專(zhuān)利名稱(chēng)：Brca1活性調(diào)節(jié)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛涉及人類(lèi)疾病領(lǐng)域，更特別地涉及對(duì)基于具有BRCA1活性的調(diào)節(jié)子的疾病的治療和診斷方法。
背景技術(shù)：
乳腺癌是美國(guó)死于癌癥的婦女的主要病因，每年有近170000名婦女罹患該病。報(bào)導(dǎo)病例的5％被認(rèn)為起因于患者對(duì)該病有遺傳傾向。乳腺癌通常可分為早期發(fā)作和晚期發(fā)作型，后者定義為在50歲左右發(fā)病。診斷患有乳腺癌的40歲以下婦女的接近25％被認(rèn)為是家族性的，因此是有遺傳因素的。晚期型乳腺癌也常是家族性的，雖然該病患者的家庭成員患此病的危險(xiǎn)要少于早期型患者的家庭成員。
根據(jù)對(duì)遺傳性早期乳腺癌和卵巢癌家族的研究，據(jù)稱(chēng)與這些疾病相關(guān)的一個(gè)基因已確定位于17號(hào)染色體的長(zhǎng)臂，命名為BRCA1，或乳腺癌1基因(breast cancer one gene)。見(jiàn)Hitoyuki T.等，癌癥研究，552998-3002。對(duì)偶發(fā)乳腺癌的研究也表明該病與更精確地定位于染色體區(qū)17q21的BRCA1有遺傳聯(lián)系。見(jiàn)Hall J.M.等，科學(xué)，2501684-1689(1990)。
最近，BRCA1基因已被克隆，顯示出編碼一個(gè)有腫瘤抑制蛋白活性的蛋白質(zhì)。參見(jiàn)Miki Y.等，科學(xué)，26666-71；WO96/05306。一段時(shí)間以來(lái)，人們已經(jīng)知道許多癌癥至少部分起因于某些稱(chēng)為“原癌基因”的正?；虻耐蛔??！霸┗颉眳⑴c調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)，其方式剛剛開(kāi)始在分子水平進(jìn)行探討。突變的“原癌基因”，或稱(chēng)為“癌基因”的致癌基因破壞了正常細(xì)胞生長(zhǎng)，如果癌癥不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療，這最終將導(dǎo)致生物的死亡。正常或癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，“原癌基因”或“癌基因”分別與調(diào)節(jié)或試圖調(diào)節(jié)正常細(xì)胞或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子相抗衡。這種蛋白稱(chēng)為腫瘤抑制蛋白，包括BRCA1、P53、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(Rb)，多發(fā)性結(jié)腸腺癌蛋白(APC)、Wilm癌1型蛋白(WT1)、1型神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF1)和2型神經(jīng)纖維瘤蛋白(NF2)。
BRCA1 cDNA編碼具1863個(gè)氨基酸的一個(gè)蛋白質(zhì)，理論分子量接近207000。參見(jiàn)Miki Y.等(1994)，科學(xué)，26666-71。BRCA1經(jīng)過(guò)克隆和鑒定表明是一個(gè)腫瘤抑制蛋白。例如幾位研究者最近的工作表明將BRCA1基因序列轉(zhuǎn)染到MCF-7腫瘤細(xì)胞中并表達(dá)時(shí)，抑制了體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了患有腫瘤的動(dòng)物的存活時(shí)間。參見(jiàn)Holt J.T.等，(1996)，國(guó)家遺傳學(xué)(Nat.Genet.)，12298-302。用表達(dá)抗已形成的MCF-7腹膜腫瘤的野生型BRCA1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體得到相似的結(jié)果。
已有大量工作致力于鑒定BRCA1中影響其腫瘤抑制活性的區(qū)域?？磥?lái)該分子的不同區(qū)域?qū)ζ淠[瘤抑制活性影響不同。例如，近手全長(zhǎng)的截短BRCA1蛋白不抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但能抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)。參見(jiàn)Holt J.T.等，(1996)，國(guó)家遺傳學(xué)，12298-302。這些現(xiàn)象有力地提示不同的宿主細(xì)胞因子，推測(cè)是一些蛋白質(zhì)，與BRCA1不同區(qū)域相互作用而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
在過(guò)去幾年中已著手闡明某些腫瘤抑制蛋白與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用。參見(jiàn)Levin A.，生物化學(xué)年度綜述，1993，62卷623-651。鑒定參與這些相互作用的蛋白將有助于發(fā)展新的診斷方法，和新的確診、治療癌癥的療法。例如，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑制蛋白鄰近脯氨酸的絲氨酸處于磷酸化狀態(tài)。細(xì)胞周期S、G2和M期磷酸化水平高，影響這個(gè)反應(yīng)的激酶依次被調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一個(gè)細(xì)胞周期蛋白激活。隨后在有絲分裂晚期，磷酸酶移去該蛋白質(zhì)的磷酸基團(tuán)，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤抑制蛋白在G0-G1期恢復(fù)非磷酸化狀態(tài)。顯然，鑒定出能影響這些相互作用的藥物有望在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，因而能應(yīng)用于癌癥治療。
然而，到目前為止，對(duì)與腫瘤抑制蛋白BRCA1的相互作用的研究很少。為了完善診斷和治療乳腺癌、卵巢癌的方法，關(guān)鍵在于鑒定和分離出這樣的蛋白質(zhì)。
發(fā)明概述本發(fā)明第一個(gè)目的是描述一族相關(guān)的分離核酸序列，它們編碼以下稱(chēng)為調(diào)節(jié)子蛋白的能結(jié)合腫瘤抑制蛋白BRCA1的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第二個(gè)目的是描述一族相關(guān)的分離核酸序列，它們編碼分子量大約45-97Kdal的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述蛋白質(zhì)至少有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，任選有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，它們結(jié)合位于BRCA1前600個(gè)氨基酸內(nèi)用于調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合的不連續(xù)序列。
本發(fā)明第三個(gè)目的是描述有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的分子量約為53Kdal的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均靠近分子的氨基端，結(jié)合BRCAI上位于BRCA1前600個(gè)氨基酸內(nèi)調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合的共有序列。
本發(fā)明第四個(gè)目的是分別描述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離核酸或蛋白質(zhì)片段。
本發(fā)明第五個(gè)目的是描述用編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白或片段的分離的核酸序列轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明第六個(gè)目的是描述含有編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白或片段的分離的核酸序列的載體。
本發(fā)明第七個(gè)目的是描述由BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的全長(zhǎng)或片段組成的復(fù)合物。
本發(fā)明第八個(gè)目的是描述利用編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白全長(zhǎng)或其片段的分離核酸序列或其片段診斷疾病，優(yōu)選涉及不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病(包括癌癥)的方法。
本發(fā)明第九個(gè)目的是描述一種檢驗(yàn)方法，用于鑒定對(duì)涉及不希望的細(xì)胞生長(zhǎng)的疾病(包括癌癥)有療效的化合物。
在閱讀了下述說(shuō)明書(shū)中對(duì)本發(fā)明各個(gè)方面的描述后，本發(fā)明以上和其它目的對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明上述和其它內(nèi)容在下面的附圖、發(fā)明詳述、實(shí)施例中將作更詳細(xì)解釋。
附圖概述

圖1顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為1號(hào)序列，091-21A31。
圖2顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為3號(hào)序列，091-1F84。
圖3顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和氨基酸序列，描述為5號(hào)序列，091-132Q20。
圖4顯示可提高細(xì)胞內(nèi)BRCA1含量的化合物的鑒定方法模式。
表1顯示BRCA1中與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白3號(hào)序列091-1F84，1號(hào)序列091-21A31，5號(hào)序列091-132Q20相互作用的區(qū)域。實(shí)驗(yàn)中利用雙雜合檢測(cè)方法，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5 283 173或Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582。編碼3號(hào)序列091-1F84，1號(hào)序列091-21A31和5號(hào)序列091-132Q20的cDNA與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合，表中顯示的BRCA1區(qū)域與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合?！?”號(hào)作為β-半乳糖苷酶活性指標(biāo)。一個(gè)“+”號(hào)表示活性最低，三個(gè)表示活性最高。
表2顯示BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白1號(hào)序列091-21A31中與BRCA1的區(qū)域相互作用的區(qū)域。
發(fā)明詳述說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)?jiān)诖艘胱鳛閰⒖?，它們?cè)谕怀潭壬媳灰?，似乎每篇出版物或?qū)＠暾?qǐng)都是特別地并單獨(dú)地引入作為參考。
定義首先需要指出，除非另有規(guī)定，此處所有科技名詞與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。一般所用的術(shù)語(yǔ)和下面描述的實(shí)驗(yàn)操作是本領(lǐng)域內(nèi)公知和常用的。重組核酸方法、多核苷酸合成、微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化(如電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染)均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。通常，酶反應(yīng)和提純步驟均參照生產(chǎn)商說(shuō)明。技術(shù)和操作通常按照本領(lǐng)域常規(guī)方法和常用參考書(shū)進(jìn)行(通常參考Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(1989)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.，在此引入作為參考)。此處所用的術(shù)語(yǔ)和下面描述的分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)及藥物配制實(shí)驗(yàn)操作是本領(lǐng)域內(nèi)公知和常用的?；瘜W(xué)合成、化學(xué)分析、藥物配制和給藥、患者醫(yī)治均使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
表示本發(fā)明BRCA1或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白選定的特定實(shí)施方案的分子式中，盡管常常未特別指出，但應(yīng)理解氨基和羧基末端基團(tuán)為處于生理pH值時(shí)的構(gòu)型，除非另有規(guī)定。因此，應(yīng)理解在生理pH值時(shí)為N-端H2+和C-端O-狀態(tài)，在特定實(shí)施例或分子式中不特別說(shuō)明。此處所用多肽符號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)使用方法和傳統(tǒng)一致，即分子左手端是氨基末端，右手端是羧基末端。當(dāng)然，酸和堿式鹽，包括在非生理pH值時(shí)形成的鹽，也包含在本發(fā)明化合物中。文中所述氨基酸殘基優(yōu)選為L(zhǎng)異構(gòu)型。20個(gè)常見(jiàn)氨基酸、非天然氨基酸如a，a-分布的氨基酸(a，a-distributed amino acids)、N-烷基化氨基酸、乳酸及其它非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(如D型氨基酸)也適合作為本發(fā)明多肽的組分，只要該多肽仍保留了所需的功能性質(zhì)即可。對(duì)于圖示的多肽而言，每個(gè)編碼殘基適當(dāng)時(shí)用三字母表示，與常見(jiàn)氨基酸的三字母名稱(chēng)一致，這符合標(biāo)準(zhǔn)多肽命名法(描述于生物化學(xué)雜志，2433553-59(1969))，在37CFR§1.822(6)(2)中采用。
游離官能團(tuán)，包括位于羧基和氨基末端的(稱(chēng)為非干擾性取代基)，也可以是酰胺化、酰基化或其它改變化合物溶解度而不影響其活性的取代。這在已知BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白具有能結(jié)合BRCA1的某些區(qū)，并希望從這些區(qū)域制備可溶性多肽的情況中尤其有用。
本發(fā)明公開(kāi)中使用的下列術(shù)語(yǔ)，除非另有說(shuō)明，作如下理解“分離的蛋白質(zhì)”在本文中指一種來(lái)源于cDNA、重組RNA的蛋白質(zhì)，或者來(lái)源于合成的或某種組合的蛋白質(zhì)，由于其來(lái)源，所述“分離的蛋白質(zhì)”(1)基本上與自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)，(2)基本不含相同來(lái)源的其它蛋白質(zhì)，如不含人蛋白質(zhì)，(3)可以用其它種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)自然界中不存在。
此處用于描述物質(zhì)的“自然存在”是指該物質(zhì)能在自然界中找到。例如，存在于生物體(包括病毒)內(nèi)，能從自然界來(lái)源中分離得到，未被人有意在實(shí)驗(yàn)室修飾過(guò)的多肽和多核苷酸序列是自然存在的。
術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”在本文中指一個(gè)至少10個(gè)堿基長(zhǎng)的多聚體形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這兩種類(lèi)型的修飾形式。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈或雙鏈DNA。
本文所用術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”包括自然存在的、或通過(guò)自然存在或非自然存在的寡核苷酸鍵連接在一起的修飾核苷酸。寡核苷酸是具200個(gè)堿基或更短的多核苷酸子集合。優(yōu)選寡核苷酸長(zhǎng)度為10到60個(gè)堿基，最優(yōu)選12、13、14、15、16、17、18、19或20到40個(gè)堿基。寡核苷酸通常是單鏈的，例如用作探針；雖然也可以是雙鏈的，例如用于構(gòu)建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“自然存在的核苷酸”包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“修飾的核苷酸”包括帶有修飾的或取代的糖基等的核苷酸。本文所用術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸鍵”包括如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoroaniladate、氨基磷酸酯等寡核苷酸鍵。需要時(shí)寡核苷酸可帶有檢測(cè)標(biāo)記。
本文所用術(shù)語(yǔ)“序列同源性”是描述兩個(gè)核酸序列之間堿基匹配的比例或兩個(gè)氨基酸序列之間氨基酸匹配的比例。若序列同源性表示為百分比，如50％，則該百分比表示與其它序列進(jìn)行比較的BRCA1序列長(zhǎng)度上的匹配比例。可以允許存在缺口(在兩個(gè)序列中任一個(gè))以達(dá)到最大匹配程度；一般所用缺口長(zhǎng)度為15個(gè)堿基或更少，優(yōu)選6個(gè)堿基或更少，更優(yōu)選2個(gè)堿基或更少。寡核苷酸用作探針或處理時(shí)，目標(biāo)核酸和寡核苷酸序列之間序列同源性一般在20個(gè)可能的寡核苷酸堿基對(duì)配對(duì)中有不少于17個(gè)目標(biāo)堿基匹配(85％)；優(yōu)選10個(gè)可能的堿基對(duì)配對(duì)中有不少于9個(gè)目標(biāo)堿基匹配(90％)；最優(yōu)選20個(gè)可能的堿基對(duì)配對(duì)中不少于19個(gè)目標(biāo)堿基匹配(95％)。
如果兩個(gè)氨基酸序列部分或全部相同，則它們是同源的，例如，85％同源性意味著兩個(gè)序列排列比較達(dá)到最大匹配時(shí)有85％氨基酸是相同的?？梢栽试S存在缺口(在兩個(gè)序列任一個(gè)中)以達(dá)到最大匹配程度；缺口長(zhǎng)度優(yōu)選5個(gè)堿基或更少，更優(yōu)選2個(gè)堿基或更少?？商娲夭?yōu)選地，如果兩個(gè)蛋白質(zhì)序列(或來(lái)源于它們的最少30個(gè)氨基酸的多肽序列)用具有突變數(shù)據(jù)矩陣和缺口罰分為6或更大的ALIGN程序得到的序列對(duì)比度大于5(標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)，則它們是同源的。參見(jiàn)Dayhoff M.O.，蛋白序列與結(jié)構(gòu)圖譜，1972，第五卷，國(guó)家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，101-110，和該卷的第2號(hào)增刊，1-10頁(yè)。更優(yōu)選地，若用ALIGN程序最佳排列使兩個(gè)序列或其部分的氨基酸有50％或以上相同時(shí)，則它們是同源的。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個(gè)特點(diǎn)是有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。后者描述為富含亮氨酸殘基的一段氨基酸，通常為每第7個(gè)殘基，通過(guò)它，蛋白質(zhì)可二聚化形成同源或異源二聚體。有亮氨酸拉鏈的蛋白包括Jun和Fos。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個(gè)任選的特點(diǎn)是有鋅指結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選類(lèi)型是C3H2C3，C3HC4，或CX2CX11-27CXHX2H或CX2CX6-17CX2C；其中C、X和H分別代表半胱氨酸、一個(gè)氨基酸和組氨酸。這個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合鋅離子，經(jīng)常與結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)有關(guān)。用本領(lǐng)域人員知道的合適的數(shù)據(jù)庫(kù)，特別是Prosite Protein Database易于識(shí)別這樣的結(jié)構(gòu)域。
本文所用“基本純”意味著目的種類(lèi)是優(yōu)勢(shì)種類(lèi)(即組合物中，在摩爾水平上，它比其它種類(lèi)大分子含量高)，優(yōu)選地，基本純的級(jí)分是目的種類(lèi)至少占所有種類(lèi)大分子的50％(摩爾基礎(chǔ)上)的一種組合物。通常，一種基本純的組合物是組合物中目的種類(lèi)占所有種類(lèi)大分子的80％以上，更優(yōu)選高于85％、90％、95％和99％。最優(yōu)選目的種類(lèi)已純化至基本同質(zhì)(組合物中不能由常規(guī)檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)污染種類(lèi))，其中組合物基本由一種大分子組成。
“調(diào)節(jié)子蛋白”、“調(diào)節(jié)肽”或“調(diào)節(jié)多肽”指的是影響B(tài)RCA1基因的活性或該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)或肽。每個(gè)定義包括一個(gè)或更多這樣的實(shí)體。
化學(xué)術(shù)語(yǔ)的使用按照本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)使用方法，示例見(jiàn)此處引作參考的《McGraw-Hill化學(xué)名詞詞典》(Parker S.編，1985)，McGraw-Hil，San Francisco。
通過(guò)基因工程由克隆的基因制備蛋白質(zhì)是公知的技術(shù)。參見(jiàn)Bell等的美國(guó)專(zhuān)利4 761 371號(hào)第6列第3行到第9列第65行(所有引用的專(zhuān)利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容均在此引入作為參考)。下面的討論意欲作為本領(lǐng)域概述，不求反映全貌。
功能相關(guān)的DNA區(qū)是可操縱地連接在一起的。例如啟動(dòng)子與由它控制轉(zhuǎn)錄的編碼序列是可操縱地連接的；核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操縱地連接到由它決定起始翻譯的編碼序列上。通?？刹倏v地連接意味著是鄰近的，在前導(dǎo)序列的情況中，是鄰近的且讀框一致的。
合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或高等真核細(xì)胞。原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性和陽(yáng)性生物體，如大腸桿菌或桿菌屬(Bacilli)。高等真核細(xì)胞包括下面描述的來(lái)源于哺乳動(dòng)物的已建好的細(xì)胞系?？勺鳛槔拥乃拗骷?xì)胞是DH5α、E.coli W3110(ATCC27 325)、E.coli B、E.coli X1776(ATCC31 537)、E.coli294(ATCC31 446)。假單胞菌、芽孢桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesans)也是合適的宿主。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)可作為表達(dá)外源基因的載體。(參見(jiàn)Smith等，1983，病毒學(xué)雜志，46584；Smith，美國(guó)專(zhuān)利第4 215 051號(hào))。在下面描述的一個(gè)特定實(shí)施方案中，用表達(dá)標(biāo)記了glu-glu表位的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。參見(jiàn)Rubinfeld等，生物化學(xué)雜志，270(10)5549-5555(1995)。可使用本領(lǐng)域公知的其它表位標(biāo)記，包括6x組氨酸標(biāo)記、myc或EE-標(biāo)記(即Glu-Glu標(biāo)記)。E代表谷氨酸。
有多種合適的微生物載體可供選擇。通常，一種微生物載體包含能被目的宿主識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)、在宿主中能行使功能的啟動(dòng)子和表型選擇基因如編碼賦予抗生素抗性或提供自養(yǎng)需要的蛋白質(zhì)的基因?？蓸?gòu)建相似的構(gòu)建體以用于其它宿主。大腸桿菌通常使用pBR322轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)Bolivar等，基因，2，95(1977)。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此易于鑒定到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。表達(dá)載體應(yīng)含有能被宿主生物識(shí)別的啟動(dòng)子。這通常意味著啟動(dòng)子來(lái)源于目的宿主。最常用于重組微生物表達(dá)載體的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，自然，275，615(1978)；Goeddel等，核酸研究，8，4057(1980)和歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)36 776)，tac啟動(dòng)子(H.De Boer等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，80，21(1983))。這些是常用的，其它微生物啟動(dòng)子也是適宜的。許多啟動(dòng)子的核酸序列細(xì)節(jié)已公開(kāi)，技術(shù)人員可以將它們可操縱地連接到質(zhì)?；虿《据d體上編碼BRCA1的DNA上(Siebenlist等，細(xì)胞，20，269，1980)。啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno(SD)序列(用于在原核宿主中表達(dá)的情況)被可操縱地連接到編碼BRCA1的DNA上，即它們的定位能促進(jìn)從DNA到BRCA1信使RNA的轉(zhuǎn)錄。SD序列能通過(guò)它與大腸桿菌16S rRNA 3′末端的堿基配對(duì)促進(jìn)mRNA與核糖體的結(jié)合(Steitz等(1979)，生物調(diào)節(jié)與發(fā)育基因表達(dá)(R.F.Goldberger編))。要表達(dá)具有弱核糖體結(jié)合位點(diǎn)的原核基因和真核基因參見(jiàn)Sambrook等，(1989)“大腸桿菌中克隆基因的表達(dá)”，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》。此外，細(xì)菌啟動(dòng)子可以包括自然存在的非細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子，它具有結(jié)合細(xì)菌RNA聚合酶和起始轉(zhuǎn)錄的能力。自然存在的非細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子也可以與適宜的RNA聚合酶相偶聯(lián)以在原核細(xì)胞中高產(chǎn)量表達(dá)某些基因。噬菌體T7 RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)是偶聯(lián)啟動(dòng)子系統(tǒng)的一個(gè)例子(Studier等，(1986)，分子生物學(xué)雜志，189113；Tabor等(1985)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，821074)。另外，雜合啟動(dòng)子也可以由噬菌體啟動(dòng)子和大腸桿菌操縱子區(qū)域組成(歐洲專(zhuān)利公開(kāi)267 851號(hào))。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。啟動(dòng)子序列可以直接連接BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因或它的一個(gè)片段，這種情況下N端第一個(gè)氨基酸總是由ATG起始密碼子編碼的甲硫氨酸。N端的甲硫氨酸可根據(jù)需要用溴化氰體外溫育或用細(xì)菌甲硫氨酸N端肽酶(歐洲專(zhuān)利公開(kāi)219 237號(hào))通過(guò)體內(nèi)或體外溫育的方法而從該蛋白質(zhì)中切去。
真核微生物如酵母培養(yǎng)物可以用合適的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白載體轉(zhuǎn)化。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4 745 057。釀酒酵母是低等真核宿主微生物中最常用的，雖然有許多其它菌株可選用。酵母載體可以含有酵母2μ質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng)子、編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的DNA、多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止序列，及選擇基因。
適用于酵母載體的啟動(dòng)子序列包括金屬硫蛋白啟動(dòng)子、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化學(xué)雜志，255，2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7，149(1968)；Holland等，生物化學(xué)，17，4900(1978))，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡萄糖激酶等的啟動(dòng)子。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子在R.Hitzman等，歐洲專(zhuān)利公開(kāi)73 657號(hào)有進(jìn)一步的詳述。
來(lái)源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物是我們希望的用于重組BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白合成的宿主。原則上，任何來(lái)源于脊椎或無(wú)脊椎動(dòng)物的高等真核細(xì)胞都是可行的。但正如實(shí)施例中顯示，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)體系中增殖這些細(xì)胞已是常規(guī)操作。參見(jiàn)組織培養(yǎng)，學(xué)術(shù)出版社，Kruse和Paterson主編(1973)。
用于轉(zhuǎn)化脊椎動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列經(jīng)常來(lái)源于病毒。例如，常用的一些啟動(dòng)子來(lái)源于CMV、多瘤病毒、腺病毒2和猴病毒40(SV40)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4599308。
復(fù)制起點(diǎn)可通過(guò)構(gòu)建含有外源起點(diǎn)的載體提供，如來(lái)源于SV40或其它病毒(多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)或由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。如果載體能整合到宿主染色體中，則后者是一種有效的方法。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的鑒定BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的鑒定可以使用多種鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的不同檢測(cè)方法。可用的傳統(tǒng)方法有將細(xì)胞裂解液或利用BRCA1從細(xì)胞裂解物中得到的蛋白質(zhì)通過(guò)梯度或?qū)游鲋M(jìn)行共免疫沉淀、交聯(lián)和共提純，在細(xì)胞裂解液中鑒定出可與BRCA1相互作用的蛋白質(zhì)。這些方法中可以應(yīng)用完整BRCA1或一個(gè)BRCA1肽。一旦分離后，這樣的胞內(nèi)蛋白可被鑒定，并可隨之與標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)結(jié)合，從而鑒定與它相互作用的蛋白質(zhì)。例如，可以用本領(lǐng)域人員熟知技術(shù)如Edman降解技術(shù)確定與BRCA1相互作用的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的至少部分氨基酸序列。(參見(jiàn)如Creighton 1983，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理”，W.H.Freeman&Co.，N.Y.，34-49)。得到的氨基酸序列可用來(lái)指導(dǎo)合成寡核苷酸混合物，用于篩選編碼這些胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因序列。篩選可用如標(biāo)準(zhǔn)的雜交或PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)。合成寡核苷酸混合物和篩選的技術(shù)是眾所周知的。(參見(jiàn)Ausubel，出處同前，PR教程方法和應(yīng)用指南，1990，Innis，M.等編，學(xué)術(shù)出版社公司，紐約)。
另外，可以使用能同時(shí)鑒定到編碼與BRCA1相互作用的胞內(nèi)蛋白質(zhì)的基因的方法。這些方法包括，例如用探針檢測(cè)表達(dá)文庫(kù)，其方式與熟知的抗體檢測(cè)λgt11文庫(kù)相似，其中使用標(biāo)記的BRCA1蛋白或融合蛋白如BRCA1與標(biāo)記蛋白(如酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光蛋白或染料)融合，或融合一個(gè)Ig-Fc結(jié)構(gòu)域。
作為體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法-雙雜合系統(tǒng)，如下詳述，這種方法僅作例證而非限定。這個(gè)系統(tǒng)已有描述(美國(guó)專(zhuān)利5283173，Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582)，并且可從Clontech(Palo Alto，CA)購(gòu)到。簡(jiǎn)要步驟是，利用這個(gè)系統(tǒng)構(gòu)建編碼兩個(gè)雜合蛋白的質(zhì)粒一個(gè)質(zhì)粒由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸與編碼BRCA1、BRCA1肽或融合蛋白的BRCA1核苷酸序列融合組成，另一個(gè)質(zhì)粒由編碼該轉(zhuǎn)錄激活蛋白激活結(jié)構(gòu)域的核苷酸與編碼未知蛋白的cDNA融合組成，該cDNA已重組到這個(gè)質(zhì)粒中作為cDNA文庫(kù)的一部分。將所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合質(zhì)粒和該cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化釀酒酵母的一個(gè)菌株，該菌株帶有一個(gè)報(bào)告基因(如HIS3或LacZ)，其調(diào)控區(qū)包含該轉(zhuǎn)錄激活蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。單獨(dú)一個(gè)雜合蛋白不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活是因?yàn)樗鼰o(wú)激活功能，激活結(jié)構(gòu)域雜合蛋白不能激活則是因?yàn)樗荒芏ㄎ坏郊せ畹鞍椎慕Y(jié)合位點(diǎn)。兩個(gè)雜合蛋白的相互作用重新組成了功能性的激活蛋白，導(dǎo)致報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活，這可以通過(guò)對(duì)報(bào)告基因產(chǎn)物的測(cè)定而檢測(cè)到。
雙雜合系統(tǒng)或相關(guān)方法可以用來(lái)從激活結(jié)構(gòu)域文庫(kù)篩選出與“誘餌”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。作為例證而非限制，優(yōu)選利用BRCA1肽或融合蛋白作為誘餌基因產(chǎn)物。單獨(dú)的全長(zhǎng)BRCA1可以作為轉(zhuǎn)錄激活蛋白，因此不能作誘餌。將整個(gè)基因組或cDNA序列與編碼激活結(jié)構(gòu)域的DNA融合。將這個(gè)文庫(kù)與一個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到一種酵母報(bào)告菌株中，該質(zhì)粒編碼誘餌BRCA1基因產(chǎn)物和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合形成的雜合蛋白。從產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中篩選出報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄被激活的那些轉(zhuǎn)化體。作為例證而非限制，可將誘餌BRCA1基因序列例如BRCA1的開(kāi)放閱讀框(或BRCA1的一個(gè)結(jié)構(gòu)域)克隆到載體中以便該序列被可翻譯地融合到編碼GAL4蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA上。純化菌落，分離出引起報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的文庫(kù)質(zhì)粒。利用DNA測(cè)序確定克隆的核苷酸序列，進(jìn)而揭示由所述文庫(kù)質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)序列的性質(zhì)。
可用本領(lǐng)域常規(guī)方法，構(gòu)建細(xì)胞系的cDNA文庫(kù)，所述細(xì)胞系是欲從中檢測(cè)與誘餌BRCA1基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞系。根據(jù)此處敘述的特定體系，例如，可將cDNA片段可插入載體中以便與GAL4蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可翻譯地融合。該文庫(kù)與誘餌BRCA1基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到帶有LacZ基因的酵母菌株，其中LacZ基因由含有GAL4激活序列的啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。將cDNA編碼的與誘餌BRCA1基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)與GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，重新組成活性GAL4蛋白，由此啟動(dòng)HIS3基因表達(dá)。表達(dá)HIS3的克隆在缺乏組氨酸的半固體瓊脂培養(yǎng)基平板能生長(zhǎng)，據(jù)此可被檢出。從這些菌株提純cDNA，并用來(lái)通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備和分離與誘餌BRCA1基因相互作用的蛋白質(zhì)。
用上述雙雜合技術(shù)鑒定到了幾個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，顯示具有包括亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的某些共同特征。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白cDNA三個(gè)代表性的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA和推測(cè)的氨基酸序列見(jiàn)圖1-3。cDNA和它們編碼的蛋白質(zhì)定為1號(hào)序列，091-21A31；3號(hào)序列，091-1F84；5號(hào)序列，091-132Q20。這些cDNA編碼的蛋白質(zhì)分子量約為45-97kd。特別值得注意的是，其中至少有一個(gè)亮氨酸拉鏈基序，還任選存在一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的核苷酸序列包括(a)圖1-3所示或1996年8月14日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的保藏號(hào)為98141(3號(hào)序列，091-1F84)、98142(1號(hào)序列，091-21A31)、98143(5號(hào)序列，091-132Q20)的cDNA克隆中的DNA序列；(b)與圖1-3所示的或所述保藏于A(yíng)TCC的cDNA克隆所含的DNA序列的互補(bǔ)序列在高度嚴(yán)緊條件下能雜交上且編碼功能相當(dāng)?shù)幕虍a(chǎn)物的任何核苷酸序列，所述高度嚴(yán)緊條件例如是與結(jié)合于濾膜的DNA在0.5MNaHPO4，7％十二烷基磺酸鈉(SDS)，1mM EDTA，65℃下雜交，在0.1xSSC/0.1％SDS，于68℃下洗滌(Ausubel F.M.等編，1989，分子生物學(xué)最新方案，第1卷，Green Publishing Associates，Inc.，JohnWiley&sons，Inc.，New York，p2.10.3)；(c)與編碼圖1-3所示的氨基酸序列的DNA序列或包含于如上所述的保藏于A(yíng)TCC的cDNA克隆中的DNA序列的互補(bǔ)序列在較弱嚴(yán)緊度的條件下能雜交上、但仍編碼與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白功能相當(dāng)?shù)幕虍a(chǎn)物的任何核苷酸序列，所述較弱嚴(yán)緊條件例如是中度嚴(yán)緊條件下，舉例來(lái)說(shuō)，用0.2xSSC/0.1％SDS在42℃洗滌(Ausubel等，1989，出處同前)。功能相當(dāng)?shù)幕虍a(chǎn)物包括自然存在于其它種的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因，以及自然存在的或工程化的保持至少部分BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性(即結(jié)合BRCA1)的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因。本發(fā)明也包括(a)到(c)的序列的簡(jiǎn)并性變體。
本發(fā)明還包括與上段中(a)到(c)的核苷酸序列能雜交上，因此是相應(yīng)核苷酸序列的互補(bǔ)體的核酸分子，優(yōu)選DNA分子。這樣的雜交條件可以是如上所述的高度或不太高的嚴(yán)緊條件。在所述核酸分子是脫氧寡核苷酸(寡核苷酸)情況下，高度嚴(yán)緊條件是指在如6xSSC/0.05％焦磷酸鈉中于37℃(對(duì)14個(gè)堿基的寡核苷酸)、48℃(對(duì)17個(gè)堿基的寡核苷酸)、55℃(對(duì)20個(gè)堿基的寡核苷酸)、60℃(對(duì)23個(gè)堿基的寡核苷酸)下洗滌。這些核酸分子可以編碼或作為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的反義分子，可以用于例如基因調(diào)控(用于和/或作為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)的反義引物)。這樣的序列可以作為核酶和/或三股螺旋序列的一部分，也可以用于BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因調(diào)控。更進(jìn)一步，這些分子可以作為診斷方法的組分，由此例如可檢測(cè)與失控細(xì)胞生長(zhǎng)(即癌癥)相關(guān)的特定BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的存在。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，利用依據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物內(nèi)的氨基酸序列設(shè)計(jì)的兩組簡(jiǎn)并寡核苷酸引物群，可以通過(guò)PCR從所需生物體的核酸中分離到BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的同系物。該反應(yīng)的模板可以是從諸如已知或懷疑表達(dá)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的人或非人細(xì)胞系或細(xì)胞型(如乳腺或卵巢細(xì)胞)的mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
可對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆和測(cè)序，以確保擴(kuò)增的序列代表BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的序列。隨后可利用該P(yáng)CR片段通過(guò)多種方法分離全長(zhǎng)cDNA克隆。例如，可標(biāo)記所述擴(kuò)增片段并用于篩選cDNA文庫(kù)，如噬菌體cDNA文庫(kù)?；蛘?，可利用該標(biāo)記片段通過(guò)篩選基因組文庫(kù)而分離基因組克隆。
可以應(yīng)用PCR技術(shù)分離全長(zhǎng)cDNA序列。例如，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟，可以從合適的細(xì)胞來(lái)源(即已知或懷疑表達(dá)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的細(xì)胞例如乳腺或卵巢細(xì)胞)分離RNA。用一個(gè)特異于擴(kuò)增片段5′最末端的寡核苷酸引物引發(fā)第一鏈的合成，從而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。所得的RNA/DNA雜合體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)加上鳥(niǎo)嘌呤尾巴，該雜合體經(jīng)RNAaseH消化，隨后用poly-C引物引發(fā)第二鏈的合成。這樣可容易地分離出所述擴(kuò)增片段上游cDNA序列?？赡苡玫降目寺〔呗跃C述見(jiàn)如Sambrook等，1989，出處同前。
突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因的cDNA也可以利用例如PCR進(jìn)行分離。這種情況下，可以從推測(cè)帶有突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個(gè)體的已知或懷疑表達(dá)該突變蛋白的細(xì)胞中分離mRNA，用oligo-dT寡核苷酸與之雜交，并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄延伸新鏈，從而合成第一鏈cDNA。然后利用與正常基因5′端特異雜交的寡核苷酸合成第二鏈cDNA。用這兩個(gè)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增出該產(chǎn)物，將其克隆至合適的載體中，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行DNA序列分析。通過(guò)比較突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因和正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的DNA序列，可以確定導(dǎo)致突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物功能喪失或改變的突變。
可以利用從已知或懷疑帶有突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個(gè)體得到的DNA構(gòu)建基因組文庫(kù)，或者利用從已知或懷疑表達(dá)突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的細(xì)胞型得到的RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。然后可標(biāo)記正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因或其任何合適的片段，并用作探針從這些文庫(kù)中鑒定相應(yīng)的突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因。然后可純化含有突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因序列的克隆，并按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行序列分析。
另外，可以利用從諸如已知或懷疑帶有突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白等位基因的個(gè)體的已知或懷疑表達(dá)這種突變等位基因的細(xì)胞型中分離的RNA合成的cDNA構(gòu)建表達(dá)文庫(kù)。以這種方式，可以表達(dá)由所述推測(cè)的突變細(xì)胞型產(chǎn)生的基因產(chǎn)物，并利用標(biāo)準(zhǔn)抗體篩選技術(shù)和抗正常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物的抗體(如下述)進(jìn)行篩選。(篩選技術(shù)，參見(jiàn)例如，HarlowE和Lane編，1988，《抗體實(shí)驗(yàn)指南》，冷泉港出版社，冷泉港)，另外，可以用標(biāo)記的融合蛋白實(shí)現(xiàn)篩選。在BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因突變導(dǎo)致表達(dá)了一個(gè)功能改變的基因產(chǎn)物(如由于錯(cuò)義或移碼突變引起的)的情況下，BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一套多克隆抗體就可能與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白突變體發(fā)生交叉反應(yīng)。通過(guò)它們與標(biāo)記抗體的反應(yīng)檢測(cè)到的這種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白突變體可被純化，并按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行序列分析。
本發(fā)明也包括編碼BRCA1調(diào)節(jié)子肽段、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子、BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白的核苷酸序列。核苷酸編碼的融合蛋白包括但不限于全長(zhǎng)BRCA1調(diào)節(jié)子、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子或肽片段與不相關(guān)的蛋白質(zhì)或肽(如協(xié)助融合蛋白純化和檢測(cè)的標(biāo)記表位或可以用作標(biāo)記的酶、熒光蛋白、發(fā)光蛋白)等的融合體。優(yōu)選的表位標(biāo)記是glu-glu，如Rubinfeld B.等，生物學(xué)和化學(xué)雜志，第270卷，105549-5555(1995)和Grussenmyer T等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，827952-7954(1985)所述。
本發(fā)明也包括(a)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列和/或它們的互補(bǔ)體(即反義序列)的DNA載體；(b)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列的DNA表達(dá)載體，其中所述編碼序列可操縱性地連接了可指導(dǎo)其表達(dá)的調(diào)控元件；(c)含有任意上述BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列的基因工程宿主細(xì)胞，其中所述編碼序列可操縱性地連接了可指導(dǎo)其在宿主細(xì)胞的表達(dá)的調(diào)控元件。此處所用調(diào)控元件包括但不限于誘導(dǎo)型和非誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操縱子和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的可啟動(dòng)和調(diào)控表達(dá)的其它元件。這樣的調(diào)控元件包括但不限于桿狀病毒啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒hCMV即早期基因、SV40腺病毒早期或晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、噬菌體A的主要操縱子和啟動(dòng)區(qū)、fd衣殼蛋白控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子、酸性磷酸酶啟動(dòng)子、酵母交配因子啟動(dòng)子。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白如前所述，圖1-3顯示三個(gè)代表性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA序列和推測(cè)的氨基酸序列；1號(hào)序列，091-21A31；3號(hào)序列，091-1F84；5號(hào)序列，091-132Q20。5號(hào)序列，091-132Q20不是全長(zhǎng)序列。已計(jì)算出諸蛋白質(zhì)的分子量約為45-97kd。特別值得注意的是其中存在至少一個(gè)亮氨酸拉鏈基序，任選一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。例如，3號(hào)序列，091-1F84有兩個(gè)亮氨酸拉鏈；5號(hào)序列，091-132Q20有一個(gè)亮氨酸拉鏈，而1號(hào)序列，091-21A31有一個(gè)亮氨酸拉鏈和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。用Prosite蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)很容易識(shí)別這些結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、肽片段、它們的突變、截短或缺失形式及它們的融合蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于多種用途，包括但不限于抗體制備、作診斷檢測(cè)中的試劑、鑒定和/或與其它參與細(xì)胞生長(zhǎng)的基因產(chǎn)物相互作用，在篩選可用于治療不期望的細(xì)胞生長(zhǎng)紊亂(包括但不限于癌癥)的化合物的測(cè)定中用作試劑、作治療這些疾病的藥物。
舉例說(shuō)明，BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白1號(hào)序列，091-21A31以甲硫氨酸開(kāi)始，該甲硫氨酸的周?chē)鶧NA序列與翻譯起始位點(diǎn)一致。這個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白預(yù)測(cè)分子量為53.3KD。
本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白氨基酸序列包括圖1所示的氨基酸序列或前述保藏于A(yíng)TCC的cDNA克隆編碼的氨基酸序列。另外，其它種的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白也包括在本發(fā)明內(nèi)。實(shí)際上，由上面描述的cDNA編碼的任何一種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白都在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本發(fā)明還包括上面描述的核酸序列編碼的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子，判斷原則包括但不限于結(jié)合BRCA1的能力，與BRCA1結(jié)合的親和力，當(dāng)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子存在于適宜類(lèi)型細(xì)胞(如卵巢或乳腺細(xì)胞)中時(shí)所導(dǎo)致的細(xì)胞代謝或表型的變化。這種BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的同功分子包括但不限于在由上述BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列編碼的氨基酸序列內(nèi)發(fā)生了氨基酸殘基的添加或取代，但產(chǎn)生的是沉默突變，由此得到的功能等同的基因產(chǎn)物。氨基酸殘基的取代建立在相關(guān)殘基在極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或兩親性方面的相似性。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；非極性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；帶正電荷的氨基酸(堿性)包括精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸；帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性)包括天冬氨酸和谷氨酸。
雖然可以對(duì)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白DNA進(jìn)行隨機(jī)突變(利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的隨機(jī)誘變技術(shù))，并檢測(cè)產(chǎn)生的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性，但定點(diǎn)突變BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列(利用本領(lǐng)域熟知的定點(diǎn)誘變技術(shù))，可以產(chǎn)生功能增強(qiáng)(如對(duì)BRCA1親和力改變)的突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
例如，可以改造突變體BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白以使蛋白質(zhì)保留了種間特征區(qū)域，而可變殘基發(fā)生改變，這可通過(guò)諸如缺失或插入一個(gè)氨基酸殘基或者一或多個(gè)不同氨基酸殘基的取代?？梢栽诳勺兾恢蒙献鞅Ｊ匦愿淖?，以便產(chǎn)生的突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白仍保留原有功能?？稍谶@些可變位置上作非保守性改變，以使突變BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白功能改變?；蛘?，若需要改變功能，則可對(duì)保守區(qū)作缺失或非保守性改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用此處所述內(nèi)容可以很容易檢測(cè)出這種功能改變的突變或缺失的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
可以對(duì)BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列作其它突變，以產(chǎn)生更適于在所選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)、表達(dá)量增加等的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。例如，每個(gè)氨基酸的三聯(lián)密碼子可被修飾以更接近宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制偏好使用的密碼子。
對(duì)應(yīng)于BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(或者結(jié)構(gòu)域的一部分)的肽(如亮氨酸拉鏈、鋅指)，截短的或缺失的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白(如缺失一個(gè)或多個(gè)上述結(jié)構(gòu)域的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白)，以及全長(zhǎng)的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白與其它無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)的融合蛋白也在本發(fā)明范圍內(nèi)，這可以根據(jù)這部分和上文公開(kāi)的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白氨基酸序列設(shè)計(jì)。這種融合蛋白包括但不限于與表位標(biāo)記的融合體(例如文中示例)；或與提供標(biāo)記功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白的融合體。
雖然BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白和肽可以化學(xué)合成(參見(jiàn)Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與分子原理，W.H.Freeman&Co.，N.Y.)，但BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白衍生的大的多肽和全長(zhǎng)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白本身可能最好是通過(guò)重組DNA技術(shù)，采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)表達(dá)含有BRCA1調(diào)節(jié)子基因序列和/或編碼序列的核酸而制備。這些方法可以用來(lái)構(gòu)建含有上述BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列和適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括諸如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)、體內(nèi)遺傳重組等。實(shí)例參見(jiàn)Sambrook等，1989(出處同前)和Ausubel等，1989(出處同前)等內(nèi)敘述的技術(shù)?？晒┻x擇的，編碼BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的RNA可以用例如合成儀化學(xué)合成。實(shí)例參見(jiàn)《寡核酸合成》，1984，Gait，M.J.等編，IRL Press，Oxford中所述技術(shù)，該書(shū)全文引入本文作為參考。
可以利用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列。BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽或多肽是可溶性分泌型衍生物時(shí)，則可從培養(yǎng)基中回收。如果該BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽或多肽不是分泌型的，則可以從宿主細(xì)胞中分離。但在不僅需要保持BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性，并能應(yīng)用于估計(jì)生物活性(例如藥物篩選測(cè)定)的情況下，可以使用這種加工過(guò)的宿主細(xì)胞本身。
可用于本發(fā)明目的的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于微生物，例如轉(zhuǎn)化了含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體的細(xì)菌(如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；轉(zhuǎn)化了含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體的酵母菌(如酵母屬、畢赤酵母屬)；被含有BRCA1調(diào)節(jié)子序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞體系；被含有BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染的或者重組質(zhì)粒(如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化了的植物細(xì)胞體系；引入了帶有來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒(如腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系(如COS、CHO、BHK、293、3T3、U937)。
在細(xì)菌體系中，可以根據(jù)待表達(dá)的BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的預(yù)定用途選擇較好的表達(dá)載體。例如，若要制備大量的這種蛋白質(zhì)以生產(chǎn)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的藥用組合物或產(chǎn)生抗BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體，就選用能啟動(dòng)高水平表達(dá)較容易純化的融合蛋白產(chǎn)物的載體。這種載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO J，21791)，其中BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列可與Lac-Z編碼區(qū)讀框一致地單獨(dú)連接至載體中從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye，1985，核酸研究，133103-3109；Van Heeke&Schuster，1989，生物學(xué)與化學(xué)雜志，2645503-5509)等。也可以用pGEX載體來(lái)表達(dá)與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)形成融合蛋白的外源多肽。若插入片段編碼一個(gè)較小的多肽(小于25kD)，則融合蛋白通常可溶，并可以通過(guò)谷胱甘肽-瓊脂糖珠吸附細(xì)胞水解物后，再用游離谷胱甘肽洗脫的方法而很容易地純化。pGEX載體設(shè)計(jì)為包含凝血酶或凝血因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)，這樣克隆的目的基因產(chǎn)物就能從GST部分釋放出來(lái)。或者，若融合蛋白不可溶，并在宿主細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，則可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)提純包涵體，溶解該重組蛋白質(zhì)。
在昆蟲(chóng)細(xì)胞體系，可以用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)作載體來(lái)表達(dá)外源基因。(參見(jiàn)Smith等，1983，病毒學(xué)雜志，46584；Smith，美國(guó)專(zhuān)利4215051)。下面描述的一個(gè)特定實(shí)施方案中，用表達(dá)6xHIS標(biāo)記的構(gòu)建體或表達(dá)EE標(biāo)記的BRCA1調(diào)節(jié)子構(gòu)建體的桿狀病毒載體感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。下面更詳細(xì)地描述的特定實(shí)施方案用CMV啟動(dòng)子在U937細(xì)胞或Cos-7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)標(biāo)記的BRCA1調(diào)節(jié)子cDNA序列，以表達(dá)重組蛋白質(zhì)。或者，可以利用本領(lǐng)域熟知的逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)將該重組表達(dá)構(gòu)建體插入宿主細(xì)胞。例如，公開(kāi)的PCT申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)WO96/09400和WO94/29438描述的用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄載體系統(tǒng)。
在用病毒作為表達(dá)載體的情況下，可將所需的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列連接到腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合物上，如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。隨后可通過(guò)體內(nèi)或體外重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組。在病毒基因組非必要區(qū)域(例如E1或E3區(qū))插入一段序列將產(chǎn)生活性的、能在感染宿主中表達(dá)BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的重組病毒(參見(jiàn)Logan&Shenk，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，813655-3659)。還可能需要特異起始信號(hào)以有效翻譯插入的BRCA1調(diào)節(jié)子核苷酸序列。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰序列。若將帶有自身起始密碼子和相鄰序列的完整BRCA1調(diào)節(jié)子基因或cDNA插入合適的表達(dá)載體，則不需要另外的翻譯調(diào)控信號(hào)。然而，若只插入部分BRCA1調(diào)節(jié)子編碼序列，則需要提供外源翻譯調(diào)控信號(hào)，可能包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須與目的編碼序列的閱讀框一致，以保證翻譯出完整的插入片段。外源翻譯調(diào)控信號(hào)和起始密碼子可以是自然或合成等多種來(lái)源。表達(dá)效率可以通過(guò)加入合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等獲得提高(參見(jiàn)Bittner等，1987，酶學(xué)方法，153516-544)。
另外，可以選擇可調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或按照預(yù)期方式修飾和加工該基因產(chǎn)物的宿主株?；虍a(chǎn)物的修飾(如糖基化)和加工(如切割)可能對(duì)蛋白質(zhì)的功能很重要。對(duì)于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾，不同宿主細(xì)胞有特征性和特異的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)來(lái)保證所表達(dá)的外源蛋白正確修飾和加工。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，可以用具有用于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物適當(dāng)加工的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞，這樣的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、U937細(xì)胞。
為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期、高產(chǎn)地制備重組蛋白，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)體系。例如，可以加工能穩(wěn)定表達(dá)上述BRCA1調(diào)節(jié)子序列的細(xì)胞系。用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，不如用轉(zhuǎn)化了在合適的表達(dá)調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等)調(diào)控下的DNA和一個(gè)選擇性標(biāo)記的宿主細(xì)胞。導(dǎo)入外源DNA后，可以使工程化的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基中。該重組質(zhì)粒含有的選擇性標(biāo)記使細(xì)胞能抗選擇壓，并允許質(zhì)粒穩(wěn)定整合到細(xì)胞的染色體內(nèi)，生長(zhǎng)形成集落，這種集落又可以被克隆，發(fā)展為細(xì)胞系。這個(gè)方法可以用于構(gòu)建表達(dá)BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。這種工程化細(xì)胞系在篩選和評(píng)估影響B(tài)RCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物內(nèi)源活性的化合物時(shí)特別有用。
多種選擇系統(tǒng)可供利用，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等，1977，細(xì)胞，11223)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Szybalska&Szybalski，1962，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，482026)、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(Lowy等，1980，細(xì)胞22817)，它們分別可以用于tk-、hgprt-、aprt-細(xì)胞。對(duì)抗代謝物的抗性也可以用作選擇下列基因的基礎(chǔ)dhfr，此基因賦予對(duì)氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，773567；Ohare，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，781527)；gpt，此基因賦予對(duì)霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，782072)；neo，此基因賦予對(duì)氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物學(xué)雜志，1501)；hygro，此基因賦予對(duì)潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因，30147)。
BRCA1調(diào)節(jié)子基因產(chǎn)物也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中進(jìn)行表達(dá)。任何種類(lèi)動(dòng)物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、微型豬、羊、非人靈長(zhǎng)類(lèi)如狒狒、猴和黑猩猩可以用于制作BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本領(lǐng)域熟知的任何技術(shù)可以用來(lái)將BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基礎(chǔ)品系。這樣的技術(shù)包括但不限于原核微量注射(HoppeP.C.和WagnerT.E.，1989，美國(guó)專(zhuān)利4873191)、對(duì)種系細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Van der Putten等，1985，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，826148-6152)、對(duì)胚胎干細(xì)胞實(shí)施基因打靶(Thompson等，1989，細(xì)胞，56313-321)、胚胎電穿孔(Lo，1983，分子細(xì)胞生物學(xué)，31803-1814)、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等，1989，細(xì)胞，57717-723)等。這些技術(shù)的綜述參見(jiàn)此處全文引作參考文獻(xiàn)的Gordon，1989，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，細(xì)胞學(xué)國(guó)際評(píng)論(Intl.Rev.Cytol.)，115171-229。
本發(fā)明提供了全部細(xì)胞帶有BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及部分而非全部細(xì)胞帶有轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物即嵌合體動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因可以以單個(gè)轉(zhuǎn)基因或串聯(lián)體例如頭接頭或頭接尾串聯(lián)體形式整合。該轉(zhuǎn)基因可以選擇性地導(dǎo)入特定細(xì)胞類(lèi)型中，并參照下列Lasko等的技術(shù)(Lasko，M.等，1992，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，896232-6236)進(jìn)行激活。這種細(xì)胞類(lèi)型特異性激活所需調(diào)控序列取決于感興趣的特定細(xì)胞類(lèi)型，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是很顯然的。如果需要將BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的染色體位點(diǎn)，則優(yōu)選基因打靶。簡(jiǎn)而言之，用這種技術(shù)時(shí)，設(shè)計(jì)含有與內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因同源的一些核苷酸序列的載體，以通過(guò)與染色體序列之間的同源重組，插入內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的核苷酸序列中并破壞其功能。這樣，也可以通過(guò)在內(nèi)源基因中插入非功能性序列而使內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因的表達(dá)喪失。轉(zhuǎn)基因可以選擇性地導(dǎo)入特定細(xì)胞類(lèi)型中，從而僅在這一細(xì)胞類(lèi)型中失活內(nèi)源BRCA1調(diào)節(jié)子基因，參照下列Gu等的技術(shù)(Gu等，1994，科學(xué)，265103-106)。這種細(xì)胞類(lèi)型特異性失活所需的調(diào)控序列取決于感興趣的細(xì)胞類(lèi)型，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)也是顯然的。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建成后，就可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測(cè)重組BRCA1調(diào)節(jié)子基因的表達(dá)。初步篩選可以用Southern印跡分析或PCR技術(shù)分析動(dòng)物組織，檢測(cè)所述轉(zhuǎn)基因是否已整合。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平可以利用下述技術(shù)估計(jì)，這些技術(shù)包括但不限于對(duì)得自動(dòng)物的特定細(xì)胞類(lèi)型樣品進(jìn)行Northern印跡分析，原位雜交分析，RT-PCR。也可以利用下述的特異于BRCA1調(diào)節(jié)子轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗體對(duì)表達(dá)BRCA1調(diào)節(jié)子基因的組織樣品進(jìn)行免疫化學(xué)定量。
BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體特異識(shí)別BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位，或其保守變體、肽片段的一個(gè)或多個(gè)表位的抗體也包括在本發(fā)明內(nèi)。這樣的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人源化的或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(anti-Id)抗體、以及上述任一形式的表位結(jié)合片段。
本發(fā)明的抗體可以用于例如，檢測(cè)生物樣品中的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所以可以作為該蛋白質(zhì)含量異常的患者的診斷和治療手段。這樣的抗體也可以與例如化合物篩選方案結(jié)合應(yīng)用，如本文所述用于評(píng)價(jià)待測(cè)化合物對(duì)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白表達(dá)和/或活性的影響。另外，這樣的抗體也可以與基因治療技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，以在導(dǎo)入患者體內(nèi)前評(píng)價(jià)正常和/或工程化的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白表達(dá)細(xì)胞。這樣的抗體還可以作為抑制異常BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白活性的方法。
為制備抗體，可通過(guò)注射BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白肽、截短的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白多肽、BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白同功分子、或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的突變體而對(duì)各種宿主動(dòng)物進(jìn)行免疫。這樣的宿主動(dòng)物包括但不限于兔、小鼠、大鼠等等?？梢岳枚喾N佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答，這取決于宿主種類(lèi)，包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)，礦物膠如氫氧化鋁，表面活性劑如溶血卵磷脂、普盧龍尼克多元醇類(lèi)、聚陰離子、肽、油乳膠、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚、和可能有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小型棒狀桿菌。多克隆抗體是來(lái)源于免疫動(dòng)物血清的異種抗體分子群。
單克隆抗體是特異抗原的同種抗體群，可以用通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然，256495-497；美國(guó)專(zhuān)利4376110)、人類(lèi)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，1983，今日免疫學(xué)，472；Cole等，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，802026-2030)、EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss，Inc.，pp77-96)。這樣的抗體可以是包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD的任何免疫球蛋白型及其亞型。本發(fā)明產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可以體內(nèi)或體外培養(yǎng)。在體內(nèi)能高滴度產(chǎn)生單克隆抗體使得這一方法成為目前優(yōu)選的方法。
另外，可以利用將合適抗原特異性的小鼠抗體分子基因連接合適生物活性的人抗體分子基因產(chǎn)生嵌合抗體的技術(shù)(Morrison等，1984， 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)816851-6855；Neuberger等，1984，自然，312604-608；Takeda等，1985，自然，314452-454)。嵌合抗體是各部分來(lái)源于不同動(dòng)物種類(lèi)的分子，如具有來(lái)源于單克隆抗體的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子。
或者，用于制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4946778；Bird，1988，科學(xué)，242423-426；Huston等，1988，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，855879-5883；Ward等，1989，自然，334544-546)可用來(lái)生產(chǎn)抗BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白基因產(chǎn)物的單鏈抗體。單鏈抗體是通過(guò)一個(gè)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段而產(chǎn)生的單鏈多肽。
識(shí)別特異表位的抗體片段可由已知技術(shù)制備。例如，這種片段包括但不限于可通過(guò)胃蛋白酶水解抗體產(chǎn)生的F(ab’)2和還原F(ab’)2的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段?；蛘?，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等，1989，科學(xué)，2461275-1281)從而快速、簡(jiǎn)單地鑒定到所需特異性的單克隆Fab片段。
反過(guò)來(lái)，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，可以利用BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗體產(chǎn)生能“模擬”BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的抗獨(dú)特型抗體(參見(jiàn)Greenspan&Bona，1993，F(xiàn)ASEB J.，7(5)437-444；Nissinoff，1991，免疫學(xué)雜志，147(8)2429-2438)。
用BRCA1調(diào)節(jié)子鑒定可提高BRCA1水平的化合物BRCA1基因編碼有腫瘤抑制活性的一種蛋白質(zhì)。參見(jiàn)Holt J.T.等，(1996)國(guó)家遺傳學(xué)，12卷，298-302。研究表明某些癌癥細(xì)胞中BRCA1水平低，提高BRCA1水平能恢復(fù)正常細(xì)胞表型。因此，可提高BRCA1水平的化合物在癌癥治療中有重要的治療用途。
本發(fā)明一個(gè)方面是描述協(xié)助鑒定可提高BRCA1胞內(nèi)水平的化合物的分析方法，其中使用BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子。圖4以簡(jiǎn)圖形式給出該方法的一個(gè)模式。概括地說(shuō)，這一方法是基于以下兩點(diǎn)首先，已知BRCA1是通用的轉(zhuǎn)錄激活子；第二，BRCA1調(diào)節(jié)子結(jié)合BRCA1。該方法利用了上述雙雜合技術(shù)的某些特性。構(gòu)建兩個(gè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞系，優(yōu)選乳腺或卵巢細(xì)胞系。優(yōu)選的一個(gè)乳腺細(xì)胞系是MCF-7。一個(gè)質(zhì)粒含有由GAL4識(shí)別的核苷酸序列，其操縱性連接了激活子序列，還含有位于這一序列下游的報(bào)告基因。優(yōu)選的報(bào)告基因的一個(gè)例子是熒光素酶的編碼基因。第二個(gè)質(zhì)粒編碼表達(dá)GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與BRCA1調(diào)節(jié)子的融合蛋白。優(yōu)選的調(diào)節(jié)子是1號(hào)序列，091-21A31。
GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白結(jié)合第一個(gè)質(zhì)粒的GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，隨后與存在的任何BRCA1形成GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-BRCA1調(diào)節(jié)子融合蛋白和BRCA1的復(fù)合物。復(fù)合物中的BRCA1靠近激活子序列，從而啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此，可以檢測(cè)出化合物刺激BRCA1產(chǎn)生的能力。能刺激BRCA1產(chǎn)生的化合物會(huì)使報(bào)告基因產(chǎn)物增加。上述方法見(jiàn)圖4。
鑒定改變BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子相互作用的化合物如上所述，BRCA1是已知的腫瘤抑制蛋白。參見(jiàn)Holt J.T.等，(1996)國(guó)家遺傳學(xué)，12卷，298-302。因此，影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間正常的相互作用的化合物可能會(huì)影響B(tài)RCA1腫瘤抑制活性。影響程度主要取決于受測(cè)化合物的化學(xué)性質(zhì)。有些可能強(qiáng)烈破壞BRCA1與BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用，有些僅有小的影響。前者用分析致瘤性改變的生物學(xué)檢測(cè)方法可以反映，后者則不行。反之亦然，某些化合物能增進(jìn)BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的相互作用，出現(xiàn)相反的生物學(xué)影響。因此迫切需要鑒定出影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物。
用于鑒定影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物的體系，其基本原理包括制備含有上述BRCA1蛋白、多肽、肽、融合蛋白以及BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的反應(yīng)混合物，條件適宜、兩者充分相互作用并結(jié)合，因而形成復(fù)合物。為了檢測(cè)化合物的抑制活性，分別制備含有和不含待測(cè)化合物的反應(yīng)混合物。待測(cè)化合物可以開(kāi)始就包含在反應(yīng)混合物中，或者在加入BRCA1部分和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白后的某時(shí)刻加入。對(duì)照反應(yīng)混合物溫育，其中不含化合物或加安慰劑。檢測(cè)BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白形成的任何復(fù)合物。對(duì)照反應(yīng)體系中形成復(fù)合物，而含有受測(cè)化合物的反應(yīng)混合物中不產(chǎn)生，表明該化合物干擾BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用。另外，含有待測(cè)化合物和正常BRCA1蛋白的反應(yīng)混合物中復(fù)合物的形成情況可以與含有待測(cè)化合物和突變體BRCA1蛋白的反應(yīng)混合物中復(fù)合物的形成情況進(jìn)行比較。在需要鑒定破壞突變體BRCA1的相互作用，而不破壞正常BRCA1的相互作用的化合物時(shí)這種比較可能很重要。
干擾BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的化合物的分析方法可以異種或同種形式進(jìn)行。異種分析包括將BRCA1部分或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白固定在固相上，反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相上的復(fù)合物。同種分析中整個(gè)反應(yīng)在液相進(jìn)行。兩種方法加入反應(yīng)物的順序可以改變以得到待測(cè)化合物的不同信息。例如，以競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制干擾相互作用的待測(cè)化合物可以在存在待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)中鑒定到，即在BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之前或同時(shí)將待測(cè)物質(zhì)加入反應(yīng)體系。或者，破壞復(fù)合物形成的受測(cè)化合物，例如有更高的結(jié)合常數(shù)而取代復(fù)合物中的一個(gè)組分的化合物，通過(guò)在復(fù)合物形成后加入待測(cè)化合物可以鑒定到。下面有簡(jiǎn)要敘述。
在異種分析體系中，BRCA1部分或反應(yīng)性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白錨定在固相表面，而未錨定的那一種被直接或間接標(biāo)記。實(shí)際操作中，可以方便地利用微量滴定板。錨定的那一種可以是通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)連接而固定。簡(jiǎn)單地將固相表面涂覆BRCA1或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白溶液并干燥即可實(shí)現(xiàn)非共價(jià)連接?；蛘?，可以用特異于待錨定的那一種物質(zhì)的固定化抗體將該物質(zhì)錨定于固相表面。固相表面可以預(yù)先制備并存放。
為了進(jìn)行檢測(cè)，將有或沒(méi)有待測(cè)化合物的涂覆表面與固定物質(zhì)的對(duì)應(yīng)反應(yīng)物接觸。反應(yīng)完全后，除去未反應(yīng)的組分(如沖洗)，任何已形成的復(fù)合物均保留在固相表面。固相表面錨定的復(fù)合物的檢測(cè)方法有多種。若未固定的那一種物質(zhì)已預(yù)先標(biāo)記，則在固相表面檢測(cè)到固定的標(biāo)記物表明形成了復(fù)合物。若未固定的那一種物質(zhì)沒(méi)有預(yù)先標(biāo)記，則可以用間接標(biāo)記檢測(cè)錨定于表面的復(fù)合物；例如，用特異于起初未固定的物質(zhì)的標(biāo)記抗體(抗體可以直接標(biāo)記或用標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體間接標(biāo)記)。根據(jù)反應(yīng)組分加入的順序可以檢測(cè)待測(cè)化合物是抑制復(fù)合物的形成或破壞已形成的復(fù)合物。
或者，反應(yīng)可以在有或沒(méi)有待測(cè)化合物的液相中進(jìn)行，從未反應(yīng)組分中分離出反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)復(fù)合物；例如，用特異于結(jié)合組分之一的固定化抗體將溶液中形成的任何復(fù)合物錨定，用特異于另一反應(yīng)物的標(biāo)記抗體檢測(cè)錨定的復(fù)合物。同樣，根據(jù)反應(yīng)組分加入液相的順序可以鑒定出待測(cè)化合物是抑制復(fù)合物的形成還是破壞已形成的復(fù)合物。
在本發(fā)明一個(gè)候選實(shí)施方案中，可以使用同種分析。這個(gè)方法中，提前制備BRCA1部分和相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白形成的復(fù)合物，其中BRCA1或其BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白已被標(biāo)記，但標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)將因?yàn)閺?fù)合物的形成而猝滅(參見(jiàn)Rubenstein的美國(guó)專(zhuān)利4109496，其中用這種方法進(jìn)行免疫測(cè)定)。加入與已形成的復(fù)合物的一種組分競(jìng)爭(zhēng)并發(fā)生取代的測(cè)試物質(zhì)將產(chǎn)生高于本底的信號(hào)。這樣就可以鑒定出破壞BRCA1/胞內(nèi)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用的待測(cè)物質(zhì)。
本發(fā)明一個(gè)特定實(shí)施方案中，可以制備BRCA1融合蛋白以用于固定化。例如，可以用融合載體如pGEX-5X-1等將BRCA1或肽片段與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合，融合方式保證在所產(chǎn)生的融合蛋白中能維持它的結(jié)合活性。純化相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，按照本領(lǐng)域常規(guī)和上述方法制備單克隆抗體。該抗體用例如放射性同位素125I通過(guò)常規(guī)方法標(biāo)記。在異種測(cè)定中，例如可以將GST-BRCA1融合蛋白錨定于谷胱甘肽-瓊脂糖珠上。隨后在有或沒(méi)有待測(cè)化合物的情況下加入與之作用的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，保證發(fā)生相互作用和結(jié)合。反應(yīng)結(jié)束后洗去未結(jié)合的物質(zhì)，將標(biāo)記單克隆抗體加入體系，使其結(jié)合到復(fù)合物組分中。測(cè)定谷胱甘肽-瓊脂糖珠存留的放射強(qiáng)度可以檢測(cè)到BRCA1蛋白和相互作用性BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白之間的相互作用。待測(cè)化合物成功抑制相互作用會(huì)使測(cè)得的放射強(qiáng)度下降。
或者，可以在沒(méi)有谷胱甘肽-瓊脂糖珠的液相中混合GST-BRCA1融合蛋白和與之相互作用的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。待測(cè)化合物在兩種物質(zhì)結(jié)合過(guò)程中或之后加入。然后將混合液加入谷胱甘肽-瓊脂糖珠中，洗去未結(jié)合物質(zhì)。同樣通過(guò)加入標(biāo)記抗體并測(cè)定瓊脂糖珠中存留的放射強(qiáng)度可以檢測(cè)到BRCA1/BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白相互作用被抑制的程度。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，同樣的技術(shù)可以用于BRCA1和/或BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域所對(duì)應(yīng)的肽片段，而代替兩種全長(zhǎng)蛋白質(zhì)之一或二者?？梢杂帽绢I(lǐng)域多種常規(guī)方法鑒定和分離結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域在實(shí)施例中有更詳細(xì)討論。這些方法包括但不限于誘變編碼兩種蛋白質(zhì)之一的基因和用共免疫沉淀測(cè)定篩選結(jié)合被破壞的一些方法。然后可選擇出編碼復(fù)合物中另一種物質(zhì)的基因中發(fā)生的補(bǔ)償性突變。對(duì)編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的基因的序列分析將揭示與蛋白質(zhì)中參與相互結(jié)合的區(qū)域?qū)?yīng)的突變。也可以使用雙雜合分析，實(shí)施例中有更詳細(xì)討論。舉例說(shuō)明，如果得到胞內(nèi)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的編碼基因，可以構(gòu)建短基因片段表達(dá)該蛋白質(zhì)的肽片段，隨后可檢測(cè)其結(jié)合活性并純化或合成。
有效劑量上述鑒定到的影響B(tài)RCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的相互作用、從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)的化合物，其毒性和藥效可以按照標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程在細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定。例如，可以確定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療有效劑量)。多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的模型體系可以用來(lái)檢測(cè)化合物的細(xì)胞生長(zhǎng)性質(zhì)，包括細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)和在體內(nèi)對(duì)腫瘤的作用。這些實(shí)驗(yàn)可以在用BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行。
毒性和治療效果之間的劑量比率是治療指數(shù)，可以表達(dá)為L(zhǎng)D50/ED50。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。因?yàn)榭赡苡玫接卸靖弊饔玫幕衔?，?yīng)仔細(xì)設(shè)計(jì)給藥體系，將化合物定位到目的組織位點(diǎn)，以使對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷減至最小，從而減少副作用。
可以利用細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定和動(dòng)物研究中得到的數(shù)據(jù)制定出適合人類(lèi)使用的劑量范圍。優(yōu)選化合物劑量在包括ED50且僅有弱的或沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可在該范圍內(nèi)根據(jù)采用的劑量形式和給藥途徑而變化。本發(fā)明方法中所用的任何一種化合物的治療有效劑量均可由細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定初步估計(jì)?？梢栽趧?dòng)物模型中確定劑量，得到一個(gè)血循環(huán)濃度范圍，其中包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)得的IC50(即待測(cè)化合物取得對(duì)癥狀二分之一最大抑制效果的濃度)。這種信息可以用來(lái)更精確地確定人類(lèi)的有效劑量。血漿中的含量可以用例如高效液相層析測(cè)定。
下面的實(shí)施例舉例說(shuō)明了本發(fā)明的特定實(shí)施方案及各種應(yīng)用。這些實(shí)施例僅供解釋之用而非對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA的鑒定用美國(guó)專(zhuān)利5283173或Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)889578-9582描述的酵母雙雜合檢測(cè)系統(tǒng)初步鑒定BRCA1調(diào)節(jié)子。檢測(cè)組分可以購(gòu)自Clontech(Palo Alto CA)。
編碼人BRCA1的cDNA(參見(jiàn)Miki Y.等，科學(xué)，26666-71；PCT/US95/10202)用MvnI-Nhel消化，將代表BRCA1第8-1293位氨基酸的片段與pGBT8質(zhì)粒的SmaI-Nhel位點(diǎn)的GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，該質(zhì)粒是Chien等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582(1991)中描述的質(zhì)粒pMA424在EcoR1和Sal1單切位點(diǎn)間插入序列5’-CCGGGGATCCCCATGGCTAGCCATATG-3’進(jìn)行改造而得到的。將融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株YGH1，評(píng)估攜有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1株激活兩個(gè)報(bào)告性狀的能力在無(wú)組氨酸培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和β-半乳糖苷酶活性。帶有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1菌株能在無(wú)組氨酸的平板上生長(zhǎng)但在無(wú)組氨酸的平板中加入7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑(3AT)會(huì)受到調(diào)控，該菌株無(wú)可檢測(cè)到的β-半乳糖苷酶活性。帶有質(zhì)粒GAL4-BRCA1(8-1293)的YGH1菌株隨后被融合于質(zhì)粒pGAD中GAL4激活結(jié)構(gòu)域的Hela細(xì)胞cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化(Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582)。若cDNA編碼的蛋白質(zhì)可與BRCA1蛋白(氨基酸8-1293)相互作用，則該YGH1菌株應(yīng)能在補(bǔ)充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無(wú)組氨酸平板中生長(zhǎng)，并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。
2.5×106個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到4株能在補(bǔ)充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無(wú)組氨酸平板中生長(zhǎng)，并有β-半乳糖苷酶活性。用從這4株酵母菌株回收的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化初始YGH1 GAL4-BRCA1(8-1293)菌株。所有質(zhì)粒都賦予菌株在補(bǔ)充了7.5mM 3-氨基-1，2，4-三唑的無(wú)組氨酸平板中生長(zhǎng)的能力，并能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。在隨后的篩選中，發(fā)現(xiàn)4株菌中的3株含有編碼與BRCA1有明確結(jié)合能力的調(diào)節(jié)子蛋白的cDNA。一個(gè)質(zhì)粒含有編碼被命名為1號(hào)序列，091-21A31的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的新cDNA。其核苷酸和氨基酸序列見(jiàn)圖1。計(jì)算分子量約53kd，pI估計(jì)為9.05。特別值得注意的是它有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈基序。
第二個(gè)cDNA的核苷酸序列和它編碼的氨基酸序列(此后命名為3號(hào)序列，091-1F84)見(jiàn)圖2。它有兩個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)分子量計(jì)算為96443.3，pI估計(jì)為4.95。
第三個(gè)cDNA的核苷酸序列和它編碼的氨基酸序列(此后命名為5號(hào)序列，091-132Q20)見(jiàn)圖3。該克隆有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)分子量計(jì)算為45904.9，pI估計(jì)為6.73。
實(shí)施例2BRCA1結(jié)構(gòu)域與BRCA1調(diào)節(jié)子的結(jié)合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定BRCA1哪些區(qū)域與實(shí)施例1所述三個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子相互作用。采用美國(guó)專(zhuān)利5 283 173或Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582描述的酵母雙雜合測(cè)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將編碼3號(hào)序列，091-1F84；1號(hào)序列，091-21A31；5號(hào)序列，091-132Q20的cDNA與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合，將表1所示的BRCA1的各個(gè)區(qū)域和含有BRCA1氨基酸1-300、1-600或8-1293的區(qū)域與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。對(duì)照包括載體或與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的bcl-2(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5539 085)。
表1BRCA1與雙雜合系統(tǒng)(091-)的相互作用用于上述研究的BRCA1構(gòu)建體由BRCA1限制酶切片段克隆至質(zhì)粒pGBT8中而產(chǎn)生，該質(zhì)粒是質(zhì)粒pMA424在EcoRI和SalI單切位點(diǎn)間插入序列5’-CCGGGGATCCCCATGGCTAGCCATATG-3’而改造得到的(如Chien等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，88卷，9578-9582(1991)所述)。簡(jiǎn)言之，含有BRCA1前300個(gè)氨基酸的構(gòu)建體是將Nco1-EcoR1消化產(chǎn)生的BRCA1鈍末端片段亞克隆至pGBT8的EcoR1酶切位點(diǎn)鈍末端而產(chǎn)生的。含有8-1293位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體如上述構(gòu)建。最后，含有1-600位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體是將BRCA1的Nco1-Spe1片段亞克隆至pGBT8的Nco1-Nhe1位點(diǎn)而產(chǎn)生的。
表1顯示BRCA1中與3號(hào)序列，091-1F84；1號(hào)序列，091-21A31；5號(hào)序列，091-132Q20編碼的蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域。用“+”主觀(guān)反映測(cè)定的β-半乳糖苷酶活性。一個(gè)“+”表示最低，三個(gè)“+”表示活性最高。從表1明顯可見(jiàn)BRCA1前300個(gè)氨基酸不結(jié)合三個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子中的任一個(gè)，但三個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子都與含有BRCA1前600個(gè)氨基酸的BRCA1構(gòu)建體結(jié)合。BRCA1調(diào)節(jié)子都不結(jié)合載體或bcl-2對(duì)照，卻都與近似全長(zhǎng)的含有8-1293位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體結(jié)合。
這些結(jié)果顯示三個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子優(yōu)先結(jié)合BRCA1前600個(gè)氨基酸。
實(shí)施例31號(hào)序列，091-21A31與BRCA1相互作用的結(jié)構(gòu)域的鑒定進(jìn)行雙雜合實(shí)驗(yàn)來(lái)確定BRCA1調(diào)節(jié)子091-21A31，1號(hào)序列與BRCA1相互作用的區(qū)域。方法基本如實(shí)施例1所述。酵母培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)基本按照美國(guó)專(zhuān)利5283173；Chien等，1991，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，889578-9582；Spaargaren M等，(1994)生物化學(xué)雜志，300303-307描述的方法進(jìn)行。
簡(jiǎn)言之，將YGH1酵母菌株用編碼1號(hào)序列，091-21A31的cDNA，或編碼融合了GAL4激活結(jié)構(gòu)域、含有1號(hào)序列091-21A31的氨基酸78-469、1-300、300-469的片段的cDNA共轉(zhuǎn)化。將bcl-2 cDNA(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5539085)與GAL4激活結(jié)構(gòu)域融合作為對(duì)照。將編碼具有氨基酸1-300、1-600、8-1293的BRCA1片段的cDNA如實(shí)施例2所述與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。
1號(hào)序列，091-21A31構(gòu)建體用質(zhì)粒pGADGH或pGAD424制備；兩者可購(gòu)自Clontech。
含有氨基酸78-469的1號(hào)序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號(hào)序列，091-21A31的EcoR1-Xhol片段亞克隆至pGAD424的EcoR1-Sal1位點(diǎn)而產(chǎn)生的。
含有氨基酸1-300的1號(hào)序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號(hào)序列，091-21A31的BamH1-Sal1片段亞克隆至pGADGH的BamH1-Sal1位點(diǎn)而產(chǎn)生的。
含有氨基酸300-469的1號(hào)序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號(hào)序列，091-21A31的BamH1鈍末端-Sal1片段亞克隆至pGADGH的Sal1鈍末端-Xhol位點(diǎn)而產(chǎn)生的。
表2顯示共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯然BRCA1的前300個(gè)氨基酸不結(jié)合三個(gè)1號(hào)序列(091-21A31)的片段構(gòu)建體中的任何一個(gè)，也不結(jié)合1號(hào)序列(091-21A31)。含有1-600位氨基酸的BRCA1構(gòu)建體確實(shí)結(jié)合1號(hào)序列，091-21A31和含有該序列氨基酸78-469的構(gòu)建體，但不結(jié)合含有該序列氨基酸1-300、300-469的構(gòu)建體。同樣，含有氨基酸8-1293的BRCA1構(gòu)建體也與1號(hào)序列(091-21A31)的氨基酸78-469、1-300的構(gòu)建體結(jié)合，而不結(jié)合具有該序列的氨基酸300-469的構(gòu)建體。
表2BRCA1與091-21的相互作用實(shí)施例4BRCA1調(diào)節(jié)子的表達(dá)和提純?cè)跅U狀病毒感染的SF9細(xì)胞中表達(dá)并提純BRCA1調(diào)節(jié)子。產(chǎn)生桿狀病毒及培養(yǎng)SF9細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域公知技術(shù)，詳細(xì)操作可見(jiàn)于M.Summers和G.Smith“桿狀病毒載體與昆蟲(chóng)培養(yǎng)操作指南”一文，Texas Agricultural Experiment Station，Bulletin NO.1555(1987年5月或G.E.Smith和M.D.Summers的EPO127839)。
以下構(gòu)建體用pAcC 13(Rubinfeld B.等，細(xì)胞，651033-1042(1991))或pAcC 13衍生的pAcOG制備。后一個(gè)質(zhì)粒中用加工成編碼起始甲硫氨酸、Glu-Glu表位標(biāo)記(Grussenmyer T.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)827952(1985))和含有數(shù)個(gè)終止子的多克隆位點(diǎn)(Rubinfeld B.等，生物學(xué)和化學(xué)雜志，2705549-5555(1995))的合成接頭取代了原質(zhì)粒的多接頭。
含有1號(hào)序列，091-21A31的構(gòu)建體是將1號(hào)序列，091-21A31的Kpn1-Xbal片段亞克隆至pAcC 13的Kpn1-Xbal位點(diǎn)制備的。
含有3號(hào)序列，091-1F84的構(gòu)建體是將3號(hào)序列，091-1F84的Nco1-Xbal片段亞克隆至pAcOG 1的Nco1-Xbal位點(diǎn)制備的。
含有5號(hào)序列，091-132Q20的構(gòu)建體是將5號(hào)序列，091-132Q20的Kpn1-Xbal片段亞克隆至pAcC 13的Kpn1-Xbal位點(diǎn)制備的。
含有適當(dāng)BRCA1調(diào)節(jié)子的桿狀病毒是用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，并基本按照Pharmingen′s cat.no.21100D，BaculoGoldtm/BaculovirusDNA的方法分離相應(yīng)桿狀病毒而產(chǎn)生的。從單個(gè)噬斑分離病毒，并用來(lái)感染SF9細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)4天，離心分離，將細(xì)胞團(tuán)溶解制備細(xì)胞提取物。簡(jiǎn)要步驟是，重組SF9細(xì)胞離心成團(tuán)，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，1mM EDTA，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]溶液中裂解，冰浴10分鐘。然后加入NaCl至終濃度為150mM，在室溫保持10分鐘，離心。將所得上清液上樣到含有共價(jià)交聯(lián)到蛋白G-瓊脂糖的小鼠Glu-Glu單克隆抗體的1ml親和柱上。參見(jiàn)Grussenmyer T.等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)，827952(1985)。將柱子用10-15ml裂解緩沖液洗滌，用每ml同一緩沖液含100μg Glu-Glu肽(EYMPME)的溶液洗脫。收集各級(jí)分，通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，匯集峰級(jí)分，根據(jù)純度進(jìn)一步在HPLC柱上純化，這些柱包括Resource Q、ResourceS、Resource Eth(Pharmacia)。若純化不可溶蛋白質(zhì)，特別是1號(hào)序列，091-21A31，則將重組SF9細(xì)胞離心沉淀，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，2％SDS，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]中裂解，室溫保持20-30分鐘，超速離心。取出上層液相，調(diào)節(jié)NaCl至400mM，再離心。上清液用1×TG緩沖液[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，1％TritonX 100，10％甘油，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]1∶10稀釋?zhuān)?jīng)3μm GelmanVersapore濾器過(guò)濾，上樣到1ml抗Glu-Glu的親和柱上。參見(jiàn)RubinfeldB.等，分子細(xì)胞生物學(xué)，124634-4642(1992)。親和柱用10-15ml含400mM NaCl的1×TG緩沖液洗滌，用含1％SDS和100ug/mlGlu-Glu肽的1×TG緩沖液洗脫。各級(jí)分經(jīng)SDS-PAGE分析。
實(shí)施例5確證BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白與BRCA1的結(jié)合為了確證實(shí)施例1中所述的雙雜合檢測(cè)結(jié)果及進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)每個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子與BRCA1結(jié)合，制備兩個(gè)BRCA1構(gòu)建體并檢測(cè)它們與BRCA1調(diào)節(jié)子的結(jié)合能力。兩個(gè)BRCA1構(gòu)建體是Glu-Glu標(biāo)記的BRCA1 5’(1-1293)和BRCA1 3’(1293-1863)。如以上實(shí)施例所述，Glu-Glu表位標(biāo)記能協(xié)助免疫親和純化。對(duì)照構(gòu)建體包括rapGAP。該構(gòu)建體制備如Rubinfeld B.和Polakis P.，“桿狀病毒產(chǎn)生的Rap1 GTPase-激活蛋白的純化”，酶學(xué)方法，W.E.Balch，Channing J.Der和Alan Hall編，CaliforniaAcademic Press，Inc.，25531-38中所述。BRCA1構(gòu)建體的制備如下將BRCA1 Nco1-Nhel片段亞克隆至pAcOG1S的Nco1-Nhel位點(diǎn)得到pAcO BRCA1 5’(1-1293)。將BRCA1的Nhel鈍末端-Not1片段亞克隆至pAcO G2 Stu1-Not1l位點(diǎn)得到pAcO BRCA1 3’(1293-1863)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到SF9細(xì)胞中。基本按上述實(shí)施例中所述的免疫親和純化方法提純BRCA1構(gòu)建體。
為了體外轉(zhuǎn)錄和翻譯BRCA1調(diào)節(jié)子，將下列構(gòu)建體亞克隆至PCANmyc中，它是pCDNA3(Invitrogen)用加工成編碼起始甲硫氨酸、Myc表位標(biāo)記(參見(jiàn)Evan G.等，分子細(xì)胞生物學(xué)，53610(1985))和一個(gè)多克隆位點(diǎn)(Rubinfeld B.等，科學(xué)，2721023-1026(1996))的合成接頭取代多接頭而衍生得到的。
含有BRCA1調(diào)節(jié)子3號(hào)序列，091-1F84的質(zhì)粒PCANmyc091-1F84是將3號(hào)序列，091-1F84的Spel鈍末端-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的EcoRV-Xhol位點(diǎn)制備的。含有BRCA1調(diào)節(jié)子1號(hào)序列，091-21A31的質(zhì)粒PCANmyc091-21A31是將1號(hào)序列，091-21A31的BamH1-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的BamH1-Xhol位點(diǎn)制備的。最后，含有BRCA1調(diào)節(jié)子5號(hào)序列，091-132Q20的質(zhì)粒PCANmyc091-132Q20是將5號(hào)序列，091-132Q20的EcoR1-Xhol片段亞克隆至PCANmyc3的EcoR1-Xhol位點(diǎn)制備的。
為了進(jìn)行體外結(jié)合分析，BRCA1調(diào)節(jié)子cDNA(3號(hào)序列，091-1F84；1號(hào)序列，091-21A31；5號(hào)序列，091-132Q20)用TNT偶聯(lián)的小麥胚細(xì)胞裂解體系(Promega)在[35S]甲硫氨酸存在下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。然后，將1-2ug純化的重組BRCA1蛋白(Glu-Glu標(biāo)記的BRCA1 5’(1-1293)或BRCA1 3’(1293-1863))與10μl抗Glu-Glu偶聯(lián)的G蛋白-瓊脂糖珠一起加入25μl預(yù)先澄清的裂解物中。4℃振蕩溫育2小時(shí)后，瓊脂糖珠用1ml冰冷的B緩沖液(20mMTris(pH7.5)，150mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)洗3次，用20μlSDS-PAGE樣品緩沖液洗脫，進(jìn)行SDS-PAGE和熒光顯影。
SDS-PAGE熒光顯影顯示三個(gè)BRCA1調(diào)節(jié)子都與BRCA1 5’(1-1293)構(gòu)建體發(fā)生親和沉淀，而不與BRCA1 3’(1293-1863)形成沉淀。
rapGAP對(duì)照不與任何一種BRCA1調(diào)節(jié)子發(fā)生親和沉淀。綜合上述結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)展了雙雜合檢測(cè)的結(jié)果，證實(shí)了BRCA1調(diào)節(jié)子與BRCA1的結(jié)合。
實(shí)施例6制備BRCA1調(diào)節(jié)子的抗體為了制備抗體，利用特異識(shí)別重組可溶蛋白中表達(dá)的Glu-Glu表位的固定化抗Glu-Glu抗體從桿狀病毒感染的SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞中免疫親和純化BRCA1調(diào)節(jié)子(參見(jiàn)Rubinfeld B.等，分子細(xì)胞生物學(xué)，124634-4642(1992))。簡(jiǎn)言之，將重組SF9細(xì)胞離心沉淀，在5倍體積的[20mMTris(pH8.0)，1mM EDTA，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]溶液中裂解，冰浴10分鐘。加入NaCl至終濃度150mM，室溫保持10分鐘，離心。然后將所得上清液上樣到含有共價(jià)交聯(lián)到蛋白G-瓊脂糖的小鼠Glu-Glu抗體的1ml親和柱上。將柱子用10-15ml裂解緩沖液洗滌，用每毫升同一緩沖液含100ugGlu-Glu肽(EYMPME)的溶液洗脫。收集各級(jí)分，通過(guò)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，匯集峰級(jí)分，根據(jù)純度進(jìn)一步在HPLC柱中純化，該柱包括Resource Q、Resource S、ResourceEth(Pharmacia)。若純化不可溶蛋白，特別是1號(hào)序列，091-21A31，則離心沉淀重組SF9細(xì)胞，在5倍體積的溶液[20mM Tris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，2％SDS，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]中裂解，室溫保持20-30分鐘，超速離心。取出上層液相，調(diào)節(jié)NaCl至400mM，再離心。然后將澄清的上清液用1×TG緩沖液[20mMTris(pH8.0)，137mM NaCl，1mM EGTA，1.5mM MgCl2，1％TritonX 100，10％甘油，分別為10ug/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽、pefabloc，1mM抑酶肽，1mM DTT]1∶10稀釋?zhuān)?jīng)3μm GelmanVersapore濾器過(guò)濾，上樣到1ml抗Glu-Glu的親和柱上。親和柱用10-15ml含400mM NaCl的1×TG緩沖液洗滌，用含1％SDS和100ug/ml Glu-Glu肽的1×TG緩沖液洗脫。各級(jí)分進(jìn)行SDS-PAGE分析，匯集，用于免疫兔子。
要制備含抗BRCA1調(diào)節(jié)子的抗體的抗血清，則用BRCA1調(diào)節(jié)子如下免疫兔子。對(duì)BRCA1調(diào)節(jié)子1號(hào)序列，091-21A31，通常要進(jìn)行兩次免疫；第一次皮下注射含在CFA中的0.500mg，四個(gè)星期后第二次肌內(nèi)注射含在ICFA中的0.250mg。取兔血，收集抗血清，如下純化抗體。
用偶聯(lián)于載體基質(zhì)上的BRCA1調(diào)節(jié)子免疫原親和純化BRCA1調(diào)節(jié)子抗體。簡(jiǎn)要步驟為，將BRCA1調(diào)節(jié)子1號(hào)序列，091-21A31按如下偶聯(lián)到CNBr活化的Sepharose 6MB(Pharmacia)上。1ml基質(zhì)按照廠(chǎng)商說(shuō)明進(jìn)行活化(即重懸于1mM HCl，在1mM HCl中用燒結(jié)玻璃濾器洗15分鐘)。將1mg 1號(hào)序列，091-21A31對(duì)偶聯(lián)緩沖液
在4℃透析過(guò)夜，換兩次緩沖液。將透析得到的蛋白質(zhì)與CNBr活化的Sepharose 6MB溫育，于4℃振蕩過(guò)夜。過(guò)量的配體用偶聯(lián)緩沖液洗去，殘留的任何活性基團(tuán)用1M乙醇胺室溫封閉反應(yīng)兩小時(shí)。用不同pH值的緩沖液交替洗三輪，每輪包括用0.1M醋酸緩沖液(pH4.0)，0.5M NaCl洗一次，隨后用0.1M Tris(pH8.0)，0.5M NaCl洗一次。將偶聯(lián)了蛋白質(zhì)的凝膠基質(zhì)重新懸浮于PBS，與5ml抗體血清在4℃振蕩溫育過(guò)夜。將混合液注入柱子，使其逐滴流出，每次用15ml PBS洗滌，共洗三次。用800μl 0.2M甘氨酸(pH2.5)洗脫，收集七次的洗脫液，每次洗脫液立即用200μl 1M K2HPO4中和。合并峰級(jí)分，透析到PBS疊氮化物中保存。
美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏物編碼3號(hào)序列，091-1F84；1號(hào)序列，091-21A31；5號(hào)序列，091-132Q20的cDNA克隆于1996年8月14日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)分別為98141(3號(hào)序列，091-1F84)、98142(1號(hào)序列，091-21A31)、98143(5號(hào)序列，091-132Q20)。這些保藏物是依據(jù)Budapest條約保藏的，保藏日之后至少保留30年，最近一次要求之后至少保留5年。
如上已詳盡描述了本發(fā)明，有許多本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的變化和修改不背離附加權(quán)利要求的精神和范圍。
序列表(1)基本信息(i)申請(qǐng)人Rubinfeld，BonneePolakis，Paul G.
Ligenfelter，CarolVuong，Terilyn T.
(ii)發(fā)明名稱(chēng)BRCA1活性調(diào)節(jié)子(iii)序列數(shù)目6(iv)聯(lián)系地址(A)地址Onyx Pharmaceuticals，Inc.
(B)街道3031 Rsearch Drive(C)城市Richmond(D)州名CA(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼94806(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.30(vi)目前申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)柮绹?guó)未知(B)遞交日(C)分類(lèi)實(shí)用新型(viii)律師/代理人信息(A)名稱(chēng)Giotta，Gregory(B)登記號(hào)32,028(C)參考/著錄號(hào)ONYX1024 GG
(ix)電信信息(A)電話(huà)(510)262-8710(B)傳真(510)222-9758(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2065個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)否(iv)反義否(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置103..1512(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGGATCCCC CGGGCTGCAG GAATTCGGCA CGAGCGGCAC GAGTACGAAG CCGGACCTGT60AGCAGTTTCT TTGGCTGCCT GGGCCCCTTG AGTCCAGCCA TC ATG CCT ATC CGT 114Met Pro Ile Arg1GCT CTG TGC ACT ATC TGC TCC GAC TTC TTC GAT CAC TCC CGC GAC GTG 162Ala Leu Cys Thr Ile Cys Ser Asp Phe Phe Asp His Ser Arg Asp Val5 10 15 20GCC GCC ATC CAC TGC GGC CAC ACC TTC CAC TTG CAG TGC CTA ATT CAG 210Ala Ala Ile His Cys Gly His Thr Phe His Leu Gln Cys Leu Ile Gln25 30 35TGG TTT GAG ACA GCA CCA AGT CGG ACC TGC CCA CAG TGC CGA ATC CAG 258Trp Phe Glu Thr Ala Pro Ser Arg Thr Cys Pro Gln Cys Arg Ile Gln40 45 50GTT GGC AAA AGA ACC ATT ATC AAT AAG CTC TTC TTT GAT CTT GCC CAG 306Val Gly Lys Arg Thr Ile Ile Asn Lys Leu Phe Phe Asp Leu Ala Gln55 60 65GAG GAG GAG AAT GTC TTG GAT GCA GAA TTC TTA AAG AAT GAA CTG GAC 354Glu Glu Glu Asn Val Leu Asp Ala Glu Phe Leu Lys Asn Glu Leu Asp70 75 80AAT GTC AGA GCC CAG CTT TCC CAG AAA GAC AAG GAG AAA CGA GAC AGC 402Asn Val Arg Ala Gln Leu Ser Gln Lys Asp Lys Glu Lys Arg Asp Ser85 90 95 100CAG GTC ATC ATC GAC ACT CTG CGG GAT ACG CTG GAA GAA CGC AAT GCT 450Gln Val Ile Ile Asp Thr Leu Arg Asp Thr Leu Glu Glu Arg Asn Ala105 110 115ACT GTG GTA TCT CTG CAG CAG GCC TTG GGC AAG GCC GAG ATG CTG TGC 498Thr Val Val Ser Leu Gln Gln Ala Leu Gly Lys Ala Glu Met Leu Cys120 125 130TCC ACA CTG AAA AAG CAG ATG AAG TAC TTA GAG CAG CAG CAG GAT GAG 546Ser Thr Leu Lys Lys Gln Met Lys Tyr Leu Glu Gln Gln Gln Asp Glu135 140 145ACC AAA CAA GCA CAA GAG GAG GCC CGC CGG CTC AGG AGC AAG ATG AAG 594Thr Lys Gln Ala Gln Glu Glu Ala Arg Arg Leu Arg Ser Lys Met Lys150 155 160ACC ATG GAG CAG ATT GAG CTT CTA CTC CAG AGC CAG CGC CCT GAG GTG 642Thr Met Glu Gln Ile Glu Leu Leu Leu Gln Ser Gln Arg Pro Glu Val165 170 175 180GAG GAG ATG ATC CGA GAC ATG GGT GTG GGA CAG TCA GCG GTG GAA CAG 690Glu Glu Met Ile Arg Asp Met Gly Val Gly Gln Ser Ala Val Glu Gln185 190 195CTG GCT GTG TAC TGT GTG TCT CTC AAG AAA GAG TAC GAG AAT CTA AAA 738Leu Ala Val Tyr Cys Val Ser Leu Lys Lys Glu Tyr Glu Asn Leu Lys200 205 210GAG GCA CGG AAG GCC TCA GGG GAG GTG GCT GAC AAG CTG AGG AAG GAT 786Glu Ala Arg Lys Ala Ser Gly Glu Val Ala Asp Lys Leu Arg Lys Asp215 220 225TTG TTT TCC TCC AGA AGC AAG TTG CAG ACA GTC TAC TCT GAA TTG GAT 834Leu Phe Ser Ser Arg Ser Lys Leu Gln Thr Val Tyr Ser Glu Leu Asp230 235 240CAG GCC AAG TTA GAA CTG AAG TCA GCC CAG AAG GAC TTA CAG AGT GCT 882Gln Ala Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ala Gln Lys Asp Leu Gln Ser Ala245 250 255 260GAC AAG GAA ATC ATG AGC CTG AAA AAG AAG CTA ACG ATG CTG CAG GAA 930Asp Lys Glu Ile Met Ser Leu Lys Lys Lys Leu Thr Met Leu Gln Glu265 270 275ACC TTG AAC CTG CCA CCA GTG GCC AGT GAG ACT GTC GAC CGC CTG GTT 978Thr Leu Asn Leu Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Val Asp Arg Leu Val280 285 290TTA GAG AGC CCA GCC CCT GTG GAG GTG AAT CTG AAG CTC CGC CGG CCA1026Leu Glu Ser Pro Ala Pro Val Glu Val Asn Leu Lys Leu Arg Arg Pro295 300 305TCC TTC CGT GAT GAT ATT GAT CTC AAT GCT ACC TTT GAT GTG GAT ACT1074Ser Phe Arg Asp Asp Ile Asp Leu Asn Ala Thr Phe Asp Val Asp Thr310 315 320CCC CCA GCC CGG CCC TCC AGC TCC CAG CAT GGT TAC TAC GAA AAA CTT1122Pro Pro Ala Arg Pro Ser Ser Ser Gln His Gly Tyr Tyr Glu Lys Leu325 330 335 340TGC CTA GAG AAG TCA CAC TCC CCA ATT CAG GAT GTC CCC AAG AAG ATA1170Cys Leu Glu Lys Ser His Ser Pro Ile Gln Asp Val Pro Lys Lys Ile345 350 355TGC AAA GGC CCC AGG AAG GAG TCC CAG CTC TCA CTG GGT GGC CAG AGC1218Cys Lys Gly Pro Arg Lys Glu Ser Gln Leu Ser Leu Gly Gly Gln Ser360 365 370TGT GCA GGA GAG CCA GAT GAG GAA CTG GTT GGT GCC TTC CCT ATT TTT1266Cys Ala Gly Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Gly Ala Phe Pro Ile Phe375 380 385GTC CGG AAT GCC ATC CTA GGC CAG AAA CAG CCC AAG AGG CCC AGG TCA1314Val Arg Asn Ala Ile Leu Gly Gln Lys Gln Pro Lys Arg Pro Arg Ser390 395 400GAG TCC TCT TGC AGC AAA GAT GTG GTA AGG ACA GGC TTC GAT GGG CTC1362Glu Ser Ser Cys Ser Lys Asp Val Val Arg Thr Gly Phe Asp Gly Leu405 410 415 420GGT GGC CGG ACA AAA TTC ATC CAG CCT ACT GAC ACA GTC ATG ATC CGC1410Gly Gly Arg Thr Lys Phe Ile Gln Pro Thr Asp Thr Val Met Ile Arg425 430 435CCA TTG CCT GTT AAG CCC AAG ACC AAG GTT AAG CAG AGG GTG AGG GTG1458Pro Leu Pro Val Lys Pro Lys Thr Lys Val Lys Gln Arg Val Arg Val440 445 450AAG ACA GTG CCT TCT CTC TTC CAG GCC AAG CTG GAC ACC TTC CTG TGG1506Lys Thr Val Pro Ser Leu Phe Gln Ala Lys Leu Asp Thr Phe Leu Trp455 460 465TCG TGA GAACAGTGAG TCTGACCAAT GGCCAGACAC ATGCCTGCAA CTTGTAGGTC 1562Ser *470AAGGACTGTC CAGGCAGGGG TTTTGTGGAC AGAGCCCCAC TTTCGGGACC AGCCTGAGGT 1622GTAAGGGCAG ACAAACAGGT GAGGGTGAGT GTGACACCCA GAGACTGCTC TTCCTGCCCT 1682CACCCTGCCC CACTCCTACG ACTGGGAGCT GACATGACCA GCCCACTGAT CCTGTCAGCA 1742GGTCCTGCTC CTGTTGCCAG GCTCCTGTTT ATAGCCATGA TCAGATGTGG TCAGACTCTT 1802TCTGGGCCTG GAGACCACGG TCACTTGTTG ACTGTCTCTG TGGACCAGAG TGCTTGAGGC 1862ATCTCAGGCA GCCTCAGCCC AAGCTTCTAC CTGCCTTTGA CTTGCTTCTA GGCATAGCCT 1922GGGCCAAGCA GGGTGGGGAA TGGAGGATAG CATGGGATGT ATGGAGAGGA TGGAAGATTT 1982TCATGTAAAA TAAAATTAAA AAAAAAAAAA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2042AAAAAAAAAA AAAAAAACTC GAG 2065(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度470個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Ile Arg Ala Leu Cys Thr Ile Cys Ser Asp Phe Phe Asp His1 5 10 15Ser Arg Asp Val Ala Ala Ile His Cys Gly His Thr Phe His Leu Gln20 25 30Cys Leu Ile Gln Trp Phe Glu Thr Ala Pro Ser Arg Thr Cys Pro Gln35 40 45Cys Arg Ile Gln Val Gly Lys Arg Thr Ile Ile Asn Lys Leu Phe Phe50 55 60Asp Leu Ala Gln Glu Glu Glu Asn Val Leu Asp Ala Glu Phe Leu Lys65 70 75 80Asn Glu Leu Asp Asn Val Arg Ala Gln Leu Ser Gln Lys Asp Lys Glu85 90 95Lys Arg Asp Ser Gln Val Ile Ile Asp Thr Leu Arg Asp Thr Leu Glu100 105 110Glu Arg Asn Ala Thr Val Val Ser Leu Gln Gln Ala Leu Gly Lys Ala115 120 125Glu Met Leu Cys Ser Thr Leu Lys Lys Gln Met Lys Tyr Leu Glu Gln130 135 140Gln Gln Asp Glu Thr Lys Gln Ala Gln Glu Glu Ala Arg Arg Leu Arg145 150 155 160Ser Lys Met Lys Thr Met Glu Gln Ile Glu Leu Leu Leu Gln Ser Gln165 170 175Arg Pro Glu Val Glu Glu Met Ile Arg Asp Met Gly Val Gly Gln Ser180 185 190Ala Val Glu Gln Leu Ala Val Tyr Cys Val Ser Leu Lys Lys Glu Tyr195 200 205Glu Asn Leu Lys Glu Ala Arg Lys Ala Ser Gly Glu Val Ala Asp Lys210 215 220Leu Arg Lys Asp Leu Phe Ser Ser Arg Ser Lys Leu Gln Thr Val Tyr225 230 235 240Ser Glu Leu Asp Gln Ala Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ala Gln Lys Asp245 250 255Leu Gln Ser Ala Asp Lys Glu Ile Met Ser Leu Lys Lys Lys Leu Thr260 265 270Met Leu Gln Glu Thr Leu Asn Leu Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Val275 280 285Asp Arg Leu Val Leu Glu Ser Pro Ala Pro Val Glu Val Asn Leu Lys290 295 300Leu Arg Arg Pro Ser Phe Arg Asp Asp Ile Asp Leu Asn Ala Thr Phe305 310 315 320Asp Val Asp Thr Pro Pro Ala Arg Pro Ser Ser Ser Gln His Gly Tyr325 330 335Tyr Glu Lys Leu Cys Leu Glu Lys Ser His Ser Pro Ile Gln Asp Val340 345 350Pro Lys Lys Ile Cys Lys Gly Pro Arg Lys Glu Ser Gln Leu Ser Leu355 360 365Gly Gly Gln Ser Cys Ala Gly Glu Pro Asp Glu Glu Leu Val Gly Ala370 375 380Phe Pro Ile Phe Val Arg Asn Ala Ile Leu Gly Gln Lys Gln Pro Lys385 390 395 400Arg Pro Arg Ser Glu Ser Ser Cys Ser Lys Asp Val Val Arg Thr Gly405 410 415Phe Asp Gly Leu Gly Gly Arg Thr Lys Phe Ile Gln Pro Thr Asp Thr420 425 430Val Met Ile Arg Pro Leu Pro Val Lys Pro Lys Thr Lys Val Lys Gln435 440 445Arg Val Arg Val Lys Thr Val Pro Ser Leu Phe Gln Ala Lys Leu Asp45C 455 460Thr Phe Leu Trp Ser*465470(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度3256個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置34.，2541(xi)序列描述SEQ ID NO3GAACTAGTGG ATCCCCCGGG CTGCAGGAAT TCG GCA CGA GAA AGC TTA TCC CTT 54Ala Arg Glu Ser Leu Ser Leu1 5CCC TCG ATG CTT CGG GAT GCT GCA ATT GGC ACT ACC CCT TTC TCT ACT 102Pro Ser Met Leu Arg Asp Ala Ala Ile Gly Thr Thr Pro Phe Ser Thr10 15 20TGC TCG GTG GGG ACT TGG TTT ACT CCT TCA GCA CCA CAG GAA AAG AGT 150Cys Ser Val Gly Thr Trp Phe Thr Pro Ser Ala Pro Gln Glu Lys Ser25 30 35ACA AAC ACA TCC CAG ACA GGC CTG GTT GGC ACC AAG CAC AGT ACT TCT 198Thr Asn Thr Ser Gln Thr Gly Leu Val Gly Thr Lys His Ser Thr Ser40 45 50 55GAG ACA GAG CAG CTC CTG TGT GGC CGG CCT CCA GAT CTG ACT GCC TTG 246Glu Thr Glu Gln Leu Leu Cys Gly Arg Pro Pro Asp Leu Thr Ala Leu60 65 70TCT CGA CAT GAC TTG GAA GAT AAC CTG CTG AGC TCT CTT GTC ATT CTG 294Ser Arg His Asp Leu Glu Asp Asn Leu Leu Ser Ser Leu Val Ile Leu75 80 85GAG GTT CTC TCC CGC CAG CTT CGG GAC TGG AAG AGC CAG CTG GCT GTC 342Glu Val Leu Ser Arg Gln Leu Arg Asp Trp Lys Ser Gln Leu Ala Val90 95 100CCT CAC CCA GAA ACC CAG GAC AGT AGC ACA CAG ACT GAC ACA TCT CAC 390Pro His Pro Glu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Gln Thr Asp Thr Ser His105 110 115AGT GGG ATA ACT AAT AAA CTT CAG CAT CTT AAG GAG AGC CAT GAG ATG 438Ser Gly Ile Thr Asn Lys Leu Gln His Leu Lys Glu Ser His Glu Met120 125 130 135GGA CAG GCC CTA CAG CAG GCC AGA AAT GTC ATG CAA TCA TGG GTG CTT 486Gly Gln Ala Leu Gln Gln Ala Arg Asn Val Met Gln Ser Trp Val Leu140 145 150ATC TCT AAA GAG CTG ATA TCC TTG CTT CAC CTA TCC CTG TTG CAT TTA 534Ile Ser Lys Glu Leu Ile Ser Leu Leu His Leu Ser Leu Leu His Leu155 160 165GAA GAA GAT AAG ACT ACT GTG AGT CAG GAG TCT CGG CGT GCA GAA ACA 582Glu Glu Asp Lys Thr Thr Val Ser Gln Glu Ser Arg Arg Ala Glu Thr170 175 180TTG GTC TGT TGC TGT TTT GAT TTG CTG AAG AAA TTG AGG GCA AAG CTC 630Leu Val Cys Cys Cys Phe Asp Leu Leu Lys Lys Leu Arg Ala Lys Leu185 190 195CAG AGC CTC AAA GCA GAA AGG GAG GAG GCA AGG CAC AGA GAG GAA ATG 678Gln Ser Leu Lys Ala Glu Arg Glu Glu Ala Arg His Arg Glu Glu Met200 205 210 215GCT CTC AGA GGC AAG GAT GCG GCA GAG ATA GTG TTG GAG GCT TTC TGT 726Ala Leu Arg Gly Lys Asp Ala Ala Glu Ile Val Leu Glu Ala Phe Cys220 225 230GCA CAC GCC AGC CAG CGC ATC AGC CAG CTG GAA CAG GAC CTA GCA TCC 774Ala His Ala Ser Gln Arg Ile Ser Gln Leu Glu Gln Asp Leu Ala Ser235 240 245ATG CGG GAA TTC AGA GGC CTT CTG AAG GAT GCC CAG ACC CAA CTG GTA 822Met Arg Glu Phe Arg Gly Leu Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gln Leu Val250 255 260GGG CTT CAT GCC AAG CAA GAA GAG CTG GTT CAG CAG ACA GTG AGT CTT 870Gly Leu His Ala Lys Gln Glu Glu Leu Val Gln Gln Thr Val Ser Leu265 270 275ACT TCT ACC TTG CAA CAA GAC TGG AGG TCC ATG CAA CTG GAT TAT ACA 918Thr Ser Thr Leu Gln Gln Asp Trp Arg Ser Met Gln Leu Asp Tyr Thr280 285 290 295ACA TGG ACA GCT TTG CTG AGT CGG TCC CGA CAA CTC ACA GAG AAA CTC 966Thr Trp Thr Ala Leu Leu Ser Arg Ser Arg Gln Leu Thr Glu Lys Leu300 305 310ACA GTC AAG AGC CAG CAA GCC CTG CAG GAA CGT GAT GTG GCA ATT GAG1014Thr Val Lys Ser Gln Gln Ala Leu Gln Glu Arg Asp Val Ala Ile Glu315 320 325GAA AAG CAG GAG GTT TCT AGG GTG CTG GAA CAA GTC TCT GCC CAG TTA1062Glu Lys Gln Glu Val Ser Arg Val Leu Glu Gln Val Ser Ala Gln Leu330 335 340GAG GAG TGC AAA GGC CAA ACA GAA CAA CTG GAG TTG GAA AAC AGT CGT1110Glu Glu Cys Lys Gly Gln Thr Glu Gln Leu Glu Leu Glu Asn Ser Arg345 350 355CTA GCA ACA GAT CTC CGG GCT CAG TTG CAG ATT CTG GCC AAC ATG GAC1158Leu Ala Thr Asp Leu Arg Ala Gln Leu Gln Ile Leu Ala Asn Met Asp360 365 370 375AGC CAG CTA AAA GAG CTA CAG AGT CAG CAT ACC CAT TGT GCC CAG GAC1206Ser Gln Leu Lys Glu Leu Gln Ser Gln His Thr His Cys Ala Gln Asp380 385 390CTG GCT ATG AAG GAT GAG TTA TTC TGC CAG CTT ACC CAG AGC AAT GAG1254Leu Ala Met Lys Asp Glu Leu Phe Cys Gln Leu Thr Gln Ser Asn Glu395 400 405GAG CAG GCT GCT CAA TGG CAA AAG GAA GAG ATG GCA CTA AAA CAC ATG1302Glu Gln Ala Ala Gln Trp Gln Lys Glu Glu Met Ala Leu Lys His Met410 415 420CAG GCA GAA CTG CAG CAG CAA CAA GCT GTC CTG GCC AAA GAG GTG CGG1350Gln Ala Glu Leu Gln Gln Gln Gln Ala Val Leu Ala Lys Glu Val Arg425 430 435GAC CTG AAA GAG ACC TTG GAG TTT GCA GAC CAG GAG AAT CAG GTT GCT1398Asp Leu Lys Glu Thr Leu Glu Phe Ala Asp Gln Glu Asn Gln Val Ala440 445 450 455CAC CTG GAG CTG GGT CAG GTT GAG TGT CAA TTG AAA ACC ACA CTG GAA1446His Leu Glu Leu Gly Gln Val Glu Cys Gln Leu Lys Thr Thr Leu Glu460 465 470GTG CTC CGG GAG CGC AGC TTG CAG TGT GAG AAC CTC AAG GAC ACT GTA1494Val Leu Arg Glu Arg Ser Leu Gln Cys Glu Asn Leu Lys Asp Thr Val475 480 485GAG AAC CTA ACG GCT AAA CTG GCC AGC ACC ATA GCA GAT AAC CAG GAG1542Glu Asn Leu Thr Ala Lys Leu Ala Ser Thr Ile Ala Asp Asn Gln Glu490 495 500CAA GAT CTG GAG AAA ACA CGG CAG TAC TCT CAA AAG CTA AGG CTG CTG1590Gln Asp Leu Glu Lys Thr Arg Gln Tyr Ser Gln Lys Leu Arg Leu Leu505 510 515ACT GAG CAA CTA CAG AGC CTG ACT CTC TTT CTA CAG ACA AAA CTA AAG1638Thr Glu Gln Leu Gln Ser Leu Thr Leu Phe Leu Gln Thr Lys Leu Lys520 525 530 535GAG AAG ACT GAA CAA GAG ACC CTT CTG CTG AGT ACA GCC TGT CCT CCC1686Glu Lys Thr Glu Gln Glu Thr Leu Leu Leu Ser Thr Ala Cys Pro Pro540 545 550ACC CAG GAA CAC CCT CTG CCT AAT GAC AGG ACC TTC CTG GGA AGC ATC1734Thr Gln Glu His Pro Leu Pro Asn Asp Arg Thr Phe Leu Gly Ser Ile555 560 565TTG ACA GCA GTG GCA GAT GAA GAG CCA GAA TCA ACT CCT GTG CCC TTG1782Leu Thr Ala Val Ala Asp Glu Glu Pro Glu Ser Thr Pro Val Pro Leu570 575 580CTT GGA AGT GAC AAG AGT GCT TTC ACC CGA GTA GCA TCA ATG GTT TCC1830Leu Gly Ser Asp Lys Ser Ala Phe Thr Arg Val Ala Ser Met Val Ser585 590 595CTT CAG CCC GCA GAG ACC CCA GGC ATG GAG GAG AGC CTG GCA GAA ATG1878Leu Gln Pro Ala Glu Thr Pro Gly Met Glu Glu Ser Leu Ala Glu Met600 605 610 615AGT ATT ATG ACT ACT GAG CTT CAG AGT CTT TGT TCC CTG CTA CAA GAG1926Ser Ile Met Thr Thr Glu Leu Gln Ser Leu Cys Ser Leu Leu Gln Glu620 625 630TCT AAA GAA GAA GCC ATC AGG ACT CTG CAG CGA AAA ATT TGT GAG CTG1974Ser Lys Glu Glu Ala Ile Arg Thr Leu Gln Arg Lys Ile Cys Glu Leu635 640 645CAA GTT AGG CTG CAG GCC CAG GAA GAA CAG CAT CAG GAA GTC CAG AAG2022Gln Val Arg Leu Gln Ala Gln Glu Glu Gln His Gln Glu Val Gln Lys650 655 660GCA AAA GAA GCA GAC ATA GAG AAG CTG AAC CAG GCC TTG TGC TTG CGC2070Ala Lys Glu Ala Asp Ile Glu Lys Leu Asn Gln Ala Leu Cys Leu Arg665 670 675TAC AAG AAT GAA AAG GAG CTC CAG GAA GTG ATA CAG CAG CAG AAT GAG2118Tyr Lys Asn Glu Lys Glu Leu Gln Glu Val Ile Gln Gln Gln Asn Glu680 685 690 695AAG ATC CTA GAA CAG ATA GAC AAG AGT GGC GAG CTC ATA AGC CTT AGA2166Lys Ile Leu Glu Gln Ile Asp Lys Ser Gly Glu Leu Ile Ser Leu Arg700 705 710GAG GAG GTG ACC CAC CTT ACC CGC TCA CTT CGG CGT GCG GAG ACA GAG2214Glu Glu Val Thr His Leu Thr Arg Ser Leu Arg Arg Ala Glu Thr Glu715 720 725ACC AAA GTG CTC CAG GAG GCC CTG GCA GGC CAG CTG GAC TCC AAC TGC2262Thr Lys Val Leu Gln Glu Ala Leu Ala Gly Gln Leu Asp Ser Asn Cys730 735 740CAG CCT ATG GCC ACC AAT TGG ATC CAG GAG AAA GTG TGG CTC TCT CAG2310Gln Pro Met Ala Thr Asn Trp Ile Gln Glu Lys Val Trp Leu Ser Gln745 750 755GAG GTG GAC AAA CTG AGA GTG ATG TTC CTG GAG ATG AAA AAT GAG AAG2358Glu Val Asp Lys Leu Arg Val Met Phe Leu Glu Met Lys Asn Glu Lys760 765 770 775GAA AAA CTC ATG ATC AAG TTC CAG AGC CAT AGA AAT ATC CTA GAG GAG2406Glu Lys Leu Met Ile Lys Phe Gln Ser His Arg Asn Ile Leu Glu Glu780 785 790AAC CTT CGG CGC TCT GAC AAG GAG TTA GAA AAA CTA GAT GAC ATT GTT2454Asn Leu Arg Arg Ser Asp Lys Glu Leu Glu Lys Leu Asp Asp Ile Val795 800 805CAG CAT ATT TAT AAG ACC CTG CTC TCT ATT CCA GAG GTG GTG AGG GGA2502Gln His Ile Tyr Lys Thr Leu Leu Ser Ile Pro Glu Val Val Arg Gly810 815 820TGC AGA GAA CTA CAG GGA TTG CTG GAA TTT CTG AGC TAA GAAACTGAAA 2551Cys Arg Glu Leu Gln Gly Leu Leu Glu Phe Leu Ser825 830 835GCCAGAATCT GCTTCACCTC TTTTTACCTG CAATACCCCC TTACCCCAAT ACCAAGACCA2611ACTGGCATAG AGCCAACTGA GATAAATGCT ATTTAAATAA AGTGTATTTA ATGAAAACTC2671GTGCCGAATT CGGCACGAGC GGCACGAGCG GCACGAGCTG CAGCCATGTC TCTAGTGATC2731CCTGAAAAGT TCCAGCATAT TTTGCGAGTA CTCAACACCA ACATCGATGG GCGGCGGAAA2791ATAGCCTTTG CCATCACTGC CATTAAGGGT GTGGGCCGAA GATATGCTCA TGTGGTGTTG2851AGGAAAGCAG ACATTGACCT CACCAAGAGG GCGGGAGAAC TCACTGAGGA TGAGGTGGAA2911CGTGTGATCA CCATTATGCA GAATCCACGC CAGTACAAGA TCCCAGACTG GTTCTTGAAC2971AGACAGAAGG ATGTAAAGGA TGGAAAATAC AGCCAGGTCC TAGCCAATGG TCTGGACAAC3031AAGCTCCGTG AAGACCTGGA GCGACTGAAG AAGATTCGGG CCCATAGAGG GCTGCGTCAC3091TTCTGGGGCC TTCGTGTCCG AGGCCAGCAC ACCAAGACCA CTGGCCGCCG TGGCCGCACC3151GTGGGTGTGT CCAAGAAGAA ATAAGTCTGT AGGCCTTGTC TGTTAATAAA TAGTTTATAT3211ACCAAAAAAA AAAAAAAAAA ACTCGAGCAT GCATCTAGAG GGCCC3256(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度836個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Arg Glu Ser Leu Ser Leu Pro Ser Met Leu Arg Asp Ala Ala Ile1 5 10 15Gly Thr Thr Pro Phe Ser Thr Cys Ser Val Gly Thr Trp Phe Thr Pro20 25 30Ser Ala Pro Gln Glu Lys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Thr Gly Leu Val35 40 45Gly Thr Lys His Ser Thr Ser Glu Thr Glu Gln Leu Leu Cys Gly Arg50 55 60Pro Pro Asp Leu Thr Ala Leu Ser Arg His Asp Leu Glu Asp Asn Leu65 70 75 80Leu Ser Ser Leu Val Ile Leu Glu Val Leu Ser Arg Gln Leu Arg Asp85 90 95Trp Lys Ser Gln Leu Ala Val Pro His Pro Glu Thr Gln Asp Ser Ser100 105 110Thr Gln Thr Asp Thr Ser His Ser Gly Ile Thr Asn Lys Leu Gln His115 120 125Leu Lys Glu Ser His Glu Met Gly Gln Ala Leu Gln Gln Ala Arg Asn130 135 140Val Met Gln Ser Trp Val Leu Ile Ser Lys Glu Leu Ile Ser Leu Leu145 150 155 160His Leu Ser Leu Leu His Leu Glu Glu Asp Lys Thr Thr Val Ser Gln165 170 175Glu Ser Arg Arg Ala Glu Thr Leu Val Cys Cys Cys Phe Asp Leu Leu180 185 190Lys Lys Leu Arg Ala Lys Leu Gln Ser Leu Lys Ala Glu Arg Glu Glu195 200 205Ala Arg His Arg Glu Glu Met Ala Leu Arg Gly Lys Asp Ala Ala Glu210 215 220Ile Val Leu Glu Ala Phe Cys Ala His Ala Ser Gln Arg Ile Ser Gln225 230 235 240Leu Glu Gln Asp Leu Ala Ser Met Arg Glu Phe Arg Gly Leu Leu Lys245 250 255Asp Ala Gln Thr Gln Leu Val Gly Leu His Ala Lys Gln Glu Glu Leu260 265 270Val Gln Gln Thr Val Ser Leu Thr Ser Thr Leu Gln Gln Asp Trp Arg275 280 285Ser Met Gln Leu Asp Tyr Thr Thr Trp Thr Ala Leu Leu Ser Arg Ser290 295 300Arg Gln Leu Thr Glu Lys Leu Thr Val Lys Ser Gln Gln Ala Leu Gln305310 315 320Glu Arg Asp Val Ala Ile Glu Glu Lys Gln Glu Val Ser Arg Val Leu325 330 335Glu Gln Val Ser Ala Gln Leu Glu Glu Cys Lys Gly Gln Thr Glu Gln340 345 350Leu Glu Leu Glu Asn Ser Arg Leu Ala Thr Asp Leu Arg Ala Gln Leu355 360 365Gln Ile Leu Ala Asn Met Asp Ser Gln Leu Lys Glu Leu Gln Ser Gln370 375 380His Thr His Cys Ala Gln Asp Leu Ala Met Lys Asp Glu Leu Phe Cys385 390 395 400Gln Leu Thr Gln Ser Asn Glu Glu Gln Ala Ala Gln Trp Gln Lys Glu405 410 415Glu Met Ala Leu Lys His Met Gln Ala Glu Leu Gln Gln Gln Gln Ala420 425 430Val Leu Ala Lys Glu Val Arg Asp Leu Lys Glu Thr Leu Glu Phe Ala435 440 445Asp Gln Glu Asn Gln Val Ala His Leu Glu Leu Gly Gln Val Glu Cys450 455 460Gln Leu Lys Thr Thr Leu Glu Val Leu Arg Glu Arg Ser Leu Gln Cys465 470 475 480Glu Asn Leu Lys Asp Thr Val Glu Asn Leu Thr Ala Lys Leu Ala Ser485 490 495Thr Ile Ala Asp Asn Gln Glu Gln Asp Leu Glu Lys Thr Arg Gln Tyr500 505 510Ser Gln Lys Leu Arg Leu Leu Thr Glu Gln Leu Gln Ser Leu Thr Leu515 520 525Phs Leu Gln Thr Lys Leu Lys Glu Lys Thr Glu Gln Glu Thr Leu Leu530 535 540Leu Ser Thr Ala Cys Pro Pro Thr Gln Glu His Pro Leu Pro Asn Asp545 550 555 560Arg Thr Phe Leu Gly Ser Ile Leu Thr Ala Val Ala Asp Glu Glu Pro565 570 575Glu Ser Thr Pro Val Pro Leu Leu Gly Ser Asp Lys Ser Ala Phe Thr580 585 590Arg Val Ala Ser Met Val Ser Leu Gln Pro Ala Glu Thr Pro Gly Met595 600 605Glu Glu Ser Leu Ala Glu Met Ser Ile Met Thr Thr Glu Leu Gln Ser610 615 620Leu Cys Ser Leu Leu Gln Glu Ser Lys Glu Glu Ala Ile Arg Thr Leu625 630 635 640Gln Arg Lys Ile Cys Glu Leu Gln Val Arg Leu Gln Ala Gln Glu Glu645 650 655Gln His Gln Glu Val Gln Lys Ala Lys Glu Ala Asp Ile Glu Lys Leu660665 670Asn Gln Ala Leu Cys Leu Arg Tyr Lys Asn Glu Lys Glu Leu Gln Glu675 680 685Val Ile Gln Gln Gln Asn Glu Lys Ile Leu Glu Gln Ile Asp Lys Ser690 695 700Gly Glu Leu Ile Ser Leu Arg Glu Glu Val Thr His Leu Thr Arg Ser705 710 715 720Leu Arg Arg Ala Glu Thr Glu Thr Lys Val Leu Gln Glu Ala Leu Ala725 730 735Gly Gln Leu Asp Ser Asn Cys Gln Pro Met Ala Thr Asn Trp Ile Gln740 745 750Glu Lys Val Trp Leu Ser Gln Glu Val Asp Lys Leu Arg Val Met Phe755 760 765Leu Glu Met Lys Asn Glu Lys Glu Lys Leu Met Ile Lys Phe Gln Ser770 775 780His Arg Asn Ile Leu Glu Glu Asn Leu Arg Arg Ser Asp Lys Glu Leu785 790 795 800Glu Lys Leu Asp Asp Ile Val Gln His Ile Tyr Lys Thr Leu Leu Ser805 810 815Ile Pro Glu Val Val Arg Gly Cys Arg Glu Leu Gln Gly Leu Leu Glu820 825 830Phe Leu Ser *835(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1191個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型cDNA(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置34.，1191(xi)序列描述SEQ ID NO5GAACTAGTGG ATCCCCCGGG CTGCAGGAAT TCG GCA CGA GGC GGC GCC GAA GAG 54Ala Arg Gly Gly Ala Glu Glu1 5GCG ACT GAG GCC GGA CGG GGC GGA CGG CGA CGC AGC CCG CGG CAG AAG 102Ala Thr Glu Ala Gly Arg Gly Gly Arg Arg Arg Ser Pro Arg Gln Lys10 15 20TTT GAA ATT GGC ACA ATG GAA GAA GCT GGA ATT TGT GGG CTA GGG GTG 150Phe Glu Ile Gly Thr Met Glu Glu Ala Gly Ile Cys Gly Leu Gly Val25 30 35AAA GCA GAT ATG TTG TGT AAC TCT CAA TCA AAT GAT ATT CTT CAA CAT 198Lys Ala Asp Met Leu Cys Asn Ser Gln Ser Asn Asp Ile Leu Gln His40 45 50 55CAA GGC TCA AAT TGT GGT GGC ACA AGT AAC AAG CAT TCA TTG GAA GAG 246Gln Gly Ser Asn Cys Gly Gly Thr Ser Asn Lys His Ser Leu Glu Glu60 65 70GAT GAA GGC AGT GAC TTT ATA ACA GAG AAC AGG AAT TTG GTG AGC CCA 294Asp Glu Gly Ser Asp Phe Ile Thr Glu Asn Arg Asn Leu Val Ser Pro75 80 85GCA TAC TGC ACG CAA GAA TCA AGA GAG GAA ATC CCT GGG GGA GAA GCT 342Ala Tyr Cys Thr Gln Glu Ser Arg Glu Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala90 95 100CGA ACA GAT CCC CCT GAT GGT CAG CAA GAT TCA GAG TGC AAC AGG AAC 390Arg Thr Asp Pro Pro Asp Gly Gln Gln Asp Ser Glu Cys Asn Arg Asn105 110 115AAA GAA AAA ACT TTA GGA AAA GAA GTT TTA TTA CTG ATG CAA GCC CTA 438Lys Glu Lys Thr Leu Gly Lys Glu Val Leu Leu Leu Met Gln Ala Leu120 125 130 135AAC ACC CTT TCA ACC CCA GAG GAG AAG CTG GCA GCT CTC TGT AAG AAA 486Asn Thr Leu Ser Thr Pro Glu Glu Lys Leu Ala Ala Leu Cys Lys LysTAT GCT GAT CTT CTG GAG GAG AGC AGG AGT GTT CAG AAG CAA ATG AAG 534Tyr Ala Asp Leu Leu Glu Glu Ser Arg Ser Val Gln Lys Gln Met Lys155 160 165ATC CTG CAG AAG AAG CAA GCC CAG ATT GTG AAA GAG AAA GTT CAC TTG 582Ile Leu Gln Lys Lys Gln Ala Gln Ile Val Lys Glu Lys Val His Leu170 175 180CAG AGT GAA CAT AGC AAG GCT ATC TTG GCA AGA AGC AAG CTA GAA TCT 630Gln Ser Glu His Ser Lys Ala Ile Leu Ala Arg Ser Lys Leu Glu Ser185190 195CTT TGC AGA GAA CTT CAG CGT CAC AAT AAG ACG TTA AAG GAG GAA AAT 678Leu Cys Arg Glu Leu Gln Arg His Asn Lys Thr Leu Lys Glu Glu Asn200 205 210 215ATG CAG CAG GCA CGA GAG GAA GAA GAA CGA CGT ATA GAA GCA ACT GCA 726Met Gln Gln Ala Arg Glu Glu Glu Glu Arg Arg Ile Glu Ala Thr Ala220 225 230CAT TTC CAG ATT ACC TTA AAT GAA ATT CAA GCC CAG CTG GAG CAG CAT 774His Phe Gln Ile Thr Leu Asn Glu Ile Gln Ala Gln Leu Glu Gln His235 240 245GAC ATC CAC AAC GCC AAA CTC CGA CAG GAA AAC ATT GAG CTG GGG GAG 822Asp Ile His Asn Ala Lys Leu Arg Gln Glu Asn Ile Glu Leu Gly Glu250 255 260AAG CTA AAG AAG CTC ATC GAA CAG TAC GCA CTG AGG GAA GAG CAC ATT 870Lys Leu Lys Lys Leu Ile Glu Gln Tyr Ala Leu Arg Glu Glu His Ile265 270 275GAT AAG GTG TTC AAA CAT AAG GAA CTG CAA CAG CAG CTC GTG GAT GCC 918Asp Lys Val Phe Lys His Lys Glu Leu Gln Gln Gln Leu Val Asp Ala280 285 290 295AAA CTG CAG CAA ACG ACA CAA CTG ATA AAA GAA GCT GAT GAA AAA CAT 966Lys Leu Gln Gln Thr Thr Gln Leu Ile Lys Glu Ala Asp Glu Lys His300 305 310CAG AGA GAG AGA GAG TTT TTA TTA AAA GAA GCG ACA GAA TCG AGG CAC1014Gln Arg Glu Arg Glu Phe Leu Leu Lys Glu Ala Thr Glu Ser Arg His315 320 325AAA TAC GAA CAA ATG AAA CAG CAA GAA GTA CAA CTA AAA CAG CAG CTT1062Lys Tyr Glu Gln Met Lys Gln Gln Glu Val Gln Leu Lys Gln Gln Leu330 335 340TCT CTT TAT ATG GAT AAG TTT GAA GAA TTC CAG ACT ACC ATG GCA AAA1110Ser Leu Tyr Met Asp Lys Phe Glu Glu Phe Gln Thr Thr Met Ala Lys345 350 355AGC AAT GAA CTG TTT ACA ACC TTC AGA CAG GAA ATG GAA AAG ATG ACA1158Ser Asn Glu Leu Phe Thr Thr Phe Arg Gln Glu Met Glu Lys Met Thr360 365 370 375AAG AAA ATT AAA AAA AAA AAA AAA AAA CTC GAG 1191Lys Lys Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu380 385(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度386個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)型(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Arg Gly Gly Ala Glu Glu Ala Thr Glu Ala Gly Arg Gly Gly Arg1 5 10 15Arg Arg Ser Pro Arg Gln Lys Phe Glu Ile Gly Thr Met Glu Glu Ala20 25 30Gly Ile Cys Gly Leu Gly Val Lys Ala Asp Met Leu Cys Asn Ser Gln35 40 45Ser Asn Asp Ile Leu Gln His Gln Gly Ser Asn Cys Gly Gly Thr Ser50 55 60Asn Lys His Ser Leu Glu Glu Asp Glu Gly Ser Asp Phe Ile Thr Glu65 70 75 80Asn Arg Asn Leu Val Ser Pro Ala Tyr Cys Thr Gln Glu Ser Arg Glu85 90 95Glu Ile Pro Gly Gly Glu Ala Arg Thr Asp Pro Pro Asp Gly Gln Gln100 105 110Asp Ser Glu Cys Asn Arg Asn Lys Glu Lys Thr Leu Gly Lys Glu Val115 120 125Leu Leu Leu Met Gln Ala Leu Asn Thr Leu Ser Thr Pro Glu Glu Lys130 135 140Leu Ala Ala Leu Cys Lys Lys Tyr Ala Asp Leu Leu Glu Glu Ser Arg145 150 155 160Ser Val Gln Lys Gln Met Lys Ile Leu Gln Lys Lys Gln Ala Gln Ile165 170 175Val Lys Glu Lys Val His Leu Gln Ser Glu His Ser Lys Ala Ile Leu180 185 190Ala Arg Ser Lys Leu Glu Ser Leu Cys Arg Glu Leu Gln Arg His Asn195 200 205Lys Thr Leu Lys Glu Glu Asn Met Gln Gln Ala Arg Glu Glu Glu Glu210 215 220Arg Arg Ile Glu Ala Thr Ala His Phe Gln Ile Thr Leu Asn Glu Ile225 230 235 240Gln Ala Gln Leu Glu Gln His Asp Ile His Asn Ala Lys Leu Arg Gln245 250 255Glu Asn Ile Glu Leu Gly Glu Lys Leu Lys Lys Leu Ile Glu Gln Tyr260 265 270Ala Leu Arg Glu Glu His Ile Asp Lys Val Phe Lys His Lys Glu Leu275 280 285Gln Gln Gln Leu Val Asp Ala Lys Leu Gln Gln Thr Thr Gln Leu Ile290 295 300Lys Glu Ala Asp Glu Lys His Gln Arg Glu Arg Glu Phe Leu Leu Lys305 310 315 320Glu Ala Thr Glu Ser Arg His Lys Tyr Glu Gln Met Lys Gln Gln Glu325 330 335Val Gln Leu Lys Gln Gln Leu Ser Leu Tyr Met Asp Lys Phe Glu Glu340 345 350Phe Gln Thr Thr Met Ala Lys Ser Asn Glu Leu Phe Thr Thr Phe Arg355 360 365Gln Glu Met Glu Lys Met Thr Lys Lys Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys370 375 380Leu Glu38權(quán)利要求
1.一種組合物，它包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述分離的核酸序列編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述調(diào)節(jié)子蛋白包含至少一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述分離的核酸序列編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白，所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白分子量約為45-97kd。
4.權(quán)利要求3的包含一種分離的核酸序列的組合物，其中所述核酸序列為cDNA序列。
5.權(quán)利要求4的包含分離核酸序列的組合物，其中所述cDNA序列選自下列成員3號(hào)序列，091-1F84；1號(hào)序列，091-21A31；5號(hào)序列，091-132Q20。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中編碼所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的所述分離的核酸序列含有所述核酸序列的一個(gè)分離的核酸片段。
7.一種核酸序列，它與權(quán)利要求1所述BRCA1調(diào)節(jié)子核酸序列在高度嚴(yán)緊條件下能雜交。
8.權(quán)利要求7的核酸序列，其中所述核酸序列與所述BRCA1調(diào)節(jié)子序列有大約95％同源。
9.一種包含BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的組合物。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分子量約為45-97kd。
11.包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列的分離的宿主細(xì)胞。
12.包含編碼BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的分離的核酸序列的載體。
13.一種復(fù)合物，其包含基本純的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
14.含有權(quán)利要求13的復(fù)合物的宿主細(xì)胞。
15.一種形成基本純的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的復(fù)合物的方法，包括將基本純的BRCA1和基本純的BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白在溶液中相互接觸，給予足夠時(shí)間以形成所述復(fù)合物，并除去未復(fù)合的BRCA1和BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白。
16.與BRCA1調(diào)節(jié)子結(jié)合的分離的抗體。
17.包含BRCA1調(diào)節(jié)子的藥用組合物。
18.權(quán)利要求15的藥用組合物，其中所述BRCA1調(diào)節(jié)子選自下列成員1號(hào)序列，091-21A31；3號(hào)序列，091-1F84；5號(hào)序列，091-132Q20。
19.一種核酸序列，其編碼由保藏在A(yíng)TCC的編號(hào)為98141的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(3號(hào)序列，091-1F84)。
20.一種核酸序列，其編碼由保藏在A(yíng)TCC的編號(hào)為98142的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(1號(hào)序列，091-21A31)。
21.一種核酸序列，其編碼由保藏在A(yíng)TCC的編號(hào)為98143的保藏物中的cDNA所編碼的蛋白質(zhì)(5號(hào)序列，091-132Q20)。
22.一種生產(chǎn)BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求11所述細(xì)胞，并從所述細(xì)胞或所述培養(yǎng)基中分離所述蛋白質(zhì)。
全文摘要
由編碼名為BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的蛋白質(zhì)的一族相關(guān)核苷酸序列組成的組合物,該調(diào)節(jié)子蛋白能結(jié)合腫瘤抑制基因產(chǎn)物BRCA1;以及用所述核苷酸序列和它們編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行診斷和/或治療疾病的方法,該BRCA1調(diào)節(jié)子蛋白的表觀(guān)分子量為45—97千道爾頓,其特征在于具有至少一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,任選地含有鋅指結(jié)構(gòu)域。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1228811SQ97197589
公開(kāi)日1999年9月15日 申請(qǐng)日期1997年8月6日 優(yōu)先權(quán)日1996年9月4日
發(fā)明者B·魯賓菲爾德, P·泊拉基斯, C·利根菲爾特, T·T·翁 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司