專利名稱：一種新的免疫毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由生物工程技術(shù)制備的免疫毒素，特別是涉及一種用人源性毒素穿孔素(perforin)的活性片段作為毒素分子，通過基因工程技術(shù)將穿孔素的活性片段與載體相結(jié)合而制成的免疫毒素。
目前，所用的大多數(shù)毒素仍為異源性毒素，細(xì)菌或植物來源，如綠膿桿菌外毒素PE，白喉?xiàng)U菌外毒素DT，蓖麻毒素Ricin等，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床使用已證明這類毒素可喚起機(jī)體對(duì)毒素的免疫反應(yīng)，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可中和免疫毒素的細(xì)胞毒活性。此外，目前所用毒素均屬于細(xì)胞內(nèi)毒素，包括人源毒素RNA酶(血管生成素等)，要發(fā)揮作用，首先涉及到毒素的內(nèi)化(endocytosis/internalization)，毒素能夠被載體順利攜帶使之內(nèi)化，并能轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)中才能發(fā)揮作用。不能內(nèi)化或不能適當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)則無活性，不能殺傷靶細(xì)胞。應(yīng)用人源性毒素(如血管生成素)作為毒素分子，由于其作用過程亦需內(nèi)化，作用機(jī)制與經(jīng)典毒素類似，用這種免疫毒素治療惡性腫瘤，更有刺激腫瘤血管增生之慮，并未得到廣泛接受和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)人體不具有免疫原性，有嚴(yán)格靶向性，可直接激發(fā)細(xì)胞膜損傷過程，不需內(nèi)化及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程的免疫毒素。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法是以PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼細(xì)胞因子或者抗體的基因片段，以及編碼穿孔素(Perforin)活性部位的基因片段，與表達(dá)載體(Expression Vector)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，復(fù)性并分離純化得到免疫毒素。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是人源性毒素穿孔素的活性片段為人體固有蛋白，又是一種膜損傷性毒素，長期反復(fù)應(yīng)用不會(huì)發(fā)生過敏或免疫反應(yīng)，也不需要內(nèi)化。殺傷靶細(xì)胞的過程直接、迅速，與已有技術(shù)相比，殺傷時(shí)間可縮短3-100倍。本發(fā)明可廣泛在生物工程領(lǐng)域的各類生產(chǎn)單位實(shí)施，可用于治療某些腫瘤、自身免疫性疾病，特別適合用于抑制器官移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)。
實(shí)施例一、IL2HPN34重組免疫毒素的質(zhì)粒構(gòu)建1.擴(kuò)增不含終止密碼的IL2 cDNA片段取凍存的分別含pBV221/IL2原核表達(dá)質(zhì)粒和pBV221原核表達(dá)質(zhì)粒的菌株，劃線接種于含氨芐青霉素的LB-瓊脂培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)20小時(shí)，挑取單菌落接種于10ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基30℃振搖過夜，采用小量快速質(zhì)粒提取法，提取質(zhì)粒作為模板。
IL-2上游引物5′GGG AAT TCC ATG GCA CCT ACT TCAA3’，5’端包含有EcoRI酶切位點(diǎn)，ATG起始密碼，但不含信號(hào)肽序列，IL2下游引物5’-GCC GGA TCC AGT TAG TGT TGA GA-3’不含終止密碼，含BamHI酶切位點(diǎn)。
以適度稀釋的pBV221/IL2質(zhì)粒DNA為模板，以特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增不含終止密碼的IL2 cDNA片段，反應(yīng)條件如下反應(yīng)體系去離子水30μl25mM MgCl23μl4×dNTP 4μl(每鐘200μM)上游引物2.5μl(25pmol)下游引物2.5μl(25pmol)
模板1μl(～100ng)經(jīng)95℃變性10分鐘，加入Taq DNA聚合酶2u表面覆蓋液體石蠟以防蒸發(fā)，94℃，50秒變性，55℃，50秒退火，72℃，1分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)，最終72℃延伸10分鐘，循環(huán)完畢，取反應(yīng)產(chǎn)物5μl，2.0％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物為參照，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物為420bp片段。經(jīng)電泳證實(shí)后，以酚氯仿抽提，乙醇沉淀，風(fēng)干后溶于適量去離子水中備用。
2.人穿孔素(HP)cDNA活性片段的制備HPN34上游引物5’GCC GGA TCC CCG TGC CAC ACA GCCGCA 3’起始于HP第一個(gè)氨基酸，含BamHI酶切點(diǎn)，不含起始密碼，下游引物5’-CCG CTG CAG TTA GCG GCG GAG GCT GGTCA3’，與nt85 nt102互補(bǔ)，含Pst1酶切位點(diǎn)及終止密碼。
取凍存的含PCDM8/HP質(zhì)粒的菌株，劃線接種于含氨芐青霉素和四環(huán)素的LB-瓊脂板上，37℃培養(yǎng)20小時(shí)，挑取單菌落，于10ml含兩種抗菌素的LB培養(yǎng)基中37℃的振蕩過夜，采用小量快速質(zhì)粒提取法提取質(zhì)粒。
以PCDM8/HP質(zhì)粒為模板，加入特異性HPN34引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同前。
3. pBV221/IL2 HPN34質(zhì)粒構(gòu)建及工程菌建立①取不含終止密碼的IL2基因片段，HPN34基因片段，以及質(zhì)粒pBV221，分別用EcoRI/BamHI，BamHI/PstI，EcoRI/PstI雙酶切，酶切體系20μl，37℃ 3小時(shí)，取少量酶切產(chǎn)物電泳，證實(shí)pBV221已被切開，經(jīng)低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收線化的pBV221質(zhì)粒，及經(jīng)酶切的IL2，HPN34基因片段，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于適量去離子水中，三者按一定比例混勻，加T4連接酶及連接緩沖液，總量20μl，16℃連接過液。連接產(chǎn)物置4℃?zhèn)溆谩?br> ②DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備-70℃凍存的DH5α菌株，劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37℃劇烈振搖培養(yǎng)，至OD600，達(dá)0.3～0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管，冰浴10分鐘，4000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，加入預(yù)冷的0.1M無菌CaCl2溶液10ml，重懸細(xì)菌，冰浴10分鐘，4℃，4000rpm，離心沉淀細(xì)菌，再以2ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液重懸，分裝至1.5mlEppendorf管備用(200μl/支)。
③重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化取制備的感受態(tài)細(xì)胞200μl，加入連接產(chǎn)物5μl(50ng)，混勻后冰浴30分鐘，42℃循環(huán)水浴2分鐘后，迅速置冰浴中2分鐘，加800μl LB培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，取100μl菌液用無菌玻棒涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板，30℃培養(yǎng)20小時(shí)，觀察菌落生長情況。
二、重組體IL2HPN34融合蛋白的表達(dá)和初步純化(一)證實(shí)pBV221/IL2HPN34表達(dá)融合蛋白①待測(cè)樣品準(zhǔn)備，取經(jīng)證實(shí)含有pBV221/HPN34質(zhì)粒的菌株，接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃擴(kuò)增細(xì)菌至OD6000.5，升溫至42℃，誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)(對(duì)照不升溫誘導(dǎo))。4℃，4000rpm離心，沉淀細(xì)菌，加1×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃水浴變性5分鐘備用。
②SDS-PAGE電泳檢測(cè)IL2HPN34融合蛋白表達(dá)。照儀器說明書安裝電泳裝置，按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》配制15％，Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠及5％的積層膠，并灌制膠板。等凝膠聚合后，取上述制好的樣品，依次加樣，每孔15μl，電泳(積層膠70V，分離膠140V)，至溴酚蘭到達(dá)分離膠下緣，停止電泳，取下凝膠，考馬氏亮蘭染色4小時(shí)，甲醇醋酸脫色至條帶清晰，背景透明。可見誘導(dǎo)株出現(xiàn)一條約18-20KD的蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量相符。
(二)IL2HPN34大量表達(dá)及初步純化選擇表達(dá)陽性菌株，接種于100ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃振搖培養(yǎng)至OD6000.5，升溫42℃誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)，4℃，4000rpm離心收菌，重懸于適量細(xì)菌破碎緩沖液(20mM Tris 50mMEDTA.pH7.5)，加入溶菌酶(1mg/1ml)，室溫下放置30分鐘，冰浴下超聲粉碎，在含1％ Triton-X100的洗滌液及含2％脫氧膽酸鈉的洗滌液中反復(fù)多次離心，(1％ Triton-X100，30mM Tris，50mMEDTA，2％脫氧膽酸20mM Tris，50mM EPTA，pH7.5)，獲得包涵體。6M鹽酸胍裂解包涵體，以0.1M Tris(pH8.0)復(fù)性緩沖液，室溫下稀釋復(fù)性，復(fù)性產(chǎn)物對(duì)生理鹽水透析，除去鹽酸胍等雜質(zhì)。然后經(jīng)硫酸銨分段沉淀(30％及80％飽和硫酸銨)，沉淀產(chǎn)物透析除鹽，過濾除菌，即得到粗制IL2HPN34。
還可根據(jù)上述原理制備出以穿孔素其它活性片段作為毒素分子的免疫毒素。
權(quán)利要求
1.一種由載體分子與毒素分子經(jīng)基因工程技術(shù)制備的免疫毒素，其特征在于所述的免疫毒素的毒素分子是穿孔素(Perforin)的活性片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的免疫毒素,其特征在于利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作為毒素分子,通過基因工程技術(shù)將毒素分子與載體分子的基因重組在大腸桿菌中表達(dá)出的免疫毒素,其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)人體不具有免疫原性,有嚴(yán)格靶向性,可直接激發(fā)細(xì)胞損傷過程,殺滅靶細(xì)胞,不需要內(nèi)化及細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程,可用于治療某些腫瘤和自身免疫性疾病。特別是適合用于抑制器官移植時(shí)的免疫排斥反應(yīng)。
文檔編號(hào)C07K2/00GK1254717SQ9811302
公開日2000年5月31日 申請(qǐng)日期1998年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月24日
發(fā)明者王一理, 司履生 申請(qǐng)人:西安醫(yī)科大學(xué)