專利名稱：復(fù)合骨組織工程支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及一種骨組織工程支架材料，特別是膠原-羥基磷灰石(HA)-硫酸軟骨素(CS)-骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)復(fù)合骨組織工程支架材料及其制備方法。應(yīng)用組織工程原理，以該材料為支架材料可構(gòu)建組織工程化人工骨，用于修復(fù)各種原因造成的骨缺損。
背景技術(shù)：
由創(chuàng)傷、腫瘤、感染以及其它病因?qū)е碌墓侨睋p的發(fā)病率較高，它對(duì)人類的健康構(gòu)成極大威脅。目前，骨缺損的修復(fù)主要采用自體骨、異體骨移植材料以及金屬、高分子化合物、天然或合成磷酸鈣類材料如珊瑚、羥基磷灰石等人造骨。由于供體有限、免疫反應(yīng)、有傳染病菌的危險(xiǎn)等原因，這些治療方法受到很大限制。因此，迫切需要發(fā)展具有理想生物相容性和生物功能性的移植材料。這些材料要求具有穩(wěn)定、良好的生物性能，在新骨生成修復(fù)的同時(shí)可生物降解，從而真正實(shí)現(xiàn)骨缺損的修復(fù)。
近年來(lái)，隨著細(xì)胞生物學(xué)、材料科學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，新興組織工程學(xué)科的形成為骨缺損的修復(fù)提供了新的方法和思路。該方法是將細(xì)胞種植于多孔三維支架材料上生長(zhǎng)、增殖，細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)并形成新的骨組織并且支架材料逐漸降解，然后將其植入缺損部位。三維支架材料，即細(xì)胞外基質(zhì)替代物，是骨組織工程研究的關(guān)鍵之一，它不僅影響細(xì)胞的生物學(xué)行為和培養(yǎng)效率，而且決定著移植后能否與機(jī)體很好地適應(yīng)、結(jié)合和修復(fù)的效果。
用于骨組織工程的三維支架材料應(yīng)滿足以下幾個(gè)要求(1)良好的生物相容性和生物降解性，其在體內(nèi)的降解產(chǎn)物對(duì)人體無(wú)害；(2)具有骨傳導(dǎo)性，利于細(xì)胞粘附和增殖；(3)有一定的強(qiáng)度，能對(duì)抗外力；(4)易于塑形，可以根據(jù)需要加工成各種形狀和大小。目前，用于骨組織工程的支架材料主要有兩類，一類是無(wú)機(jī)材料，如生物活性陶瓷；另一類是有機(jī)高分子材料，如α-聚酯等合成材料、膠原等天然材料。研究表明，這些材料均不夠理想，高分子材料強(qiáng)度不足，受力時(shí)容易變形，這樣會(huì)損傷移植的細(xì)胞，而生物陶瓷降解速度慢，受力后容易碎裂。
天然骨基質(zhì)主要由有機(jī)質(zhì)和無(wú)機(jī)質(zhì)組成。有機(jī)質(zhì)中包括膠原纖維和無(wú)定形基質(zhì)。其中膠原纖維約占有機(jī)質(zhì)的95％，骨組織中絕大多數(shù)細(xì)胞都貼附在膠原表面生長(zhǎng)，同時(shí)膠原也維持著骨組織的韌性，掃描電鏡下可見(jiàn)骨基質(zhì)中的膠原纖維的分支連結(jié)成網(wǎng)狀。天然膠原材料具有引導(dǎo)和誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，我們利用膠原材料制備的組織引導(dǎo)再生膠原膜(專利號(hào)94118836.1)顯示了這一生物學(xué)功能。無(wú)定形基質(zhì)為中性和酸性粘多糖，其中以嗜堿性的4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素為主。它們可促進(jìn)細(xì)胞貼附、提高骨組織的強(qiáng)度和韌性。骨的無(wú)機(jī)鹽是由磷酸鈣形成的亞微沉淀物構(gòu)成，與無(wú)機(jī)鹽HAP[Ca10(PO4)6(OH)2]非常相近，它們位于基質(zhì)內(nèi)，膠原纖維物質(zhì)在表面及內(nèi)部沿纖維的方向長(zhǎng)軸排列。在骨組織中，骨膠原纖維的抗壓性和彈性較差，而HAP結(jié)晶則脆性較大，易碎裂，但當(dāng)兩者有規(guī)律的結(jié)合在一起時(shí)，骨組織即擁有獨(dú)特的強(qiáng)度和韌性。在生理?xiàng)l件下，成骨細(xì)胞的分化和增殖受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，包括類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等，在骨修復(fù)過(guò)程中，細(xì)胞因子往往是通過(guò)多種因子協(xié)同作用而產(chǎn)生效果。其中BMP是一組具有骨誘導(dǎo)性的蛋白質(zhì)。在組織工程化人工器官的構(gòu)建中，無(wú)論從仿生學(xué)的原理，還是從功能化的角度來(lái)看，引入多糖類物質(zhì)和細(xì)胞生長(zhǎng)因子都有著積極的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的復(fù)合骨組織工程支架材料及其制備方法。本發(fā)明是模擬天然骨組織細(xì)胞外基質(zhì)成分，在組織引導(dǎo)再生膠原膜(專利號(hào)94118836.1)專利基礎(chǔ)上，以牛腱膠原、羥基磷灰石、硫酸軟骨素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白為原料，構(gòu)建骨組織工程支架材料。應(yīng)用組織工程原理，以該材料為支架材料可構(gòu)建組織工程化人工骨。本發(fā)明具有良好的理化和生物學(xué)性能，是性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料?？捎糜谥委煾鞣N原因造成的骨缺損。
本發(fā)明包括膠原、羥基磷灰石、硫酸軟骨素與骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成，具有三維多孔的結(jié)構(gòu)特征，孔徑為50-150微米。
所述的膠原與羥基磷灰石的質(zhì)量配比為1∶1-10，其通過(guò)冷凍干燥法成型。
所述的硫酸軟骨素通過(guò)交聯(lián)復(fù)合到支架材料上，交聯(lián)劑中含2-嗎啉乙烷磺酸、碳化二亞胺、琥珀酰亞胺與硫酸軟骨素，交聯(lián)劑中硫酸軟骨素含量(質(zhì)量比)為0.2-2％。
所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白為0.35-0.5mg/mL支架材料體積，其通過(guò)吸附結(jié)合到支架材料上。
復(fù)合骨組織工程支架材料的制備包括下述步驟1)以0.3％丙二酸溶液為溶脹液，配置固含量為0.5-0.7％的膠原溶脹液，按配比稱取膠原溶脹液與羥基磷灰石，混合均勻，得到膠原-羥基磷灰石分散液，-20--60℃預(yù)凍至少4h，-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20C4h冷凍干燥，得到未交聯(lián)膠原-羥基磷灰石支架材料；2)室溫下，將制備的未交聯(lián)的膠原-羥基磷灰石支架材料(按20ml/50mg膠原的量)浸泡于含50mmol/L 2-嗎啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min；然后將膠原-HA支架材料按20ml/50mg膠原的量浸泡在交聯(lián)液中，交聯(lián)液含50mmol/L MES，24mmol/L碳化二亞胺(EDC)，5mmol/L琥珀酰亞胺(NHS)，0.2-2％的硫酸軟骨素；室溫下交聯(lián)4h；將支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1晝夜，最后，用水清洗除去殘余的交聯(lián)液和NaCl，-30℃預(yù)凍至少4h，冷凍干燥機(jī)中二次凍干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。
3)稱取人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，溶于甘氨酸緩沖液，濃度為1μg/μL，PH＝6.5，0℃下靜置30min，將滅菌的支架材料浸沒(méi)于上述反應(yīng)液中，0℃下靜置60min，取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。


圖1本發(fā)明的掃描電鏡(SEM)照片。
圖2成骨細(xì)胞在本發(fā)明支架材料上體外培養(yǎng)三周后的SEM照片。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1以0.3％丙二酸溶液為溶脹液，配置固含量為0.5％的膠原溶脹液。稱取固含量0.5％膠原溶脹液60g與羥基磷灰石0.3g，混合均勻，得到膠原-HA分散液。先-30℃預(yù)凍至少4h，再以-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20℃4h冷凍干燥得到未交聯(lián)膠原-HA支架材料。
室溫下，將制備的未交聯(lián)的膠原-HA支架材料浸泡于含120ml50mmol/L2-嗎啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后將膠原-HA支架材料浸泡在120ml交聯(lián)液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亞胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亞胺(NHS)，0.2％的硫酸軟骨素)室溫下交聯(lián)4h。將支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1晝夜，最后，用水清洗除去殘余的交聯(lián)液和NaCl，-30℃預(yù)凍至少4h，冷凍干燥機(jī)中二次凍干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。
將交聯(lián)后的支架材料裁成直徑16mm，厚3mm的圓片，稱取rhBMP-2(人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2)，溶于甘氨酸緩沖液，濃度為1μg/μL，0℃下靜置30min，將滅菌的支架材料浸沒(méi)于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下靜置60min。取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。
掃描電鏡觀察(SEM)支架材料表面鍍金后，用HITACHI S-3500N掃描電鏡進(jìn)行SEM觀察。SEM觀察可知，支架材料為多孔三維結(jié)構(gòu)，孔徑平均約為100um。(見(jiàn)圖1)成骨細(xì)胞于支架材料上的種植取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的3-4代骨髓基質(zhì)干來(lái)源的成骨細(xì)胞，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，吹打，離心，重新懸浮于DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)細(xì)胞活性率，然后調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107個(gè)細(xì)胞/毫升。
將支架材料置于24孔培養(yǎng)板中，分別加入成骨細(xì)胞懸液各0.1ml，再加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1毫升，37℃，5％CO2下培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液。
在第三周，取培養(yǎng)中的組織工程化人工骨樣品，于戊二醛中固定2小時(shí)，鋨酸中固定1小時(shí)，臨界干燥；離子度膜；HITACHI S-3500N掃描電鏡行SEM觀察。
成骨細(xì)胞在支架材料中生長(zhǎng)良好。分泌細(xì)胞外基質(zhì)沉淀于細(xì)胞周圍，大量細(xì)胞已被細(xì)胞外基質(zhì)包埋，細(xì)胞與支架間、細(xì)胞與細(xì)胞間形成細(xì)胞橋。(見(jiàn)圖2)實(shí)施例2以0.3％丙二酸溶液為溶脹液，配置固含量為0.5％的膠原溶脹液。稱取固含量0.5％膠原溶脹液60克與羥基磷灰石1.2克，混合均勻，得到膠原-HA分散液。先預(yù)凍，再以冷凍干燥得到未交聯(lián)膠原-HA支架材料。
室溫下，將制備的未交聯(lián)的膠原-HA支架材料浸泡于含120ml50mmol/L2-嗎啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后將膠原-HA支架材料浸泡在120ml交聯(lián)液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亞胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亞胺(NHS)，0.5％硫酸軟骨素)室溫下交聯(lián)4h。將支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中清洗1晝夜，最后，用水清洗除去殘余的交聯(lián)液和NaCl，冷凍干燥機(jī)中二次凍干。
將交聯(lián)后的支架材料裁成直徑16mm，厚3mm的圓片，稱取rhBMP-2，溶于甘氨酸緩沖液，濃度為1μg/μL，0℃下靜置30min，將滅菌的支架材料浸沒(méi)于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下靜置60min。取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。
實(shí)施例3以0.3％丙二酸溶液為溶脹液，配置固含量為0.7％的膠原溶脹液。稱取固含量為0.7％膠原溶脹液60克與羥基磷灰石0.84克，混合均勻，得到膠原-HA分散液。先預(yù)凍，再以冷凍干燥得到未交聯(lián)膠原-HA支架材料。
室溫下，將制備的未交聯(lián)的膠原-HA支架材料浸泡于含168ml50mmol/L2-嗎啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min，然后將膠原-HA支架材料浸泡在168ml交聯(lián)液中(含50mmol/L的MES，24mmol/L的碳化二亞胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亞胺(NHS)，0.2％硫酸軟骨素)室溫下交聯(lián)4h。將支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中清洗1晝夜，最后，用水清洗除去殘余的交聯(lián)液和NaCl，冷凍干燥機(jī)中二次凍干。
將交聯(lián)后的支架材料裁成直徑16mm，厚3mm的圓片，稱取rhBMP-2，溶于甘氨酸緩沖液，濃度為1μg/μL，0℃下靜置30min，將滅菌的支架材料浸沒(méi)于223μL rhBMP-2溶液中，0℃下靜置60min。取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合骨組織工程支架材料，其特征在于它包括膠原、羥基磷灰石、硫酸軟骨素與骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成，具有三維多孔的結(jié)構(gòu)特征，孔徑為50-150微米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨組織工程支架材料，其特征在于所述的膠原與羥基磷灰石的質(zhì)量配比為1∶1-10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨組織工程支架材料，其特征在于所述的硫酸軟骨素通過(guò)交聯(lián)復(fù)合到膠原-羥基磷灰石復(fù)合材料上，交聯(lián)劑中含2-嗎啉乙烷磺酸、碳化二亞胺、琥珀酰亞胺與硫酸軟骨素，交聯(lián)劑中硫酸軟骨素質(zhì)量含量為0.2-2％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨組織工程支架材料，其特征在于所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白為0.35-0.5mg/mL支架材料體積，其通過(guò)吸附結(jié)合到支架材料上。
5.權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于它是包括下述步驟1)以0.3％丙二酸溶液為溶脹液，配置固含量為0.5-0.7％的膠原溶脹液，按配比稱取膠原溶脹液與羥基磷灰石，混合均勻，得到膠原-羥基磷灰石分散液，先-20-60℃預(yù)凍，再以冷凍干燥，-30℃15h，-15℃18h，0℃15h，10℃7h，20℃4h，得到未交聯(lián)膠原—羥基磷灰石支架材料；2)室溫下，將制備的未交聯(lián)的膠原—羥基磷灰石支架材料按20ml/50mg膠原的量浸泡于含50mmol/L2-嗎啉乙烷磺酸(MES)的40％乙醇中30min；然后將膠原-HA支架材料按20ml/50mg膠原的量浸泡在交聯(lián)液中，室溫下交聯(lián)4h；將支架在0.1mol/L的Na2HPO4中清洗1h，在1mol/L的NaCl中清洗2h，2mol/L的NaCl中浸泡清洗1晝夜，最后，用水清洗除去殘余的交聯(lián)液和NaCl，先-20-60℃預(yù)凍，冷凍干燥機(jī)中二次凍干，-20℃8h，10℃4h，20℃4h。3)稱取人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，溶于甘氨酸緩沖液，濃度為1μg/μL，PH＝6.5，0℃下靜置30min，將滅菌的膠原-羥基磷灰石復(fù)合材料浸沒(méi)于反應(yīng)液中，0℃下靜置60min，取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于所述的交聯(lián)液含50mmol/L2-嗎啉乙烷磺酸(MES)，24mmol/L的碳化二亞胺(EDC)，5mmol/L的琥珀酰亞胺(NHS)，0.2-2％的硫酸軟骨素。
全文摘要
本發(fā)明是涉及復(fù)合骨組織工程支架材料及其制備方法。它包括膠原、羥基磷灰石、硫酸軟骨素與骨形態(tài)發(fā)生蛋白構(gòu)成，具有三維多孔的結(jié)構(gòu)特征，孔徑為50－150微米。所述的膠原與羥基磷灰石的質(zhì)量配比為1∶1－10。所述的硫酸軟骨素通過(guò)交聯(lián)與材料復(fù)合。應(yīng)用組織工程原理，以該材料為支架材料可構(gòu)建組織工程化人工骨。本發(fā)明具有良好的理化和生物學(xué)性能，是性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料，可用于臨床上因各種原因造成的骨缺損的修復(fù)。
文檔編號(hào)C08L89/00GK1526765SQ03144308
公開(kāi)日2004年9月8日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月23日
發(fā)明者張其清, 劉玲蓉, 李學(xué)敏 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所