專利名稱：從河豚魚肝臟提取河豚毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從河豚魚肝臟提取高純度河豚毒素的方法。
一種從河豚魚肝臟提取河豚毒素的方法，其特征是將河豚魚肝切碎，用去離子水低溫浸泡，攪動，將浸提液過濾，冷凍，再重復浸泡數(shù)次，直至浸提液無毒后，獲得粗毒液；該粗毒液經(jīng)冷凍放置后，出現(xiàn)沉淀，吸出上層澄清液，加熱至沸騰之后，將毒液放出，再冷凍后，分出上清毒液，經(jīng)過濾后得到橙黃色澄清粗毒液；調(diào)節(jié)pH值，加入活性炭，攪拌，過濾，得到淺黃色澄清液；將氫型陽離子110樹脂與該澄清液混合，攪拌，過濾，得到的微黃色澄清液，經(jīng)過銨型陽離子110樹脂，飽和后用酸洗脫樹脂，收集洗脫部分；調(diào)節(jié)pH值，降溫，靜置，數(shù)天后出現(xiàn)晶體，將母液吸出，過濾，再調(diào)pH，冷凍，靜置，結(jié)晶，反復調(diào)節(jié)pH數(shù)次，得白色粉末狀晶體；或?qū)⑾疵摬糠荩么罂孜綐渲珼101重復吸附，后用醇、酸水溶液洗脫，得到毒液，調(diào)節(jié)pH值得到河豚毒素晶體。
本發(fā)明的優(yōu)點是(1)對毒液重復吸附能最大限度地提高河豚毒素的回收率；(2)采用氫型樹脂材料能有效地除去雜質(zhì)，減少了提取時間，使河豚毒素的生物活性損失減少到最低限度；(3)提取分離過程中，保持較低溫度處理；(4)從河豚毒素的提取原料上來看，肝臟較卵巢更易獲得。
2、將上述粗毒液經(jīng)冰庫放置后出現(xiàn)絮狀沉淀，用蠕動泵吸出上層澄清液，打入加熱鍋中，底層沉淀液用濾紙過濾后也加入鍋內(nèi)，加熱至沸騰并維持10分鐘之后，將毒液放出，冷卻后打回冰庫冷凍，靜置待其出雜質(zhì)沉淀，冷凍2小時后，打出桶中的上清毒液，經(jīng)過濾后得到橙黃色澄清粗毒液，調(diào)pH值至4.0，加入經(jīng)處理過的活性炭，毒液(ml)與活性炭(g)比例為50∶1，攪拌30分鐘，經(jīng)過濾得到淺黃色澄清液。
3、將轉(zhuǎn)化好的氫型110樹脂加入淺黃色澄清液，樹脂與毒液體積比1∶15，靜相反應，攪拌30分鐘，經(jīng)過濾得到微黃色澄清液。該微黃色澄清液經(jīng)過氨型110樹脂，流速為50ml/min。用小鼠法監(jiān)測飽和情況，飽和后停止上料。
4、配制15％(重量百分濃度)的HAC洗脫液，用它以10ml/min的流速洗脫毒液，用碘量瓶收集洗脫毒液。調(diào)節(jié)pH值到9.5，放入冰箱，靜置，數(shù)天后晶體出現(xiàn)。將碘量瓶中的母液吸出，用一定濃度的醋酸溶解附壁物，用砂芯漏斗過濾，再調(diào)pH到9.5，放入冰箱，靜置，待出結(jié)晶。如此反復4次最終得白色粉末狀晶體111.8mg，經(jīng)HPLC定量純度為87％.如

圖1所示。
5、如果上述操作未得到結(jié)晶，則作如下處理將洗脫過程中得到的毒液用稀氨水調(diào)節(jié)pH值為7.5，調(diào)節(jié)過程中出現(xiàn)絮狀沉淀，過濾，將D101樹脂加入過濾好的清液，靜相反應，適時攪動，約2小時后，取少量D101樹脂和毒液的混合液過濾，小鼠法檢測毒液的毒力，腹腔注射0.5ml不死即認為濾液無毒，后用布氏漏斗過濾出D101樹脂。
6、用無離子水在250ml聚乙烯離心桶內(nèi)洗D101樹脂，該樹脂和水的比例為1∶3，用玻璃棒攪勻D101樹脂，15分鐘后停止攪動，冷凍，用離心機離心10分鐘，棄去上清液再加水洗，重復水洗數(shù)次。將洗好的D101樹脂濕法裝柱，用乙醇、醋酸、水(它們的重量比為20∶2∶78)的混合液洗脫，收集洗脫液，直接結(jié)晶。得到河豚毒素晶體54.25mg，經(jīng)HPLC定量，純度為87％。
權(quán)利要求
1.一種從河豚魚肝臟提取河豚毒素的方法，其特征是將河豚魚肝切碎，用去離子水低溫浸泡，攪動，將浸提液過濾，冷凍，再重復浸泡數(shù)次，直至浸提液無毒后，獲得粗毒液；該粗毒液經(jīng)冷凍放置后，出現(xiàn)沉淀，吸出上層澄清液，加熱至沸騰之后，將毒液放出，再冷凍后，分出上清毒液，經(jīng)過濾后得到橙黃色澄清粗毒液；調(diào)節(jié)pH值，加入活性炭，攪拌，過濾，得到淺黃色澄清液；將氫型陽離子110樹脂與該澄清液混合，攪拌，過濾，得到的微黃色澄清液，經(jīng)過銨型陽離子110樹脂，飽和后用酸洗脫樹脂，收集洗脫部分；調(diào)節(jié)pH值，降溫，靜置，數(shù)天后出現(xiàn)晶體，將母液吸出，過濾，再調(diào)pH，冷凍，靜置，結(jié)晶，反復調(diào)節(jié)pH數(shù)次，得白色粉末狀晶體；或?qū)⑾疵摬糠萦么罂孜綐渲珼101重復吸附，后用醇、酸水溶液洗脫，得到毒液，調(diào)節(jié)pH值得到河豚毒素晶體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的去離子水與肝臟的重量比例為1-5∶1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的加熱溫度為100℃以上，加熱時間在2分鐘以上。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的調(diào)節(jié)粗毒液pH到3-7，毒液的ml數(shù)與活性炭的g數(shù)的比例范圍為10-50∶1。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，所述的低溫為0-15度。
全文摘要
一種從河豚魚肝臟提取河豚毒素的方法，其特征是將河豚魚肝切碎，低溫浸泡，攪動，過濾，冷凍，再重復浸泡數(shù)次，獲得粗毒液，經(jīng)冷凍放置后，出現(xiàn)沉淀，加熱至沸騰后，放出毒液，再冷凍后，分出上清毒液，調(diào)節(jié)pH值，加入活性炭，攪拌，過濾，將陽離子110樹脂與該澄清液混合，攪拌，過濾，經(jīng)過陽離子110樹脂，飽和后用酸洗脫，收集洗脫部分；調(diào)節(jié)pH值，降溫，靜置，出現(xiàn)晶體后，將母液吸出，過濾，再調(diào)pH，冷凍，靜置，結(jié)晶，反復調(diào)節(jié)pH數(shù)次，得白色粉末狀晶體；本發(fā)明能最大限度地提高河豚毒素的回收率；能有效地除去雜質(zhì)，減少了提取時間，使河豚毒素的生物活性損失減少到最低限度；提取分離過程中，保持較低溫度處理；原料更易獲得。
文檔編號C07D491/22GK1470515SQ0313870
公開日2004年1月28日 申請日期2003年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者宮慶禮, 崔建洲, 閻承璋, 王仁芳, 黃海龍 申請人:中國海洋大學