專利名稱:克隆限制修飾系統(tǒng)的方法
本發(fā)明是有關(guān)克隆限制修飾系統(tǒng)的方法，由此產(chǎn)生的克隆，和用克隆生產(chǎn)限制酶和(或)修飾酶的方法。具體講是有關(guān)DdeⅠ和BamHⅠ限制性核酸內(nèi)切酶和修飾性甲基化酶的克隆以及這些克隆和酶的生產(chǎn)方法。
限制性核酸內(nèi)切酶是天然存在于細菌中的一類酶，細菌中含有此酶的成分經(jīng)分離提純可在實驗室中用于裂解DNA分子成為DNA片斷。此類酶的這種性質(zhì)便于DNA分子的鑒定和基因成分的分部分離。已經(jīng)證明限制性內(nèi)切酶是現(xiàn)代遺傳學(xué)研究所不可缺少的工具，在遺傳工程和遺傳分析中被譽為生物化學(xué)的“剪刀”。
限制性核酸內(nèi)切酶能夠識別DNA分子并結(jié)合在專一的核苷酸序列(“識別序列”)上。限制性核酸內(nèi)切酶一旦與DNA結(jié)合上，就能在專一序列的內(nèi)部或端部進行切割。不同的限制性核酸內(nèi)切酶對不同的識別序列親和性也不同。目前從數(shù)百種細菌中已鑒定出有將近一百種不同的限制性核酸內(nèi)切酶。
在每一種細菌中往往只含有極少量的限制性核酸內(nèi)切酶。這類酶多根據(jù)來源菌的名稱命名。比如埃及噬血菌(Haemophilus aeqyptius)所合成的三種不同的限制性核酸內(nèi)切酶分別命名為HaeⅠ，HaeⅡ和HaeⅢ。這三種酶的識別序列及切點分別為(AT)GGCC(AT)，Pu GCGCPy和GGCC。再例如大腸桿菌RY(Escherichia coli RY13)只合成一種限制性核酸內(nèi)切酶，定名為EcoRⅠ，其識別序列為GAATTC。
事實上，限制性核酸內(nèi)切酶對細菌細胞的生長具有保護作用，它可使細菌抵御外源DNA分子的入侵，如病毒和質(zhì)粒DNA，這種外源DNA可破壞或寄生于細菌細胞。限制性核酸內(nèi)切酶可沿外源DNA分子掃描，每發(fā)現(xiàn)一個識別序列就進行切割，從而使細菌對外源DNA具有抗性。切斷了的外源DNA不能成為入侵基團并且對非專一性核酸內(nèi)切酶的進一步降解作用更加敏感。
細菌保護系統(tǒng)的另一成分是修飾性甲基化酶。這類酶與限制性核酸內(nèi)切酶在功能上互補能夠識別和區(qū)分內(nèi)外源DNA。修飾性甲基化酶在DNA上的識別及結(jié)合序列與相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶相同，但不打斷DNA。此酶只在識別序列內(nèi)某一個或另一個核苷酸殘基上進行化學(xué)修飾即加上一個甲基基團。甲基化后的識別序列不再被限制性核酸內(nèi)切酶結(jié)合或切斷。細菌細胞的DNA在甲基化酶的作用下充分甲基化，因而細菌DNA對內(nèi)源性限制性核酸內(nèi)切酶的存在絲毫不敏感，只有未被甲基化的，外源性的DNA才易被限制性核酸內(nèi)切酶所識別和攻擊。
隨著遺傳工程技術(shù)的發(fā)展，目前有可能用克隆基因的方法來生產(chǎn)蛋白質(zhì)和酶，比起常規(guī)提純的方法其基因的編碼量要大得多。分離限制性核酸內(nèi)切酶克隆的關(guān)鍵是找到一種簡單可靠的方法在復(fù)雜的“庫”中鑒別出這種克隆。即在克隆頻率為10-4到10-3用“鳥槍法”誘導(dǎo)克隆的程序。較優(yōu)選的方法是能使大量不需要的克隆被破壞掉，而少量理想中的克隆被保留下來。
Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)越來越快地被克隆。首先克隆的系統(tǒng)是用細菌噬菌體感染作為選擇性分離限制性核酸內(nèi)切酶克隆手段(Pst I Walder et al.，Proc.Nat.Acad.Sci，74 1503-1507(1981)，Hha I IMann et al.Gene 397-112(1981))。由于限制修飾系統(tǒng)的存在使得細菌能夠抵御細菌噬菌體的感染。被噬菌體感染的存活細胞原則上能選擇性地分離出攜帶限制修飾系統(tǒng)基因克隆細胞。這種方法已經(jīng)建立但有很大的局限性，特別是用這種方法克隆的限制修飾基因不能持久地為經(jīng)選擇存活下來的細胞提供極顯著的噬菌體抗性。另一種克隆方法是轉(zhuǎn)移系統(tǒng)本身具有負載質(zhì)粒進入E.coli后形成克隆質(zhì)粒的特性(Eco RV Bougueleret et al.，Nucl.Acid.Res.1293659-3676 1984;PacR7，Gingeras and Brooks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80402-406 1983，Theriault and Roy，1982;RvuⅡ，Blumenthal et al;J，Bacteriol，164501-509 1985.)。最終為了選擇一個具有活性的甲基化酶基因，目前正在克隆著若干個系統(tǒng)(Bsu RI，Kiss et al.，Nucl.Acid.Res.136403-6421 1986;Taq I);由于這兩個基因經(jīng)常是緊密連鎖，所以兩個基因可同時被克隆。然而篩選的甲基化酶常不能帶有完整的限制性系統(tǒng)(Bsp RI，Szomolanyi et al.，Gene 10219-225 1980;MspI，Walder et al.J，Biol.Chem.2581235-1241 1983)。盡管試圖克隆與甲基化酶基因相鄰的較大區(qū)段也未能產(chǎn)生出具有活性的核酸內(nèi)切酶基因。
在某些系統(tǒng)中克隆的難點在于導(dǎo)入宿主的核酸內(nèi)切酶基因不能靠被甲基化加以適當(dāng)?shù)谋Ｗo。如果甲基化酶基因和核酸內(nèi)切酶基因被引入一個普通DNA片段，則甲基化酶基因產(chǎn)物勢必會在核酸內(nèi)切酶基因產(chǎn)物裂解宿主基因組之前將宿主DNA加以修飾。
在Ecoli中克隆限制修飾酶系統(tǒng)的另一障礙是在克隆分支甲基化酶的過程中發(fā)現(xiàn)的。許多Ecoli菌株(包括通常用于克隆的菌株)具有阻止帶有甲基化胞苷的異源DNA導(dǎo)入宿主細胞的系統(tǒng)。(Raleigh and Wilson，submitted for publication)。因此有必要仔細考慮哪一種Ecoli菌株適于克隆。
因為提純的限制性核酸內(nèi)切酶和少量的修飾性甲基化酶對于在實驗室中描述DNA性質(zhì)及DNA重排仍是很有用的工具，所以找到一種能使菌株合成大量酶的方法則更具有商業(yè)性的刺激作用。由于這種菌株能簡化提純過程并同時能提供商業(yè)性產(chǎn)量，因而這種菌株將是非常有用的。
按照本發(fā)明，一種克隆限制修飾系統(tǒng)的方法包括將修飾基因?qū)肟寺≥d體并在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎斜磉_以及將限制基因?qū)牒行揎椈虻乃拗骷毎?br>本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)限制性酶和(或)與之相應(yīng)的修飾酶的方法，該方法是通過克隆編碼上述二類酶的基因并在高水平上排列待表達的基因進行的。更明確地說是提供了一種克隆這些酶的新方法，這樣生產(chǎn)的克隆以及生產(chǎn)這些酶本身的方法，首先是在合適的宿主內(nèi)克隆和表達甲基化酶基因，目的在于靠甲基化來適當(dāng)保護宿主;第二步，將核酸內(nèi)切酶內(nèi)切基因克隆并轉(zhuǎn)導(dǎo)到含有甲基化酶克隆的宿主中，載體上核酸內(nèi)切酶基因的表達水平低于甲基化酶基因的表達水平。
脫硫脫硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)和淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloiquefaciens)的DdeⅠ和BamHⅠ限制及修飾基因中該方法的應(yīng)用，以及所產(chǎn)生的克隆將分別進行詳細的描述，所產(chǎn)生的克隆構(gòu)成純化DdeⅠ和BamHⅠ限制及修飾酶的一套新的，極有用的克隆方法的基礎(chǔ)。
本發(fā)明將根據(jù)實施例加以說明，有關(guān)附圖如下圖1為帶質(zhì)粒的pDde 3.0a甲基化酶Tn5基因圖及DdeⅠ甲基化酶高表達克隆pDdeM 1.6的組建。
圖2為體內(nèi)M.DdeⅠ克隆保護性測定結(jié)果的說明。
圖3表明M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶。
圖4為DdeⅠ克隆的Southern雜交分析及限制性圖譜的說明。圖4A.是用3.0Kb HindⅢ插入pDdeM 3.0a中與基因組DNA探針的Southern雜交說明。圖4B是脫硫脫硫弧菌基因組內(nèi)含有DdeⅠ系統(tǒng)和衍生質(zhì)粒的限制性圖譜說明。
圖5是用處理的甲基化酶質(zhì)粒的Bam HⅠ酶切圖譜圖6是用BamHⅠ處理的帶核酸內(nèi)切酶基因的pDH2質(zhì)粒的BamH酶切圖譜。
圖7是Bam染色體的說明。
用兩步法克隆限制修飾系統(tǒng)以及收集由此產(chǎn)生的限制酶如下所述。此方法的優(yōu)點在于克隆和帶有克隆的宿主均含有修飾基因，如果克隆或宿主中存在相應(yīng)限制基因的識別序列，那么修飾基因就在該順序內(nèi)進行自身DNA的甲基化，同時對體外相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶的消化作用產(chǎn)生抗性。而后在含有這些克隆的宿主中引入限制性核酸內(nèi)切酶基因，從而只有那些被甲基化酶保護的宿主選擇性地存活下來。
第一步將所需限制基因相對應(yīng)的甲基化酶基因克隆并最好將誘導(dǎo)的高水平表達的甲基化酶組建。第二步將限制基因克隆到含有甲基化酶基因的宿主中，并根據(jù)核酸內(nèi)切酶活性加以篩選?？寺〉接邢鄳?yīng)甲基化酶基因保護的宿主細胞中的核酸內(nèi)切酶能夠表達。
雖然不能只局限于理論上的成立，但以往之所以不能克隆有活性的核酸內(nèi)切酶基因就是因為導(dǎo)入宿主內(nèi)帶有甲基化酶基因和核酸內(nèi)切酶基因的普通DNA片段不能使宿主細胞和克隆被充分的甲基化，相反卻使得宿主基因組被相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶所裂解。若首先引入甲基化酶基因并提尚其表達，同時使克隆到載體上的核酸內(nèi)切酶基因的表達水平低于甲基化酶基因的表達，那么上述問題就能被解決。
克隆和表達限制性基因優(yōu)選的方法包括如下步驟A.克隆甲基化酶基因。
1.用于克隆的細菌DNA要被純化。最近發(fā)現(xiàn)某些病毒內(nèi)也含有限制修飾系統(tǒng)，因而也可作為材料來源。
2.用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶將DNA部分消化或完全消化。
3.消化得到的DNA片段連接到克隆載體上，如pBR322，pUC8，9，18或19，pBR328或者一種含有其它末端連接的衍生載體，然后用帶有目的基因的載體去轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎鏓coli細胞。
4.將DNA與細胞的混合物涂布于抗生素選擇平板培養(yǎng)基上。經(jīng)培養(yǎng)將轉(zhuǎn)化的細胞菌落合并，懸浮并生長達到飽和從而形成初級的細胞庫。
5.重組質(zhì)粒從初級細胞庫中被大量純化形成初級質(zhì)粒庫。
6.在體外用所需甲基化酶基因相對應(yīng)的限制性酶對質(zhì)粒庫消化完全。在消化中加一些核酸外切酶和(或)磷酸酶可以增強對非甲基化酶基因克隆的破壞性。
7.消化過的DNA轉(zhuǎn)化Ecoli并且再次用抗生素選擇平板培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的克隆。其中一些菌落，即二級細胞群可以甲基化酶基因的存在為標(biāo)準(zhǔn)加以篩選和DNA分析。將其余的菌落一起刮下形成二級細胞庫，然后可制備二級質(zhì)粒庫。
8.二級質(zhì)粒庫再次用限制性核酸內(nèi)切酶(加或不加核酸外切酶和磷酸酶)消化來重復(fù)篩選，最終得到三級細胞個體、三級細胞庫和三級質(zhì)粒庫。
9.每次限制性核酸內(nèi)切酶的消化都能選擇性地破壞非甲基化酶的克隆，使得所需要的攜帶甲基化酶的克隆頻率相對增加。
10.二級和三級細胞群中存活下來的菌落以甲基化酶基因的存在與否進行挑選和分析。
11.甲基化酶的篩選可按下述四項加以驗證(a).克隆的重組質(zhì)粒DNA分子要被純化并在體外用有選擇的限制性核酸內(nèi)切酶作用以確定其對酶的消化作用具有抗性。如果載體質(zhì)粒有幾個核酸內(nèi)切酶位點，抗性就是修飾的結(jié)果而不是位點丟失的突變。
(b)最初用酶消化的重組質(zhì)粒是供體細菌DNA片斷，存在于克隆中的DNA片段應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)娜萘孔銐蚓幋a甲基化酶基因(例如大于500堿基對)，最重要的是為各種已形成的獨立的克隆所共用，其所有克隆必須具有同樣的一種片段或一些片段。
(c)克隆的全部染色體DNA或者是轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞內(nèi)的二級質(zhì)粒DNA以及生長在細胞中的噬菌體DNA可被純化和受到選擇性限制核酸內(nèi)切酶的作用。如果克隆攜帶了甲基化酶基因，那么細菌染色體、質(zhì)?；蚴删wDNA都應(yīng)能部分或全部地被甲基化并且對酶的消化作用表現(xiàn)出抗性。
(d)從克隆中抽取出細胞在體外檢測其甲基化酶活性(甲基化酶的保護作用和放射性標(biāo)記)。要經(jīng)常能看到專一性甲基化酶活性。
12.甲基化酶基因?qū)Π栈蛳佘占谆傅男再|(zhì)取決于適當(dāng)宿主內(nèi)所克隆的相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶基因。一系列宿主用于克隆甲基化酶基因，然后決定其甲基化的專一性。
B.核酸內(nèi)切酶基因的克隆1.因為核酸內(nèi)切酶與甲基化酶基因經(jīng)常是緊密連鎖的，所以基因組內(nèi)甲基化酶基因附近的區(qū)段已經(jīng)被定位，即以含有甲基化酶基因的克隆作為探針，和從同源蛋白質(zhì)中制取的限制性核酸內(nèi)切酶探針進行Southern雜交。甲基化酶克隆與細菌染色體在圖譜上產(chǎn)生的任何差異都可能標(biāo)志著有DNA的重排發(fā)生并且事實上也就表明有核酸內(nèi)切酶基因存在。
2.利用限制性內(nèi)切酶圖譜，將各種細菌的DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼冈俅蜗?。提純能雜交到探針上的適當(dāng)大小的片段，連接到克隆載體上，其核酸內(nèi)切酶的表達水平要相對低于甲基化酶。應(yīng)優(yōu)選那些帶有甲基化酶基因的克隆載體作為合適的載體。然后用克隆載體混合物轉(zhuǎn)化帶有甲基化酶質(zhì)粒的宿主細胞。盡管不是很理想，但只要核酸內(nèi)切酶基因的表達低或受啟動子的嚴(yán)格控制，核酸內(nèi)切酶就能轉(zhuǎn)導(dǎo)到帶有甲基化酶基因的克隆載體上。用克隆載體混合物同時轉(zhuǎn)化帶有和不帶有甲基化酶質(zhì)粒的宿主細胞。不論在什么情況下，DNA和細胞的混合物都可以靠抗生素培養(yǎng)基來篩選轉(zhuǎn)化細胞。
3.限制性核酸內(nèi)切酶的篩選可以三種方式進行(a)從克隆中抽取出細胞在體外檢測其對敏感DNA的消化能力應(yīng)具有限制性核酸內(nèi)切酶活性。
(b)在體內(nèi)檢測細胞自身抗噬菌體感染能力。對噬菌體侵染抗性證明有限制修飾系統(tǒng)存在。
(c)轉(zhuǎn)化的菌落還可以通過與限制性核酸內(nèi)切酶基因和(或)相鄰區(qū)段制成的寡聚核苷酸探針雜交來檢驗互補序列的存在。但所用探針不包括在甲基化酶基因探針內(nèi)。
含有DdeⅠ和BamHⅠ的限制和修飾基因的克隆已生產(chǎn)出來了，供體基因的DNA來源于脫硫脫硫弧菌(Desulforibrio desulfuricans)(DdeⅠ)(NCIB83120)和淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloiquefaciens H)BamHⅠ(樣品已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心-ATCC 53495)。
一個影響到限制和修飾基因克隆成敗的重要因素是用來作宿主的Ecoli菌株。許多細菌都有限制修飾系統(tǒng)，包括Ecoli。在Ecoli中最普通的系統(tǒng)是宿主專一性決定簇或“Hsd”系統(tǒng)，還有其它一些系統(tǒng)，象較重要的P1和EcoR系統(tǒng)(Roberts，R.J.，Nucl，Acids Res.12SR167-204(1984))。這些系統(tǒng)能干擾克隆的形成，因為它們可以破壞轉(zhuǎn)化進來的DNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子數(shù)量極低和沒有意義的庫。因此通常優(yōu)選的Ecoli菌株是限制系統(tǒng)因突變或缺失而失活的菌株，較好的菌株是這些系統(tǒng)均失活或缺陷，因而可以用來作一般克隆用途，其中包括HB101(hsd R M)ATCC 33694，RRI(hsd R-M-)ATCC 31343，K802(hsd R-M-)ATCC 33526，K803(hsd R-M-)ATCC 27065和MM294(hsd R-M-)ATCC 33625和ER1467(hsd R-M-)，其菌株樣品已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC 53496。
尤其是在外源限制和(或)修飾基因克隆到Ecoli中時有一個附加系統(tǒng)能干擾到克隆的成功。該系統(tǒng)還未搞清楚，將其歸于“Rgl”系統(tǒng)(Revel，H.R.，Bacteriophage T，pp.156-165 American Society of Microbiology(1983)和Revel et al.，Annual Review of Genetics 4177-192(1970))。最特殊的是EcoliRgl系統(tǒng)能限制帶有甲基化胞苷殘基的DNA分子，因此妨礙了自身己甲基化的克隆質(zhì)粒被分離。最近已證明Rgl系統(tǒng)是受叫做“mcr B”(Modified Cytosine restriction，Raleigh和Wilson，如上所述)位點的控制。因此，為了克隆甲基化酶基因，最好所用宿主Ecoli的Hsd(普遍性)系統(tǒng)和Rgl(專一性)系統(tǒng)均為缺陷型?，F(xiàn)已建成一種新的克隆菌株系列，此系列是利用Tn10插入因子使‘Mcr B’位點失活。一個用于克隆胞苷型甲基化酶基因的較好的菌株是ER1467。ER1467是從JC1552菌株中衍變而來的。在‘Mcr B’位點含有Tn 10插入序列(Bachman，Bacteriol.Rev.36525;1972)。然而并不是所有克隆到的甲基化酶基因都具有易感性，特別是與甲基化胞苷殘基的基因相比，甲基化腺苷殘基的甲基化酶基因絲毫不受Rgl系統(tǒng)的影響。
盡管不能局限于理論，但可以肯定Rgl系統(tǒng)由兩種成份組成，命名為“RglA”和“RglB”。在功能上RglB可限制許多含有DNAs的胞苷甲基化酶而Rg1A目前已知只能專一地限制一種克隆(HpaⅡ)。
要選擇一種宿主，其克隆的限制和(或)修飾基因不帶有限制修飾系統(tǒng)的特性，或者該宿主已知在胞苷上甲基化，這個優(yōu)選的宿主就是Ecoli三突變體，即Hsd、RglA和RglB系統(tǒng)均缺陷的菌株，其中還包括K802。用DdeⅠ優(yōu)選的宿主是ER1467，此菌株基因型為hst R-M-和RglA+B-。換句話說，如果修飾系統(tǒng)已知是腺苷甲基化類型的，則可忽略宿主內(nèi)Rgl活性。雖然Rgl系統(tǒng)不能干擾腺苷甲基化酶，但可作用于Ecoli中其它特性較弱的系統(tǒng)來影響腺苷的甲基化。因此，宿主的選擇取決于被克隆的修飾基因的性質(zhì)。表1簡要介紹幾種適合于克隆幾種修飾基因的Ecoli菌株。
下面將本發(fā)明用實施例加以說明并配有附例實施例1DdeⅠ限制性修飾基因的克隆A.甲基化酶基因的克隆及其活性特征1.提純DNA脫硫脫硫弧菌DNA的純化采用下述方法5克冰凍細胞重懸浮于20ml的25%蔗糖溶液，50mM Tris，PH8.0中;加入10ml 0.25M EDTA，PH8.0，并在0.25M Tris PH8.0中加入6.0ml的10mg/ml的溶菌酶，懸浮液在冰浴中放置2小時。2小時后，加入24ml裂解緩沖液(1% Triton x-100，50mM Tris，PH8.0，67mM EDTA)加上5ml 10% SDS混勻使細胞裂解。加入等體積的苯酚(用100mMtris.PH8.0平衡)振動使溶液乳化。加入70ml氯仿?lián)u10分鐘。然后在貝克曼離心機中離心30分鐘，速度為10K。上層含有DNA的水層轉(zhuǎn)移到干凈瓶中重新用苯酚和氯仿的混合液抽提兩次以上。
使水層在10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0中透析24小時，透析時換四次溶液。透析后的DNA溶液用0.1倍體積的DNA酶(10mg/ml)在37℃下處理1小時。加入5M Na Cl溶液，最終濃度為0.4M Na Cl并在上面加入一層2倍體積的乙醇。將DNA用玻璃棒攪拌起用70%的乙醇洗滌一次，然后溶解在15ml的10mM Tris，1mM EDTA，PH8.0中。DNA在-20℃下冰凍保存。從5克細胞中能回收1.5毫克純化DNA。
2.完全消化10μg提純的脫硫脫硫弧菌DNA用15單位的HindⅢ在100μl HindⅢ緩沖溶液體系中于37℃反應(yīng)1小時，經(jīng)培養(yǎng)建立脫硫脫硫弧菌DNA庫。(HindⅢ緩沖液10mM Tris，PH7.5;10mM Mg Cl2;50mM Na Cl;10mM β-巰基乙醇)。
3.連接
4μg消化過的DNA連接到2μg經(jīng)HindⅢ裂解并脫磷酸的pBR322(新英格蘭生物實驗室)上，100μl反應(yīng)液含有50mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl，10mM DTT，0.5mMATP和1000單位的T4DNA連接酶(新英格蘭生物實驗室)。連接反應(yīng)在16℃下持續(xù)進行4小時。樣品經(jīng)氯仿處理轉(zhuǎn)化到200μl的冰凍的感受態(tài)RRI細胞(溶在50mM Ca Cl2)中細胞在42℃下被“熱激”2分鐘，然后稀釋到5ml LB培養(yǎng)基中(L-Broth)并在37℃下生長達到飽和。
4.通過離心收集轉(zhuǎn)化細胞(4K，10分鐘，貝克曼離心機)，離心后將細胞重新懸浮在250μl的L-Broth中，涂布在含100μg/ml氨芐青霉素瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。用2.5ml 10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2緩沖液沖洗平板，混合細胞群中約有10-5轉(zhuǎn)化子從平板上洗脫下來。
5.混合物接種到500ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB中，37℃培養(yǎng)過夜。在37℃振蕩培養(yǎng)物過夜然后再收集細胞(4K，5分鐘)。室溫下再將細胞懸浮于10ml 25%蔗糖，50mM Tris，PH8.0中，加入5ml 0.25M EDTA，PH8.0和3ml 10μg/ml的溶菌酶。溶液在4℃下放置1小時;然后加入12ml裂解緩沖液使懸浮的細胞逐漸混勻。裂解后，裂解液在速度15K下離心1小時，上清液用濾布傾析。加入固體氯化銫(0.93g/ml)和溴化乙啶，終濃度為100μg/ml。將溶液裝入試管，平衡離心，使用貝克曼離心機Ti 70轉(zhuǎn)頭，在44，000rpm，17℃下超速離心48小時。被乙啶著色的DNA區(qū)帶用注射器抽提并將DNA沉淀在冷凍的乙醇中。轉(zhuǎn)速在12K離心20分鐘收集質(zhì)粒DNA。重新懸浮在1ml 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA的DNA用苯酚抽提一次，氯仿抽提一次，然后沉淀在2倍體積的乙醇中，干燥后重新懸浮于100μl 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA緩沖液中。
6.DdeⅠ降解
5μg的初級質(zhì)粒庫用80單位的DdeⅠ核酸內(nèi)切酶在總體積為100μl 10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2，10mMβ-巰基乙醇，100mM Na Cl溶液中反應(yīng)消化1小時。
7.轉(zhuǎn)化用10μl反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化200μl前面提到過的RRⅠ細胞。經(jīng)2分鐘熱處理，轉(zhuǎn)化的混合物馬上涂布在加有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)過夜。DdeⅠ處理過的與未處理的重組質(zhì)粒相比較收率為103。將菌落接種到10ml含有氨芐青霉素的L-Broth中，制備一個微量培養(yǎng)物并在含氨芐青霉素的LB平板上劃線。
8.微量提取過程每次培養(yǎng)的過程如下10ml過夜培養(yǎng)物經(jīng)6K rpm離心5分鐘后形成的小球重新懸浮到1ml 25mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，50mM葡萄糖和1mg/ml溶菌酶中，室溫下放置10分鐘。然后加2ml 0.2M NaOH，1%SDS溶液，在試管內(nèi)混勻，4℃下放置5分鐘;再加上1.5ml 3M醋酸鈉、PH4.8，混勻后在冰上培養(yǎng)5分鐘?；旌衔镌?5K rpm條件下離心10分鐘。上清液倒入裝有3.0ml的異丙醇的離心管中，室溫放置10分鐘后離心10分鐘，速度為15K rpm。沉淀物在室溫下空氣干燥后重懸浮在0.85ml10m M Tris，1mM EDTA，PH8.0中。加入75ml 5M Na Cl再使DNA室溫下在異丙醇中沉淀。在eppendorf離心機中離心1分鐘后，使沉淀物空氣干燥并重懸浮于50μl 10mM Tris，PH8.0，含有20μg/ml RNA酶的1mM EDTA中。
9.甲基化酶基因克隆質(zhì)粒的微量提取先用DdeⅠ降解，然后用HindⅢ消化進行分析。在存活下來的質(zhì)粒中有兩類對DdeⅠ核酸內(nèi)切酶降解具抗性的質(zhì)粒。這兩類質(zhì)粒在pBR322相反方向上攜帶有3.0Kb的HindⅢ片段而且后來證明這些質(zhì)粒帶有DdeⅠ修飾性甲基化酶基因。這兩類質(zhì)粒被稱做pDdeM3.0a和pDdeM 3.0b，所使用的標(biāo)準(zhǔn)命名法是Gingeras和Brooks等人建立的(PNAS(USA)80402(1985))。經(jīng)粗提過的這些克隆(參見下文B-5)沒有表現(xiàn)出任何DdeⅠ核酸內(nèi)切酶的活性。
甲基化酶基因在3.0Kb HindⅢ片段內(nèi)的位置是由一系列Tn5誘變實驗確定的(圖1A)(Berg.D.E.(1977)in DNA Insertions Elements，Plasmids，and Episomes，Bukhari，A.I.，Shapiro，J.A.and Adhya，S.L.Eds.，pp.205-212 Cold Spring Harbor Laboratoires，New York)。攜帶甲基化酶基因質(zhì)粒pDdeM3.0a或pDdeM3.0b的HB101(rec A)細胞在L-Broth中30℃培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)基還要加100μg/ml氨芐青霉素及0.2%的麥芽糖。將飽和的培養(yǎng)物以1∶100稀釋到加有氨芐青霉素和麥芽糖的5ml LB中繼續(xù)培養(yǎng)到細胞密度大約在109細胞/毫升為止。取1ml細胞培養(yǎng)液與帶有Tn5的細菌噬菌體(λ467∶∶Tn5 from N.kleckner via E.Raleigh)在m.o.i.＝0.1的條件下混勻。得到的混合物在30℃中培養(yǎng)2小時。將0.2ml的液體涂在含有50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)48小時。
用5ml 25mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，50mM葡萄糖將平板上的菌落洗脫下來。根據(jù)上述方法進行微量提取。(見8.微量提取)用微量提取物來轉(zhuǎn)化200μl的冷凍感受態(tài)細胞HB101(在50mM Ca Cl中)。細胞在42℃下熱激2分鐘，然后稀釋到1ml L-Broth中培養(yǎng)1小時，再將細胞涂布在含有50μg/ml卡那霉素，100μg/ml氨芐青霉素的L-Broth平板上。
用HindⅢ消化微量提取的質(zhì)粒DNA來篩選帶有Tn5質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。再用DdeⅠ核酸內(nèi)切酶作用微量提取的質(zhì)粒DNA來檢測帶Tn5質(zhì)粒中DdeⅠ甲基化酶的活性。
如圖1A所示，只有當(dāng)Tn5插入到ClaⅠ和HindⅢ位點中才能導(dǎo)致DdeⅠ甲基化酶活性的喪失，從而說明甲基化酶基因位于這兩個位點區(qū)間?？拷⒁粋€由ClaⅠ作用而有缺失的pDdeM0.3a，能建立一個具有甲基化酶活性的pDdeM1.6作為亞克隆，從而進一步確定整個甲基化酶基因位于1.6Kb區(qū)間內(nèi)(圖1B)。
用體內(nèi)保護性測定和體外3H-甲基摻入測定可比較三個M.DdeⅠ克隆的甲基化酶活性，步驟如下a.體外3H-甲基摻入測定(Gingeras and Brooks，見上)為了測定甲基化需制備下列三種混合物1.10X甲基化緩沖液1M Na Cl，0.5M Tris，PH7.5，0.1mM EDTA，H和50mMβ-巰基乙醇。
2.甲基化反應(yīng)混合物底物，由EcoRⅠ酶切變成線狀的pBR322制備方法如下pBR322與20倍的EcoRⅠ在100mM Na Cl，10mM Tris，PH7.5，10mM Mg Cl2中培養(yǎng)，pBR322最終濃度為20μg/ml。37℃培養(yǎng)1小時后，線型質(zhì)粒用苯酚抽提，乙醇沉淀，空氣干燥沉淀物。將DNA重新懸浮于10mM Tris，PH8.0，1m MEDTA中，最終濃度為1mg/ml線型質(zhì)粒。甲基化反應(yīng)混合物包括1μg(＝1μl線型pBR322，2.5μl 10X甲基化緩沖液，0.5μl3H-S-腺苷-甲硫氨酸和H2O，總體積20μl。
3.細胞提取物制備如下5ml被測克隆培養(yǎng)液在含100μg/ml氨芐青霉素的L-Broth中37℃培養(yǎng)過夜。達到飽和時以5K rpm離心10分鐘，使細胞成團狀。細胞團重懸浮于500μl超聲處理緩沖液中(10mM Tris，PH7.5，10mM β-巰基乙醇)?；旌弦褐性偌尤?5μl溶菌酶(10mg/ml)和50μl EDTA(100mM)。此樣品冰凍后再凍融，用超聲波處理進行一次10秒鐘的裂解，加入5μl1M Mg Cl2后，樣品在小離心管中離心5分鐘。
為了測定細胞提取物，將5μl提取液加到20μl甲基化反應(yīng)混合物中在37℃下培養(yǎng)30分鐘，然后將全部25μl反應(yīng)液用移液管轉(zhuǎn)移到1英寸見方的紙上。將紙空氣干燥，用10%三氯乙酸，(150ml)沖洗兩次，再用200ml異丙醇沖洗兩次。再次將紙空氣干燥，將紙浸泡在加有閃爍液(Omniflour，NEN)的試管中進行3H-甲基摻入計數(shù)以檢測樣品甲基化的水平。
b.體內(nèi)λ保護性測定含甲基化酶基因的質(zhì)粒pDdeM 3.0a、pDdeM 3.0b、pDdeM 1.6依前述轉(zhuǎn)化程序轉(zhuǎn)化到ER1467菌株中。在加有100μg/ml氨芐青霉素的L-Broth中使克隆生長達到飽和，以1∶100接種到含有氨芐青霉素的的10ml L-Broth中，當(dāng)細胞生長到對數(shù)期時離心5分鐘，轉(zhuǎn)速為5K rpm。離心得到的細胞團重懸浮于1ml噬菌體緩沖液中，其成分為10mM Tris，PH7.4，5mM Mg Cl2，0.2MNa Cl，0.1%的凝膠。然后再加入100μlλ噬菌體(1011噬菌體/ml)，混勻，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)后的混合液用9ml噬菌體緩沖液稀釋后再離心10分鐘，轉(zhuǎn)速5K rpm。離心產(chǎn)物重懸浮于10ml含有100μg/ml氨芐青霉素的L-Broth中37℃培養(yǎng)過夜。
噬菌體DNA按如下方法制備。裂解的細胞轉(zhuǎn)移到離心管中并加3滴氯仿，樣品在試管中混勻后在10K rpm速度下離心10分鐘。棄去沉淀物。將上清液加上等體積的苯酚抽提，混勻后放入離心機離心5分鐘，速度5K rpm。水層用氯仿抽提，混勻再離心。上層轉(zhuǎn)移到干凈試管中加入2倍體積的乙醇沉淀DNA，然后以10K rpm轉(zhuǎn)速離心20分鐘，離心后的沉淀空氣干燥后重懸浮在1ml 10mM Tris，PH8.0，1mMEDTA，20μg/ml RNA酶中。
為了檢測噬菌體DNA的修飾情況，我們將20-40μl噬菌體DNA與下列溶液混合5μl 10Dde Ⅰ緩沖液(1M Na Cl，100mM Tris，PH7.5，和100mM Mg Cl)和1.5μl DdeⅠ核酸內(nèi)切酶(10，000單位/ml)，總反應(yīng)體積為50μl。對全部樣品做凝膠電泳分析，如圖2所示。
體外體內(nèi)測定表明甲基化酶的活性呈梯度分布，pDdeM3.0b活性最低，而pDdeM1.6活性最高;體外體內(nèi)測定結(jié)果一致證明pDdeM1.6的甲基化酶活性足夠完全保護λ噬菌體DNA。因此pDdeM1.6后來被用于克隆核酸內(nèi)切酶基因(見下文)。
按下列方法可以證明M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶而不是腺苷甲基化酶λ噬菌體DNA中Sau3a(GATC)和DdeⅠ(CTNAG)在25325′-GATCTCAG-3′位點發(fā)生重疊(Suggs.S.V.，Wallace，R.B.，Hirose，T.，Kawashima，E.H.and Itakura，K.(1981)PNAS(USA)78，6613-6617，Sanger，F(xiàn).，Coulson，A.R.，Hong，GF.，Hill，D.P.and Petersen，G.B.(1982)J.Moh Biol.162，729-773)。
用Sau3a裂解λ噬菌體DNA得到165bp和487bp兩個片段，一個5.0Kb MluⅠ片段包含Sau 3a和DdeⅠ兩個重疊位點。分離這個片段使得與Ssu3a有關(guān)的片段更易看到。我們用MDdeⅠ處理λ片段然后用Sau3a作用，如果MDdeⅠ是腺苷甲基化酶，那么就會在該序列的第二個腺苷上進行修飾并且是在Sau3a識別位點以外。因此，Sau3a的降解作用一般可產(chǎn)生165bp和487bp兩個片段。然而，如果M.DdeⅠ是胞苷甲基化酶，修飾則發(fā)生在Sau3a識別序列內(nèi)的胞苷上。Sau3a位點上的部分甲基化阻礙Sau3a的裂解，而只能在單鏈上產(chǎn)生缺口(Streek、R.E.(1980)Gene 12，267)。經(jīng)Sau3a處理可出現(xiàn)一個新的652bp片段，如圖3所示。實際上出現(xiàn)的一條新帶表明M.DdeⅠ是一個胞苷甲基化酶。
確定M.DdeⅠ是一個胞苷甲基化酶有助于解釋下列現(xiàn)象。當(dāng)我們所被克隆的菌株RR1帶有pDdeM3.0b質(zhì)粒時，生產(chǎn)多數(shù)甲基化酶并帶有pDdeM1.6質(zhì)粒的克隆存活率相當(dāng)?shù)?。攜帶pDdeM1.6的RR1菌株生長到靜止期時，其存活率只相當(dāng)于單純RR1菌株的6%(表Ⅱ)。最近已證明在某些E.Coli菌株中存在阻礙含胞苷甲基化酶的DNA導(dǎo)入的系統(tǒng)(Raleigh et al.，in press);負責(zé)此系統(tǒng)活性的位點已命名為“mcr B”(mdified cytosine restriction)。在RR1中這個位點是從E.Coli B中誘導(dǎo)出的，而且專一性不同，活性也明顯地弱(Raleigh et al.，見上，Revel，H.R(1967)，Virology 31，688-701)。利用Tn 10的插入使mcr B失活可建立一套新的克隆菌株。我們將甲基化克隆導(dǎo)入到這套菌株中的ER1467中比較pDdeM3.0a、pDdeM3.0b、pDdeM1.6，只有ER1467完全恢復(fù)了生存能力。表Ⅱ中靜止生長期時菌落形成單位(c.f.u)雖有數(shù)量上的差異但可忽略不計。因此，在ER1467菌株中已進一步克隆和確定其DdeⅠ系統(tǒng)的特性。
B.克隆核酸內(nèi)切酶基因由于核酸內(nèi)切酶和甲基化酶基因常緊密連續(xù)，因而有理由推測R.DdeⅠ基因位于甲基化酶基因鄰近的區(qū)域。用從pDdeM3.0a中得到的3.0Kb HindⅢ片段作為探針，對脫硫脫硫弧菌基因組甲基化酶基因周圍區(qū)段進行Southern雜交分析，結(jié)果見圖4A。
核酸內(nèi)切酶基因5′末端的專一性寡聚核苷酸探針已合成。
步驟1純化DdeⅠ核酸內(nèi)切酶達到均一性DdeⅠ核酸內(nèi)切酶的純化。
23克冰凍脫硫脫硫弧菌細胞團凍融后重懸浮于120ml超聲波處理緩沖
液中(10m M KPO4，PH6.9，10mM β-巰基乙醇，0.1mM EDTA).，50mM Na Cl。下述所有步驟均在4℃下進行。加入溶菌酶，最終濃度為300μg/ml，超聲波破碎細胞。裂解的細胞在10，000xg條件下離心45分鐘。
120ml上清液裝上2.5×15cm磷酸纖維素柱P11(Whatman)用超聲波處理緩沖液和150mM Na Cl平衡。用700ml從150mM到1M Na Cl進行線性梯度洗脫，核酸內(nèi)切酶大約在0.5M Na Cl時被洗脫。洗脫峰分段收集并用超聲波處理緩沖液和50mM Na Cl進行透析。
170ml酶洗脫液裝到1.5×15cm肝素-瓊脂糖(Pharmacia)柱上用超聲波處理緩沖液和25mM Na Cl平衡。用340ml從25mM到1M NaCl進行梯度洗脫，大約在0.5M Na Cl時酶可洗脫下來。將具有核酸內(nèi)切酶活性的分段收集液收集到一起用HPLC緩沖液(20mM Tris，PH7.5，10mM β-巰基乙醇)和50mM KCl進行透析。
10ml酶收集液經(jīng)過單級Q柱(Pharmacia)和多級SI柱(Pharmacia)后用50mM KCl裝到1×8cm單級S株上，用50mM到1M KCl分段梯度洗脫出53ml洗脫液，核酸內(nèi)切酶約在0.2M KCl時有一個單獨的洗脫峰。
按下述方法對要進行蛋白質(zhì)序列分析的樣品進行液相層析處理。DdeⅠ核酸內(nèi)切酶樣品(15μg)放到色譜儀Vyadac CA214 TP54(5μm，4.6×300mm)的孔經(jīng)為300埃的反相柱上進行層析，用5%乙腈加0.1%三氟醋酸以線性梯度展開25分鐘，流速控制在1ml/分，在214nm進行觀察。人工收集各個峰并冰凍干燥。
步驟2核酸內(nèi)切酶探針的蛋白質(zhì)序列分析和合成蛋白質(zhì)的順序降解是采用470A型實用生物系統(tǒng)氣相色譜順序分析儀完成的(Strickler，J.E.，Hunkapiller，M.W.and Willson，K.S.(1984)Analytical Biochemistry 140，553-566)。根據(jù)高效液相色譜IBM Cyano-柱(um，4.5×250mm)首先鑒定出19個異苯基硫脲醋苷。此方法是前人曾使用過的，在梯度上稍有修改(Hunkapiller，M.W.and Hood，L.E.(1983)in methods in Enzymology，Hirs，C.H.W.and Timasheff，S.N.Eds.，Vol.91，pp.486-493，Academic Press，New York)。
這個蛋白質(zhì)順序可用來推導(dǎo)出具有最小簡并性的DNA順序。該十四聚體可用DNA合成試劑盒(新英格蘭生物實驗室)來合成并通過在Water Associates C8(10μm，0.5×10cm)Radial Rak柱上層析加以提純。
核酸內(nèi)切酶的前19個氨基酸是Met-Lys-Ala-Ala-Thr-Asp-Gln-Glu-Leu-Arg-Lys-Leu-Ile-Val-Leu-Tyr-Asn-Asn-Val。根據(jù)畫線部分推導(dǎo)出的DNA順序5′-ATG-AAR-GCN-GCN-AC-3′(R核苷酸A或G;N核苷酸A、G、C或T)可制備出一個混合的十四聚體探針?；蚪MDNA的消化液與探針Southern雜交。已知不能雜交到核酸內(nèi)切酶探針上的3.0kb HindⅢ片段含有甲基化酶基因。
Southern雜交1.用切口轉(zhuǎn)移片段1-2μg基因組DNA用大于其20倍的下列核酸內(nèi)切酶消化PstⅠ，SalⅠ，BglⅡ，BclⅠ，HindⅢ，EcoRⅠ，BamHⅠ(新英格蘭生物實驗室)依照所要求的條件進行反應(yīng)。消化產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，并將消化過的DNA用Southern法轉(zhuǎn)移到硝化纖維素薄膜上(Southern，E.M.(1975)J.Mol，Biol.98，503-517)。
硝化纖維素薄膜用于與從pDdeM3.0a而來的3.0kb HindⅢ片段雜交。用下述的凝膠提純法制備這種片段用20倍過量的HindⅢ消化pDdeM3.0a后在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠濃度為1%，含0.5μg/ml溴化乙錠。將帶有DdeⅠ甲基化酶基因的3.0kb片段從凝膠上切割下來，通過規(guī)格為21.5的針頭將其糜化懸浮在Tris-乙酸緩沖液中，用SW型50.1轉(zhuǎn)子(見克曼)在4℃下超速離心35分鐘，速度為290，000xg。上清液加到0.4M Na Cl中用異丙醇沉淀DNA。重新懸浮DNA，用苯酚抽提兩次，乙醇沉淀后重新懸浮在10mM Tris，1mM EDTA，PH.8.0中。6μl提取的DNA片段(1μg)加上100pmol α P-dATP(新英格蘭生物實驗室Ci/mmol)、1μl 10×缺口轉(zhuǎn)移緩沖液(0.5M Tris，PH7.2，0.1M Mg SO4，1mM DTT，500μg/ml BSA)、1μl dGTP(1mM)、dTTP(1mM)、dCTP(1mM)混勻，再加入1μl E.Coli DNA聚合酶Ⅰ(新英格蘭生物實驗室)、1μl DNA酶Ⅰ(Sigma)稀釋液(將3μl 3mg/ml儲備液稀釋到10ml水中)使1μg的該片段缺口轉(zhuǎn)移。15℃溫育2小時后加入50μl 20mM EDTA和200μl 10mM Tris，PH8.0，10mM EDTA，苯酯抽提一次，氯仿抽提一次。加入6μg蛙精DNA，用10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA使總體積增至1ml。煮沸10分鐘后將缺口轉(zhuǎn)移的片段作為濾膜雜交之用。
雜交缺口轉(zhuǎn)移探針之前，硝化纖維素濾膜要在預(yù)雜交混合液中在室溫條件下預(yù)雜交4小時。預(yù)雜交混合液3ml 50×Oenharelt儲備液(5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g BSA，H2O總體積500ml)，4.5ml 20×SSPE儲備液(174g Na Cl、27.6g Na2HPO4·H2O、7.4g EDTA;用NaOH調(diào)到PH7.4，加水至1升)，0.3ml10% SDS，3ml 50%右旋硫酸鹽、4.2ml H2O。
雜交時，將缺口轉(zhuǎn)移探針加到預(yù)雜交的濾膜上(包括預(yù)雜交混合液)65℃溫育過夜。雜交后的濾膜在室溫下用2×SSPE(100ml)沖洗兩次，約5分鐘，再用2×SSPE加0.5% SDS55℃沖洗兩次，30分鐘。濾膜空氣干燥后在X光片上曝光。
2.應(yīng)用寡聚核苷酸探針1-2μg基因組DNA或0.5-1μg質(zhì)粒DNA經(jīng)消化后凝膠電泳，按前述方法轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾膜上。按如下方法將濾膜與寡聚核苷酸探針雜交2μl探針(25-50μg/ml)加上2.5μl10X緩沖液(0.5mM Tris，PH7.6，0.1M Mg Cl2，50mM DTT，1mM亞精胺，1mM EDTA)15μl水，5μl γ-32P-ATP(New England Nuclear，3000Ci/mmol)，0.5μl多聚核苷酸激酶(新英格蘭生物實驗室或Boehringer Mannheim)，在一起混勻，37℃下溫育30分鐘。然后將該混合物加熱到65℃，加熱10分鐘。標(biāo)記探針中加上1ml 10mM Tris，PH8.0，1mM EDTA，然后加到預(yù)雜交過的硝化纖維素濾膜上室溫溫育過夜。
雜交后的濾膜在室溫下用2X SSPE(200ml)沖洗兩次，5分鐘;2X SSPE加上0.5% SDS 30℃沖洗兩次，30分鐘。濾膜空氣干燥后在X光片上曝光。
Soathern雜交的限制性圖譜如圖4B所示。兩種酶消化得到的片段雜交到兩種探針上，而且片段的大小足以編碼甲基化酶基因和(或)核酸內(nèi)切酶基因。圖4A(a)畫箭頭的部位表明兩個探針均雜交到PstⅠ單個片段上，這說明核酸內(nèi)切酶基因和甲基化酶基因位于這段4.8kb的DNA片段內(nèi)。另外，圖4A(g)中標(biāo)箭頭的部位表明兩個探針均雜交在HamHⅠ片段的5.3kb上，這個片段包括一部分甲基化酶基因并足以編碼整個核酸內(nèi)切酶基因。
將核酸內(nèi)切酶基因和甲基化酶基因分別轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒上。將脫硫脫硫弧菌DNA的2.3kb BamHⅠ片段克隆到pACYC184(Chang and Cohen.J.Bacteriol，1341131(1978))，方法如下50μg脫硫脫硫弧菌DNA用BamHⅠ降解后電泳，大小合適的片段如前法凝膠電泳純化，大約可得到100ng的DNA。將DNA片段連接到BamHⅠ切口，同時將pACYC184用牛胰堿性磷酸酶(Boehring Man)。脫磷酸化。用這個連接混合物轉(zhuǎn)化帶有M.DdeⅠ基因的pDdeM1.6的ER1467細胞。在含有100μg/ml氨芐青霉素和30μg/ml氯霉素的L-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化子。平板在37℃培養(yǎng)過夜。
5.篩選限制性核酸內(nèi)切酶用消毒牙簽隨機挑撿50個轉(zhuǎn)化子放入微滴培養(yǎng)皿(Nunc)，每個微皿含100μl L-broth，其中有100μg/ml氨芐青霉素，30μg/ml氯霉素。37℃培養(yǎng)6小時后，轉(zhuǎn)化子重新涂布在6個含有氨芐青霉素、氯霉素及λ病毒噬菌體稀釋液(104-108噬菌體/平板)的L-瓊脂平板上。這些平板培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)過夜，單個轉(zhuǎn)化子對噬菌體的限制大約在10水平。用轉(zhuǎn)化子粗提液(見前法)來檢定DdeⅠ核酸內(nèi)切酶活性的存在。具體方法是向1μg p BR322(＝1μl)中加入5μl 10X dDdeⅠ緩沖液(100mM Tris，PH7.5，100mM Mg Cl2和1M Na Cl)、43μl H2O和1μ1粗提液，37℃溫育30分鐘，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。從克隆中提取的DNA初級限制性圖譜表明這個2.3kb BamHⅠ片段是pDdeM1.6中BamHⅠ與HindⅢ重疊的部分，如圖6所示。因此脫硫脫硫弧菌DNA2.9kb中包含了DdeⅠ系統(tǒng)。
實施例ⅡBamHⅠ限制修飾基因的克隆A.BamHⅠ甲基化酶基因的克窿及其活性特征1.淀粉芽孢桿菌H DNA的制備將5g新鮮的活細胞重新懸浮于含25%蔗糖、50mM Tris，PH8.0，10ml 0.25mM EDTA，PH8.0，6.0ml 10mg/ml溶菌酶(在0.25mM Tris，PH8.0中)混合物中，冰浴中放置2小時。其后加24ml裂解緩沖液(1%Triton X-100，50mM Tris，PH8.0 67mM EDTA)、5ml 10% SDS混勻使細胞裂解。加入等體積的苯酚(用100mM Tris，PH8.0平衡)振動使溶液乳化。加70ml氯仿?lián)u10分鐘?；旌衔镆?0K離心30分鐘(貝克曼離心機)。含DNA的水層轉(zhuǎn)移到干凈瓶中重新用大于2倍體積的苯酚-氯仿抽提。
上層溶液用4×1升TE(10mM Tris，1mM EDTA PH8.0)透析24小時以上。透析后的DNA用0.1體積的RNA酶(10μg/ml)37℃處理1小時。加上5M Na Cl溶液，最終濃度到0.4MNa Cl，最后加2倍體積的乙醇。用玻棒攪起DNA用70%EDTA沖洗一次，然后重新溶解到15mlTE中，冰凍保存在-20℃中，DNA最終濃度＝100μg/ml。
2.部分消化2ml Bam DNA(100μg/ml)加到10個試管中;(200μg/管)內(nèi)裝有HindⅢ緩沖液(10mM Tris，PH7.5;10mM MgCl2、50mM NaCl、10mM巰基乙醇)。HindⅢ分別稀釋到2X系列試管中，即1號管40單位、2號管20單位，依此類推。在37℃消化1小時，然后在72℃處理15分鐘，使酶失活。每810μg消化物凝膠電泳分析一次。部分消化的樣品收集備用。
3.連接將4μg HindⅢ消化的Bam DNA與2μg堿性磷酸酶處理過的pBR322(新英格蘭生物實驗室)連接，16℃下連接反應(yīng)4小時。反應(yīng)溶液總體積100μl，其中包括50mM Tris，PH7.5、10mM MgCl2、10mM DTT，0.5mM ATP及1000單位的T4DNA連接酶(N.E.Biolabs);然后樣品用氯仿處理分成10份，每一份轉(zhuǎn)化200μl冰凍感受態(tài)RR1細胞(加50mM Ca Cl2)。42℃下細胞熱激2分鐘，稀釋到5ml L-Broth中，37℃下生長到飽和。
4.離心收獲轉(zhuǎn)化細胞(4K，10分鐘)并重懸浮于250μl L-Broth中，在加有100μg/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。用2.5ml 10mM Tris，PH7.5;10mM Mg Cl2將轉(zhuǎn)化子從平板上洗脫下來。
5.沖洗下的混合物接種到500ml含100μg/ml氨芐青霉素的L-Broth中。37℃振蕩培養(yǎng)過夜，再次離心收集(4K，5分鐘)。細胞在室溫下重新懸浮于10ml 25%蔗糖，50mM Tris，PH8.0中。加入5ml 0.25M EDTA，PH8和3ml 10mg/ml溶在水中的溶菌酶。溶液在40℃下放置1小時。然后用12ml裂解緩沖液使細胞懸液混勻。裂解液離心1小時(15K)。上清液用濾布擠濾。加入固體氯化銫(0.93g/ml)和溴化乙錠;濃度到100μg/ml。裝入離心管平衡，在貝克曼超速離心機中離心48小時(44，000rpm17℃貝克曼Ti70轉(zhuǎn)頭)。用注射器收集溴化乙錠著色的DNA帶。用2倍體積乙醇沉淀質(zhì)粒并冷凍。12，000rpm離心20分鐘收集質(zhì)粒DNA。重新懸浮到1ml TE緩沖液的DNA用苯酚抽提一次，氯仿抽提一次，2倍體積乙醇沉淀后干燥，再重新懸浮到100μl TE緩沖液中。
6.Bam作用初級質(zhì)粒庫(約100μg DNA/100μl)在5×100μl反應(yīng)液中逐級消化。反應(yīng)液包括20μg質(zhì)粒DNA、10mM Tris，PH7.5、10mM Mg Cl、100mM Na Cl;10mM β-巰基乙醇。第1管加100單位BamHⅠ(N.E Biolabs)、第二管加50單位，依此類推。試管在37℃下培養(yǎng)1小時。
7.轉(zhuǎn)化按前述方法每10μl反應(yīng)物轉(zhuǎn)化100μl RR1細胞。轉(zhuǎn)化混合物熱處理2分鐘后馬上涂布在加氨芐青霉素的L瓊脂平板培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜。
后來的實驗中發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶反應(yīng)中用2.5單位的核酸外切酶Ⅲ(N.E.Biolabs)或10單位的堿性磷酸酶(Boehringer)處理可使轉(zhuǎn)化子增加到103或104。存活率最低的平板大約也能檢出200個菌落。
8.每個菌落接種到10ml加氨芐青霉素的L-Broth中和劃線接種到加氨芐青霉素的LB平板上。
每個培養(yǎng)物的DNA微量提取有如下法10ml培養(yǎng)物離心收集(6K，5分鐘)，而后重新懸浮在1ml 25mM Tris、10mM EDTA、50mM葡萄糖、PH8，1mg/ml溶菌酶中。室溫放置10分鐘后加入2ml 0.2M NaOH、1%SDS溶液，混勻后4℃下放置5分鐘。加1.5ml 3M醋酸鈉，PH.4.8混勻在冰浴中培養(yǎng)5分鐘?；旌衔?5K離心10分鐘。例出上清液加入3.0ml異丙醇，室溫放置10分鐘后，15K離心10分鐘。沉淀部分干燥后重新懸浮于0.85mlTE，75μl5M NaCl中，室溫下用乙醇沉淀一次以上。用Eppendorf離心機離心1分鐘。DNA干燥后重新懸浮于50μl含20μg/ml RNA酶的TE，PH8.0中。
每個制備出的質(zhì)粒要測定其HindⅢ片段和對BamHⅠ核酸內(nèi)切酶的抗性。
發(fā)現(xiàn)有四個菌落具BamHⅠ抗性含有大量HindⅢ片段。進一步分析這四個菌落，取每種克隆的少量細胞培養(yǎng)物(10ml)培養(yǎng)并制備整個染色體DNA(見第一部分)。四個克隆中，其中一個宿主DNA上帶有抗BamHⅠ降解的抗性并被進一步用于實驗。
9.甲基化測定按照實施例1所述方法對BamHⅠ提取物進行體外體內(nèi)測定，所不同的是將體外測定所用的底物連接到BamHⅠ接頭(dp CGGATCCG)(N.E.Biolabs)上的方法如下(1)連接IO.D單位的BamHⅠ銜接物，其100μl反應(yīng)物中包括1000單位T4 DNA連接酶(N.E.Biolabs)、50mM Tris，PH8;20mM DTT，2mMATP，10mM Mg Cl 50g/ml牛血清白蛋白(Pentax)，室溫下過夜。反應(yīng)物在70℃下加熱10分鐘失活。每一甲基化酶反應(yīng)物中加0.005 O.D單位的銜接物，反應(yīng)物用[H]-S-腺苷甲硫氨酸標(biāo)記。
體內(nèi)測定按實施例所1述方法使用λ噬菌體進行。
甲基化酶克隆經(jīng)測定未發(fā)現(xiàn)核酸內(nèi)切酶活性。(除用10單位PstⅠ核酸內(nèi)切酶切成線性的1μg p BR322底物外，粗提物核酸內(nèi)切酶測定的操作方法與實施例1相同)。
B.核酸內(nèi)切酶基因的克隆1.甲基化酶質(zhì)粒圖譜在人工控制的條件下用一系列的限制性核酸內(nèi)切酶雙消化已測定出HindⅢ片段的順序(見圖5)。
另外，由BamHⅠ核酸內(nèi)切酶同源基因推導(dǎo)出的順序制成的寡核苷酸探針(模擬Dde探針-見實施例1)被用來測定HindⅢ片段的順序，其方法如下150μl反應(yīng)液，其中包括15μg溶在10mM Tris，PH7.5中的Bam甲基化酶質(zhì)粒、10mM Mg Cl、50mM Na Cl，混勻后加到9個試管中，首先將30μl 2單位的HindⅢ核酸內(nèi)切酶(N.E.Biolabs)裝入第一管，然后轉(zhuǎn)移一半體積到第二管，依此類推，組成一系列酶稀釋液。1小時后(37℃下溫育)終止消化，消化液進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳。電泳產(chǎn)物按實施例1所述方法轉(zhuǎn)移到硝化纖維素薄膜上與寡聚核苷酸探針雜交。如實施例1所述，探針是經(jīng)T4多聚核苷酸激酶作用，用γ-32P-ATP(New England Nuclear)標(biāo)記的。實驗中發(fā)現(xiàn)2.2kb片段被雜交到探針上。
2.甲基化酶基因亞克隆圖譜帶甲基化酶基因(命名pDHⅠ)的質(zhì)粒用Ca Cl2處理轉(zhuǎn)化到HB101細胞中。依據(jù)第5部分所述將質(zhì)粒DNA經(jīng)氯化銫梯度提純。
a)帶pDHⅠ的HB101細胞被噬菌體λ467∶∶Tn5感染致使甲基化酶功能圖譜被轉(zhuǎn)座子誘變。詳細內(nèi)容見實施例Ⅰ。
b)甲基化酶基因被證明位于2.2kb HindⅢ片段上。100μg pDHⅠ DNA用HindⅢ消化完全后在制備型0.7%瓊脂糖凝膠中電泳。紫外燈下可觀察到2.2kb片段。用解剖刀切下該片段在IBⅠ型UEA電動洗脫分析儀上洗脫，條件遵從制造者的要求。洗下的片段沉淀在2倍體積乙醇中，沉淀重新懸浮在300μl TE中，苯酚抽提、氯仿抽提。用加0.2M Li Cl的乙醇沉淀。將DNA片段重新懸浮在100μl TE后在-20℃冷凍保存。
c)將2μg上述DNA片段連接到0.1μg p BR322-HindⅢ或0.1μg p UC19-HindⅢ上，兩種質(zhì)粒均經(jīng)堿性磷酸酶處理過。連接反應(yīng)在室溫下過夜。連接混合液(連接的詳細步驟見A-3部分)氯仿抽提一次后用來轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)細胞。微量提取轉(zhuǎn)化子并檢測質(zhì)粒的甲基化酶活性(見A-9部分)。帶有2.2kb片段的pBR322和pUC19中有產(chǎn)生Bam甲基化酶的結(jié)構(gòu)，這兩個質(zhì)粒被分別命名為p BH2和p DH3。
d)用標(biāo)準(zhǔn)方法做出p DH2圖譜并且核酸內(nèi)切酶探針也被雜交到該片段上[圖6]。在HindⅢ位點上游約450bp的地方定位3XmnⅠ位點，與被寡核苷酸探針雜交部位緊密相鄰。
10μg提純的2.2kb片段用XmnⅠ核酸內(nèi)切酶劇烈地消化，反應(yīng)混合物用苯酚抽提，氯仿抽提、乙醇沉淀并重新懸浮。5μg提取到的DNA連接到經(jīng)HindⅢ和SmaⅠ雙重消化過的0.5μg p UC8上。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)K802細胞。微量提取各種轉(zhuǎn)化子觀察其質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，體內(nèi)檢測其克隆的Bam甲基化酶活性。發(fā)現(xiàn)其中一個具有1.75kbHindⅢ-Xmn片段和甲基化酶活性(其它克隆中具有與核酸內(nèi)切酶探針雜交上的0.45kb片段，沒有Bam甲基化酶活性)。這個仍具有Bam甲基化酶活性且被縮短的結(jié)構(gòu)命名為p DH5。
e)Bam染色體上核酸內(nèi)切酶基因圖譜。
純化的淀粉芽孢桿菌DNA用一系列限制性核酸內(nèi)切酶在標(biāo)準(zhǔn)條件下消化，消化產(chǎn)物在0.5%瓊脂糖凝膠中電泳。如實施例1所述將DNA轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。Southern雜交轉(zhuǎn)移物被平行的雜交到激酶處理的Bam寡核苷酸探針上(順序5′TCC(T)TTC(T)TCG(TCA)ACC(T)TCCAT3′)和缺口轉(zhuǎn)移提純的2.2kb片段上[缺口轉(zhuǎn)移具體步驟見實施例1)。
雖然寡核苷酸探針雜交和洗滌操作上不夠嚴(yán)格而且沒有產(chǎn)生更多的專一性雜交，但很顯然兩部分被雜交到Bam染色體的同一區(qū)域上(圖7)。特別是兩種探針都雜交到Bam染色體中4.5kb HindⅢ片段上。
3.尋找核酸內(nèi)切酶基因100μg純化的Bam DNA用200單位的HindⅢ核酸內(nèi)切酶消化完全，消化的DNA用0.5%瓊脂糖凝膠電泳，切下后電動洗脫，方法如前所述。
將10μg經(jīng)純化的4.5kb片段連接到1μg經(jīng)HindⅢ消化、堿性磷酸酶處理過的pACYC184載體上。氯仿處理后，連接物從100μl稀釋到300μl。用100μl轉(zhuǎn)化感受態(tài)K802細胞，此菌株曾用于轉(zhuǎn)化pDH5。篩選出Am PRCamR轉(zhuǎn)化子。用消毒牙簽將其中350個挑撿到微滴培養(yǎng)皿中[Nunc]，培養(yǎng)皿中含100μl L-Broth+Amp+Cam(氯霉素;終濃度30μg/ml)，37℃下培養(yǎng)過夜。第二天用一個多孔接種裝置將克隆印到LB+Amp+Cam平板上。平板在37℃培養(yǎng)過夜;50菌落/平板。
檢驗核酸內(nèi)切酶活性7個主平板分別各用5ml超聲波處理緩沖液(100mM Tris PH8.0，10mM巰基乙醇)沖洗平板表面的菌落。將細胞懸浮液離心，5K，10分鐘。收集到的細胞再懸浮于0.5ml超聲波處理緩沖液中。超聲波處理細胞15秒。細胞用25μl溶菌酶(10mg/ml)、50μl 0.1M EDTA，PH7.0處理后冷凍，再凍融。棄去超聲波處理的細胞碎片，加入10μl 1M Mg Cl2后低速離心(5分鐘，Eppendorf)，用上述每一提取物取1μl消化1μg p BR322DNA，pBR322 DNA已在10μl PstⅠ反應(yīng)混合物(10mM，Tris PH8.0，10mM Mg Cl2，100mM Na Cl)中切成線狀。消化液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在第5號平板上可看到所預(yù)計的結(jié)果。因此，將每個菌落的細胞接種到5ml LB+Amp+Cam中培養(yǎng)過夜，收集后分別做BamHⅠ核酸內(nèi)切酶活性測定。
另外，檢測菌落的噬菌體抗性[見實施例Ⅰ]。其中發(fā)現(xiàn)一個菌落有Bam核酸內(nèi)切酶活性。
權(quán)利要求
1.一種克隆限制修飾系統(tǒng)的方法，該方法包括修飾基因引入克隆載體使其在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎麅?nèi)表達，將限制基因引入到含修飾基因的宿主細胞內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中將修飾基因引入克隆載體并在適當(dāng)宿主細胞中表達。具體步驟包括(a)從含有用作克隆的限制修飾系統(tǒng)的材料中提純DNA，(b)至少部分消化提純的DNA使其形成DNA片段，(c)連接DNA片段到克隆載體上，(d)用步驟(c)的克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以建立庫，(e)從庫中篩選含有修飾基因的克隆，和(f)培養(yǎng)含有步驟(e)中克隆的宿主細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其中在篩選后和培養(yǎng)前將限制基因引入宿主細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3所述的方法，其中從含有限制修飾系統(tǒng)的細菌或病毒中選擇DNA來源。
5.根據(jù)上述任一權(quán)利要求
所述的方法，其中克隆的載體是質(zhì)粒或病毒DNA分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其中質(zhì)粒為pBR322、pUC8、pUC9、pUC18、或pUC19。
7.根據(jù)上述任一權(quán)利要求
所述的方法，其中將限制基因引入宿主細胞，包括將限制基因引入次級質(zhì)粒，該質(zhì)粒是與含修飾基因的質(zhì)粒一致的，而后用次級質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1到6中任一項所述的方法，其中將限制基因引入宿主細胞，包括將限制基因?qū)牒行揎椈虻馁|(zhì)粒。
9.根據(jù)上述任一權(quán)利要求
所述的方法，其中宿主細胞所采用ER1467，K802、HB101、RR1、K803或MM294。
10.生產(chǎn)限制酶的方法，該方法包括如上述任一權(quán)利要求
所述的克隆方法和從培養(yǎng)物中回收限制酶。
11.按照上述任一權(quán)利要求
所述方法生產(chǎn)的克隆。
12.權(quán)利要求
11所述的克隆，其中被克隆的系統(tǒng)包括DdeⅠ限制修飾系統(tǒng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
11所述的克隆，其中被克隆的系統(tǒng)包括BamHⅠ限制性修飾系統(tǒng)。
14.被克隆的BamHⅠ核酸內(nèi)切酶基因。
15.用權(quán)利要求
14的克隆轉(zhuǎn)化的宿主。
16.被克隆的DdeⅠ核酸內(nèi)切酶基因。
17.用權(quán)利要求
16的克隆轉(zhuǎn)化的宿主。
專利摘要
所提供的兩步克隆限制修飾系統(tǒng)的方法包括在宿主中引入修飾基因或甲基化酶基因并表達，為保護宿主細胞使引入的限制基因或核酸內(nèi)切酶基因表達能力低于被引入的修飾基因。同時提供了與生產(chǎn)限制酶有關(guān)的方法及BamI和Dd eI限制基因的克隆。
文檔編號C12N1/21GK87104039SQ87104039
公開日1988年3月23日 申請日期1987年6月6日
發(fā)明者瓊·埃蘭·布魯克斯, 金伯利·安·哈瓦德 申請人:新英格蘭生物實驗室公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan