專利名稱：一種吲哚乙酸分子印跡聚合物的制備方法及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，更具體涉及ー種吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法及其應用，適用于植物樣品中生長素的富集和分析。
背景技術(shù)：
生長素是植物生長發(fā)育過程中必需的ー類植物激素。常見生長素有吲哚こ酸(IAA)、吲哚丁酸、4-氯吲哚こ酸J引哚丙酸(IPA)等。它們都以吲哚為母環(huán)，是ー類結(jié)構(gòu)相似的化合物。在實際生產(chǎn)中，生長素具有調(diào)節(jié)植物頂端優(yōu)勢、促進組織器官成熟和衰老等生理作用，因此準確測定其含量，能更有效地了解生長素的作用機制。
固相微萃取(SPME)是在固相萃取(SPE)的原理上發(fā)展起來的一種前處理技術(shù)，具有操作簡便、樣品用量少、無需有機溶劑等許多優(yōu)點。在復雜樣品前處理中，商品化的SPME涂層由于選擇性較低、價格昂貴、使用壽命較短等不足而限制了其應用。分子印跡技術(shù)具有很高的選擇性和特異性，能彌補SPME選擇性不高的缺陷，因而受到許多研究者的廣泛關(guān)注。通過制備與目標分子在空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點上完全匹配的分子印跡聚合物(MIP)，并將其作為SPME的涂層，即形成MISPME技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了 SPME萃取的高效性和MIPs強的分子識別能力，是ー種很有發(fā)展?jié)摜那疤幚矸椒āIP或SPME單個方法作為植物激素的前處理方法已有相關(guān)文獻報道。Li等制備了 IAA分子印跡磁性微球提取植物樣品中的生長素。Liu等將SPME-HPLC聯(lián)用技術(shù)用于測定巴蕉木質(zhì)部流中4種植物激素，但該方法涉及商品化SPME萃取頭，價格昂貴且專ー性有限。而以IAA作為模板分子，制備纖維式MISPME涂層用于生長素的分析至今未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法及其在SPME涂層上的應用。本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
本發(fā)明首先提供了一種吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法，以IAA作為模板分子，加入功能単體4-こ烯吡啶和致孔劑こ腈，混勻，常溫放置12 h，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮ニ異丁腈，超聲混勻、通氮除氧后即得到預聚合溶液；將預聚合溶液于60で反應8 h以上，得到固態(tài)聚合物；上述固態(tài)聚合物以甲醇-こ酸溶液脫除模板分子，干燥得到吲哚こ酸分子印跡聚合物。其中模板分子、功能単體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑四者的摩爾比分別為2 12 6 :1。交聯(lián)劑和功能單體的總體積與致孔劑的體積比為I :6。所述吲哚こ酸分子印跡聚合物用于SPME涂層。本發(fā)明還提供了ー種分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，所述制備方法的具體步驟包括
I)石英纖維處理石英纖維預處理及硅烷化；2)預聚合溶液配制以IAA作為模板分子，加入功能単體4-こ烯吡啶和致孔劑こ臆，混勻，常溫放置12 h，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮ニ異丁臆，超聲混勻、通氮除氧后即得到預聚合溶液；
3)在上述預聚合溶液中插入硅烷化處理的石英纖維，60で反應8h以上；然后將聚合后的石英纖維取出，老化；
4)配置新鮮預聚合溶液，重復步驟3)在同一根石英纖維上多次涂潰制得涂層；
5)涂層制備完成后，用體積比為90:10的甲醇-こ酸混合溶液洗脫去除模板分子。所述的硅烷化采用硅烷化試劑進行活化處理；所述硅烷化試劑為Y -MAPs和丙酮按體積比I :9混合配制而成；活化處理時間為2 h。所述老化的條件為60で放置3 h。、其中模板分子、功能単體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑四者的摩爾比分別為2 12 6 :1。將制得的IAA-MIP作為SPME涂層。此涂層性質(zhì)穩(wěn)定、厚度可控、易于自動化操作，并可選擇性萃取和富集結(jié)構(gòu)類似的2種目標物。結(jié)合液相色譜檢測平臺，可實現(xiàn)對生長素的有效分離和高靈敏檢測，并用于植物樣品分析。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是
1.將SPME與IAA-MIP有效結(jié)合，首次合成了IAA-MISPME涂層；
2.該涂層是以石英纖維為介質(zhì)，纖維處理簡單、成本低、可多次使用，而且可直接在自組裝的萃取裝置中使用；
3.制備的涂層與纖維連接緊密，表面疏松多孔，良好的結(jié)構(gòu)特性有利于目標物的萃
取；
4.制備的涂層具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、耐溶劑能力和較長的使用壽命，在多種溶劑中反復使用，也未發(fā)現(xiàn)萃取性能下降；
5.采用多次涂潰法，能制備一定厚度的MISPME涂層，過程易控，且能更有效地實現(xiàn)目標物的萃取與富集；
6.與常規(guī)SPE相比，該SPME方法的靈敏度顯著提高；與常規(guī)SPME方法比較，該涂層的選擇性大為增強；
7.建立的方法能適用于復雜基質(zhì)預處理，應用范圍廣泛。


圖I是自組裝的SPME裝置示意圖；其中，I.活塞；2. 5 μ L GC微量注射器；3.血清瓶；4.正己烷；5. IAA-MISPME涂層；6.磁子；7.磁力攪拌器。圖2 是 IAA-MISPME 涂層的表面形貌；放大倍數(shù)(a) : X 1000 ； (b) : X 5000 ； (c):X10000。圖3是IAA和IPA萃取前后的色譜對比圖；其中，(A)直接進樣，10 mg/L ；(B)MISPME涂層萃取，O. I mg/L，均固定進樣10 μし圖4是IAA-MISPME涂層的選擇性評價；其中，IAA (口引哚こ酸，模板分子)，IPA (噴哚丙酸，結(jié)構(gòu)類似物)， Ρ (異戊烯基腺嘌呤，參照物)。 圖5是空白(虛線)和加標(實線)煙草葉片基質(zhì)提取液萃取實驗的色譜疊加圖，加標濃度為O. 05 mg/L ο
具體實施例方式按本發(fā)明的內(nèi)容制備IAA-MISPME涂層
a)石英纖維預處理取長約20 cm石英纖維，一端浸于丙酮中5 min，剝?nèi)ネ鈱拥木埘啺蓖繉?，依次用二次水、L O mo I/L NaOH、二次水、I mo I/L HCl浸泡、洗凈,晾干后將石英纖維放入10% (v/v) Y-MAPS丙酮溶液中硅烷化處理2 h，取出后用甲醇沖洗，氮氣吹干，待用。b)預聚合溶液制備將IAA作為模板分子，加入適量4-こ烯吡啶(功能単體)和乙腈(致孔劑)混勻，常溫放置12 h，再加入三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(交聯(lián)劑)和偶氮ニ異丁腈(引發(fā)劑)，超聲混勻、通氮除氧后即得到預聚合溶液。c)聚合反應將b)液轉(zhuǎn)移至2. O mL衍生化小瓶中，插入硅烷化的纖維，60で熱引發(fā)共聚反應。8 h后，小心拔出石英纖維，60で老化3 h。 d)反復涂潰按b)配制新鮮預聚溶液，在同根纖維上重復c)操作，至涂層厚度達到要求。e)去除模板分子用甲醇-こ酸(90:10，v/v)混合溶液洗脫去除模板分子。除不加模板分子外，同時制備非印跡固相微萃取(NISPME)涂層。自組裝萃取裝置如圖I所示以5 μ L GC微量進樣器(2)作為萃取手柄，以涂有IAA-MISPME涂層的纖維(5)取代原微量進樣器的鐵絲，以進樣器活塞(I)來控制萃取過程中涂層的伸縮，樣品溶液(正己烷)裝于血清瓶(3)中，并置于磁力攪拌器(7)上進行攪拌萃取。具體MISPME法萃取過程為萃取溶劑為20 mL正己烷，攪拌速度為400 rpm，萃取溫度為60 °C,萃取時間為40 min,解析溶劑為こ腈，解析體積為10 μ L,解析時間為10 min。將上述萃取頭與液相色譜聯(lián)用，色譜條件如下色譜柱為ZORBAX SB-C8 (250mmX4. 6 mm I. D. , 5 μ m, Agilent),流動相甲醇-水(60 :40, v/v, %),流速I. O mL/min,最大紫外波長223 nm。涂層的性能評價通過場發(fā)射透射電鏡研究了 IAA-MISPME涂層的表面形貌。結(jié)果表明，涂層與纖維粘附情況總體較好，未發(fā)現(xiàn)有涂層脫落現(xiàn)象(圖2a);圖2 (b)和(C)中可觀察到MISPME涂層表面呈現(xiàn)疏松多孔狀和高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)。這種形貌結(jié)構(gòu)為MISPME涂層萃取分析物奠定了基礎(chǔ)。為考察MISPME法對目標物的富集能力，將自制涂層萃取濃度為0.1 mg/L的2種生長素，并與直接進樣法(待測物10 mg/L)相比較(圖3)?？梢钥闯觯M管濃度相差2個數(shù)量級，但MISPME涂層對兩種生長素的萃取響應值仍然較高。產(chǎn)生這種富集效果，主要歸因于在IAA-MIP制備時，聚合溶液中模板分子IAA與功能単體之間的氫鍵作用使4-こ烯吡啶圍繞在IAA分子周圍，并呈現(xiàn)特異性的排列。配制濃度為O. I mg/L的IAA、IPAliP (異戊烯基腺嘌呤)混合溶液，來考察MISPME涂層的性能。吸附量Q KQ1 - C1)
*V/m。其中，Q-吸附量(mg/g) ;0τ萃取前樣品溶液濃度(mg/mL) A1-萃取后樣品溶液濃度(mg/mL) ;V-樣品溶液體積(mL) ;m-纖維上的IAA-MIP質(zhì)量(g)。用印跡因子α的值來評價KT-MIP對模板分子KT的選擇性識別能力，a =Qmip /Qnip，其中，QMIP、Qnip分別為分子印跡材料、非分子印跡材料對目標物的吸附量。由圖4可知，IAA-MISPME涂層對模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物IPA的萃取量明顯高于NISPME涂層，其萃取量可達930 pmol和764 pmol ；而對結(jié)構(gòu)相似度較小的iP，其萃取量僅為156 pmol，與NISPME涂層相當。用MISPME涂層對分析物的萃取量除以NISPME涂層對應的萃取量，計算得到三種物質(zhì)的印跡因子(α )分別為2. 78,2. 59,0. 95，進ー步表明MISPME涂層對IAA和IPA選擇性能較佳。將建立的MISPME法用于植物基質(zhì)的分析準確稱取2 g新鮮煙草嫩葉液氮下迅速研磨成粉末，加入5. O mL 80%甲醇提取液(含有O. 1%抗氧化劑2，6- ニ叔丁基對甲酚)，-20で下浸提12 h，離心(4 °C,4000 rpm, 5 min)后取上清液，殘渣用3. O mL上述提取液再次浸提I h，合并兩次濾液并轉(zhuǎn)移至100 mL圓底燒瓶中，45で減壓蒸餾除去有機相，加入20mL正己烷提取，用于后續(xù)分析。由圖5可知，經(jīng)過MISPME處理后，植物樣品的基質(zhì)干擾減少，背景較為干凈。盡管空白植物樣品中未測得目標物，但該方法對加標樣品中測得的IAA和IPA具有較好的選擇性?？傊?，以IAA為模板分子，制備了形貌均勻、疏松多孔的IAA-MISPME涂層。在化學性能方面，MISPME涂層能耐甲醇、こ腈等多種有機溶劑，使用壽命較長。在萃取性能方面，IAA-SPME涂層對模板分子IAA及類似物IPA具有較好的富集能力及選擇性，選擇性因子高達2. 78。建立了 IAA-MIPSPME與HPLC聯(lián)用的方法用于測定生長素，線性范圍為1-100 μ g/ L，檢測限為O. 5μ g/L。該方法用于煙草葉片分析，加標回收率在82. 5-120. 6%之間。與其它SPME、SPE等預處理方法相比，該分子印跡法能復雜的植物背景被純化，同吋，也使痕量被測物得到一定程度的富集，從而提高了分析的靈敏度和專ー性。
權(quán)利要求
1.一種吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法，其特征在干以IAA作為模板分子，加入功能単體4-こ烯吡啶和致孔劑こ腈，混勻，常溫放置12 h，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮ニ異丁腈，超聲混勻、通氮除氧后即得到預聚合溶液；將預聚合溶液于60で反應8 h以上，得到固態(tài)聚合物；上述固態(tài)聚合物以甲醇-こ酸溶液脫除模板分子，干燥得到吲哚こ酸分子印跡聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于模板分子、功能単體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑四者的摩爾比分別為2 12 6 :1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于交聯(lián)劑和功能単體的總體積與致孔劑的體積比為I :6。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的吲哚こ酸分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于所述吲哚こ酸分子印跡聚合物用于SPME涂層。
5.ー種分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，其特征在于所述制備方法的具體步驟包括 1)石英纖維處理石英纖維預處理及硅烷化； 2)預聚合溶液配制以IAA作為模板分子，加入功能単體4-こ烯吡啶和致孔劑こ臆，混勻，常溫放置12 h，再加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮ニ異丁臆，超聲混勻、通氮除氧后即得到預聚合溶液； 3)在上述預聚合溶液中插入硅烷化處理的石英纖維，60で反應8h以上；然后將聚合后的石英纖維取出，老化； 4)配置新鮮預聚合溶液，重復步驟3)在同一根石英纖維上多次涂潰制得涂層； 5)涂層制備完成后，用甲醇-こ酸溶液洗脫去除模板分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，其特征在于所述的硅烷化采用硅烷化試劑進行活化處理；所述硅烷化試劑為Y-MAPs和丙酮按體積比I :9混合配制而成；活化處理時間為2 h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，其特征在于老化的條件為60で放置3 h。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，其特征在于模板分子、功能単體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑四者的摩爾比分別為2 12 6 :1。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分子印跡固相微萃取涂層的制備方法，其特征在于所述甲醇-こ酸溶液中甲醇、こ酸的體積比為90:10。
全文摘要
本發(fā)明屬于分析化學領(lǐng)域，更具體涉及一種吲哚乙酸分子印跡聚合物的制備方法及其應用，適用于植物樣品中生長素的富集和分析。該方法以IAA作為模板分子，加入功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑得到預聚合溶液；60℃反應8h以上，脫除模板分子得到吲哚乙酸分子印跡聚合物?？蓪⑵溆糜赟PME涂層。處理后的石英纖維插入預聚合溶液中，熱引發(fā)聚合。反應完成后取出石英纖維，老化并重復涂漬，洗凈模板分子，最后將纖維插入微萃取裝置中用于后續(xù)萃取。此IAA-MISPME制備簡單、厚度可控、選擇性強、富集效果好，且能反復使用。此萃取頭與液相色譜聯(lián)用時，可實現(xiàn)對植物樣品中2種生長素的高效萃取和分離。
文檔編號C08F2/44GK102702565SQ20121019068
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者盧巧梅, 張?zhí)m, 范良彪, 蔡惠堅, 陳國南 申請人:福州大學