一種組織工程人工骨及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織工程人工骨及其構(gòu)建方法，該人工骨將人臍帶血間充質(zhì)干細胞（human?umbilical?cord?mesenchymal?stem?cells，hUCMSCs）接種到膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料上。其中CPC由磷酸四鈣（tetracalcium?phosphate，TTCP）和磷酸氫鈣（dicalcium?phosphate?anhydrous，DCPA)組成(TTCP和DCPA以摩爾比1/1混合)。然后將膠原蛋白縫合線與CPC粉末按不同的體積比混勻后再將混合物與去離子水按3-5/1的質(zhì)量比混合。最后將hUCMSCs接種到膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料上。本發(fā)明制備的人工骨強度高，修復(fù)骨缺損的能力強。
【專利說明】一種組織工程人工骨及其構(gòu)建方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于外科用品材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種修復(fù)骨缺損的材料及其構(gòu)建方法，特別是一種臍帶血干細胞與膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料構(gòu)建的組織工程人工骨及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人骨髓間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，可分化為不同的組織，如骨、軟骨及肌肉等。人骨髓間充質(zhì)干細胞可來源于病人的骨髓，經(jīng)過體外擴增，誘導(dǎo)分化后接種到生物支架上修復(fù)骨缺損。因此，基于干細胞的組織工程人工骨在骨缺損和骨再生方面發(fā)揮了巨大的潛能，而且，目前需要手術(shù)治療的骨缺損患者數(shù)量龐大，組織工程人工骨投入到臨床使用后將會造福廣大患者，具有積極的意義。
[0003]但獲取人骨髓間充質(zhì)干細胞是一種有創(chuàng)性的過程，而且干細胞的活力及增殖隨著年齡的增加而逐漸降低。最近，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells,hUCMSCs)受到關(guān)注，并可分化為骨、軟骨、神經(jīng)元及內(nèi)皮細胞等。hUCMSCs具有以下優(yōu)點:1)低成本獲??；2)來源廣闊；3)獲取對機體損傷小，甚至無損傷；4)無免疫原性及致瘤性，用其來替代人骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)該是將來的趨勢。
[0004]用于制備生物支架的生物活性材料鈣磷陶瓷與人骨的無機成分相似，可促進細胞的粘附、增殖及成骨分化，所以羥基磷灰石hydroxyapatite (HA)及其他鈣磷支架對于骨缺損的治療已受到廣泛關(guān)注。盡管如此，對燒結(jié)而成的生物陶瓷，在使用過程中需用外科手術(shù)修剪成適當?shù)男螤畈拍苤踩胍浦膊课?，這不僅造成人工骨的浪費，而且也消耗手術(shù)時間。相比之下，磷酸1丐骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)可在體外塑型然后填充到骨缺損部位，能夠與自體骨緊密結(jié)合。目前常用的CPC由磷酸四鈣tetracalcium phosphate,TTCP)和憐酸氧|丐(dicalcium phosphate anhydrous, DCPA)組成。CPC可自固形成骨移植物，而且由于其具有良好的生物相容性，移植后能被新骨取代等優(yōu)點，1996年被美國FDA批準用于臨床。但傳統(tǒng)的CPC易碎，力學(xué)強度較低，所以只能用于非承重區(qū)的骨組織，因此需要改進其力學(xué)性能。
[0005]純天然膠原蛋白縫合線，具有良好的生物相容性，生物可降解性及較強的抗拉力，作為可吸收縫線已在臨床廣泛應(yīng)用。本發(fā)明將hUCMSCs種植到膠原蛋白縫合線增強的CPC上構(gòu)建了一種新型的組織工程人工骨，為骨缺損患者的治療提供了一種新的材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的提供一種構(gòu)建方法簡單、方便、成本較低的組織工程人工骨及其構(gòu)建方法，該方法構(gòu)建的組織工程人工骨具有較強的力學(xué)性能，可用于承重區(qū)骨的修復(fù)；而且構(gòu)建組織工程人工骨所選用的hUCMSCs具有低成本獲取、 來源廣闊、獲取對機體損傷小，甚至無損傷、無免疫原性及致瘤性等優(yōu)勢。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的。[0008]一種組織工程人工骨，是在由膠原蛋白縫合線及磷酸鈣骨水泥混合制成的復(fù)合材料上接種了人臍帶間充質(zhì)干細胞。
[0009]所述的磷酸鈣骨水泥是由磷酸四鈣和磷酸氫鈣以摩爾比1:1混合的粉末。然后把膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末按1:3-5的體積比混勻后加入去離子水，調(diào)成糊狀物放置于模具定型后制成復(fù)合材料。膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合物與去離子水的質(zhì)量比為3-5:1。
[0010]所述的組織工程人工骨的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0011](I)磷酸鈣骨水泥粉末的混合，
[0012]磷酸四鈣和磷酸氫鈣以摩爾比1:1混合；
[0013](2)膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合，
[0014]把膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末按1: 3-5的體積比混勻；
[0015](3)膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料的制備，
[0016]膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合物與去離子水按照質(zhì)量比為3-5:1混合調(diào)制成糊狀物，將糊狀物放置于模具定型得到膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料，消毒備用；
[0017](4)將hUCMSCs種植于膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料。
[0018]hUCMSCs用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM低糖培養(yǎng)液中含100ml/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution, PBS), lOOU/mL 青霉素、100 μ g/mL 鏈霉素，10nmol/L 地塞米松、200 μ m/L L-抗壞血酸-2-磷酸鹽及l(fā)Ommol/L B-甘油磷酸鈉)稀釋，將細胞懸液滴加到膠原蛋白縫合線-CPC支架上，然后將細胞與材料復(fù)合物放置在37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中進行孵育。膠原蛋白縫合線-CPC支架在接種干細胞前先用鈷60消毒后再用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液浸泡24h。
[0019]可將本發(fā)明種植了人臍帶血間充質(zhì)干細胞的膠原蛋白縫合線-CPC支架作為骨填充物直接放置于骨缺損部位。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:一方面，本發(fā)明的膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料強度高，可用于承重區(qū)骨的修復(fù)；另一方面，本發(fā)明使用hUCMSCs作為干細胞來源，避免了傳統(tǒng)使用骨髓干細胞造成新的創(chuàng)傷的缺點，而且具有低成本獲取、來源廣闊、無免疫原性及致瘤性等優(yōu)勢。此外，本發(fā)明的臍帶血干細胞與可降解膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料復(fù)合構(gòu)建組織工程人工骨的方法相對簡單，操作方便，成本較低，能夠廣泛應(yīng)用于臨床骨缺損的修復(fù)。而使用本發(fā)明制備的組織工程人工骨進行骨缺損的修復(fù)方法也非常容易操作，便于在修復(fù)手術(shù)中進行推廣和應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為hUCMSCs分別在CPC與膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料上粘附生長情況圖。【具體實施方式】
[0021]以下結(jié)合實施例旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0022]實施例1
[0023]本發(fā)明的膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料，由膠原蛋白縫合線、TTCP和DCPA組成。通過調(diào)整膠原蛋白縫合線的比例可改變CPC的強度，最后將干細胞接種到膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料上，構(gòu)建組織工程人工骨。
[0024]本實施例的組織工程人工骨的構(gòu)建步驟如下:
[0025]( I)膠原蛋白縫合線-CPC復(fù)合材料的制備
[0026]TTCP和DCPA購自北京恩賽科技股份有限責(zé)任公司，其中TTCP粉末的平均尺寸為20 μ m, DCPA顆粒的平均長度為2 μ m。TTCP和DCPA混合形成CPC粉末，TTCP和DCPA以摩爾比1/1混合。膠原蛋白縫合線購自武漢眾鑫醫(yī)療器械有限責(zé)任公司(縫線型號為2#，可提供力學(xué)支撐約50天)，將膠原蛋白縫合線剪成長為6mm備用。膠原蛋白縫合線與CPC的體積比為1/3。膠原蛋白縫合線-CPC混勻后再將混合物與去離子水混合，混合的質(zhì)量比為3/1。將糊狀物至于4X3X 25cm的模具(力學(xué)測定)及厚度為2mm，直徑12mm的圓形(生物學(xué)測試)模具定型4小時，干燥后用于下面相關(guān)測試。
[0027](2)樣品的力學(xué)性能[0028]三點彎曲試驗用于測定樣品的抗彎強度，跨距為20mm，加載速度為0.5mm/min?？箯潖姸萐=3F L/(2bd2),式中F是最大載荷，L是跨度，b是樣品寬度，d是厚度。彈性模量E= [3L (P1-P2) /2bh2 (S2-S1) ] X 10_3，式中Pl，P2分別為材料在線性范圍內(nèi)加載的初載荷和末載荷，L是跨度，b是樣品寬度，h是厚度，S1、S2分別為與Pl與P2對應(yīng)的試樣跨中的應(yīng)變。
(3)hUCMSCs種植于CPC支架
[0029]在24孔培養(yǎng)板中加入膠原蛋白縫合線-CPC材料作為試驗組，普通培養(yǎng)板作為空白對照。hUCMSCs用2ml成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(DMEM低糖培養(yǎng)液中含100ml/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution, PBS), lOOU/mL 青霉素、100 μ g/mL 鏈霉素，10nmol/L 地塞米松、200 μ m/L L-抗壞血酸-2-磷酸鹽及l(fā)Ommol/L B-甘油磷酸鈉)稀釋；將細胞懸液滴加到膠原蛋白縫合線-CPC支架上，每孔20000個細胞左右，細胞與材料復(fù)合物放置在37°C、5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中進行孵育，每2天換液一次，共培養(yǎng)14天。膠原蛋白縫合線-CPC支架在接種干細胞前先用鈷60消毒后再用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液浸泡24h。
[0030](4)掃描電鏡(Scaning electron microscopy, SEM)觀察 hUCMSCs 在 CPC 與膠原蛋白縫合線-CPC材料上粘附生長情況
[0031]hUCMSCs與膠原蛋白縫合線-CPC支架共培養(yǎng)7天，使用PBS洗滌，2.5%戊二醛固定，酒精梯度脫水，餓酸浸泡，干燥并噴金后SEM觀察hUCMSCs在材料上的粘附生長情況。
[0032](5) MTT法檢測材料對hUCMSCs生長及增殖的影響
[0033]共培養(yǎng)14天，細胞與材料復(fù)合物移入一新的24孔板，加入PBS洗滌2次，再加入Iml的PBS和100 μ IMTT溶液(5mg/ml)繼續(xù)37 °C孵育4小時，然后吸棄培養(yǎng)液，加入DMSOlml，震蕩使甲瓚完全溶解，取200 μ 1DMS0溶解液加入到一新的96孔板。酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm處測定每孔光吸收值。
[0034](6)酶聯(lián)法檢測hUCMSCs在材料上的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性
[0035]ALP活性在干細胞的成骨分化中起著重要的作用，是評價hUCMSCs成骨分化的重要指標。各組細胞分別培養(yǎng)14天，吸棄各孔培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，將膠原蛋白縫合線-CPC支架移入一新的24孔板，加入0.2ml去離子水，反復(fù)凍融3次(-80°C和室溫，每次30分鐘)，收集樣品至1.5ml的離心管，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，仔細收集上清。取上清按兔堿性磷酸酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢華美)提供的步驟進行操作，酶聯(lián)儀450nm波長處測定各孔吸光度值，通過標準曲線計算樣品中堿性磷酸酶濃度，以普通培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞作為對照組。
[0036]試驗結(jié)果如下:
[0037](I)力學(xué)結(jié)果[0038]膠原蛋白縫合線-CPC的彎曲強度為24MPa，明顯高于CPC樣品的lOMPa。膠原蛋白縫合線-CPC的彈性模量為5.1GPa,明顯高于CPC樣品的2.3GPa。
[0039](2) SEM 結(jié)果
[0040]如圖1所示，hUCMSCs (用箭頭表示)分別粘附于CPC (圖1A)與膠原蛋白縫合線-CPC(圖1B)支架上，細胞在兩種材料上粘附生長并大量增殖，已基本覆蓋材料的表面。這些數(shù)據(jù)顯示，膠原蛋白縫合線可增強CPC的力學(xué)性能，但不會影響hUCMSCs在材料上的粘附生長。
[0041](3) hUCMSCs在不同材料上的增殖
[0042]第14天，CPC組和膠原蛋白縫合線-CPC組的吸光度值分別為1.02和1.05，兩組無統(tǒng)計學(xué)意義。這些數(shù)據(jù)顯示，膠原蛋白縫合線可增強CPC的力學(xué)性能，但不會影響hUCMSCs在材料上的增殖。
[0043](4) ALP 活性
[0044]膠原蛋白縫合線-CPC組ALP活性為4.12U/L，BCP組4.10U/L，兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義。兩者都明顯高于對照組ALP活性(1.58U/L)。這些數(shù)據(jù)顯示，膠原蛋白縫合線可增強CPC的力學(xué)性能，但不會影響hUCMSCs在材料上的成骨分化。
[0045]使用本實施例制備得到的組織工程人工骨修復(fù)骨缺損，具體的修復(fù)方法為:將組織工程人工骨直接放置于骨缺損部位。使用本發(fā)明制備的組織工程人工骨修復(fù)骨缺損，既能使人工骨的修復(fù)強度明顯提高，而且由于加入了干細胞可加速骨的愈合。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程人工骨，其特征在于，是在由膠原蛋白縫合線及磷酸鈣骨水泥混合制成的復(fù)合材料上接種了人臍帶血間充質(zhì)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程人工骨，其特征在于，所述的磷酸鈣骨水泥是由磷酸四鈣和磷酸氫鈣以摩爾比1:1混合的粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織工程人工骨，其特征在于，把膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末按1:3-5的體積比混勻后加入去離子水，調(diào)成糊狀物放置于模具定型后制成復(fù)合材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織工程人工骨，其特征在于，膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合物與去離子水的質(zhì)量比為3-5:1。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的組織工程人工骨的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)磷酸鈣骨水泥粉末的混合， 磷酸四鈣和磷酸氫鈣 以摩爾比1:1混合； (2 )膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合， 把膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末按1:3-5的體積比混勻； (3)膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料的制備， 膠原蛋白縫合線與磷酸鈣骨水泥粉末的混合物與去離子水按照質(zhì)量比為3-5:1混合調(diào)制成糊狀物，將糊狀物放置于模具定型得到膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料，消毒備用； (4)將人臍帶間充質(zhì)干細胞種植于膠原蛋白縫合線-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料。
【文檔編號】A61L27/12GK103520774SQ201310440363
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】胡建中, 呂紅斌, 周永春 申請人:胡建中