專利名稱：：一種茶多糖的分離純化制備方法及降血糖活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種茶多糖的制備方法，尤其涉及一種茶多糖的分離純化制備方法及降血糖活性
背景技術(shù)：
：茶葉是我國的大宗農(nóng)副產(chǎn)品，現(xiàn)有茶園面積約100萬公頃，年產(chǎn)茶葉約60萬噸左右，其中約有10萬噸左右的粗老茶葉滯消或積壓，如果不考慮這些制茶副產(chǎn)品的綜合利用，將造成很大的資源浪費和經(jīng)濟損失。自20世紀80年代始，國內(nèi)外學者對茶葉中所含的多糖復合物進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)茶多糖具有增加機體免疫能力、降血糖、降血脂和減少動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗輻射及抗炎等多種生物活性。關(guān)于茶多糖提取的專利報道近年來主要有張效林"一種從茶葉中提取茶多酚副產(chǎn)咖啡堿和茶多糖的方法"(申請?zhí)?00510042629.3)，李永泉"從提取過茶多酚的下腳料中提取茶多糖的方法"(申請?zhí)?3114898.0)，汪叔雄"在茶葉中提取茶多酚及其副產(chǎn)'品的方法"(申請?zhí)?6113134.9)，嚴良榮"粗、老茶鮮葉提取多糖、多酚混晶工藝方法"(申請?zhí)?7109115.3)，黃寶生"茶多糖的提取方法"(申請?zhí)?1134065.7)，惠永正"純化茶多糖及提成方法"(申請?zhí)?2110999.0)，江和源"從茶葉中綜合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡堿的方法"(申請?zhí)?00410015905.2)，汪東風"茶葉中有效成分綜合制備工藝"(申請?zhí)?00310114694.3)，張守政"從茶葉中提取茶多酚、茶氨酸、茶多糖、茶色素的方法"(申請?zhí)?00610055145.7)，楊紅武"一種茶多糖及其制備方法和用途"(申請?zhí)?00610125174.6)，這些專利報道極大的豐富了茶多糖提取純化手段，但并沒有從茶葉提取物中純化出一種單一組分。本方法的特色在于從茶葉中茶多糖提取工藝中提高提取率、縮短提取時間、減少能耗、有效保存茶葉多糖生物活性等目的，并且純化得到一個多糖和蛋白的綴合物組分(TeaGlycocongujate，TGC)，并且對該組分的理化性質(zhì)、分子量、氨基酸組成、單糖組成、一級結(jié)構(gòu)和溶液中的構(gòu)象等進行了系統(tǒng)的分析鑒定。a-淀粉酶參與人體的糖代謝過程，在小腸內(nèi)，由胰臟的a-淀粉酶把淀粉分解為葡萄糖和寡糖。過去一般認為淀粉酶抑制劑對胰島素和血糖的利用并無直接作用，只具有輔助降糖作用，而無直接治療作用。淀粉酶抑制劑降血糖是70年代后興起的降血糖新思路。近幾年的研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病人長時間的高血糖尤其餐后血糖過高、血糖下降過慢是導致病人多系統(tǒng)多臟器損害的最主要原因，因此減少淀粉分解為單糖從而降低餐后血糖水平對糖尿病患者的好處就顯而易見了。淀粉酶抑制劑可以抑制消化道、尤其是十二指腸的淀粉酶活性，減少或延緩消化道淀粉水解為單糖，使單糖的吸收減少而降低血糖，所以對糖尿病人餐后高血糖以及肥胖者過食碳水化合物引起的脂肪增加有對抗作用。20世紀80年代末我國也開始了此類藥物的篩選和研制，但目前尚無產(chǎn)品問世。本研究通過測定產(chǎn)品對a-淀粉酶酶活的抑制效果來進一步來評價產(chǎn)品的效果，指導生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種茶多糖的分離純化制備方法及降血糖活性，該方法縮短提取時間、減少能耗、有效保存茶葉多糖生物活性。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，其工藝步驟是1、原料以粗老茶葉、低檔茶葉或提取茶多酚后的茶葉廢渣為原料；2、高壓氣流破碎將原料經(jīng)50—6(TC干燥、一4(TC冷凍等預處理后，氣流式超微粉碎對原料進行處理，其主要是通過氣流的沖擊、剪切、碰撞和摩擦對物料進行粉碎，要求氣源壓力為5MPa，粉碎壓力為3—5MPa,從而使原料等活性成分的溶出量提高、粉體粒度減小，以改善原料中茶多糖提取過程中得率低等問題。3、過篩高壓氣流破碎后的原料進行分級過篩4G—80目；4、微波輔助溶劑萃取采用微波提取主要使原料細胞內(nèi)溫度迅速上升，細胞內(nèi)液水份汽化產(chǎn)生的壓力使細胞膜和細胞壁急劇破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物質(zhì)快速溶出。微波輔助溶劑萃取最佳工藝條件為微波時間75秒，微波強度100%，固液比l:15;5、真空酶提采用CellubrixTML纖維素酶(含纖維素酶1500NCU/mL、纖維二糖酶25CbU/mL)，Termamyl耐溫a-淀粉酶，為保持茶多糖的活性，采用真空低溫水提、酶提二次結(jié)合法提取茶多糖。第一次在50°C、固液比1:15、水提取30min，多糖提取率為2.33%，粗多糖(干重)的提取率為6.82%。過濾后，濾渣用pH4.6的擰檬酸—檸檬酸鈉緩沖液加纖維素酶提取，酶提最佳工藝參數(shù)為55°C、固液比1:14、酶用量2.2pL/g茶葉，120min;6、徑向高效色譜分離多糖的凝膠柱純化將制備的初步純化茶多糖溶解于蒸餾水中(或直接用不經(jīng)干燥的提取液)。過SephadexG100凝膠柱(2.6x70cm)。用10ml進樣器逐滴將樣液加入柱中，以0.1mol/LNaCl洗脫，流速1.5mL/min，自動分部收集儀每6min收集一管。逐管檢測A28o^(蛋白質(zhì)吸收峰)、A62。(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，濃縮，備用。SephadexG100凝膠濕法裝柱取一定量的SephadexG100凝膠，置于燒杯中，加入足量的蒸餾水浸泡，在100。C水浴中溶脹5到6小時，取出冷卻后，于室溫放置24小時繼續(xù)溶脹。溶脹結(jié)束后，傾去表面的懸浮物，超聲波脫氣，即可裝柱。本專利采用的是聚四氟乙烯的專用層析柱，在柱中加蒸餾水至一定高度，通過漏斗從柱的頂部將溶脹的凝膠加入柱中，同時柱的底部放水，邊加邊敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝膠界面始終處在水面以下。裝柱完成后，先用蒸餾水平衡一天，最后用洗脫液平衡，平衡時流速小于洗脫流速。HPLC鑒定純度及其色譜條件的摸索HPLC分析時，采用手動進樣，每次進樣量為20pL，洗脫流速為0.5mL/min。樣品溶液和洗脫液分別用0.80pm和0.45pm的濾膜過濾。7、超濾選用中空纖維材料，工作壓力為28psi，料液溫度為29°C，料液pH為6.7，超濾處理40min，膜的滲透通量達最佳值為9.98LHM;8、冷凍干燥冷凍干燥條件:-8(TC預凍8hr后，-8(TC真空冷凍干燥6小時。9、a-淀粉酶活性抑制實驗抑制a-淀粉酶活性的計算方法為分光光度計法(據(jù)諾維信公司提供的方法，附有"吸光度A-酶濃度c"附錄表)吸取可溶性淀粉溶液20.0mL和pH6.0的磷酸緩沖液5.0mL于試管中，在70°C恒溫水浴中預熱平衡5分鐘，然后加入到在55°C預熱20分鐘的混合溶液中(含lmL的多糖水溶液和lmL待測酶液，酶液己稀釋至合適濃度)。搖勻，準確反應(yīng)5分鐘。立即吸取反應(yīng)液l.OOmL，加到預先盛有0.5mL鹽酸(O.lmol/L)禾B5.00mL稀碘液的試管中，搖勻。以蒸餾水代替淀粉溶液作試劑空白調(diào)零。660nm處用10mm比色皿迅速測定其吸光度(A)。本發(fā)明的方法中，初步純化的茶多糖提取物水溶液對a-淀粉酶酶活力制效果如下表1不同茶多糖提取物水溶液對a-淀粉酶酶活力抑制效果的對比茶多糖提取多糖提取液濃a-淀粉酶濃度抑制效果抑制物度(mg/mL)d(U/mL)(U/mg多糖)率_____—___第一次水提鄉(xiāng),1.0623.6040.97020.9第二次酶提，1.1293.7710.76416.5多糖第二次水提^1.3434.3240.2314.98夕城多裙結(jié)果表明，第二次用纖維素酶提取的茶多糖的抑制率比第一次水提取的多糖低21.2%，這可能是由于多糖的分子量或結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變化，或者此混合多糖的分子量分布發(fā)生了改變，摻雜進了一些其它分子量的多糖，但主要種類未變，仍具有較強的抑制(X-淀粉酶的活性。第二次水提茶多糖的抑制率比第一次水提取的多糖低76.2%,這可能是由于在低溫條件下第二次水提取得到的茶多糖的組成與第一次水提取的多糖相差很大，其中可能主要為分子量更大的可溶性纖維素等多糖類物質(zhì)。本發(fā)明的方法中，不同溫度提取茶多糖粉末對a-淀粉酶酶活力抑制效果如下表2多糖提取溫度對抑制a-淀粉酶效果的影響提取溫度(°C)25506080lOQ抑制率(％)2.438.225.742.701.24抑制效果(U/500mg提1.313.823.101.450.66取物)研究結(jié)果表明，提取溫度越高，雖然得率提高，但可能會使茶多糖降解或變性，從而影響活性而使抑制效果降低。提取溫度太低如常溫提取，可能會由于提取物中活性茶多糖含量低，抑制效果也不好。本發(fā)明的方法中，茶多糖粉末用量對其抑制(x-淀粉酶酶活力效果的影響如下結(jié)果見表3。研究結(jié)果表明，茶多糖用量增加，對oi-淀粉酶的抑制率會提高，用量增加到一定程度，抑制率增加幅度會降低。表3茶多糖用量對抑制(x-淀粉酶效果的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明的方法中，茶多糖的蛋白鏈對抑制a-淀粉酶酶活力效果的影響如下表4蛋白質(zhì)去除方法對抑制效果的影響除蛋白方法Sevag法中性蛋白酶未除蛋白法抑制率(％)21.97.348.22抑制效果(U/500mg提11.23.763.82取物)茶多糖為一酸性糖蛋白，經(jīng)不同的去除蛋白試驗，發(fā)現(xiàn)由于蛋白酶對糖蛋白的蛋白鏈的降解作用，使茶葉多糖對a-淀粉酶的抑制作用大大降低，而Sevag法除蛋白由于條件溫和，不會對糖蛋白的蛋白鏈產(chǎn)生影響，故抑制率較前者高很多，說明茶葉糖蛋白的蛋白鏈對其對a-淀粉酶的抑制活性起很大作用。雜的游離蛋白使多糖的純度降低，從而使得粗茶多糖的活性比經(jīng)除蛋白初步純化的茶多糖要低。本發(fā)明的方法中，酸性多糖對a-淀粉酶的抑制效果如下同樣是5(TC水提取，用乙醇沉淀得到的茶多糖提取物與用CTAB沉淀得到的酸性茶多糖對a-淀粉酶的抑制效果見表5。表5酸性多糖與混合茶多糖對a-淀粉酶的抑制效果的比較沉淀方法抑制效果(U/500mg提取—一—一......................................................————.壟■—)—.一"—.————.................................................—■—■■—乙醇沉淀茶多糖4.20CTAB沉淀的酸性茶多糖23.4用CTAB沉淀的酸性茶多糖對a-淀粉酶的抑制效果明顯好于乙醇沉淀樣，但得率降低。這可能意味著對a-淀粉酶起抑制的物質(zhì)是某種酸性多糖。本發(fā)明的方法中，茶多糖的存在狀態(tài)及構(gòu)象對其抑制a-淀粉酶活力效果的影響如下茶多糖粉末和水溶液對(x-淀粉酶酶活力抑制效果的比較結(jié)果見表6。表6茶多糖的存在狀態(tài)及構(gòu)象對抑制效果的影響廿^化^七一,丄+抑制效果(U/100mg提取茶多糖的存在狀態(tài)^————————........._______________———.....—埜—).——...........................................................茶多糖粉末0.764茶多糖水溶液97_—結(jié)果表明，由于溶液中茶多糖的天然活性構(gòu)象得到了最大程度的保存，因而其對a-淀粉酶的抑制效果遠遠好于干燥的粉末狀茶多糖，說明茶多糖對(x-淀粉酶的抑制活性與其構(gòu)象密切相關(guān)，干燥使得茶多糖脫水，天然構(gòu)象遭到破壞，從而極大地影響它的活性。本發(fā)明的方法中，不同純度茶多糖抑制a—淀粉酶活性實驗結(jié)果如下a-淀粉酶參與人體的糖代謝過程，茶多糖對a-淀粉酶水解淀粉的活力進行抑制，延緩葡萄糖的釋放，可能是其降血糖的的機理之一。結(jié)果表明，隨著多糖的純度的提高，茶多糖的抑制活性也增加，茶多糖TGC的抑制a—淀粉酶的活性最高，比初步純化的茶多糖的活性高出367.86%，從a—淀粉酶的抑制率來看(PER)，500mgTGC的抑制率高達97.2%。本發(fā)明的技術(shù)效果是提高了茶多糖含量及降血糖活性，提高茶多糖提取率、縮短提取時間、減少能耗、有效保存茶葉多糖生物活性。具體實施例方式實施例一將粗老茶葉經(jīng)5(TC千燥、一4(TC冷凍等預處理后，氣流式超微粉碎對茶葉進行處理，稱取40目茶粉100g，微波輔助溶劑萃取，微波時間75秒，微波強度100%，固液比l:15，雙層濾布過濾，①濾渣用熱蒸餾水洗滌，合并濾液與洗滌液，得到提取液I;②濾渣用熱蒸餾水洗滌，濾渣加pH4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，加一定量酶，水浴加熱水解，調(diào)pH值至中14抑酶，雙層濾布過濾，濾渣用熱蒸餾水洗滌，合并濾液與洗滌液，得提取液II。將提取液I和II分別離心，真空濃縮至一定體積，加入無水乙醇，低溫過夜醇沉，將乙醇沉淀液離心分離，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，得茶葉粗多糖I(水提)和n(酶提)。將制備的初步純化茶多糖溶解于蒸餾水中(或直接用不經(jīng)干燥的提取液)。過SephadexG100凝膠柱(2.6x70cm)。用10ml進樣器逐滴將樣液加入柱中，以0.1mol/LNaCl洗脫，流速1.5mL/min，自動分部收集儀每6min收集一管。逐管檢測A雄m(蛋白質(zhì)吸收峰)、A譜(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，濃縮，備用。取一定量的SephadexG100凝膠，置于燒杯中，加入足量的蒸餾水浸泡，在IO(TC水浴中溶脹5小時，取出冷卻后，于室溫放置24小對繼續(xù)溶脹。溶脹結(jié)束后，傾去表面的懸浮物，超聲波脫氣，即可裝柱。實驗采用的是聚四氟乙烯的專用層析柱，在柱中加蒸餾水至^定髙度，通過漏斗從柱的頂部將溶脹的凝膠加入柱屮，同時柱的底部放水，邊加邊敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝膠界面始終處在水面以下。裝柱完成后，先用蒸餾水平衡一天，最后用洗脫液平衡，甲衡時流速小于洗脫流速。實施例二將粗老茶葉經(jīng)6(TC干燥、一4(TC冷凍等預處理后，氣流式超微粉碎對茶葉進行處理，稱取40目茶粉50g，微波輔助溶劑萃取，微波時間75秒，微波強度100y。，固液比l:15，雙層濾布過濾，①濾渣甩熱蒸餾水洗滌，合并濾液與洗滌液，得到提取液I;②濾渣用熱蒸餾水洗滌，濾渣加pH4.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，力口一定量酶，水浴加熱水解，調(diào)pH值至中性抑酶，雙層濾布過濾，濾渣用熱蒸餾水洗滌，合并濾液與洗滌液，得提取液II。將提取液I和II分別離心，真空濃縮至一定體積，加入無水乙醇，低溫過夜醇沉，將乙醇沉淀液離心分離，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌兩次，得茶葉粗多糖I(水提)和II(酶提)。將制備的初步純化茶多糖溶解于蒸餾水中(或肯.接用不經(jīng)千燥的提取液)。過SephadexG100凝膠柱(2.6x70cm)。用10ml進樣器逐滴將樣液加入柱中，以0.1mol/LNaCl洗脫，流速1.5mL/min，自動分部收集儀每6min收集一管。逐管檢測A28(U蛋白質(zhì)吸收峰)、A62o(多糖的蒽酮硫酸衍生物的吸收峰)。收集含糖部分，濃縮，備用。取一定量的SephadexG100凝膠，置于燒杯中，加入足量的蒸餾水浸泡，在IO(TC水浴中溶脹6小時，取出冷卻后，于室溫放置24小時繼續(xù)溶脹。溶脹結(jié)束后，傾去表面的懸浮物，超聲波脫氣，即可裝柱。實驗采用的是聚四氟乙烯的專用層析柱，在柱中加蒸餾水至一定高度，通過漏斗從柱的頂部將溶脹的凝膠加入柱中，同時柱的底部放水，邊加邊敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝膠界面始終處在水面以下。裝柱完成后，先用蒸餾水平衡一天，最后用洗脫液平衡，平衡時流速小于洗脫流速。權(quán)利要求1、一種茶多糖的分離純化制備方法，其特征在于按下述方法制備(1)原料以粗老茶葉、低檔茶葉或提取茶多酚后的茶葉廢渣為原料；(2)高壓氣流破碎將原料經(jīng)50—60℃干燥、—40℃冷凍等預處理后，氣流式超微粉碎對原料進行處理，其主要是通過氣流的沖擊、剪切、碰撞和摩擦對物料進行粉碎，要求氣源壓力為5MPa，粉碎壓力為3—5MPa，從而使原料等活性成分的溶出量提高、粉體粒度減小，以改善原料中茶多糖提取過程中得率低等問題；(3)過篩高壓氣流破碎后的原料進行分級過篩40—80目；(4)微波輔助溶劑萃取采用微波提取主要使原料細胞內(nèi)溫度迅速上升，細胞內(nèi)液水份汽化產(chǎn)生的壓力使細胞膜和細胞壁急劇破碎，形成微小的孔洞，使可溶性物質(zhì)快速溶出，微波輔助溶劑萃取最佳工藝條件為微波時間75秒，微波強度100％，固液比115；(5)真空酶提采用纖維素酶，耐溫α-淀粉酶，為保持茶多糖的活性，采用真空低溫水提、酶提二次結(jié)合法提取茶多糖，第一次在50℃、固液比1:15、水提取30min，茶多糖提取率為2.33％，粗茶多糖的提取率為6.82％，以干重計，過濾后，濾渣用pH4.6的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液加纖維素酶提取，酶提最佳工藝參數(shù)為55℃、固液比1:14、酶用量2.2μL/g茶葉，120min；(6)徑向高效色譜分離茶多糖的凝膠柱純化將制備的初步純化茶多糖溶解于蒸餾水中，過SephadexG100凝膠柱，用10ml進樣器逐滴將樣液加入柱中，以0.1mol/LNaCl洗脫，流速1.5mL/min，自動分部收集儀每6min收集一管，逐管檢測、A620，收集含糖部分，濃縮，備用，SephadexG100凝膠濕法裝柱取一定量的SephadexG100凝膠，置于燒杯中，加入足量的蒸餾水浸泡，在100℃水浴中溶脹5到6小時，取出冷卻后，于室溫放置24小時繼續(xù)溶脹，溶脹結(jié)束后，傾去表面的懸浮物，超聲波脫氣，即可裝柱，本專利采用的是聚四氟乙烯的專用層析柱，在柱中加蒸餾水至一定高度，通過漏斗從柱的頂部將溶脹的凝膠加入柱中，同時柱的底部放水，邊加邊敲打柱身，直至填柱完成，注意要保持凝膠界面始終處在水面以下，裝柱完成后，先用蒸餾水平衡一天，最后用洗脫液平衡，平衡時流速小于洗脫流速。HPLC鑒定純度及其色譜條件的摸索HPLC分析時，采用手動進樣，每次進樣量為20μL，洗脫流速為0.5mL/min。樣品溶液和洗脫液分別用0.80μm和0.45μm的濾膜過濾；(7)超濾選用中空纖維材料，工作壓力為28psi，料液溫度為29℃，料液pH為6.7，超濾處理40min，膜的滲透通量達最佳值為9.98LHM；(8)冷凍干燥冷凍干燥條件，-80℃預凍8hr后，-80℃真空冷凍干燥6小時。2、如權(quán)利要求1所述的茶多糖的分離純化制備方法，其特征是所得妾lj的茶多糖，采用分光光度計法計算茶多糖抑制a—淀粉酶的活性比初步純化的茶多糖的活性高出367.86%,從a—淀粉酶的抑制率來看，500mgTGC的抑制率高達97.2%。全文摘要一種茶多糖的分離純化制備方法及降血糖活性，其工藝步驟是原料→高壓氣流破碎→過篩→微波輔助溶劑萃取→過濾→真空酶提→過濾→濾液(濾渣重復提取的濾液合并)→離心→徑向高效色譜分離→超濾→真空濃縮→冷凍干燥→茶多糖，本發(fā)明的技術(shù)效果是提高了茶多糖含量及降血糖活性，縮短提取時間、減少能耗、有效保存茶葉多糖生物活性。文檔編號C08B37/00GK101497906SQ20081010696公開日2009年8月5日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者偉劉,聶少平,謝建華,謝明勇申請人:南昌大學