酯。

如本文所使用，術(shù)語“免疫原性載體”意指與半抗原綴合的基團(tuán)或部分。免疫原性載體和半抗原的綴合物可以注射入能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的生物體，諸如但不限于哺乳動物、禽類(例如雞或鴿)、兩棲動物或爬行動物；或者所述綴合物可用于接種體外樣品(哺乳動物，包括人、禽類、兩棲動物或爬行動物)或以其它方式可用于產(chǎn)生半抗原的結(jié)合配偶體的技術(shù)中。

短語“結(jié)合配偶體”是指作為特異性結(jié)合對的成員的分子，其是特異性結(jié)合另一分子并因此被定義為與另一分子互補(bǔ)的兩種不同分子之一。例如，特異性結(jié)合對的一個成員可以在表面上或在空腔中具有特異性結(jié)合特異性結(jié)合對的另一成員的特定空間和極性組織的區(qū)域。通過說明而非限制的方式，所述結(jié)合配偶體可以是例如抗體或適體(例如，核酸適體或肽適體)。在一個實(shí)例中，免疫原性載體可以用作免疫原以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并引發(fā)半抗原的結(jié)合配偶體的產(chǎn)生。其它技術(shù)包括噬菌體展示和體外選擇。免疫原性載體有時也被稱為抗原載體。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，合成包含免疫原性載體(包括聚(氨基酸)和非聚(氨基酸)免疫原性載體)的免疫原，并用于制備抗體。半抗原是能夠特異性結(jié)合至相應(yīng)抗體的化合物，但本身不充當(dāng)用于制備所述抗體的免疫原(或抗原)。因此，將半抗原連接至可用于例如產(chǎn)生抗體的免疫原性載體。

作為免疫原性載體的聚(氨基酸)的分子量范圍(以道爾頓計(jì))為例如約5,000至約10,000,000，或約20,000至約600,000，或約25,000至約250,000?！熬?氨基酸)免疫原性載體部分”包括蛋白諸如，例如，白蛋白、血清蛋白，例如球蛋白、眼晶狀體蛋白和脂蛋白。說明性蛋白包括但不限于例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔?血藍(lán)蛋白(KLH)、卵卵白蛋白和牛γ球蛋白(BGG)?！胺蔷?氨基酸)免疫原性載體部分”包括多糖、核酸和顆粒(生物材料和合成材料)。各種免疫原性載體公開于Davalian等人，美國專利號5,089,390，第4欄第57行至第5欄第5行中，其通過引用并入本文。

如上所提及，所述免疫原性載體部分可以是多糖，所述多糖是單糖的高分子量聚合物，其可以天然或合成制備并通常涉及單糖的重復(fù)縮合。多糖的實(shí)例是淀粉、糖原、纖維素、碳水化合物膠，諸如阿拉伯樹膠、瓊脂等等。所述多糖還可含有聚(氨基酸)殘基和/或脂質(zhì)殘基。

如本文所使用，術(shù)語“標(biāo)記”包括聚(氨基酸)標(biāo)記和非聚(氨基酸)標(biāo)記。術(shù)語“聚(氨基酸)標(biāo)記部分”包括作為蛋白的標(biāo)記，例如但不限于例如酶、抗體、肽和免疫原。對于標(biāo)記蛋白諸如，例如酶，重均分子量范圍將為約10,000至約600,000，或約10,000至約300,000。例如，每約200,000分子量的蛋白通常存在至少一個根據(jù)本文所述的原理的化合物(類似物基團(tuán))，或每約150,000分子量至少約1個，或每約100,000分子量至少約1個，或每約50,000的分子量至少約1個，或每40,000分子量至少約1個，或每30,000分子量至少約1個，或每20,000分子量至少1個，或每10,000分子量至少1個，或每5,000分子量至少1個。在酶的情況下，類似物基團(tuán)的數(shù)目通常為1至約20，約2至約15，約3至約12，或約6至約10。

通過說明而非限制的方式，酶包括氧化還原酶諸如，例如脫氫酶，例如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和乳酸脫氫酶；涉及過氧化氫的產(chǎn)生和使用過氧化氫將染料前體氧化為染料的酶諸如，例如辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶和微過氧化物酶；水解酶諸如，例如堿性磷酸酶和β-半乳糖苷酶；熒光素酶諸如，例如螢火蟲熒光素酶和細(xì)菌熒光素酶；轉(zhuǎn)移酶；酶的組合，諸如但不限于糖氧化酶，例如葡萄糖和半乳糖氧化酶，或雜環(huán)氧化酶，諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，其與采用過氧化氫以氧化染料前體的酶(即過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶、乳過氧化物酶或微過氧化物酶)偶聯(lián)。

如本文所使用，術(shù)語“非-聚(氨基酸)標(biāo)記”包括不是蛋白的那些標(biāo)記。所述非聚(氨基酸)標(biāo)記能夠直接被檢測或可通過產(chǎn)生可檢測信號的反應(yīng)檢測。所述非聚(氨基酸)標(biāo)記可以是同位素的或非同位素的，并且通過說明而非限制的方式，可以是例如放射性同位素、發(fā)光化合物(其包括但不限于例如熒光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物)、編碼催化劑的多核苷酸、促進(jìn)劑(promoter)、染料、輔酶、酶底物、放射性基團(tuán)、小有機(jī)分子(分子量200至2,000)、顆粒和可擴(kuò)增的多核苷酸序列。

如上所提及，“小有機(jī)分子”具有約200至約2,000，或約200至約1,500，或約200至約1,000，或約200至約500的分子量。此類“小有機(jī)分子”包括但不限于例如生物素、熒光分子(諸如熒光素和羅丹明)、化學(xué)發(fā)光分子和二硝基苯酚。小有機(jī)分子的結(jié)合配偶體是特異性識別并結(jié)合至所述小分子的分子。小分子的結(jié)合配偶體由所述小分子的性質(zhì)限定，并且包括但不限于，例如抗生物素蛋白、鏈菌抗生物素蛋白、小有機(jī)分子的抗體(其包括但不限于熒光分子的抗體(例如熒光素抗體和羅丹明抗體)、化學(xué)發(fā)光分子的抗體和二硝基苯酚的抗體)。

如本文所使用，術(shù)語“非標(biāo)記聚(氨基酸)部分”和“非免疫原性載體聚(氨基酸)部分”是指通常不被認(rèn)為是標(biāo)記或免疫原性載體的聚(氨基酸)，盡管在某些情況下此類部分可以是標(biāo)記或免疫原性載體。例如，抗體可以不被認(rèn)為是標(biāo)記，但如果抗體被修飾以包括信號產(chǎn)生部分或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的一部分，則可以是標(biāo)記。此外，抗體可以不被認(rèn)為是免疫原性載體，但盡管如此在某些情況下能夠是免疫原性載體，因?yàn)槠浞肿恿扛摺?/p>

在一些實(shí)例中，非聚(氨基酸)標(biāo)記可以選自支持物、磁性顆粒、吖啶酯、磁性顆粒和吖啶酯(諸如例如，吖啶酯標(biāo)記的順磁性顆粒)的組合、化學(xué)發(fā)光顆粒和敏化劑顆粒。

術(shù)語“共價”是指分子的連接，諸如通過直接連接，例如分子之間的化學(xué)鍵。術(shù)語“非共價”是指分子的連接，其涉及連接至分子的互補(bǔ)特異性結(jié)合對(sbp)成員之間的特異性結(jié)合。

在一些實(shí)例中，根據(jù)本文所述的原理的化合物可以與支持物結(jié)合，例如通過共價或非共價結(jié)合。如上所提及，在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，R²可以是支持物，其可以由有機(jī)或無機(jī)的、固體或液體的水不溶性材料構(gòu)成，并且其可以是透明的或部分透明的。所述支持物可具有例如許多形狀的任一種，諸如但不限于顆粒(顆粒狀支持物)，包括珠粒、薄膜、膜、管、孔、條、棒、纖維或平坦表面，諸如例如板或紙。所述支持物可以或可以不在其中采用它的介質(zhì)中可懸浮。可懸浮支持物的實(shí)例是例如聚合物材料，諸如膠乳、脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)體、油滴、細(xì)胞和水凝膠以及磁性顆粒。其它支持物組合物包括聚合物，通過說明而非限制的方式，諸如硝化纖維素、醋酸纖維素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)，例如其可以本身使用或與其它材料結(jié)合使用。所述支持物可以用或可以不用例如染料、催化劑或其它可檢測基團(tuán)進(jìn)一步標(biāo)記。

在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，所述支持物可以是顆粒。所述顆粒具有至少約0.02微米且不大于約100微米的平均直徑。在一些實(shí)例中，所述顆粒具有約0.05微米至約20微米，或約0.3微米至約10微米的平均直徑。所述顆?？梢允怯袡C(jī)的或無機(jī)的、可溶脹的或不可溶脹的、多孔的或非多孔的，優(yōu)選具有通常為約0.7 g/mL至約1.5 g/mL的接近于水的密度，并且由可以是透明的、部分透明的或不透明的材料構(gòu)成。所述顆?？梢允抢缟锊牧?，諸如細(xì)胞和微生物，例如紅細(xì)胞，白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，雜交瘤，鏈球菌，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，病毒。所述顆粒也可以是由有機(jī)和無機(jī)聚合物、脂質(zhì)體、膠乳顆粒、磁性或非磁性顆粒、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等構(gòu)成的顆粒。在一些實(shí)例中，所述顆粒是二氧化鉻(chrome)顆?；蚰z乳顆粒。

磁性顆粒包括順磁性顆粒、鐵磁性顆粒和抗磁性顆粒。此類顆粒包括但不限于例如周期表的周期4-7的過渡金屬，包括鉻、銅、鈷、鋁、錳、鐵和鎳。

化學(xué)發(fā)光顆粒是具有與之締合的化學(xué)發(fā)光化合物的顆粒。如本文所使用，短語“與之締合”意味著化合物諸如例如化學(xué)發(fā)光化合物和顆粒可以通過例如直接或間接鍵合、吸附、吸收、并入或溶解來締合?？梢岳玫幕瘜W(xué)發(fā)光化合物的實(shí)例是美國專利號5,340,716和6,251,581中闡述的那些，其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，化學(xué)發(fā)光化合物是可光活化物質(zhì)，其直接或由光敏化激發(fā)后，或與單線態(tài)氧反應(yīng)后，經(jīng)歷化學(xué)反應(yīng)以形成亞穩(wěn)態(tài)反應(yīng)產(chǎn)物，其能夠分解，同時或隨后發(fā)射光(通常在250-1200 nm的波長范圍內(nèi))。術(shù)語“可光活化的”包括“可光化學(xué)活化的”。在一些實(shí)例中，所述化學(xué)發(fā)光化合物是與單線態(tài)氧反應(yīng)以形成二氧雜環(huán)丁烷或二氧雜環(huán)丁酮的那些。后者通常是富電子烯烴。此類富電子烯烴的示例是烯醇醚、烯胺、9-亞烷基-N-烷基-9,10-二氫化吖啶(alkylacridan)、芳基乙烯基醚、二噁烯(dioxenes)、芳基咪唑、9-亞烷基-蒼耳烷和光澤精。其它化合物包括魯米諾(luminol)和其它鄰苯二甲酰肼，以及借助于通過光化學(xué)不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)保護(hù)它們而被保護(hù)免于經(jīng)歷化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光化合物，此類化合物包括，例如，螢火蟲熒光素、水通道蛋白(aquaphorin)和魯米諾。可以利用的此類化學(xué)發(fā)光化合物的實(shí)例是美國專利號5,709,994(其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文)中闡述的那些。

敏化劑顆粒是具有與之締合的敏化劑化合物的顆粒，其包括但不限于光敏劑化合物?？梢岳玫拿艋瘎┗衔锏膶?shí)例是美國專利號5,340,716和6,251,581(其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文)中闡述的那些。

光敏劑是通常通過用光激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧的敏化劑。在一些實(shí)例中，所述光敏劑比所述化學(xué)發(fā)光化合物吸收更長的波長且具有比所述化學(xué)發(fā)光化合物更低的能量三重態(tài)。所述光敏劑可以是可光活化的(例如，染料和芳族化合物)。所述光敏劑通常是由共價鍵合的原子構(gòu)成的化合物，其通常具有多個共軛雙鍵或三鍵。所述化合物應(yīng)當(dāng)吸收在200-1100 nm，通常300-1000 nm，優(yōu)選450-950 nm的波長范圍內(nèi)的光。典型的光敏劑包括但不限于例如丙酮、二苯甲酮、9-噻噸酮、曙紅、9,10-二溴蒽、亞甲基藍(lán)、金屬卟啉(例如血卟啉)、酞菁、葉綠素、玫瑰紅、勃克明斯特富勒烯(buckminsterfullerene)，以及這些化合物的衍生物。其它光敏劑的實(shí)例列舉于N.J. Turro，"Molecular Photochemistry"，第132頁，W. A. Benjamin Inc.，N.Y. 1965中。所述光敏劑有助于其中通過單線態(tài)氧活化的光活化。通常，所述光敏劑吸收光且因此形成的經(jīng)激發(fā)的光敏劑使氧活化以產(chǎn)生單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧與化學(xué)發(fā)光化合物反應(yīng)以產(chǎn)生亞穩(wěn)定發(fā)光中間體。

在本文闡述的式中，通過鍵的波形線指示式中的部分的連接點(diǎn)。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及針對式IV化合物(其為式I化合物且包括下述化合物中的兩種或更多種的混合物)產(chǎn)生的結(jié)合配偶體諸如，例如抗體，其中：

或H，其中至少一個R¹不是H。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及針對(7aS,E)-4-((Z)-2-((R)-5-羥基-2-亞甲基-亞環(huán)己基)亞乙基)-7a-甲基八氫-1H-茚-1-酮(HMCHEMOIO衍生物)或式V化合物(其為式I化合物且包括下述化合物中的兩種或更多種的混合物)產(chǎn)生的結(jié)合配偶體諸如，例如抗體，其中：

或H，其中至少一個R¹不是H。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及針對式VI化合物(其為式I化合物且包括下述化合物中的兩種或更多種的混合物)產(chǎn)生的結(jié)合配偶體諸如，例如抗體，其中：

(R¹)_p-(L)_q-是NHR¹-(CH₂)_r-NR¹-((CH₂)_r-NR¹)_s-(CH₂)_r-NR⁷-，其中R¹獨(dú)立地是

或

或

或H，

其中至少一個R¹不是H，

r獨(dú)立地是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

s是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，且

R⁷是H或烷基。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及針對下式II化合物且包括下述化合物中的兩種或更多種的混合物產(chǎn)生的結(jié)合配偶體諸如，例如抗體：

NHR^1’-(CH₂)_r’-NR^1’’-((CH₂)_r’-NR^1’’’)_s’-(CH₂)_r’-NR^7’-Z’，其中

R^1’、R^1’’或R^1’’’各自獨(dú)立地選自

，

，

和H，

其中R^1’、R^1’’或R^1’’’中的至少一個不是H，

r’ 獨(dú)立地是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

s’是例如1至10，或1至9，或1至8，或1至7，或1至6，或1至5，或1至4，或1至3，或1至2，或2至10，或2至9，或2至8，或2至7，或2至6，或2至5，或2至4，或2至3，或3至10，或3至9，或3至8，或3至7，或3至6，或3至5，或3至4，或4至10，或4至9，或4至8，或4至7，或4至6，或4至5，或5至10，或5至9，或5至8，或5至7，或5至6，或6至10，或6至9，或6至8，或6至7，或7至10，或7至9，或7至8，或8至10，或8至9，或9至10的整數(shù)，

R^7’是H或烷基，

R^11’是H、烷基或?；?，且

Z’是聚(氨基酸)免疫原性載體或非聚(氨基酸)免疫原性載體。

在一些實(shí)例中，s’是1。在一些實(shí)例中，R^7’是H。在一些實(shí)例中，r’是2。在一些實(shí)例中，R^1’’和R^1’’’是H；在一些實(shí)例中，R1’和R^1’’’是H；且在一些實(shí)例中，R^1’和R^1’’是H。在一些實(shí)例中，R^1’、R^1’’和R^1’’’無一是H，即R^1’、R^1’’和R^1’’’都是

或

或

。

根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例涉及藥物組合物，其包含有效量的例如針對式I化合物產(chǎn)生或針對式II化合物產(chǎn)生或針對式V化合物產(chǎn)生或針對式VI化合物產(chǎn)生的抗體。

化合物的制備

通過說明而非限制的方式，下文討論制備作為根據(jù)本文所述的原理的HMCHEMOIO衍生物的化合物的方法的實(shí)例?？梢圆捎闷渌椒ㄒ孕纬缮鲜龌衔锖团c本文所述的原理一致的其它化合物。

制備式VII化合物((7aS,E)-4-((Z)-2-((R)-5-羥基-2-亞甲基亞環(huán)己基)亞乙基)-7a-甲基八氫-1H-茚-1-酮)的實(shí)例闡述于圖2中。參考圖2，將式VIII化合物(其中R¹¹O是乙酰基)處理以形成式IX的縮酮。在一個實(shí)例中，在芳族溶劑諸如苯中，在強(qiáng)有機(jī)酸諸如例如對甲苯磺酸存在下，在形成縮酮的條件(溫度和時間)下，用乙二醇處理式VIII化合物。在一些實(shí)例中，反應(yīng)在回流下進(jìn)行約10小時至約24小時或約12至約20小時的時段。

處理式IX化合物以引入鹵化物基團(tuán)諸如，例如氯化物基團(tuán)或溴化物基團(tuán)。在一個實(shí)例中，在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷)中，例如在將溴化物基團(tuán)引入式IX化合物的條件下，用N-溴代琥珀酰亞胺和自由基引發(fā)劑諸如例如偶氮二異丁腈處理式IX化合物，以得到式X化合物。在一些實(shí)例中，反應(yīng)在回流下進(jìn)行約30分鐘。

去除式X化合物的鹵化物，以得到具有兩個共軛雙鍵的式XI化合物。在一個實(shí)例中，在極性有機(jī)溶劑諸如例如醚(例如四氫呋喃)中，例如在用于去除鹵化氫的條件下，用弱堿諸如例如四正丁基氟化銨處理式X化合物，以形成雙鍵(式XI化合物)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約2小時。

通過在極性有機(jī)溶劑諸如例如烷醇(例如，甲醇或乙醇)中用無機(jī)堿諸如例如氫氧化鈉或氫氧化鉀處理而去除式XI化合物的乙?；?R¹¹)。反應(yīng)組分經(jīng)受用于去除乙?；臈l件，以得到式XII的化合物。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃，或在室溫下。反應(yīng)時間段為約4小時至約8小時。

在水和極性有機(jī)溶劑諸如例如丙酮的混合物中，在用于去除縮酮的條件下，例如使用強(qiáng)有機(jī)酸諸如例如對甲苯磺酸，去除式XII化合物的縮酮基團(tuán)，以得到式XIII化合物。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約12小時至約48小時。

通過在極性有機(jī)溶劑諸如例如烷醇(例如甲醇或乙醇)、醚(例如乙醚)、酮(例如丙酮)或上述中的兩種或更多種的組合中，在用于打開式XIII的環(huán)的條件下，用用于打開環(huán)的試劑處理式XIII化合物，諸如例如用UV光處理(光反應(yīng))，來形成式VII化合物。在一些實(shí)例中，光反應(yīng)期間的溫度為約-20℃至約0℃。光反應(yīng)時間段為約1至約10分鐘或約3至約5分鐘。光反應(yīng)之后，使中間體在乙醇中回流約3小時。

通過說明而非限制的方式，圖3描述了制備式IIa化合物(通過實(shí)例而非限制的方式，其中Z為BSA)的方法的實(shí)例。參考圖3，使式VII化合物與氨基氧基乙酸(XIX)反應(yīng)，以形成式XX的肟(2-((7aS,E)-4-((Z)-2-((R)-5-羥基-2-亞甲基亞環(huán)己基)亞乙基)-7a-甲基八氫-1H-茚-1-亞基氨基氧基)乙酸)。在有機(jī)溶劑諸如例如醇(例如甲醇或乙醇)中，在用于形成肟的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約10℃至約30℃或約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約30小時或約2小時至約24小時。

在單獨(dú)反應(yīng)中，將聚(氨基酸)免疫原性載體(在該實(shí)例中，通過說明而非限制的方式，BSA(式II的Z’為BSA))與式XXI化合物組合，以形成式XXIa化合物。反應(yīng)在約5.0至約7.0或約5.5至約6.5或約6的pH的水性緩沖介質(zhì)中進(jìn)行。反應(yīng)介質(zhì)中包括用于促進(jìn)BSA的羧酸官能團(tuán)與XXI的一個或多個胺基團(tuán)反應(yīng)的活化劑。此類偶聯(lián)劑包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)或N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亞胺基)脲鎓四氟硼酸鹽或上述中的兩種或更多種的組合。反應(yīng)在用于形成酰胺的條件下進(jìn)行。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為例如約3小時至約24小時，或約4小時至約20小時，或約4小時至約10小時。

用活化劑諸如但不限于例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)或N,N,N′,N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亞胺基)脲鎓四氟硼酸鹽或上述中的兩種或更多種的組合處理式XX化合物，以形成活化的XX。在極性有機(jī)溶劑諸如例如烷醇(例如甲醇或乙醇)、醚(例如乙醚或四氫呋喃)、酮(例如丙酮)、二甲基亞砜、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)或上述中的兩種或更多種的組合(其也可以含有水)中進(jìn)行反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約30℃，或約20℃至約25℃，或約室溫。反應(yīng)時間段為約12小時至約36小時，或約20至約30小時。使活化的XX與式XXIa化合物反應(yīng)，以得到式IIa化合物。如所示，R^1’是式IIa化合物的部分，且R^1’’和R^1’’’各自是H。然而，與本文所述的原理一致，R¹’’和R^1’’’中的一者或兩者可以是式IIa化合物的部分。在有機(jī)溶劑諸如例如DMF或DMSO中，例如在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約30℃，或約20℃至約25℃，或約室溫。反應(yīng)時間段為約12小時至約36小時，或約20至約30小時。

通過說明而非限制的方式，圖4描述了制備式VIa化合物和將式VIa化合物轉(zhuǎn)化成式IIa化合物(通過實(shí)例而非限制的方式，其中Z為BSA)的方法的替代實(shí)例。參考圖4，使式VII化合物與氨基氧基乙酸(XIX)反應(yīng)，以形成式XX的肟。在有機(jī)溶劑諸如例如醇(例如甲醇或乙醇)中，在用于形成肟的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約10℃至約30℃或約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約30小時或約2小時至約24小時。

將式XX的肟與式XXI化合物組合以形成式VIa化合物。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約10小時至約48小時。

使式VIa化合物與聚(氨基酸)免疫原性載體(通過說明而非限制的方式，式II的Z’為BSA)反應(yīng)，以得到式IIa化合物。如所示，R^1’是式IIa化合物的部分，且R^1’’和R^1’’’各自是H。然而，與本文所述的原理一致，所得產(chǎn)物可以是化合物的混合物，其中在混合物的一種化合物中，R^1’是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’以及R^1’’’所有三者都是式IIa化合物的部分。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約10小時至約48小時。

通過說明而非限制的方式，描述了制備根據(jù)本文所述的原理的化合物實(shí)例的方法的另一個實(shí)例，參考圖5?？梢圆捎闷渌椒ㄒ孕纬膳c本文所述的原理一致的化合物。式XVIII化合物(Y是式I中的C)的制備闡述于圖5中。參考圖5，處理式VII化合物(例如，如圖3中所討論制備)以保護(hù)游離羥基(R¹³是保護(hù)基團(tuán))，以形成式XIV化合物。反應(yīng)條件取決于例如保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)。

在一個實(shí)例中，在用于形成甲硅烷基醚的條件下用叔丁基二甲基甲硅烷基氯處理式VII化合物。在極性有機(jī)溶劑諸如例如吡啶、二甲基亞砜、醚(例如四氫呋喃、乙醚或1,4-二氧雜環(huán)己烷)、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)中，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約10℃至約30℃或約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約30小時或約2小時至約24小時。

通過實(shí)例而非限制的方式，保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例是甲硅烷基(諸如但不限于，例如三甲基甲硅烷基、三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基)、叔丁氧基羰基(t-Boc)、芴基甲基氧基羰基(Fmoc)、乙酰氨基甲基(Acm)、三苯基甲基(Trt)、芐基氧基羰基、聯(lián)苯基異丙基氧基羰基、1-戊基氧基羰基、異冰片基氧基羰基、α-二甲基-3,5-二甲氧基苯基氧基羰基、鄰硝基苯基亞磺酰、2-氰基-1,1-二甲基-乙氧基羰基、溴芐基氧基、氨基甲酰基和甲?；?。

通過例如在鋅存在下與α-鹵代酯反應(yīng)(Reformatsky反應(yīng))，從式XIV化合物形成式XV化合物。在該實(shí)例中，用Reformatsky試劑諸如例如BrZnCH₂COOR¹⁴(在所示實(shí)例中的Zn和α-溴乙酸乙酯，w = 1)處理式XIV化合物，以得到式XV化合物。在有機(jī)溶劑諸如例如醚(例如四氫呋喃或乙醚)或芳族溶劑(例如苯或甲苯)中，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約4℃至約100℃或約10℃至約90℃。反應(yīng)時間段為約4小時至約24小時。

將式XV化合物的游離羥基還原以形成式XVI化合物?？梢酝ㄟ^方法處理式XV化合物以還原羥基，所述方法包括但不限于例如，甲苯磺酸酯形成，隨后用金屬氫化物諸如例如LiAlH₄或NaBH₄處理；去除羥基以形成烯烴(諸如例如，通過用濃有機(jī)酸例如濃硫酸或濃鹽酸處理)，隨后在催化劑諸如例如鉑或鈀存在下氫化。反應(yīng)條件取決于例如，采用的試劑的性質(zhì)和溶劑的性質(zhì)中的一者或兩者。

處理所得式XVI化合物以將酯基水解成羧酸基團(tuán)(脫酯化反應(yīng))，以得到式XVII化合物。許多方法可用于脫酯化，且包括但不限于例如，皂化或用堿水溶液諸如例如用NaOH或KOH在加熱下處理；或酸水解或用酸水溶液諸如例如無機(jī)酸水溶液(諸如例如鹽酸或硫酸)處理。反應(yīng)條件取決于例如，試劑的性質(zhì)和酯的性質(zhì)中的一者或多者。

通過從式XVII化合物去除保護(hù)基團(tuán)R¹³而形成式XVIII化合物。各種方法可以用于去除保護(hù)基團(tuán)，并且包括但不限于用稀無機(jī)酸(諸如例如鹽酸或硫酸)處理；在極性有機(jī)溶劑(諸如例如烷醇(例如甲醇或乙醇)、醚(例如乙醚或四氫呋喃)、酮(例如丙酮)、二甲基亞砜、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)或上述中的兩種或更多種的組合(其也可以含有水))中，在用于去除保護(hù)基的條件下，用有機(jī)酸(諸如例如乙酸)處理，以得到式XVIII化合物。反應(yīng)條件取決于例如，試劑的性質(zhì)和保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)中的一者或多者。

通過說明而非限制的方式，圖6描述了制備式VIb化合物和將式VIb化合物轉(zhuǎn)化成式IIb化合物(通過實(shí)例而非限制的方式，其中Z’為KLH)的方法的實(shí)例。參考圖6，處理式XVIII化合物以活化羧酸基團(tuán)諸如但不限于，形成N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯(式XXII化合物)的反應(yīng)。在極性有機(jī)溶劑諸如例如二甲基亞砜、醚(例如四氫呋喃或乙醚)、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)中，例如在用于形成NHS酯的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約4小時至約48小時。

將式XXII的NHS酯與式XXI化合物組合以形成式VIb化合物。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，例如，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約4小時至約48小時。

使式VIb化合物與聚(氨基酸)免疫原性載體(例如，式II的Z’為KLH)反應(yīng)，以得到式IIb化合物。如所示，R^1’是式IIb化合物的部分，且R^1’’和R^1’’’各自是H。然而，與本文所述的原理一致，所得產(chǎn)物可以是化合物的混合物，其中在混合物的一種化合物中，R^1’是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’以及R^1’’’所有三者都是式IIb化合物的部分。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約4小時至約48小時。

在替代途徑中，可以以與上面對于圖3用于制備式IIa化合物所述的方式類似的方式從式XVIII化合物制備式IIb化合物。

通過說明而非限制的方式，描述了制備根據(jù)本文所述的原理的化合物實(shí)例的方法的另一個實(shí)例，參考圖7?？梢圆捎闷渌椒ㄒ孕纬膳c本文所述的原理一致的化合物。式XXVII化合物(Y在式I中為O，且w為0至10或1至10)的制備闡述于圖7中。參考圖7，處理式VII化合物(例如，如圖2中所討論制備)以保護(hù)游離羥基(R¹⁵是保護(hù)基團(tuán))，以形成式XXIII化合物。反應(yīng)條件取決于例如保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)。

在一個實(shí)例中，在用于形成甲硅烷基醚的條件下用叔丁基二甲基甲硅烷基氯(通過實(shí)例而非限制的方式)處理式VII化合物。在極性有機(jī)溶劑諸如例如吡啶、二甲基亞砜、醚(例如四氫呋喃、乙醚或1,4-二氧雜環(huán)己烷)、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)中，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約4小時至約48小時。

通過例如將酮基還原成羥基而從式XXIII化合物形成式XXIV化合物?？梢酝ㄟ^方法處理式XXIII化合物以還原羥基，所述方法包括但不限于用金屬氫化物諸如例如LiAlH₄或NaBH₄處理以得到式XXIV化合物。在有機(jī)溶劑諸如例如烷醇(例如乙醇)中，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約0℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約0.5小時至約4小時。

通過例如在堿存在下與鹵代酯(諸如，通過實(shí)例而非限制的方式)α-鹵代酯反應(yīng)，從式XXIV化合物形成式XXV化合物。在該實(shí)例中，用例如BrCH₂COOR¹⁶(在所示實(shí)例中的α-溴乙酸乙酯，w是1且R¹⁶是乙基)處理式XXV化合物，以得到式XXV化合物。通過在堿諸如例如KOH、NaOH、Na₂CO₃或K₂CO₃存在下從式XXIV化合物的羥基形成醇鹽離子，并使醇鹽與鹵代酯反應(yīng)，進(jìn)行該反應(yīng)。用于反應(yīng)的溶劑是水性溶劑，其可以含有1％至40％的極性有機(jī)溶劑，諸如如上所述的極性有機(jī)溶劑。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為例如約50℃至約100℃或約50℃至約90℃。反應(yīng)時間段為例如約0.5小時至約24小時，或約1至約8小時。

處理所得式XXV化合物以將酯基水解成羧酸基團(tuán)(脫酯化反應(yīng))，以得到式XXVI化合物。許多方法可用于脫酯化，且包括但不限于例如，皂化或用堿水溶液諸如例如用NaOH或KOH在加熱下處理；酸水解或用酸水溶液諸如例如無機(jī)酸水溶液(諸如例如鹽酸或硫酸)處理。反應(yīng)條件取決于例如，試劑的性質(zhì)和酯的性質(zhì)中的一者或多者。

通過從式XXVI化合物去除保護(hù)基團(tuán)R¹⁵而形成式XXVII化合物。各種方法可以用于去除保護(hù)基團(tuán)，并且包括但不限于用稀無機(jī)酸(諸如例如鹽酸或硫酸)處理；在極性有機(jī)溶劑(諸如例如烷醇(例如甲醇或乙醇)、醚(例如乙醚、四氫呋喃或1,4-二氧雜環(huán)己烷)、酮(例如丙酮)、二甲基亞砜、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺(DMF)或上述中的兩種或更多種的組合(其也可以含有水))中，在用于去除保護(hù)基的條件下，用有機(jī)酸(諸如例如乙酸)處理，以得到式XXVII化合物。反應(yīng)條件取決于例如，試劑的性質(zhì)和保護(hù)基團(tuán)的性質(zhì)中的一者或多者。

通過說明而非限制的方式，圖8描述了制備式VIc化合物和將式VIc化合物轉(zhuǎn)化成式IIc化合物(通過實(shí)例而非限制的方式，其中Z’為酶G6PDH)的方法的實(shí)例。參考圖8，處理式XXVII化合物以活化羧酸基團(tuán)諸如但不限于，形成N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯(式XXVIII化合物)的反應(yīng)。在極性有機(jī)溶劑諸如例如二甲基亞砜、醚(例如四氫呋喃、乙醚或1,4-二氧雜環(huán)己烷)、乙腈、二氯甲烷或二甲基甲酰胺(DMF)中，例如，在用于形成NHS酯的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約24小時。

將式XXVIII的NHS酯與式XXI化合物組合以形成式VIc化合物。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，例如，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約24小時。

使式VIc化合物與酶G6PDH(例如式II的Z’為G6PDH)反應(yīng)，以得到式IIc化合物。如所示，R^1’是式IIc化合物的部分，且R^1’’和R^1’’’各自是H。然而，與本文所述的原理一致，所得產(chǎn)物可以是化合物的混合物，其中在混合物的一種化合物中，R^1’是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’’兩者都是式IIa化合物的部分，并且在混合物的另一種化合物中，R^1’和R^1’’以及R^1’’’所有三者都是式IIc化合物的部分。在有機(jī)溶劑諸如例如烷烴(例如，己烷或戊烷)中，在用于形成酰胺的條件下，進(jìn)行該反應(yīng)。在一些實(shí)例中，反應(yīng)期間的溫度為約15℃至約25℃。反應(yīng)時間段為約1小時至約24小時。

在替代途徑中，可以以與上面對于圖3用于制備式IIa化合物所述的方式類似的方式從式XXVII化合物制備式IIc化合物。

根據(jù)本文所述的原理的其它化合物可以以與上述的方式類似的方式制備。

結(jié)合配偶體的制備

可以使用根據(jù)本文所述的原理的化合物的實(shí)例(其中Z是聚(氨基酸)免疫原性載體或非聚(氨基酸)免疫原性載體)來制備維生素D的結(jié)合配偶體，諸如例如，例如維生素D的適體或維生素D的抗體，其包括但不限于對維生素D₃特異性的抗體，對維生素D₂特異性的抗體，對25-羥基維生素D₃特異性的抗體，對25-羥基維生素D₂特異性的抗體，對3-差向-25-羥基維生素D₃特異性的抗體和對3-差向-25-羥基維生素D₂特異性的抗體。特別感興趣的是對3-差向-25-羥基維生素D₃特異性的抗體，對3-差向-25-羥基維生素D₂特異性的抗體和對其它維生素D化合物的差向異構(gòu)體特異性的抗體(“差向異構(gòu)維生素D的抗體”)，其可用于3-差向-25-羥基維生素D₃和3-差向-25-羥基維生素D₂的測定中，或其可用于非差向異構(gòu)維生素D的測定中以減少或消除來自可以存在于待測試維生素D的存在的樣品中的維生素D的差向異構(gòu)形式諸如例如3-差向-25-羥基維生素D₃和3-差向-25-羥基維生素D₂的干擾。

抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，且可以包括完整免疫球蛋白或其片段，所述免疫球蛋白包括，但不限于，各種類別和同種型諸如，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其片段可以包括Fab、Fv和F(ab')₂、Fab'等。另外，適當(dāng)時，可以使用免疫球蛋白或其片段的聚集物、聚合物和綴合物，只要維持對于特定分子的結(jié)合親和力。

根據(jù)本文所述的原理的抗體可以通過以下技術(shù)制備，包括但不限于例如免疫宿主并收集血清(多克隆)，制備連續(xù)雜交細(xì)胞系并收集分泌的蛋白(單克隆)，或克隆和表達(dá)至少編碼特異性結(jié)合天然抗體所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其誘變版本。

可以通過技術(shù)諸如制備連續(xù)雜交細(xì)胞系并收集分泌的蛋白(體細(xì)胞雜交技術(shù))來制備單克隆抗體?？梢愿鶕?jù)K?hler和Milstein, Nature265:495-497, 1975的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來產(chǎn)生單克隆抗體。單克隆抗體技術(shù)的綜述見于Lymphocyte Hybridomas，編輯Melchers 等人，Springer-Verlag (New York 1978)，Nature 266: 495 (1977)，Science 208: 692 (1980)和Methods of Enzymology 73 (Part B): 3-46 (1981)。

在用于制備抗體的另一種方法中，可以從染色體DNA切出編碼抗體結(jié)合位點(diǎn)的序列，并插入克隆載體，其可以在細(xì)菌中表達(dá)，以產(chǎn)生具有相應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的重組蛋白。該方法涉及克隆和表達(dá)至少編碼特異性結(jié)合天然抗體所需的氨基酸序列的核苷酸序列或其誘變版本。

在用于生產(chǎn)單克隆抗體的一種方法中，第一步驟包括用例如免疫原免疫產(chǎn)生抗體的動物，諸如小鼠、大鼠、山羊、綿羊或牛，所述免疫原包含式I化合物，其中Z為免疫原性載體。免疫可在使用或不使用佐劑下進(jìn)行，所述佐劑諸如完全弗氏佐劑或其它佐劑，諸如單磷酰脂質(zhì)A和合成的海藻糖二棒桿菌分枝菌酸酯(trehalose dicorynomycolate)佐劑。下一步驟包括將脾細(xì)胞與產(chǎn)生抗體的動物分離，并諸如通過使用聚乙二醇或其它技術(shù)使所述產(chǎn)生抗體的脾細(xì)胞與適當(dāng)?shù)娜诤吓渑俭w，通常是骨髓瘤細(xì)胞融合。通常，所使用的骨髓瘤細(xì)胞是通常在次黃嘌呤-胸苷(HT)培養(yǎng)基中生長、但不能在次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基中生長、用于選擇融合細(xì)胞的那些。下一步驟包括選擇融合細(xì)胞，通常通過在HAT培養(yǎng)基中選擇。下一步驟包括使用免疫測定諸如例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)或其它適于篩選的免疫測定法來篩選用于產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目贵w的克隆雜合體。

可以通過篩選方法來選擇具有必需特異性的抗體(根據(jù)本文所述的原理由免疫原制備)，所述篩選方法，通過說明而非限制的方式，包括ELISA、斑點(diǎn)印跡、Western分析和表面等離子體共振。以該方式，獲得抗體，其在特定測定中結(jié)合目標(biāo)維生素D分析物并且不在任何可檢測程度上結(jié)合非目標(biāo)維生素D分子。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，結(jié)合目標(biāo)維生素D分析物的抗體對于目標(biāo)維生素D分析物具有以下結(jié)合親和力：例如，約10⁷至約10¹⁴升/摩爾，或約10⁷至約10¹¹升/摩爾，或約10⁷至約10¹²升/摩爾，或約10⁸至約10¹⁴升/摩爾，或約10⁸至約10¹¹升/摩爾，或約10⁸至約10¹²升/摩爾。在一些實(shí)例中，特異性結(jié)合目標(biāo)維生素D分析物的抗體應(yīng)當(dāng)對于非目標(biāo)維生素D分子具有以下結(jié)合親和力：例如，小于約10⁴升/摩爾，或小于約10³升/摩爾，或小于約10²升/摩爾，或小于約10升/摩爾。

在根據(jù)本文所述的原理的一個實(shí)例中，從上述式I化合物(其中Z是免疫原性載體)制備的免疫原用于制備對3-差向-25-羥基維生素D₃特異性的抗體，其中所述抗體不在任何可檢測的程度上與25-羥基維生素D₃或維生素D的其它變體(包括例如非-差向-維生素D化合物諸如例如25-羥基維生素D；鈣二醇；1,25-二羥基維生素D₃；1,25-二羥基維生素D₄；1,25-二羥基維生素D₅；和1,25-二羥基維生素D₆)結(jié)合。

在根據(jù)本文所述的原理的一個實(shí)例中，從上述式I化合物(其中Z是免疫原性載體)制備的免疫原用于制備對3-差向-25-羥基維生素D₃特異性的抗體，其中所述抗體不在任何可檢測的程度上與25-羥基維生素D₃或維生素D的其它變體(包括例如非-差向-維生素D化合物諸如例如25-羥基維生素D；鈣二醇；1,25-二羥基維生素D₃；1,25-二羥基維生素D₄；1,25-二羥基維生素D₅；和1,25-二羥基維生素D₆)結(jié)合。

在根據(jù)本文所述的原理的另一個實(shí)例中，從上述式I化合物(其中Z是免疫原性載體)制備的免疫原用于制備對3-差向-25-羥基維生素D₂特異性的抗體，其中所述抗體不在任何可檢測的程度上與25-羥基維生素D₂或維生素D的其它變體(包括例如非-差向-維生素D化合物諸如例如25-羥基維生素D；鈣二醇；1,25-二羥基維生素D₃；1,25-二羥基維生素D₄；1,25-二羥基維生素D₅；和1,25-二羥基維生素D₆)結(jié)合。

短語“任何可檢測的程度”意指特異性結(jié)合目標(biāo)維生素D分析物(例如，3-差向-25-羥基維生素D)的抗體對于非目標(biāo)維生素D分子(例如，非-差向-維生素D化合物)具有以下結(jié)合親和力：例如，小于約10⁴升/摩爾，或小于約10³升/摩爾，或小于約10²升/摩爾，或小于約10升/摩爾。

通過說明而非限制的方式，在一個實(shí)例中，采用免疫原，其中式I化合物中的Z是BSA。該免疫原用于腹膜內(nèi)免疫小鼠(例如，BALB/c小鼠，Swiss Webster小鼠或AJ小鼠品系)。使用3-差向-25-羥基維生素D₃和卵白蛋白的綴合物(卵白蛋白綴合物)測試來自這些小鼠的血清樣品的抗-3-差向-25-羥基維生素D₃抗體。采用微量滴定板ELISA，并檢測所述抗體與卵白蛋白綴合物、隨后與3-差向-25-羥基維生素D₃的結(jié)合。在融合前三天加強(qiáng)具有最高滴度的小鼠。在融合當(dāng)天，從這些小鼠收獲脾細(xì)胞，并使用PEG輔助融合方案與骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8.653融合。約十天之后，使用板ELISA篩選雜交瘤上清液的抗-3-差向-25-羥基維生素D₃抗體。將陽性克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，亞克隆，并使用蛋白A瓊脂糖柱純化上清液。使用ELISA測試純化的抗體樣品與卵白蛋白綴合物的結(jié)合以及與游離3-差向-25-羥基維生素D₃的結(jié)合。

通過說明而非限制的方式，對如上所述制備的對3-差向-25-羥基維生素D₃特異性或?qū)?-差向-25-羥基維生素D₂特異性的抗體的具體實(shí)例包括例如抗體4G8和抗體8F10。

在一些實(shí)例中，根據(jù)本文所述的原理的抗體可用于純化維生素D化合物。例如，抗體諸如上述那些可以結(jié)合支持物，且所述支持物可用于純化維生素D化合物。在一個實(shí)例中，3-差向-25-羥基維生素D₃的抗體可以結(jié)合親和純化色譜基質(zhì)諸如，例如柱，并且維生素D制備物可以與色譜基質(zhì)接觸，其中基質(zhì)上的抗體結(jié)合來自維生素D制備物的3-差向-25-羥基維生素D₃，而從基質(zhì)洗脫其它維生素D化合物。

采用根據(jù)本文所述的原理的抗體作為阻斷抗體的維生素D分析物的測定法的具體實(shí)例

根據(jù)本文所述的原理的抗體可用于盡可能減少或消除維生素D分析物的非差向異構(gòu)形式的測定中的3-差向異構(gòu)體交叉反應(yīng)性。采用針對作為式I化合物(其中Z是免疫原性載體)的免疫原制備的抗體作為阻斷劑，可以實(shí)質(zhì)上避免由3-差向異構(gòu)體維生素D與維生素D分析物的抗體的交叉反應(yīng)性引起的總非差向異構(gòu)維生素D分析物的過度估計(jì)。

在非差向異構(gòu)維生素D分析物的測定法的一個實(shí)例中，該測定法采用包含烯屬染料的化學(xué)發(fā)光珠粒（chemibead）試劑作為化學(xué)發(fā)光試劑和25-羥基維生素D₃作為維生素D類似物。將懷疑含有非差向異構(gòu)維生素D分析物的樣品在測定介質(zhì)中與生物素化的非差向異構(gòu)維生素D分析物的抗體和作為抗體8F10的第二抗體組合，然后與化學(xué)發(fā)光珠粒試劑組合?；瘜W(xué)發(fā)光珠粒結(jié)合未被來自樣品的非差向異構(gòu)維生素D分析物占據(jù)的單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)的級分?？贵w8F10結(jié)合樣品中存在且通過與生物素化抗體的交叉反應(yīng)干擾測定的3-差向-25-羥基維生素D₃。隨后，將包含光敏劑(敏化珠粒)的鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)的敏化劑珠粒添加至反應(yīng)混合物。這導(dǎo)致形成化學(xué)發(fā)光珠粒/敏化珠粒對，其濃度與樣品中的非差向異構(gòu)維生素D分析物的濃度成反比。在680 nm下照射后，敏化劑珠粒產(chǎn)生單線態(tài)氧，其擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光珠粒中，所述化學(xué)發(fā)光珠粒與敏化珠粒配對，與化學(xué)發(fā)光中的烯屬染料反應(yīng)，并在大約612 nm處觸發(fā)化學(xué)發(fā)光信號，其與非差向異構(gòu)維生素D分析物濃度成反比。

采用標(biāo)記的根據(jù)本文所述的原理的化合物的維生素D分析物的測定法的實(shí)例

可以使用式I化合物(其中Z是聚(氨基酸)標(biāo)記或非聚(氨基酸)標(biāo)記或支持物)進(jìn)行維生素D分析物的測定。

通過說明而非限制的方式，在用于檢測維生素D分析物的測定法的一個實(shí)例中，采用ACMIA測定形式。采用涂覆有維生素D類似物(其為式I化合物，其中Z是非聚(氨基酸)標(biāo)記)的作為二氧化鉻顆粒(二氧化鉻顆粒試劑)的二氧化鉻顆粒作為第一組分。第二組分是維生素D分析物的抗體。 將交聯(lián)至報(bào)告酶(例如，β-半乳糖苷酶)以形成抗體-酶綴合物的該抗體以過量(即大于結(jié)合樣品中可能存在的全部維生素D分析物所需的量的量)添加至反應(yīng)容器。預(yù)先經(jīng)受用釋放劑處理的樣品用維生素D的抗體處理，所述維生素D的抗體結(jié)合樣品中的維生素D分析物。在介質(zhì)中將所述抗體-酶綴合物與樣品混合，以允許維生素D分析物結(jié)合至所述抗體。接下來，添加二氧化鉻顆粒試劑以結(jié)合盡任何過量抗體-酶綴合物。然后，施加磁體，所述磁體從懸浮液中拉出所有二氧化鉻顆粒和過量的抗體-酶，并且將上清液轉(zhuǎn)移至最終反應(yīng)容器。將所述報(bào)告酶的底物添加至所述最終反應(yīng)容器，并且將酶活性分光光度測量為吸光度隨時間的變化。該信號的量與樣品中的維生素D分析物的量相關(guān)。

在上述實(shí)例中，根據(jù)本文所述的原理的抗體可用于阻斷樣品中可存在的3-差向-25-羥基維生素D₃與維生素D分析物的抗體的結(jié)合?？?-差向-25-羥基維生素D₃抗體可以是針對免疫原產(chǎn)生的抗體，所述免疫原是式I化合物，其中Z是免疫原性載體。

檢查步驟

在測定方法的下一步驟中，檢查介質(zhì)的包含維生素D分析物和維生素D分析物的抗體的復(fù)合物和/或包含維生素D類似物和維生素D的抗體的復(fù)合物的存在。復(fù)合物中的一者或兩者的存在和/或量指示樣品中維生素D分析物的存在和/或量。

短語“測量維生素D分析物的量”是指維生素D的定量、半定量和定性測定。定量、半定量和定性的方法，以及用于測定維生素D分析物的所有其它方法，都被認(rèn)為是測量維生素D分析物的量的方法。例如，僅檢測懷疑含有維生素D分析物的樣品中維生素D分析物的存在或不存在的方法被認(rèn)為包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。術(shù)語“檢測”和“測定”以及測量的其它常見同義詞被考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。

在許多實(shí)施方案中，介質(zhì)的檢查涉及從介質(zhì)檢測信號。信號的存在和/或量與樣品中維生素D分析物的存在和/或量相關(guān)。檢測的特定模式取決于信號產(chǎn)生系統(tǒng)的性質(zhì)。如上所討論，存在許多方法，通過該方法，產(chǎn)生信號的信號的標(biāo)記可以產(chǎn)生可通過外部裝置檢測的信號。信號產(chǎn)生系統(tǒng)的活化取決于信號產(chǎn)生系統(tǒng)成員的性質(zhì)。

測量期間的溫度通常范圍為例如約10℃至約70℃，或約20℃至約45℃，或約20℃至約25℃。在一種方法中，使用已知濃度的維生素D分析物形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。也可以使用校準(zhǔn)物和其它對照。

由任何標(biāo)記產(chǎn)生的發(fā)光或光可以目測、攝影、光量測定、分光光度測量，諸如通過使用光電倍增器或光電二極管，或通過測定其與介質(zhì)中維生素D分析物的量相關(guān)的量的任何其它適宜裝置。信號的存在和/或量的檢查還包括信號的檢測，這通常僅是其中閱讀信號的一個步驟。通常使用儀器閱讀信號，所述儀器的性質(zhì)取決于信號的性質(zhì)。所述儀器可以是但不限于例如分光光度計(jì)，熒光計(jì)，吸收分光計(jì)，光度計(jì)和化學(xué)光度計(jì)(chemiluminometer)。

用于進(jìn)行測定法的包含試劑的試劑盒

可以基于特定測定法的性質(zhì)配制包含用于進(jìn)行測定法的試劑的試劑盒。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，試劑盒可以包含結(jié)合配偶體諸如，例如，針對免疫原產(chǎn)生的抗體，所述免疫原是式I化合物，其中Z是免疫原性載體。在根據(jù)本文所述的原理的一些實(shí)例中，試劑盒可以包含試劑，所述試劑是式I化合物，其中Z是聚(氨基酸)標(biāo)記部分或非聚(氨基酸)標(biāo)記部分，其包括支持物。試劑盒還可以包括用于進(jìn)行維生素D分析物的特定測定法的其它試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含包裝組合的生物素-結(jié)合配偶體，諸如例如抗生物素蛋白或鏈菌抗生物素蛋白，其與顆粒，生物素化的式I化合物以及標(biāo)記的維生素D分析物抗體締合。該試劑盒可以進(jìn)一步包括用于進(jìn)行測定的其它試劑，其性質(zhì)取決于具體測定形式。

所述試劑可以各自在分開容器中，或者各種試劑可以組合于一個或多個容器中，這取決于試劑的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性。該試劑盒可以進(jìn)一步包括用于進(jìn)行測定的其它分別包裝的試劑，諸如例如額外的特異性結(jié)合對成員，信號產(chǎn)生系統(tǒng)成員，和輔助試劑。

試劑盒中各種試劑的相對量可以在很大程度上變化，以提供顯著優(yōu)化本發(fā)明方法期間需要發(fā)生的反應(yīng)和進(jìn)一步顯著優(yōu)化測定靈敏度的試劑濃度。在適當(dāng)情形下，試劑盒中的一種或多種試劑可以作為通常凍干的干燥粉末(包括賦形劑)提供，其在溶解后將提供用于使用根據(jù)本文所述的原理的化合物試劑進(jìn)行方法或測定的適當(dāng)濃度的試劑溶液。該試劑盒可以進(jìn)一步包括利用試劑(其包括根據(jù)本文所述的原理的化合物試劑)的方法的書面說明書。

如本文所使用，短語“至少”意味著指定項(xiàng)的數(shù)目可以等于或大于所述數(shù)目。如本文所使用，短語“約”意味著所述數(shù)目可以相差±10%；例如“約5”意指4.5至5.5的范圍。

通過說明而非限制的方式，以下討論涉及根據(jù)本文所述的原理的具體實(shí)施例；該具體實(shí)施例并不意圖限制本公開內(nèi)容和所附權(quán)利要求的范圍。在不背離本公開內(nèi)容的精神和范圍的情況下，可以設(shè)想許多修改和替代組合物、方法和系統(tǒng)。

實(shí)施例

除非另有說明，以下實(shí)驗(yàn)中的材料可以購自Sigma-Aldrich Chemical Corporation (St. Louis MO)或Fluka Chemical Corporation (Milwaukee WI)。本文公開的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)以重量/體積計(jì)，除非另有說明。

定義：

mg = 毫克

g = 克

ng = 納克

mL = 毫升

μL = 微升

μmol = 微摩爾

℃ = 攝氏度

min = 分鐘

sec = 秒

hr = 小時

w/v = 重量/體積

TLC = 薄層色譜法

HPLC = 高效液相色譜法

EDA = 乙二胺

EtOAc = 乙酸乙酯

DMF = 二甲基甲酰胺

DMSO = 二甲基亞砜

MeOP = 1-甲氧基-2-丙醇

MES = 2-(N-嗎啉代)乙磺酸

CMO =羧基甲氧基肟

TMB =四甲基聯(lián)苯胺

SNHS =磺基-N-羥基琥珀酰亞胺

高pH洗滌緩沖液= 5.5 mM Na₃PO₄ + 4.4 mM Na₂CO₃, pH 11

半抗原洗滌緩沖液 = 50 mM HEPES、300mM NaCl、1mM EDTA、0.1% Triton? X405、0.15% Proclin?防腐劑和1mg/ml新霉素

DI = 去離子

ELISA =酶聯(lián)免疫吸附測定法

UPA = 超微粒分析儀

LOCI = 發(fā)光氧通道免疫測定法

BSA = 牛血清白蛋白

BGG = 牛丙種球蛋白

mIgG = 小鼠免疫球蛋白

MS = 質(zhì)譜分析法。

實(shí)施例1

圖2化合物(其中R¹¹是乙?；?的制備

使5-雄甾烯-3α-醇-17-酮乙酸酯(VIII)(100 mg)與乙二醇(0.245 ml)和對甲苯磺酸一水合物(4 mg)在苯中在回流下反應(yīng)過夜，以得到5-雄甾烯-3α-醇-17-酮乙酸酯乙烯縮酮(IX)(112 mg)。在己烷(13 ml)中將乙烯縮酮IX(112 mg)用N-溴代琥珀酰亞胺(69 mg)/偶氮異丁腈(3.3 mg)在回流下溴化30分鐘，以得到化合物X，隨后用四丁基氟化銨(1M，在THF中，1.6 ml)/THF(7.3 ml)在室溫下脫去溴化氫2小時，以得到雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮乙酸酯乙烯縮酮(XI)(55 mg)。使雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮乙酸酯乙烯縮酮(XI)(55 mg)與1N氫氧化鈉(2 mL)在甲醇(10 ml)中在室溫下反應(yīng)約5小時，以得到雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮乙烯縮酮(XII)(48 mg)。使雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮乙烯縮酮(XII)(48 mg)與對甲苯磺酸一水合物(35 mg)在丙酮(5 mL)和水(0.2 mL)的混合物中在室溫下過夜反應(yīng)，以得到雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮(XIII)(43.4 mg)。在乙醚(1100 ml)中在-20至0℃下在具有VYCOR?濾光片(Ace Glass Incorporated, Vineland, NJ)的450 w汞燈下輻照雄甾-5,7-二烯-3α-醇-17-酮(XIII)(43.4 mg) 5分鐘，以得到前-HMCHEMOIO，將其在乙醇(15 ml)中回流3小時，以產(chǎn)生HMCHEMOIO (VII) (13.5 mg)。

使來自上述的HMCHEMOIO (VII) (13.5 mg)與O-(羧甲基)羥胺半鹽酸鹽(12 mg)和乙酸鈉(24 mg)在1 ml甲醇中在室溫下反應(yīng)過夜，以得到HMCHEMOIO-CMO (13.2 mg)(圖3中的式XX化合物，其中n = 1)。

如下制備陽離子化BSA：將三亞乙基四胺(0.5 mL)(圖3中的式XXI化合物，其中各自r = 1且s = 1)添加至4.5 ml 50 mM MES緩沖液(pH6)，并將pH調(diào)節(jié)至6，隨后添加20 mg BSA。將組合混合以完全溶解組分。每小時將EDAC(5 mg)添加至上述溶液，持續(xù)5小時。將溶液在10mL Amicon?室(Amicon Inc., Beverly MA)中用10 x 10 mL洗滌緩沖液(10mM磷酸鹽 + 300nM NaCl)(pH7)洗滌。然后，將100 mg Tween?20添加至50 mL圓底燒瓶。添加洗滌緩沖液(50 mL)并將混合物攪拌10分鐘以分散Tween 20。將陽離子化BSA(圖3中的式XXIa化合物，其中各自r = 1且s = 2)以約5 mg/mL儲存于含有0.2% Tween? 20的洗滌緩沖液中。

為了制備HMCHEMOIO-CMO BSA (圖3中的式IIa化合物)，將EDAC (25 mg)和10 mg NHS與如所述制備的13.2 mg HMCHEMOIO-CMO (XX)一起置于10 ml燒瓶中。將DMF (0.5 ml)添加至燒瓶。將混合物在室溫下攪拌24小時，以得到活化的HMCHEMOIO-CMO。溶液是澄清的。TLC(1:1乙酸乙酯：甲醇)指示沒有剩余的起始材料。

將來自上述的活化的HMCHEMOIO-CMO逐滴添加至來自上述的陽離子化BSA溶液，并將混合物在室溫下攪拌過夜。將混合物轉(zhuǎn)移至Amicon?室(Amicon Inc., Beverly MA)，然后用5 x 10 ml洗滌緩沖液洗滌，并濃縮(30,000截止值)至約4 mL。將混合物在SD-25柱(GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburg PA)上使用洗脫緩沖液(pH 7.0)作為洗脫液進(jìn)一步分離，以得到HMCHEMOIO-CMO BSA化合物的混合物(如上述關(guān)于圖3中的式IIa化合物所討論的混合物)。

實(shí)施例2

抗體的制備

免疫AJ品系的小鼠(雌性，至少8周齡)以產(chǎn)生單克隆抗體。第一次免疫是含有完全弗氏佐劑(來自Sigma-Aldrich, 目錄# F5881)的100 μl體積中的100 μg來自上述的免疫原(HMCHEMOIO-CMO BSA)。三周后，用含有不完全弗氏佐劑(來自Sigma-Aldrich 目錄# F5506)的100 μL體積中的100μg相同免疫原給予加強(qiáng)免疫。隨后，在另外3周之后，用含有不完全弗氏佐劑的100 μL體積中的100μg相同免疫原給予第二次加強(qiáng)免疫。在最后一次加強(qiáng)免疫后一周，對小鼠采血，并在ELISA中針對抗3-差向異構(gòu)體抗體測試抗血清。隨后，在連續(xù)三天給予融合前加強(qiáng)，然后與相同免疫原(不含任何佐劑的50 μL體積PBS中的20μg)融合。在第四天，處死小鼠并進(jìn)行脾切除。取出脾細(xì)胞，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法使用命名為P3-X63Ag8.653 (ATCC CRL-1580?)的非分泌性鼠骨髓瘤細(xì)胞系進(jìn)行融合。通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆。

通過結(jié)合和抑制ELISA篩選克隆。以下結(jié)合ELISA免疫測定程序根據(jù)以下方案。以與上述對于BSA綴合物所述的方式類似的方式在每孔50μL的PBS中以1 μg/mL用與卵白蛋白綴合的3-差向異構(gòu)體包被板。在室溫下進(jìn)行板包被1小時或更長。然后將板輕輕拍干并用每孔200μL的封閉緩沖液稀釋劑(含有0.05% Tween? 20的PBS中的0.5％酪蛋白溶液)封閉。在2-8℃下進(jìn)行板封閉1小時或過夜。然后將板洗滌三次并輕輕拍干。然后如下將待篩選的單克隆抗體添加至各孔：將25μL PBS與25μL從融合生長板中的相應(yīng)孔轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)上清液混合。孵育在室溫下在板振蕩下持續(xù)約1小時。將板使用具有板堆垛機(jī)的洗板機(jī)(BioTek, Winooski VT)洗滌，其中洗滌緩沖液為含有0.05% Tween? 20的Milli-Q?水(Millipore Corporation, Billerica, MA)。以每孔50μL添加酶綴合物(在封閉緩沖液稀釋液稀釋至1:3000的與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG)。在室溫在振蕩下進(jìn)行孵育約1小時。然后洗滌板，并以每孔100μL的體積添加顯色溶液(TMB，來自Moss Substrates, Pasadena MD)，在室溫下持續(xù)10分鐘。使用ELISA讀板器在650 nm讀板。

基于上述篩選技術(shù)，選擇產(chǎn)生合適單克隆抗體的雜交瘤。一種此類單克隆抗體被命名為抗體8F10，并且是IgG2a κ抗體。另一種此類單克隆抗體被命名為抗體4G8，并且是IgG2a κ抗體。

另外，還根據(jù)以下方案使用抑制ELISA程序篩選克隆。以每孔50μL在磷酸鹽緩沖鹽水中以1 μg/mL用與卵白蛋白綴合的3-差向異構(gòu)體包被板。在室溫下進(jìn)行板包被1小時或更長，或在約2℃至8℃下進(jìn)行板包被過夜。然后將板輕輕拍干并用每孔200μL的封閉緩沖液稀釋劑(含有0.05% Tween? 20的PBS中的0.5％酪蛋白溶液)封閉。通過在室溫下在板振蕩下孵育30分鐘或更長而進(jìn)行板封閉。洗滌板。然后如下將待篩選的單克隆抗體與游離的3-差向異構(gòu)體一起添加至各孔：從融合生長板中的相應(yīng)孔轉(zhuǎn)移每孔25μL培養(yǎng)上清液，并添加25 μL 2μg/mL 3-差向異構(gòu)體-25OH維生素D₃。孵育在室溫下在板振蕩下持續(xù)約1小時。將板使用具有板堆垛機(jī)的洗板機(jī)(BioTek, Winooski VT)洗滌，其中洗滌緩沖液為含有0.05% Tween? 20的Milli-Q?水(Millipore Corporation, Billerica, MA)。以每孔50μL添加酶綴合物(在封閉緩沖液稀釋液稀釋至1:3000的與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG)。在室溫在振蕩下進(jìn)行孵育約1小時。然后洗滌板，并以每孔100μL的體積添加顯色溶液(TMB，來自Moss Substrates, Pasadena MD)。如果所需抗體存在于雜交瘤上清液中，則觀察到與不含游離3-差向異構(gòu)體的孔相比光密度降低。使用25OH維生素D₃替代游離3-差向異構(gòu)體-25 OH維生素D₃作為對照以監(jiān)測抗體的特異性。選擇結(jié)合3-差向異構(gòu)體且不結(jié)合25OH維生素D3的抗體。

多克隆抗體產(chǎn)生：用500μg/劑量的HMCHEMOIO-CMO BSA免疫兔。進(jìn)行一次初始免疫和五次加強(qiáng)免疫，分開兩周，收集兩次測試采血和一次生產(chǎn)性出血，并如上所述在ELISA中測試抗血清。

實(shí)施例3

25OH維生素D的免疫測定

免疫測定程序

采用的25OH維生素D (25(OH)D)免疫測定形式是基于LOCI?測定技術(shù)的均質(zhì)競爭性化學(xué)發(fā)光免疫測定法。在Siemens Dimension? EXL自動化集成臨床化學(xué)系統(tǒng)(Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Deerfield, IL)上進(jìn)行測定。該測定法測量血清和血漿樣品中的25(OH)D₂和/或25(OH)D₃的總濃度。LOCI?測定試劑包括一種釋放試劑、兩種合成珠粒試劑和生物素化的單克隆抗25OH維生素D抗體試劑。第一珠粒試劑(命名為“敏化珠粒”)用鏈霉抗生物素蛋白包被并含有光敏染料。第二珠粒試劑(命名為“化學(xué)發(fā)光珠粒”)用25(OH)D₃類似物包被并含有化學(xué)發(fā)光染料。將樣品與釋放試劑孵育，以便從維生素D結(jié)合蛋白釋放25(OH)D分子，包括3-差向異構(gòu)化合物。然后將反應(yīng)混合物與生物素化的抗體孵育以形成25(OH)D-生物素化的抗體復(fù)合物。因?yàn)樯锼鼗目贵w(綿羊單克隆抗體)與3-差向-25(OH)D交叉反應(yīng)，所以添加100 μg/mL的抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1，以盡可能減少來自3-差向異構(gòu)體維生素D化合物的測定信號。添加化學(xué)發(fā)光珠粒以結(jié)合過量的游離生物素化抗體。然后添加敏化珠粒以結(jié)合生物素化抗體的生物素部分。作為結(jié)果，形成化學(xué)發(fā)光珠粒-類似物/抗體-生物素/鏈霉抗生物素蛋白-敏化珠粒的聚集物。用680 nm的光照射反應(yīng)混合物從敏化珠粒產(chǎn)生單線態(tài)氧，其擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光珠粒并觸發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在612 nm測量所得化學(xué)發(fā)光信號，并且其與樣品中的總25(OH)D的濃度成反比。

用于免疫測定的試劑的制備

25(OH)D₃化學(xué)發(fā)光珠粒的合成 – 通過將EPRM-EDA與25(OH)D₃氨基甲酸酯偶聯(lián)來合成25(OH)D₃化學(xué)發(fā)光珠粒。采用的材料為EPRM-EDA珠粒，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDAC)、Fluka磺基-N-羥基琥珀酰亞胺(SNHS)、25(OH)D₃-3-氨基甲酸酯、Gafac?表面活性劑溶液16％、無水DMSO、含有10％ MeOP和1% Gafac?表面活性劑的50mM MES pH6緩沖液。

EPRM-EDA珠粒的制備-將EPRM珠粒(2000 mg，20.0 mL)添加至40 mL小瓶。該EPRM珠粒通過與美國專利號7,179,660中所述的程序類似的程序制備，且化學(xué)發(fā)光化合物為2-(4-(N,N,二-十四烷基)-苯氨基-3-苯基二甲基噻吩與銪的螯合物。將EDA(800 mg，890 μL)與10 mL MES pH 6緩沖液(“緩沖液”)和約4.2 mL 6N HCl組合。該混合物的pH為約6.9，或調(diào)節(jié)為約6.9。在渦旋下將EDA溶液添加至EPRM珠粒，并在室溫下將混合物搖動15分鐘。在15 mL小瓶中將氰基硼氫化鈉(400 mg)與10 mL DI水組合，并將該組合添加至來自上述的珠?；旌衔?。將混合物在37℃下?lián)u振18-20小時。將珠粒轉(zhuǎn)移至六個40 mL離心管。添加MES緩沖液，使體積達(dá)到35 mL，將該混合物以19,000 rpm離心處理30分鐘。傾倒上清液，并用攪拌棒使珠粒再懸浮于2 mL緩沖液中，并添加額外的緩沖液至35 mL。將混合物以18瓦特功率超聲處理30秒，使用冰將混合物保持冷卻。洗滌/超聲處理步驟進(jìn)行4次，以去除所有活化化學(xué)品。最后的MES緩沖液離心處理之后，將含有5%MeOP和0.1%Tween?20的2 mL緩沖液 (“第二緩沖液”)添加至管中，用于再懸浮步驟。添加額外的第二緩沖液至35 mL，然后超聲處理。將珠粒懸浮液以19,000 rpm離心處理30分鐘。棄去上清液。最終的超聲處理在各個管中使用12 mL第二緩沖液，以得到25 mg/mL稀釋液。粒徑為277 nm，如在UPA儀器上所測定。

以類似于美國專利號6,153,442和美國專利申請公開號20050118727A(其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文)中所述方法的方式制備EPRM化學(xué)發(fā)光珠粒。該EPRM化學(xué)發(fā)光珠粒包含氨基葡聚糖內(nèi)層和具有游離醛官能團(tuán)的葡聚糖醛外層。參見例如美國專利號5,929,049、7,179,660和7,172,906，其相關(guān)公開內(nèi)容通過引用并入本文。在利用合適的緩沖劑(諸如例如MES)的緩沖水性介質(zhì)中，反應(yīng)在約0至約40℃的溫度，約5.5至約7.0、或約6的pH下進(jìn)行約16至約64小時。通過添加合適的淬滅劑(諸如例如羧基甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO))和隨后洗滌顆粒來淬滅反應(yīng)。

外部葡聚糖醛層上的醛基在還原胺化條件下與乙二胺反應(yīng)以形成試劑EPRM-EDA，其具有包含亞乙基鏈和末端胺基的側(cè)鏈部分。所述還原胺化條件包括使用還原劑，諸如例如金屬氫化物。該反應(yīng)在約20℃至約100℃的反應(yīng)期間溫度下在水性介質(zhì)中進(jìn)行約1小時至約48小時。

25(OH)D₃-3-氨基甲酸酯(25(OH)D₃-3-氨基甲酸酯)的合成 - 在氮?dú)庀略谑覝叵?/u>將5-ml燒瓶(用箔片覆蓋)中的22 mg (55 μmol)購自ChemReagents.com，Sugarland TX的25(OH)D₃、100 mg (420 μmol)碳酸二琥珀酰亞胺酯(DSC)、100 μL三乙胺于1 mL無水乙腈中的混合物攪拌18小時，以制備活化的25(OH)D₃。TLC (EtOAc:己烷= 2:1)顯示沒有剩余起始材料。通過將150 mg羧基甲氧基胺半鹽酸鹽(CMO)、0.3 ml三乙胺和1 ml DMF添加至10 ml燒瓶添加來制備懸浮液。在攪拌下將含有活化的25(OH)D₃的溶液逐滴添加至CMO懸浮液，其再繼續(xù)18小時。施加真空以盡可能去除溶劑(保持加熱浴溫度低于50℃)。將EtOAc (25 ml)添加至殘余物，將其用2 ml鹽水洗滌三次。將有機(jī)相用無水Na₂SO₄干燥并過濾；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑。干燥之后獲得粗產(chǎn)物(42 mg)，并通過HPLC純化。在高真空下干燥之后獲得純產(chǎn)物(24 mg)。將產(chǎn)物溶解于1.2 ml無水DMSO中。將等分試樣轉(zhuǎn)移至小瓶中，將其保持在-70℃下。

將EPRM-EDA與半抗原25(OH)D₃-氨基甲酸酯偶聯(lián) - 將1.2 mg半抗原添加至2-mL小瓶。將11.2 mg EDAC和15.5 mg SNHS加上3.73 mL無水DMSO添加至5-mL小瓶。旋轉(zhuǎn)EDAC/SNHS溶液以溶解內(nèi)容物。將1.14 mL EDAC/SNHS溶液添加至含有半抗原的小瓶。將混合物旋轉(zhuǎn)22小時。將EPRM-EDA (200 mg)用高pH洗滌緩沖液洗滌一次，然后用MES pH6緩沖液洗滌。向5-mL小瓶中添加1.08 mL (100 mg)洗滌緩沖液，隨后添加143 mL 1.6% Gafac?表面活性劑。向小試管中添加256μL無水DMSO，隨后添加49 μL EDAC/SNHS/半抗原。將DMSO/半抗原溶液逐滴添加至珠?；旌衔?在添加期間進(jìn)行渦旋)。將珠粒/半抗原混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜。

將珠粒/半抗原混合物轉(zhuǎn)移至50-mL離心管并用10％ 1-甲氧基-2-丙醇/1% Gafac?表面活性劑/MES pH6緩沖液稀釋至35 mL。將管以18,500 rpm在10℃下離心30分鐘。棄去上清液，并用1 mL相同緩沖液替換。用攪拌棒再懸浮沉淀。將小瓶用相同緩沖液填充至35 mL。將管在18-21瓦特下超聲處理1分鐘，使用冰以保持管冷卻。將離心/洗滌重復(fù)六次。在第六次洗滌后，將緩沖液切換至半抗原洗滌緩沖液(pH 7.2)，并再進(jìn)行兩次洗滌。在最后一次洗滌并用1 mL 半抗原洗滌緩沖液重懸浮后，添加4 mL 半抗原洗滌緩沖液。將珠?；旌衔镌诒匠暡▋x中以50％功率超聲處理。通過UPA測量粒徑為298 nm。進(jìn)行百分比固體測定，并將珠粒混合物稀釋至10 mg/mL。將該化學(xué)發(fā)光珠粒試劑配制于50 mM MES緩沖液中。

抗25(OH)D抗體的生物素化 – 將NHS-PEO₄-生物素(Pierce Chemical Company, Rockford IL)與抗25(OH)D抗體(綿羊單克隆抗體，來自Bioventix, Farnham, Surrey, UK)偶聯(lián)。將3 mg抗25(OH)D抗體在10 mL Amicon中用10 ml抗體透析緩沖液(10 mM NaH₂PO₄pH 7.0/300 mM NaCl)各自緩沖液交換兩次，然后濃縮至3.0 mg/mL。將1mg NHS-PEO4-生物素溶解于100 μL抗體透析緩沖液中，以制備10 mg/mL生物素試劑溶液，將其添加(35 μL)至抗25(OH)D抗體溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下?lián)u動過夜。將混合物在10 mL Amicon中用10 mL抗體透析緩沖液各自洗滌三次，然后濃縮至約1 mL。在UV A280上測量濃度。在水性緩沖液中配制生物素化的抗25(OH)D抗體試劑，所述水性緩沖液含有25 mM檸檬酸緩沖液、300 mM NaCl、1mM EDTA、封閉蛋白和防腐劑(pH 5.0)。

敏化珠粒 - 使用與美國專利號6,153,442、7.022,529、7,229,842和美國專利申請公開號20050118727A中描述的方法類似的方法制備鏈菌抗生物素蛋白-敏化劑珠粒。光敏劑為雙-(三己基)-硅-叔丁基-酞菁。敏化珠粒試劑的濃度在含有150 mM的NaCl的HEPES緩沖液(pH 8.0)中為200 μg/mL。

釋放試劑 - 5 mM HEPES緩沖液中的水楊酸鈉。

免疫測定的結(jié)果

添加抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1(抗3-差向異構(gòu)體VD Ab)對測定的3-差向異構(gòu)體交叉反應(yīng)性的影響顯示于表1中。含有25(OH)D₂或25(OH)D₃化合物的十個患者血清摻入100 ng/mL購自Sigma (儲備號751324)的3-差向異構(gòu)體維生素D₃化合物。通過摻入和未摻入3-差向異構(gòu)體化合物的25(OH)D₂或25(OH)D₃值之間的差異除以添加的3-差向異構(gòu)體化合物的量來計(jì)算3-差向異構(gòu)體交叉反應(yīng)性。在添加100 μg/mL的抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1的情況下，平均3-差向異構(gòu)體交叉反應(yīng)性從13.7％降低至小于2％。

表 1

圖9說明使用添加和不添加抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1 (3-差向異構(gòu)體Ab)的試劑產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。兩條曲線的完全重疊顯示抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1不影響25(OH)D₃(圖9中的25OH Vit D3)的測量，指示抗體對3-差向異構(gòu)體化合物是特異性的并且與25(OH)D₃沒有可觀察到的交叉反應(yīng)性。

實(shí)施例4

3-差向-25OH維生素D的免疫測定

免疫測定程序

3-差向-25OH維生素D (3-差向-25(OH)D)的測量采用基于類似于上述實(shí)施例3中所述的LOCI?測定技術(shù)的均質(zhì)競爭性化學(xué)發(fā)光免疫測定法。在Siemens Dimension? EXL自動化集成臨床化學(xué)系統(tǒng)(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)上進(jìn)行測定。用于測量3-差向-25(OH)D的LOCI?測定試劑包括一種釋放試劑、兩種合成珠粒試劑和生物素化的單克隆抗3-差向異構(gòu)體抗體試劑。第一珠粒試劑(敏化珠粒)用鏈霉抗生物素蛋白包被并含有光敏染料。第二珠粒試劑(化學(xué)發(fā)光珠粒)用以與上述對于實(shí)施例1所述的方式類似的方式制備的3-差向異構(gòu)體類似物(上述式IIa化合物，其中Z’是非聚(氨基酸)標(biāo)記，即EPRM-EDA化學(xué)發(fā)光珠粒)包被。將樣品與釋放試劑孵育，以便從維生素D結(jié)合蛋白釋放25(OH)D分子，包括3-差向異構(gòu)化合物。然后將反應(yīng)混合物與生物素化的抗體孵育以形成3-差向-25(OH)D/生物素化的抗體復(fù)合物。添加化學(xué)發(fā)光珠粒以清除過量的游離生物素化抗體。然后添加敏化珠粒以結(jié)合生物素化抗體的生物素部分。作為結(jié)果，形成化學(xué)發(fā)光珠粒-類似物/抗體-生物素/鏈霉抗生物素蛋白-敏化珠粒的聚集物。用680 nm的光照射反應(yīng)混合物從敏化珠粒產(chǎn)生單線態(tài)氧，其擴(kuò)散至化學(xué)發(fā)光珠粒并觸發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。在612 nm測量所得化學(xué)發(fā)光信號，并且其與樣品中的總3-差向-25(OH)D的濃度成反比。

用于免疫測定的試劑的制備

3-差向異構(gòu)體類似物化學(xué)發(fā)光珠粒的合成 - 以與上述實(shí)施例3中對于25(OH)D3化學(xué)發(fā)光珠粒的合成所述的方式類似的方式制備用于檢測3-差向-25(OH)D的該測定中使用的化學(xué)發(fā)光珠粒，其中半抗原是式IIa化合物，其中Z’是化學(xué)發(fā)光珠粒。

化學(xué)發(fā)光珠粒試劑 - 50 nM MES緩沖液中的3-差向異構(gòu)體類似物化學(xué)發(fā)光珠粒。

抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1的生物素化 -以與上文實(shí)施例3中對于抗25(OH)D抗體的生物素化所述的方式類似的方式進(jìn)行抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1的生物素化。

生物素化的抗體試劑 -25 mM檸檬酸緩沖液中的如上所述的生物素化的抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1。

敏化珠粒試劑 -敏化珠粒試劑與實(shí)施例3中相同。

免疫測定的結(jié)果

圖10說明用于使用抗3-差向異構(gòu)體-VD抗體8F10.1測定樣品中的3-差向-25(OH)D的免疫測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。化學(xué)發(fā)光千計(jì)數(shù)代表如上所述測量的化學(xué)發(fā)光信號。

本說明書中引用的所有出版物和專利申請通過引用并入本文，如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埍惶貏e和單獨(dú)指明通過引用并入一樣。

應(yīng)當(dāng)理解，上述實(shí)施例僅說明代表本文所述的原理的許多具體實(shí)施例中的一些。明顯地，在不背離如以下權(quán)利要求所定義的范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)想出許多其它布置。