專利名稱：氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒pRC11、工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒PRC11、含有該質(zhì)粒的基因工程菌，以及該工程菌在微生物降解鹵代烴類污染物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌降解性質(zhì)粒在有機污染物微生物降解過程中起重要作用，它們編碼了一些降解過程中的關(guān)鍵酶類，賦予細(xì)菌分解代謝各種復(fù)雜有機化合物的能力。迄今已報道的鹵代烴降解性質(zhì)粒主要以氯代芳香族化合物降解性質(zhì)粒為多，如氯代苯甲酸降解質(zhì)粒1^025、 Pac27和Pwrl，以及2，4-二氯苯氧基乙酸降解質(zhì)粒？開4，pEML159和pRCIO等。國內(nèi)關(guān)于有機污染物降解性質(zhì)粒的研究工作開展得比較晚，在80年代末才陸續(xù)有一些報道。迄今尚沒有氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了提供一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒——pRCll、含有該質(zhì)粒的基因工程菌及其在微生物分解處理氯代有機污染物中的應(yīng)用。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒pRCll，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發(fā)明質(zhì)粒從實驗室自行建成的工業(yè)廢氣生物凈化微生物資源菌種庫中篩選獲得，命名為pRCll。本發(fā)明還涉及含有所述質(zhì)粒pRCll的基因工程菌。本發(fā)明還涉及所述基因工程菌在微生物降解鹵代烴污染物中的應(yīng)用。具體的，所述鹵代烴污染物優(yōu)選為下列之一 CH2C12、CH2BrCl、C2H4Cl2或C2H2C12。優(yōu)選的，所述降解在28 32°C、pH6. 8 7. 2下進行。本發(fā)明提供了一種鹵代脂肪烴降解性質(zhì)粒pRCll，并建立了質(zhì)粒的物理圖譜，對今后利用該質(zhì)粒進行分子育種，培育高效多功能質(zhì)粒菌，消除有關(guān)物質(zhì)的環(huán)境污染創(chuàng)造了條件。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)?！猵RCll，建立了質(zhì)粒的物理圖譜，該質(zhì)粒遺傳背景非常清晰，可利用該質(zhì)粒進行分子育種，培育高效多功能質(zhì)粒菌，提高以二氯甲烷為代表的鹵代烴類有機污染物的生物降解效果，大幅度提高有機廢氣的處理能力。


圖1為氯代脂肪烴降解性質(zhì)?！猵RCll電泳檢測圖譜；圖2為質(zhì)粒pRCll利用Bam HI、Eco RI、HindIII限制性酶切圖譜；圖3為pRCll和pJP4物理圖譜比較；
圖4陽性轉(zhuǎn)化子E. coli DH5 (dcm+)對不同鹵代烷烴的降解特性。 具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 質(zhì)粒pRCll的獲得及鑒定1)質(zhì)粒檢測(1) 3mL LB菌液培養(yǎng)過夜，7000轉(zhuǎn)/分4°C離心10分鐘；(2)重懸于1 mLTE緩沖液中(40mM Tris-乙酸，2mM EDTA，用冰乙酸調(diào)整pH值為 7. 9)；(3)加入 2mL 裂解液(3% SDS, 50mM Tris,加 1. 6mL2N NaOH 調(diào)整 pH 為 12. 6)裂解，輕搖混勻(4)在50 65°C的水浴中加熱20分鐘，然后加入2倍體積的氯仿；(5)輕輕振蕩乳化，離心破乳(6000轉(zhuǎn)/分，15分鐘，40°C )；(6)上清液直接進行電泳分析。用瓊脂糖凝膠電泳分析質(zhì)粒帶，條件如下瓊脂糖濃度0. 7%，電泳電壓80V，電泳緩沖液TBE，marker為λ DNA/HindIII，采用凝膠成像儀分析電泳結(jié)果(結(jié)果見圖1)。2)質(zhì)粒的提取采用堿法提取質(zhì)粒。(1)取過夜培養(yǎng)的菌液1. 5mL于微量離心管中，用微量離心以最大轉(zhuǎn)速Vmax離心 3 4s，棄上清，用吸水紙吸干。(2)菌體中加入堿裂解液I 100 μ L，劇烈振蕩充分懸浮菌體。(3)加入200 μ L新鮮配置的堿裂解液II，快速柔和顛倒數(shù)次，以混合內(nèi)容物。(4)加入經(jīng)冰預(yù)冷的堿裂解液III 150 μ L,置于冰上5min。(5) Vmax離心5min，取上清，轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，重復(fù)該步驟一次。(6)加入等體積的酚氯仿(1 1)，劇烈振蕩。(7)Vmax離心2min，用移液槍吸出上清，注意中間層蛋白不要吸出來。(8)加入2倍體積無水乙醇(約ImL)，室溫放置2min，Vmax離心5min，棄上清。(9)加入ImL 75%乙醇，將微量離心管顛倒數(shù)次，Vmax離心2min，棄上清，用吸水紙洗干，不夠干可以離心后用移液槍吸去余液，室溫放置2 3min，直至試管內(nèi)沒有可見的液體存在。(10)加入30 μ L含有去DNA酶的RNA酶Μ20 μ g/mL)的超純水或TE溶液重新溶解核酸，貯存于_20°C。溶液I :50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，IOmM EDTA (ρΗ8· 0)；溶液II IOM NaOH 60 μ L, 10% SDS 300 μ L, dd H2O 2640 μ L 總體積 3000 μ L 或 IOM NaOH 20 μ L，10% S DS 100 μ L, dd H2O 880uL 總體積 1000 μ L ；溶液III :3M NaAc (ρΗ4· 8)無水 NaAc 26. 4g 用 70mL ddH20 溶解，用約 20mL 冰乙酸調(diào)pH至4. 8，定容至100mL。3)質(zhì)粒的消除采用丫啶橙消除法。
挑單菌落于3mL LB培養(yǎng)基(含氨芐50yg/mL)中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，然后取 200 μ L菌液，接入5mL LB培養(yǎng)基(含丫啶橙75mg/L)，30°C搖床培養(yǎng)M小時，然后稀釋后， 涂布至以下四個平板①LB平板；②LB平板(含氨芐50yg/mL)；③LB平板(含硝基苯 100mg/L)；④LB平板(含氨芐50 μ g/mL和硝基苯100mg/L)，培養(yǎng)2_3天，檢查菌落在平板上的生長情況。4)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備用接種環(huán)挑取甘油保存的DH5 α菌種在LB瓊脂平板上劃線培養(yǎng)。取瓊脂平板上一個單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，至0D_ = 0.3 0.4時，將培養(yǎng)管冷卻至0 4°C。取若干滅菌的1.5mL離心管，各加入200 μ L菌液。再各加入過濾除菌的4mol/L CaCl25yL，加上蓋，輕彈管底使混勻。即制得感受態(tài)菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在感受態(tài)細(xì)胞中加入5 μ L質(zhì)粒溶液(DNA ^ IOng)，輕彈離心管底部， 使質(zhì)粒與細(xì)菌混勻。0 4°C冰浴中靜置30min。在42°C水浴中，安靜放置90 120s。冰浴1 aiiin。37°C，振蕩培養(yǎng)45min。將離心管中全部菌液，鋪到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板上。在37°C溫箱中，倒置培養(yǎng)過夜。菌落計數(shù)、擴增、鑒定。陽性轉(zhuǎn)化子E. coli DH5 (dcm+)能在16mmol/L的無機鹽匪培養(yǎng)基中生長良好，而質(zhì)粒消除后的E. coli DH5(dcm_)又不能以DCM為碳源生長。E. coli DH5陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng) 72h的二氯甲烷生物降解效率見表1。表1 大腸桿菌E. coli DH5陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)72h的二氯甲烷生物降解效率
權(quán)利要求
1.一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒pRCll，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述質(zhì)粒pRCll的基因工程菌。
3.如權(quán)利要求2所述基因工程菌在微生物降解鹵代烴污染物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述鹵代烴污染物為下列之一CH2C12、 CH2BrCl、C2H4Cl2 或 C2H2Cl2。
5.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解在28 32°C、pH6.8 7. 2下進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)粒pRC11，其物理圖譜見圖3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，本發(fā)明質(zhì)粒從實驗室自行建成的工業(yè)廢氣生物凈化微生物資源菌種庫中篩選獲得。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供一種氯代脂肪烴降解性質(zhì)?！猵RC11，建立了質(zhì)粒的物理圖譜，該質(zhì)粒遺傳背景非常清晰，可利用該質(zhì)粒進行分子育種，培育高效多功能質(zhì)粒菌，提高以二氯甲烷為代表的鹵代烴類有機污染物的生物降解效果，大幅度提高有機廢氣的處理能力。
文檔編號B01D53/84GK102321659SQ20111025261
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者吳石金, 王艷, 邱樂泉, 鐘衛(wèi)鴻, 陳建孟 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)