專利名稱：一種用于降解纖維素的反膠束方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物能源技術(shù)開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化的領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種用于降解纖維素的反膠束方法。該方法將反膠束應(yīng)用于纖維素酶催化水解纖維素這一具有重要應(yīng)用前景的生物酶催化反應(yīng)，產(chǎn)品葡萄糖則進一步加工為飼料、食糧、化學(xué)原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等產(chǎn)品，從而開發(fā)出廢棄纖維素的生物降解無污染新工藝，實現(xiàn)纖維素類生物質(zhì)(如農(nóng)作物秸稈等)的綜合利用。該方法有效地克服傳統(tǒng)酶水解法的缺陷，使得纖維素降解效率極大提高。
背景技術(shù)：
反膠束是表面活性劑在非極性有機溶劑為本體的溶液中的聚集體，具有極性的內(nèi)腔和非極性的外殼。反膠束的一個重要性質(zhì)是能增溶一定量的水分子(稱為核心水團或“水池”)，水溶性的酶分子又可增溶在反膠束的“水池”中。由于反膠束中的“水池”為納米級空間，以此空間為反應(yīng)場可合成1～100nm的納米材料，因此又將其稱為納米反應(yīng)器。固定在反膠束中的酶學(xué)研究為介質(zhì)工程帶來了新的革命。利用反膠束包覆可使酶溶解在極性“水池”中，而一些水不溶性化合物，如膽固醇、生物堿、脂類等則溶解在非極性有機溶劑中，作為酶催化的底物進行了轉(zhuǎn)化。利用酶作用的專一性，還可能實現(xiàn)生物催化的手性合成。反膠束體系作為酶反應(yīng)介質(zhì)，具有組成靈活、熱力學(xué)穩(wěn)定、界面積大、可通過相調(diào)節(jié)來實現(xiàn)產(chǎn)物回收等優(yōu)點，因此近年來受到人們的普遍關(guān)注。其中研究最多的是肽的合成和脂肪酶的催化反應(yīng)。如Xing等研究了AOT/正辛烷的反膠束體系中α2胰凝乳蛋白酶催化合成肽衍生物的反應(yīng)，得到56％～88％的產(chǎn)率；Tsai等研究了AOT/異辛烷/磷酸緩沖液中脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)時表面活性劑濃度對CabdidaRngosa脂肪酶(CRL)水解活力的影響；Chen等在反膠束體系中用不同的蛋白酶合成了二肽。隨著研究的不斷深入，在反膠束體系中進行酶的催化合成反應(yīng)不僅僅是在理論方面，而且在應(yīng)用開發(fā)上同樣具有廣闊的前景。
納米反應(yīng)器中的酶分子往往表現(xiàn)出超活性。從結(jié)構(gòu)上說，反膠束十分類似于生物膜的脂雙層結(jié)構(gòu)，當(dāng)使用疏水性底物(如纖維素)時，人們能研究底物分子分配在納米反應(yīng)器和有機相中的酶促反應(yīng)動力學(xué)，同時由于反膠束的巨大比表面和它的極性內(nèi)腔與非極性外殼間的超短距離，且反膠束微粒間的碰撞頻率極高，其間的傳質(zhì)速率極快，為酶與底物的作用提供了最佳的微環(huán)境，因而可有效提高纖維素酶的催化效率和末端產(chǎn)物葡萄糖的收率。最近反膠束技術(shù)已被成功地應(yīng)用于研究二氫葉酸還原酶、鈣離子-ATP酶、β-乳酸酶和葡萄糖氧化酶等。
纖維素是地球上最豐富的可再生性自然資源，木質(zhì)纖維材料生物量的全利用無疑將是新的千年中對人類最為重要的生物技術(shù)之一。人類對纖維素的利用，迄今為止主要限于將木材直接作為建筑材料或加工成紙、纖維等，其廢棄物則作為堆肥或幾乎用焚燒處理。美國化學(xué)會認(rèn)為，將來能代替石油的唯一的化學(xué)原料就是每年超過2億噸的廢棄纖維素。同時由于我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)廢棄纖維素(如稻草、麥稈等)的年產(chǎn)量非常巨大，因此積極開展纖維素生物降解的研究對緩解人類的糧食和能源危機、加速我國天然資源再生利用的發(fā)展具有重大意義，同時在環(huán)境污染的防治和良性生態(tài)系統(tǒng)的建立上也會發(fā)揮重要作用。
將纖維素分解為葡萄糖的手段有酸水解法和傳統(tǒng)酶水解法。酸水解法需高溫、高酸條件和耐酸耐壓容器，葡萄糖的收率雖可達50％，但嚴(yán)重污染環(huán)境，所以現(xiàn)在已被棄用。傳統(tǒng)酶水解法則克服了酸水解法的許多不足。天然纖維素在水溶液中由纖維素酶系(包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)催化水解為葡萄糖的機理，目前尚不十分清楚，但一般認(rèn)為首先由前兩者將纖維素催化分解為纖維二糖等低聚糖，然后由β-葡萄糖苷酶將這些低聚糖水解為葡萄糖。雖然纖維素的酶水解法已進行了不少頗有成效的研究，但將纖維素以工業(yè)規(guī)模轉(zhuǎn)換成葡萄糖的無污染新工藝尚末實現(xiàn)，這主要是由于天然纖維素為疏水性底物，在水溶液中的溶解度較差而造成傳統(tǒng)酶水解法中葡萄糖的收率尚不足50％。
在中國專利網(wǎng)中，涉及反膠束的專利較少，共有10項，其中有8項是以制備納米級化學(xué)物質(zhì)為內(nèi)容的。涉及纖維素生物降解的專利共47項，但這些專利無一涉及本項目——反膠束體系中纖維素高效降解的新方法。我國專利CN02289267“纖維素固相酶解——液體發(fā)酵耦合制備乙醇的裝置”，該裝置可降低酶解液中糖類對纖維素的抑制作用，從而有利于工業(yè)生產(chǎn)乙醇；我國專利CN97125800“從堿金屬的硅酸鹽制備納米二氧化硅顆粒的方法”，涉及到在反膠束中制備納米二氧化硅顆粒的新方法。國外涉及反膠束的專利有200多項，主要集中化學(xué)物質(zhì)的制備合成，生物分子的萃取分離，以及不同類型反膠束體系的制備，也有一些是對反膠束中化學(xué)反應(yīng)的方法研究。美國專利US 2004009117“Preparation of nanosizedcopper(I)compounds”，涉及反膠束中制備納米級銅化合物顆粒的新方法。美國專利03190471名稱是“Nanoparticle manganese zinc ferrites synthesized using reverse micelles”，報道了一種在反膠束中制備鐵酸鋅錳納米級顆粒的新方法。世界專利WO03051333名稱是“Reverse-micellar delivery system for controlledtransportation and enhanced absorption of agents”，該專利涉及利用反膠束體系作為一種跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，從而提高腸吸收功能。目前反膠束系統(tǒng)中大分子物質(zhì)的降解仍屬于空白領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種用于降解纖維素的反膠束方法，該方法簡單易行且操作方便，酶需求量少、使用方便高效。有利于纖維素酶解的反膠束環(huán)境，提高了纖維素的降解效率和產(chǎn)品獲得率，且反應(yīng)效率高，生產(chǎn)過程安全、降解成本低廉。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明設(shè)計的反膠束系統(tǒng)能夠在包含的“水池”(即反膠束體系的核心水團，為反膠束增溶的一定量水分子所形成)中加入纖維素酶(一種多組分的復(fù)合酶，主要有3種組分即內(nèi)切型β-葡聚糖酶，外切型β-葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)，在體系中加入纖維素。纖維素酶在保持甚至增強活性的基礎(chǔ)上與纖維素結(jié)合并進行降解，釋放產(chǎn)物葡萄糖。產(chǎn)物溶于“水池”中，可以通過萃取的方法從體系中得到分散液，而后從中分離得到。利用本發(fā)明提供反膠束體系來進行纖維素的酶解，能在短時間(10分鐘～24小時)內(nèi)大量降解纖維素并獲取產(chǎn)物葡萄糖，相對傳統(tǒng)的酸水解或水溶液體系中的酶解等模式更加方便、高效。
本發(fā)明設(shè)計的反膠束體系是由表面活性劑(如Triton X-100、AOT等)溶解在有機溶劑(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)中自發(fā)形成的、熱力學(xué)穩(wěn)定的、光學(xué)透明的球形聚集體(如圖1所示)。其特點在于反膠束有一個由表面活性劑分子(如Triton X-100、AOT等)的烴鏈組成的外殼，疏水尾指向有機溶劑(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)，極性頭指向聚集體內(nèi)部形成極性腔。水分子在極性腔中形成納米尺寸的水池。
本發(fā)明設(shè)計中的磷酸緩沖液，為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液或磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液。
本發(fā)明提供了一種降解纖維素的反膠束方法，它含有下列步驟A、室溫下(20～25℃)，配置pH5.2～6.4的含有纖維素酶的緩沖溶液(A)，其中纖維素酶的濃度為30～900μM；B、配備含有表面活性劑的有機溶液(B)，其中表面活性劑的濃度為0.01～0.20M；表面活性劑為聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)或2-乙基己基琥珀酸鈉(AOT)；有機溶劑是二甲苯或正己醇或異辛烷；C、將適量溶液A和溶液B均勻混合，使得纖維素酶分子在混合液中的濃度為0.15～4.5μM，纖維素酶分子被包含于形成的反膠束體系的水池中，形成溶液C；D、靜置15～25秒，待溶液C形成均一穩(wěn)定的透明體系后，按0.9～10g/l的比例向其中加入微晶纖維素。所述微晶纖維素在30～60℃反應(yīng)10分鐘～24小時后被充分降解；E、加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液及與溶液C等體積的萃取劑(氯仿)，劇烈振蕩后以3000～4000rpm的轉(zhuǎn)速高速離心5～10分鐘，使溶液分層。取出上層溶液，即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。
從結(jié)構(gòu)上說，反膠束十分類似于生物膜的脂雙層，同時由于反膠束的巨大比表面和它的極性內(nèi)腔與非極性外殼間的超短距離，而且反膠束微粒間的碰撞頻率極高，其間的傳質(zhì)速率極快，這為酶與底物的作用提供了最佳的微環(huán)境，因而可有效提高纖維素酶的催化效率和纖維素降解并能源化的效率。該方法將反膠束應(yīng)用于纖維素酶催化水解纖維素這一具有重要應(yīng)用前景的生物酶催化反應(yīng)，產(chǎn)品葡萄糖則進一步加工為飼料、食糧、化學(xué)原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等產(chǎn)品，從而開發(fā)出廢棄纖維素的生物降解無污染新工藝，實現(xiàn)纖維素類生物質(zhì)(如農(nóng)作物秸稈等)的綜合利用。該方法生產(chǎn)過程設(shè)備簡單，具有良好的工業(yè)前景。圖2的實驗結(jié)果說明，與在相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比，反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進行的纖維素酶解效率得到了顯著的提高，產(chǎn)物葡萄糖溶液的濃度提高了30多倍。實驗證明，本發(fā)明可有效地克服傳統(tǒng)酶水解法的缺陷，使得纖維素降解效率極大提高。此外，該方法中使用的反膠束體系各有機組分可以通過精餾回收技術(shù)重復(fù)使用，從而減少環(huán)境污染，并進一步降低了成本。


圖1為反膠束體系結(jié)構(gòu)示意圖。圖中A為水分子在反膠束極性內(nèi)腔中形成的納米尺寸的水池；B為有機相(如二甲苯或正己醇或異辛烷等)；C為單個表面活性劑分子(如Triton X-100、AOT等)；圖2為Triton X-100和AOT兩種反膠束體系以及水溶液中纖維素酶解后產(chǎn)物葡萄糖溶液的濃度比較，圖中“T”型標(biāo)識為誤差。由圖2可見，與在相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比，反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進行的纖維素酶解效率得到了顯著的提高。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，通常按照常規(guī)條件如趙永芳主編，武漢大學(xué)出版社，2002，生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用(第三版)；周科衍、高占先主編，高等教育出版社，1997，有機化學(xué)實驗(第三版)；陳毓荃，科學(xué)出版社，2002，生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)。
實施例1利用表面活性劑AOT形成的反膠束降解微晶纖維素的方法1.室溫下(25℃)，配制1ml pH6.0的纖維素酶緩沖溶液(緩沖液的配制方案參看生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用)，濃度為380μM，記為溶液A；2.取0.15mmol 2-乙基己基琥珀酸鈉(AOT)溶于3ml異辛烷，劇烈振蕩后靜置備用，記為溶液B；3.從溶液A中取14μl與溶液B混合，劇烈振蕩后靜置20秒，待其均一透明后，即為包含有纖維素酶分子的反膠束體系；4.將上述體系在50℃條件下保溫10分鐘后加入10mg微晶纖維素，在恒溫搖床中充分反應(yīng)10分鐘(50℃，220rpm)；5.此后加入140μl磷酸緩沖液和3ml氯仿，劇烈振蕩后以3000rpm的轉(zhuǎn)速高速離心5分鐘，使溶液分層。上層無色透明，為產(chǎn)物葡萄糖溶液(本步為萃取操作，參看生物化學(xué)實驗方法和技術(shù))；6.用硫酸蒽酮法(參看生物化學(xué)實驗方法和技術(shù))測定產(chǎn)物葡萄糖的分解液，得到產(chǎn)物溶液中的葡萄糖含量，同時與相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比較，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在AOT反膠束體系中進行的纖維素酶解效率要大大高于水溶液中進行的酶解反應(yīng)效率。詳細數(shù)據(jù)如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)

實施例2利用表面活性劑Triton X-100形成的反膠束降解微晶纖維素的方法1.室溫下(25℃)，配制1ml pH6.0的纖維素酶緩沖溶液(緩沖液的配制方案參看生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用)，濃度為400μM，記為溶液A；2.取0.15mmol聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)溶于1ml二甲苯中，再加入2ml正己醇，劇烈振蕩后靜置備用，記為溶液B；3.從溶液A中取18μl與溶液B混合，劇烈振蕩后靜置約15秒，待其均一透明后，即為包含有酶分子的反膠束體系；4.將體系在50℃條件下保溫10分鐘后加入10mg微晶纖維素，在恒溫搖床中充分反應(yīng)10分鐘(50℃，220rpm)；5.此后加入180μl磷酸緩沖液和3ml氯仿，劇烈振蕩后以3500rpm的轉(zhuǎn)速高速離心8分鐘，使溶液分層。上層無色透明，為產(chǎn)物葡萄糖溶液(本步為萃取操作，參看生物化學(xué)實驗方法和技術(shù))；6.用硫酸蒽酮法(參看生物化學(xué)實驗方法和技術(shù))測定產(chǎn)物葡萄糖的分解液，得到分解液中的葡萄糖含量，同時與相同條件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纖維素酶解的結(jié)果相比較，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在反膠束體系尤其是Triton X-100反膠束體系中進行的纖維素酶解效率要大大高于水溶液中進行的酶解反應(yīng)效率。詳細數(shù)據(jù)如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)

權(quán)利要求
1.一種用于降解纖維素的反膠束方法，其特征在于，它含有下列步驟A、室溫下，配制pH5.2～6.4含有纖維素酶的緩沖溶液(A)，其中纖維素酶的濃度為30～900μM；B、配備含有表面活性劑的有機溶液(B)，其中表面活性劑的濃度為0.01～0.20M；表面活性劑為聚氧乙烯烷基苯基醚或2-乙基己基琥珀酸鈉；有機溶劑是二甲苯或正己醇或異辛烷；C、將溶液A和溶液B均勻混合，使得纖維素酶分子在混合液中的濃度為0.15～4.5μM，纖維素酶分子被包含于形成的反膠束體系的水池中，形成溶液C；D、靜置15～25秒，待溶液C形成透明體系后，按0.9～10g/l的比例向其中加入微晶纖維素，所述微晶纖維素在30～60℃反應(yīng)1～24小時后被充分降解；E、加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液及與溶液C等體積的氯仿，振蕩后以3000～4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5～10分鐘，使溶液分層，取出上層溶液，即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于降解纖維素的反膠束方法，首先將纖維素酶溶解于緩沖液得到緩沖液A；其次配備含有表面活性劑的有機溶液B；第三是將溶液A與溶液B均勻混合，形成溶液C；第四是待溶液C形成均一透明體系后，加入微晶纖維素；第五是加入10倍于溶液A體積的磷酸緩沖液和與溶液C等體積的萃取劑，劇烈震蕩后離心使溶液分層，取出上層溶液即為降解產(chǎn)物葡萄糖溶液。本方法具有反應(yīng)效率高，生產(chǎn)過程安全、降解成本低的優(yōu)點，同時生產(chǎn)過程設(shè)備簡單，具有很好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。
文檔編號C08B15/00GK1696158SQ20051001894
公開日2005年11月16日 申請日期2005年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日
發(fā)明者梁毅, 陳楠, 范俊寶, 項瑾, 周拯, 陳杰 申請人:武漢大學(xué)