專利名稱：Cc型趨化因子樣蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)、編碼該蛋白質(zhì)的DNA、含有該DNA的載體，含有該載體的轉(zhuǎn)化體。此外，本發(fā)明涉及上述新型蛋白質(zhì)的應(yīng)用以及含有該蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物的應(yīng)用，如作為抗炎劑、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑、與炎癥和/或與免疫相關(guān)疾病的診斷藥。本發(fā)明還涉及該蛋白質(zhì)的單克隆抗體和產(chǎn)生該抗體的雜交瘤。
背景技術(shù)：
由物理、化學(xué)、或生物學(xué)因素而引起的各種外源性或內(nèi)源性組織損傷、侵襲、接觸抗原等誘導(dǎo)強有力的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。雖然這些反應(yīng)是重要的機體防御反應(yīng)，但有時又成為急性或慢性疾病的原因。當(dāng)誘發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的原因物質(zhì)接觸組織的時候，中性粒細胞、粒細胞、淋巴細胞或巨噬細胞等炎癥性細胞或免疫活性細胞首先吸附到血管內(nèi)皮，并向血管外遷移，然后聚集在侵襲或損傷組織及存在抗原的組織，這就引起了炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。作為誘導(dǎo)這樣序列細胞遷移反應(yīng)的物質(zhì)，有一組趨化作用的細胞因子，即所謂的趨化因子。趨化因子是一組能誘導(dǎo)遷移反應(yīng)(趨化反應(yīng))的細胞因子，目前已報道的至少有18種趨化因子。已知，由于這些趨化因子的氨基酸序列存在相似性，其結(jié)構(gòu)彼此密切相關(guān)。
根據(jù)通常保存的4個半胱氨酸殘基中最初兩個的排列順序，可將趨化因子大致分為兩型α或CXC型(2個半胱氨酸由1個氨基酸間隔開)和β或CC型(2個半胱氨酸相鄰)。已知人類的CXC型趨化因子包括IL-8、β-TG、PF-4、MGSA/GRO、ENA-78、NAP-2、GCP-1、GCP-2、IP-10等，它們主要誘導(dǎo)中性粒細胞的活化和遷移。已知人類的CC型趨化因子有MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MCP-1、MCP-2、MCP-3、I-309等，它們主要誘導(dǎo)單核/巨噬細胞的活化和遷移。而且CC型趨化因子也能誘導(dǎo)T細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞的活化和遷移(J.J.Oppenheim等，免疫學(xué)年刊9617-648，1991；M.Baggiolini & C.A.Dahinden，今日免疫15127-133，1994)。此外，最近報道趨化因子SCM-1不屬于上述2種趨化因子類型中的任何一種，推測為γ型或C型(T.Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters 360155-159，1995)。
如上所述，由于趨化因子與生物體的防御反應(yīng)密切相關(guān)，所以新型趨化因子的鑒定和其活性的闡明不僅大大有利于分析與趨化因子相關(guān)的免疫應(yīng)答，而且大大利于開發(fā)相關(guān)癥狀和疾病的治療、預(yù)防和診斷方法。人源的趨化因子有益于實現(xiàn)該目的，而進行必要的動物實驗時，有必要應(yīng)用人之外的動物，優(yōu)選小鼠來源的趨化因子。因此人們希望獲得新型的人源趨化因子，以及相應(yīng)的小鼠來源的趨化因子。但是，與多數(shù)微量即具有活性的生理活性物質(zhì)相同，得到新型趨化因子并不容易。
本發(fā)明人們考慮到趨化因子是結(jié)構(gòu)上具有相似性的分泌蛋白質(zhì)，想通過信號序列捕獲法獲得趨化因子，為此進行了許多研究。
即用獨創(chuàng)的信號序列捕獲載體(Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters 360155-159，1995)從用絲裂原刺激的正常人外周血單核細胞分離大量的編碼分泌型蛋白質(zhì)和I型膜蛋白質(zhì)的cDNA片段，將其堿基序列與已知的數(shù)據(jù)庫相比較，找到有可能編碼CC型趨化因子特征序列的cDNA片段。然后用該cDNA片段分離全長cDNA，測定堿基序列并進行鑒定。就象這樣，本發(fā)明人們最后成功地獲得編碼具有信號序列、分離信號序列后屬于成熟型CC型趨化因子的分泌型蛋白質(zhì)的DNA。
將該新型的DNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體就能產(chǎn)生對HUT78細胞顯示細胞遷移活性的CC型人趨化因子樣蛋白質(zhì)。然后，用這人源的編碼趨化因子樣蛋白質(zhì)的DNA，最終在轉(zhuǎn)化體的表達中成功獲得相應(yīng)小鼠的基因組DNA和cDNA。新型人源的編碼CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)的DNA的堿基序列及其推定的氨基酸序列如序列號1所示，小鼠來源的編碼CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)的DNA的堿基序列及其推定的氨基酸序列如序列號2所示。發(fā)明公開本發(fā)明具有以下特征1)在免疫刺激物的存在下從外周血單核細胞誘導(dǎo)表達；2)在缺乏刺激時主要從胸腺表達而不是從脾；和3)提供蛋白質(zhì)，它具有CC型趨化因子特征的2個相鄰半胱氨酸殘基。
本發(fā)明的新型CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)，是在免疫學(xué)刺激的存在下從外周血單核細胞表達的，但在植物血凝素(PHA)及體液免疫的誘導(dǎo)下能更好地表達。尤其是在GM-CSF、IL-3和IL-4等與體液免疫誘導(dǎo)相關(guān)的細胞因子的存在下，從單核細胞表達最好。但是具有這樣的特征不用TNP-α、IPN-γ等細胞免疫誘導(dǎo)的細胞因子或LPS等進行誘導(dǎo)。
本發(fā)明的新型蛋白質(zhì)，其組成性表達器官為胸腺、并且在對免疫學(xué)刺激的應(yīng)答中誘導(dǎo)產(chǎn)生，基于這些特性，本發(fā)明人將該蛋白質(zhì)命名為“TARC”[Thymus and Activation-Regulated Chemokine(胸腺和活化調(diào)節(jié)的趨化因子)]。因此，本說明書中，稱這種新型蛋白質(zhì)為TARC或TARC蛋白質(zhì)，編碼它的DNA稱為TARC DNA。“TARC”包括人源和小鼠來源的TARC，但在必要的時候，稱人源的TARC為人TARC或hTARC，稱小鼠來源的TARC為小鼠TARC或mTARC。另外，編碼這些蛋白質(zhì)的DNA分別稱為人TARC DNA、hTARC DNA、小鼠TARC DNA、mTARC DNA。但是，有時將人TARC和編碼它的DNA簡單稱作TARC及TARC DNA。另外，本說明書中與TARC相關(guān)的，編碼它的DNA或基因術(shù)語有可能交換使用。而DNA可以是合成的或天然的DNA。
另外，由于編碼本發(fā)明TARC的DNA的公開，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可用該技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法，通過，1個或多個氨基酸的替換、插入或缺失等容易地獲得具有與有上述氨基酸序列的TARC基本上同等功能或活性的TARC變異體。因此，如上得到的變異體也包含在本發(fā)明的TARC之內(nèi)。
因此本發(fā)明還提供CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)，它具有序列號1中氨基酸殘基24～94的氨基酸序列，或者提供其變異體，該變異體具有該序列中氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，并具有與人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上的向等的功能或活性。
另外本發(fā)明還提供具有序列號1的氨基酸殘基中1～94氨基酸序列的人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)或其變異體，該變異體具有該序列中氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性。
本發(fā)明還提供具有序列號2的氨基酸殘基24～93氨基酸序列的小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)或其變異體，該變異體具有該序列中氨基酸殘或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性。
此外，本發(fā)明還提供具有序列號2的氨基酸殘基1～93氨基酸序列的小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)或其變異體，該變異體具有該序列中氨基酸殘或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性。本說明書中，TARC的“變異體”與具有說明書中氨基酸序列的TARC基本上的同等的功能或活性，具有化學(xué)或生化學(xué)的改變，或者含有天然或非天然的氨基酸。附圖簡述

圖1表示人TARC的cDNA的堿基序列和推定的氨基酸序列。
圖2表示本發(fā)明的人TARC蛋白質(zhì)與已知的7種人CC型趨化因子的氨基酸序列進行比較的結(jié)果。
圖3中A是用PHA刺激正常人外周血單核細胞后的時間以及用Northern印跡分析hTARC mRNA表達的結(jié)果的照片，B為用Northern印跡分析各種組織中hTARC mRNA表達的結(jié)果的照片。
圖4是重組載體pVL-TARC的基因圖譜。
圖5中A表示昆蟲細胞中產(chǎn)生的人TARC的最終純品從Cosmosil5C4-300柱(Nacalai Tesque)的洗脫帶，B為表明SDS-PAGE結(jié)果的電泳照片。
圖6為表達載體pGEMEX-TARC的基因圖。
圖7是表明大腸桿菌中表達的人TARC純化的各階段進行的SDS-PAGE的結(jié)果的電泳照片。
圖8是小鼠TARC的cDNA的堿基序列和推定的氨基酸序列圖。
圖9是重組載體pVL-mTARC的基因圖。
圖10中A為昆蟲細胞中產(chǎn)生的小鼠TARC的最終純品從Cosmosil5C4-300柱(Nacalai Tesque)的洗脫帶，B為表明SDS-PAGE結(jié)果的電泳的照片。
圖11是將昆蟲細胞中產(chǎn)生的純化的小鼠TARC皮下注射到Balb/C小鼠，24h小時后觀察其組織的形態(tài)學(xué)，其中用蘇木精-伊紅組織染色來觀察細胞的浸潤像。
圖12是只將PBS注射到Balb/C小鼠皮下，24h后通過蘇木精-伊紅染色觀察細胞浸潤像時的組織形態(tài)的照片。
圖13是表明125I標記的TARC與各種細胞進行特異性結(jié)合結(jié)果的棒圖。
圖15中，A表示125I標記的TARC濃度固定，非標記的TARC濃度變化的情況下，與Jurkat細胞進行特異性結(jié)合量的變化圖，B表示125I標記的TARC濃度一定的時候，不存在非標記的趨化因子或在200nm其它趨化因子或TARC存在下，與Jurkat細胞結(jié)合的125I標記的TARC結(jié)合量圖。
圖16表示125I標記的TARC的濃度固定，非標記的其它趨化因子或TARC的濃度變化的情況下，與紅細胞進行特異性結(jié)合量的變化。
圖17是圖16中所示的結(jié)果的散點(Scatchard)圖。
圖18表示TARC的濃度對HUT78細胞遷移活性的影響。
圖19表示TARC的濃度對粒細胞遷移活性的影響。
圖20表明TARC的濃度對單核細胞遷移活性的影響。
圖21表明在PHA、抗CD3抗體和LPS的刺激下正常人外周血單核細胞TARC表達隨時間的變化圖。
圖22表示在各種細胞因子[IL-1α(R&D)、IL-2(Sionogi制藥公司)、IL-3(Genzyme)、IL-4(PeproTech)、IL-7(PeproTech)、IL-10(Genzyme)、GM-CSF(Genzyme)、TNF-α(PeproTech)、IFN-γ(Sionogi制藥公司)、M-CSF及PHA(R &D)]的刺激下，正常人外周血單核細胞TARC的表達量。
圖23表示細胞因子的濃度與正常人外周血單核細胞TARC表達量的關(guān)系。
圖24表示PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4對從正常人外周血單核細胞分離的CD14陽性單核細胞和CD14陰性淋巴細胞誘導(dǎo)TARC表達的效果。
圖25是在PHA(GIBCO-BRL)、LPS(L4391、Sigma)、IL-4(PeproTech)、IL-3(Genzyme)或GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血單核細胞，用Northern印跡分析TARC mRNA表達的結(jié)果。
圖26中A表示在細胞因子(IL-4、IL-3或GM-CSF)的刺激下從正常人外周血單核細胞分泌的TARC對T細胞株HUT78的遷移活性，圖26中B表示只有在抗TARC抗體的情況下對HUT78的遷移活性才能消失。
圖27表示細胞因子IFN-γ和IL-10對細胞因子刺激下正常人外周血單核細胞TARC表達的抑制作用。
圖28是表達TARC和SEAP融合蛋白的重組載體pDREF-TARC-SEAP(His)的基因圖。
圖29表示將TARC-SEAP的濃度固定在1nM，非標記的TARC濃度變化的情況下，表達CCR4的293/EBNA-1細胞與TARC-SEAP進行特異性結(jié)合的結(jié)合量的變化。
圖30表示將TARC-SEAP的濃度固定在1nM時，各TARC在內(nèi)的各種非標記人趨化因子為200nM時，對表達CCR4的293/EBNA-1細胞與TARC-SEAP結(jié)合的抑制作用。
圖31表示TARC、RANTES及MIP-1α的濃度對表達CCR4的293/EBNA-1細胞遷移活性的影響。實施發(fā)明的最佳方案對本發(fā)明的TARC進行各種研究，結(jié)果表明TARC具有如下所述與已知的CC型趨化因子不同的特性，是一種新型的蛋白質(zhì)。
(1)人TARC在基因水平上是由94個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從結(jié)構(gòu)上分析推測在23和24位的丙氨酸間切開信號序列后是一由71個氨基酸組成的分子量約8kDa的堿性的成熟蛋白。
(2)成熟型TARC顯示出與CC型趨化因子明顯的同源性，尤其是全部保持CC型趨化因子保持的4個半胱氨酸(參照圖2)。
(3)與已知的CC型趨化因子的同源性達30％，對RANTES最高達29％。
(4)與已知的CC型趨化因子不同，幾乎只在胸腺組織中組成性表達。
(5)在免疫學(xué)刺激下，在外周血單核細胞中(PMBC)表達。
(6)在PMBC中的表達具有以下特征，如1)非特異的植物血凝素比T細胞特異的抗CD3抗體具有更強的刺激作用，而對普通趨化因子的表達具有誘導(dǎo)活性的LPS不能誘導(dǎo)表達。
2)生理濃度的細胞因子(GM-CSF，IL-3，IL-4)能誘導(dǎo)表達。
3)能誘導(dǎo)已知趨化因子表達的TNF-α、IFN-γ不能誘導(dǎo)表達。
4)PHA、GM-CSF、IL-3和IL-4也可誘導(dǎo)TARC mRNA的表達。
5)GM-CSF、IL-3、IL-4只刺激單核細胞的分泌，而PHA、PHA/PMA只刺激淋巴細胞的分泌，PHA刺激誘導(dǎo)表達在加入PMA后顯著受抑制。
6)未刺激和LPS刺激的人外周血單核細胞幾乎不表達TARC的mRNA，而GM-CSF、IL-3的刺激下能誘導(dǎo)400倍的表達，IL-4、PHA的刺激下約誘導(dǎo)40倍的表達。
7)小鼠TARC有與人TARC同樣的特征，在基因水平上是由93個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，從結(jié)構(gòu)上分析，推測在23位和24位的丙氨酸間切開信號序列后，是一種成熟蛋白，是由70個氨基酸組成，分子量約為8kDa的堿性蛋白質(zhì)。
8)人TARC與小鼠TARC的同源性高達64.4％。
9)具有白細胞浸潤作用(趨化因子樣活性)。
10)TARC的受體在某些T細胞(Jurkat、Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102)、外周血淋巴細胞、活性外周血T細胞上表達。
11)細胞上的TARC受體不依賴于其它趨化因子的受體，與TARC的結(jié)合不被其它趨化因子所抑制。
12)紅細胞上趨化因子受體中的1個與DARC特異性結(jié)合。
13)在IL-3及GM-CSF的刺激下，正常人外周血單核細胞的培養(yǎng)液能引起HUT78細胞強烈的遷移，而未經(jīng)刺激或IL-4刺激下的培養(yǎng)液不引起遷移。另外，經(jīng)GM-CSF處理的培養(yǎng)上清對HUT78細胞的遷移性經(jīng)豚鼠抗TARC抗體處理后幾乎消失。
14)抑制IL-4誘導(dǎo)的體液免疫的IFN-γ，普遍抑制免疫應(yīng)答的IL-10能抑制GM-CSF、IL-3、IL-4刺激下誘導(dǎo)的外周血單核細胞TARC的表達。
15)據(jù)報道，MIP-1α、RANTES、MCP-I的受體與CCR4(C.A.Power等，生化雜志，Vol.270，NO.33，19495-19500，1995)特異性結(jié)合(該文獻中報道用非洲爪蟾卵細胞表達的CCR4進行實驗)。
16)對表達CCR4的293/FBNA-1細胞具有遷移活性。
以上表明本發(fā)明的TARC屬于CC型趨化因子，是一種新型的細胞因子。另外，TARC在免疫學(xué)刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且只在胸腺內(nèi)組成型表達，在外周中，在某些細胞因子(GM-CSF、IL-3或IL-4)的刺激下從外周血的單核細胞表達。
因此推測TARC與未成熟的T細胞向胸腺組織遷移和胸腺組織中T細胞的分化成熟相關(guān)。此外，在免疫刺激下誘導(dǎo)外周單核細胞產(chǎn)生這一事實表明TARC在炎癥和免疫反應(yīng)中起重要作用。TARC在生物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中能誘導(dǎo)白細胞的遷移和活性，并且對胸腺T細胞的分化成熟起到重要作用，因此我們認為它是醫(yī)學(xué)上的重要蛋白質(zhì)。
上述TARC的表達與已知的CC型趨化因子有顯著不同，這表明TARC具有特異的生理學(xué)功能。例如，非特異性植物血凝素(PHA)比T細胞特異的抗CD3抗體具有更強的刺激作用，這表明TARC應(yīng)該在T細胞分泌的細胞因子的刺激下從外周血單核細胞(PMBC)表達，而不是T細胞直接分泌。LPS能誘導(dǎo)大多數(shù)已知趨化因子表達，而對單核細胞不能誘導(dǎo)TARC的表達，這一點也表明了上面的情況。
具體而言，TARC的表達在各種細胞因子的誘導(dǎo)下產(chǎn)生，尤其是在GM-CSF、IL-3和IL-4的作用下能更強的誘導(dǎo)表達。這些細胞因子中前二者與免疫系統(tǒng)維持自身恒定相關(guān)，IL-4與變態(tài)反應(yīng)等體液免疫的誘導(dǎo)相關(guān)，由此可推測，TARC在誘導(dǎo)體液免疫的狀態(tài)下發(fā)揮功能。再者能誘導(dǎo)已知趨化因子表達的TNF-α、IFN-γ不能誘導(dǎo)TARC表達，這提示TARC在與其它趨化因子不同的狀態(tài)下表達，發(fā)揮作用。但是，這些事實不能否定除正常人末梢單核細胞外，淋巴細胞也表達TARC的可能性。
另外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PMA(佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯)與PHA一起使用時，能更好地誘導(dǎo)大多數(shù)趨化因子的表達，而作用于TARC時，表達減少。這表明TARC的表達在與IL-4的表達相同的控制下進行。這支持TARC與Il-4同樣與體液免疫相關(guān)這一推測。
另外，GM-CSF、IL-3刺激正常人外周血單核細胞所得培養(yǎng)液與重組TARC同樣對HUT78細胞顯示細胞遷移活性。GM-CSF刺激所得培養(yǎng)液的遷移活性被抗TARC抗體所中和。這表明與重組TARC同樣，正常人外周血單核細胞分泌的TARC也對表達TARC特異受體的細胞具有細胞遷移活性。
如上所述，與其它趨化因子不同TARC的表達是在誘導(dǎo)體液免疫的時候誘導(dǎo)外周血單核細胞表達。IL-4誘導(dǎo)體液免疫，IFN-γ則抑制，相反，IFN-γ誘導(dǎo)細胞免疫，而IL-4則抑制。另外IL-10抑制整體免疫。GM-CSF、IL-3和IL-4誘導(dǎo)正常人外周血單核細胞表達TARC能被IFN-γ、IL-10所抑制。這表明TARC在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的情況下表達，且在誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的狀態(tài)下表達，相反在細胞免疫的狀態(tài)下其表達受到抑制。由此我們認為TARC尤其在變態(tài)反應(yīng)、特異性變態(tài)反應(yīng)。哮喘等體液免疫的狀態(tài)下表達，發(fā)揮作用。
本發(fā)明TARC功能的闡釋，有利于闡明胸腺功能、T細胞的分化和成熟、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的機制等，由此有利于提供誘導(dǎo)或抑制炎癥反應(yīng)或免疫反應(yīng)的新手段。另外，本發(fā)明的編碼TARC的基因(DNA)和抗-TARC抗體，有利于分析TARC基因的突變及其mRNA、蛋白質(zhì)的表達狀態(tài)，為揭示血液系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病的病因和診斷提供新手段，由此有利于開發(fā)診斷和治療這些疾病的新方法。
另外，將編碼本發(fā)明TARC的基因(DNA插入到適當(dāng)?shù)妮d體，以體外導(dǎo)入培養(yǎng)細胞，或者直接體內(nèi)施用，可有利于開發(fā)基因治療，如對TARC基因異常引起的遺傳性疾病，各種癌癥及艾滋病等致死性感染性疾病。
除此之外，預(yù)計通過測定TARC的血液濃度可診斷過敏反應(yīng)。特異性變態(tài)反應(yīng)、哮喘等。另外，估計通過抑制TARC的表達和活性，可治療或預(yù)防過敏反應(yīng)，特異性變態(tài)反應(yīng)、哮喘等，通過誘導(dǎo)TARC的表達和活化可誘導(dǎo)體液免疫抑制細胞免疫。
因此，本發(fā)明還提供包含本發(fā)明TARC或其變異體在內(nèi)的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物包括預(yù)防藥、治療藥和診斷藥，其施用量和施用途徑可通過常規(guī)方法，根據(jù)使用目的、施用對象的病情等適當(dāng)決定。再者，由于本發(fā)明的TARC蛋白質(zhì)本來是生物體內(nèi)的活性物質(zhì)，所以不難理解產(chǎn)生該蛋白質(zhì)活性的量，即本發(fā)明醫(yī)藥組合物中使用范圍內(nèi)的劑量不會出現(xiàn)急性中毒問題。
為了各種不同的目的，TARC和含有其活性部分的片段，針對該TARC及其片段的單克隆(單抗)或多克隆抗體、與TARC特異性結(jié)合的受體等均有用。
因此本發(fā)明還提供TARC特異的單克隆抗體及生產(chǎn)單抗的雜交瘤。如后面實施例所述，可用該領(lǐng)域確立的已知方法制備這種抗體和雜交瘤。
鑒于本發(fā)明TARC蛋白質(zhì)的作用，若能檢測該蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑將有利于TARC相關(guān)疾病或異常狀態(tài)的治療、預(yù)防或診斷。如本發(fā)明中所公開的，利用TARC蛋白質(zhì)定量法、受體特異性等來篩選這些物質(zhì)。
因此，本發(fā)明還提供篩選TARC蛋白質(zhì)激動劑或拮抗劑的方法，它包括將推測含有該激動劑或拮抗劑的樣品與分泌該蛋白質(zhì)的細胞及誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)分泌的細胞因子混合，測定該蛋白質(zhì)的分泌量。
例如參照后面實施例中所示的蛋白定量法對TARC蛋白質(zhì)進行定量。
另外，上面方法中所用的細胞因子包括，如GM-CSF、IL-3和IL-4，分泌TARC的細胞，如外周血單核細胞。
此外，本發(fā)明提供篩選TARC蛋白質(zhì)激動劑或拮抗劑的反應(yīng)，它包括將推測含有該激動劑或拮抗劑的樣品與該蛋白質(zhì)特異的受體進行反應(yīng)，測定其結(jié)合活性和/或反應(yīng)性。
上面方法中應(yīng)用的受體，如可用CCR4，可用后面實施例中所述的方法測定結(jié)合活性或反應(yīng)性。
下面將說明本發(fā)明TARC的制造和鑒定方法。如無特別指示以下的描述只是舉例說明，可適當(dāng)應(yīng)用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)進行基因重組、轉(zhuǎn)化宿主細胞、用轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，分離純化表達的蛋白質(zhì)以及分析法和免疫學(xué)方法等。I.編碼TARC蛋白質(zhì)的DNA序列的確定含編碼本發(fā)明TARC蛋白質(zhì)的DNA的DNA片段，比如，可從植物血凝素(PHA)刺激的正常人外周血單核細胞(PBMC)來源的cDNA文庫獲得。
(1)探針的制備用以下方法制備從cDNA文庫篩選編碼TARC蛋白質(zhì)的基因用的探針。
由于TARC為分泌型蛋白質(zhì)，所以其mRNA 5′端是編碼信號序列的區(qū)域。因此，首先用quickprep mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從PHA刺激的PBMC抽提poly(A)+RNA。用作隨機引物(GIBCO-BRL)可從該mRNA制備單鏈DNA，3′端結(jié)合有Oligo(dC)錨。
接著用Oligo(dG)引物合成雙鏈DNA，用超聲波裂解，用T4聚合酶修復(fù)。將該物質(zhì)與Uni-amp銜接子(Clontech)結(jié)合，進行瓊脂糖電泳，之后抽提富含5′側(cè)序列的300～600bp的片段。將所得片段插入到信號序列捕獲載體pDREF-CD4ST(Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters360155-159，1995)。該載體是含有EB病毒(EBV)復(fù)制起點的穿梭載體，在EBNA-1蛋白質(zhì)的存在下能進行自我復(fù)制。另外具有的特征是在強EF-1α啟動子的下游插入缺乏信號序列，編碼人CD4的DNA，當(dāng)編碼信號序列的未知cDNA片段正好插入到兩者間框架時，轉(zhuǎn)染的Raji細胞表達CD4。
用插入了上述片段的載體pDREF-CD4ST轉(zhuǎn)染Raji細胞，通過分選集中CD4陽性的Raji細胞，從中回收質(zhì)粒。然后再次將單個質(zhì)粒導(dǎo)入Raji細胞，通過證實CD4的表達，最后分離插入的cDNA片段，可能編碼信號序列的質(zhì)粒。測定插入到這些質(zhì)粒中的cDNA的堿基序列，與已有的數(shù)據(jù)庫相比較，以選擇編碼CC型趨化因子特征序列的cDNA片段。所得cDNA有可能編碼所期望的新型蛋白質(zhì)，用32P標記它，用作篩選PHA刺激的人PBMC來源的cDNA文庫的探針，以獲得全長cDNA。
cDNA文庫可按照常規(guī)方法進行構(gòu)建，如按照以下方法。用quickprep micro mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從PHA刺激的人PBMC抽提poly(A)+RNA，用寡核苷(dT)作引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶從poly(A)+RNA合成cDNA，然后插入到，如pSPORTl載體(GIBCO-BRL)。用上述部分得到的探針，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何一種方法，如重組噬菌體斑的雜交和重組大腸桿菌的克隆雜交等篩選文庫。
然后測定所得重組質(zhì)粒插入cDNA的堿基序列。如用下面的方法進行測序。首先，用該片段內(nèi)存在的限制性酶部位切割插入片段，然后將各cDNA片段亞克隆到適當(dāng)?shù)臏y序載體，如pBluescript(Stratagene)。然后測定克隆片段的堿基序列，如用Sanger法(F.Sanger美國國家科學(xué)院院刊，745463-5467，1977)。II.重組型TARC蛋白質(zhì)的表達將編碼本發(fā)明TARC蛋白質(zhì)的DNA整合到表達載體中，將所得表達載體導(dǎo)入適合的宿主細胞，如細菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞中，得到轉(zhuǎn)化體。
適合本發(fā)明TARC DNA表達的表達載體的實例為，宿主細胞為細菌時用pRSET、pGEMEX和pKK233-2，宿主細胞為酵母時用pYES2，昆蟲細胞用pVL1393，動物細胞用pEF-BOS，pSRα和pDR2等，但并不局限于此。
在大腸桿菌等原核微生物的情況下，在強啟動子(例如T7啟動子)的控制下，TARC DNA可作為前體蛋白質(zhì)表達，前體蛋白質(zhì)包括原核微生物分泌的蛋白質(zhì)的天然前體物質(zhì)來源的信號序列(如信號肽OMPa)和成熟型TARC蛋白質(zhì)。
用酵母時，可作為這樣的前體蛋白質(zhì)進行表達，它包括酵母分泌的蛋白質(zhì)的天然前體物質(zhì)來源的序列(如外激素α的前原序列(prepro-Sequence))和成熟型TARC蛋白質(zhì)。
用動物細胞的時候，可將TARC蛋白質(zhì)插入到適當(dāng)表達載體強啟動子如，EF-1α啟動子的下游，與有效的選擇標記(如二氫葉酸還原酶)一起導(dǎo)入動物細胞(如CHO dhfr-細胞)，選擇有耐藥(這時用氨甲蝶呤)性的細胞，這樣可建立有高表達能力的細胞株。
用人細胞的時候，將TARC蛋白質(zhì)基因整合到病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒，用重組病毒感染人細胞。在適合TARC表達的條件下培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體，轉(zhuǎn)化體可產(chǎn)生TARC蛋白質(zhì)。另外，成熟型TARC蛋白質(zhì)可用眾所周知的方法全部合成，如用固相法和有必要重視兩個二硫鍵結(jié)合的存在。
因此，本發(fā)明包括上述基因工程的TARC或化學(xué)合成的TARC。III.抗TARC抗體的制備如上所述，本發(fā)明TARC特異的抗體有利于闡明與TARC相關(guān)的生理學(xué)現(xiàn)象，有利于與TARC活性相關(guān)異常和疾病的治療、預(yù)防或診斷。因此，本發(fā)明還提供TARC蛋白質(zhì)特異的抗體。
針對蛋白質(zhì)的抗體(多克隆和單克隆)的制備方法在該技術(shù)領(lǐng)域是眾所周知的。
例如，根據(jù)序列號1或2中所示TARC氨基酸序列的一部分，可用常規(guī)的肽合成儀合成的肽，或表達TARC的載體轉(zhuǎn)化的細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞等產(chǎn)生的TARC蛋白質(zhì)通過常規(guī)的蛋白質(zhì)化學(xué)方法進行純化后，用這些肽作抗原，免疫小鼠、大鼠、倉鼠、兔子等動物，從它們的血清制備多克隆抗TARC抗體。
另外，從免疫小鼠和大鼠的脾臟或淋巴結(jié)獲取細胞，與骨髓瘤細胞融合，按照Kohler和Milstein的方法[自然，256，495-497(1975)]或其改良的方法Ueda等方法[美國國家科學(xué)院院刊，79，4386-4390(1982)]制備雜交瘤，之后可從該雜交瘤生產(chǎn)抗TARC的單克隆抗體(單抗)制備單克隆抗體的步驟如下所示。
(a)用TARC蛋白質(zhì)免疫小鼠；(b)摘除免疫小鼠的脾臟并分離脾細胞；(c)在融合促進劑的存在下(如聚乙二醇)，用上述的Kohler等的方法將分離的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合；(d)培養(yǎng)在未融合的骨髓瘤細胞不能生長的選擇培養(yǎng)基中所得到的雜交瘤；(e)用ELISA法或免疫電印跡技術(shù)選擇能生產(chǎn)所期望抗體的雜交瘤細胞，并用有限稀釋法進行克??；(f)培養(yǎng)生產(chǎn)TARC單克隆抗體的雜交瘤細胞，并從培養(yǎng)物中分離單克隆抗體。(IV)TARC mRNA及TARC蛋白質(zhì)的檢測本發(fā)明TARC mRNA及TARC蛋白質(zhì)的存在，可分別用常規(guī)的特異性mRNA檢測法和蛋白質(zhì)檢測法進行檢測。
例如可用反義RNA和cDNA作探針，通過Northern印跡分析法和原位雜交法檢測mRNA。另外，在逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)換為cDNA后，通過與合適的引物結(jié)合，用聚合酶鏈式反應(yīng)(以下稱作PCR)也可進行檢測。
蛋白質(zhì)的存在可用上述(III)得到的TARC特異性抗體，通過免疫沉淀法和Western印跡法進行證實。V.TARC蛋白質(zhì)的免疫測定例如可用放射性同位素、過氧化酶或堿性磷酸酶等酶，或熒光色素等標記一定量的TARC，加入未標記濃度已知的TARC和血清中的抗TARC多克隆抗體或單克隆抗體進行抗原抗體競爭反應(yīng)。適當(dāng)變化非標記抗原的濃度后，用適宜的方法分離與抗體結(jié)合了的標記抗原和未與抗體結(jié)合的標記抗原，測定與抗體結(jié)合的標記抗原的放射活性、酶活性或熒光強度。隨著非標記抗原量的增加，與抗體結(jié)合的標記抗原的量減少。這種關(guān)系可畫成一標準曲線。此外，可將識別TARC蛋白質(zhì)上不同表位的2種單抗中的一種固定，用上述任何一種方法標記另一種抗體，用標記抗體檢測與固定抗體結(jié)合了的TARC，并定量，即也可用夾心法。
然后將上述反應(yīng)系統(tǒng)中濃度已知的非標記抗原替換為含未知量抗原的樣品，反應(yīng)后，獲得放射活性、酶活性或熒光強度，與標準曲線進行比較就可知樣品中抗原的量即TARC蛋白質(zhì)的量，因此可提供監(jiān)測炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)或T細胞分化成熟的新方法。VI.TARC蛋白質(zhì)趨化因子活性的證實本發(fā)明TARC蛋白質(zhì)的趨化活性可這樣證實，如在體外，在由介入了孔徑恒定的濾器而分隔開的培養(yǎng)容器的一側(cè)加入TARC，在另一側(cè)加入目的細胞，一定時間后比較TARC存在時通過濾器孔移動到對側(cè)的細胞數(shù)與隨機移動的細胞數(shù)。另外，在體內(nèi)可這樣證實，動物皮下施用純化的TARC蛋白，用組織學(xué)方法檢測細胞的浸潤和募集。
通過以下實施例來說明本發(fā)明。實施例1 分離編碼人TARC的DNA1.人TARC cDNA的克隆(1)用植物血凝素刺激的人外周血單核細胞制備cDNA文庫用GIBCO-BRL的cDNA合成系統(tǒng)和cDNA克隆系統(tǒng)，按照文獻(J.Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約(1989))已有的常規(guī)方法，如下用植物血凝素(PHA)刺激的人外周血單核細胞制備cDNA文庫。
首先，用quickprep Micro mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從PHA刺激的正常人外周血單核細胞抽提Poly(A)+RNA。用試劑盒中給予的細胞溶解液溶解PHA刺激了72小時，2×107即人外周血單核細胞。然后，加入Oligo-dT樹脂，混合3分鐘，在Poly(A)+RNA與Oligo-dT樹脂結(jié)合之后，用TOMY離心機MRX-150(TOMY精工)12000轉(zhuǎn)離心，1分鐘。用高鹽濃度的洗液洗滌所得沉淀物，3次，用低鹽濃度的洗液洗5次，洗凈后洗脫液洗脫。在洗脫液中加入0.1倍量3M醋酸鈉和2倍的乙醇，-80℃冷卻1小時，用TOMY離心機MRX-150(TOMY精工)在12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，將沉淀的poly(A)+RNA溶解到無菌蒸餾水中。測定260nm處的吸光度，計算回收的poly(A)+RNA的量。從PHA刺激的人外周血單核細胞獲得10μg的poly(A)+RNA。
然后以純化的poly(A)+RNA為模板，按下面的方法合成cDNA。首先，以4μg poly(A)+RNA為模板，在反應(yīng)緩沖液中(50mm Tris-HCl、pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，500μMdNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，50μg/ml Not I引物-銜接子(GIBCO-BRL)，和2萬U/m1逆轉(zhuǎn)錄酶SUPER SCRIPT II RT)，37℃反應(yīng)1小時，合成單鏈DNA。NotI引物-銜接子的序列如序列表的序列號3所示。以該單鏈DNA為模板，在反應(yīng)緩沖液(25mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM DTT，0.15mMβ-NAD+，250μm dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，65U/ml DNA連接酶，250U/ml DNA聚合酶和13U/ml Rnase H)中，16℃反應(yīng)2小時，合成cDNA。然后，加入DNA聚合酶，終濃度達65U/ml，再在16℃反應(yīng)5分鐘，形成雙鏈。將該雙鏈DNA在反應(yīng)緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％PEG8000，200μg/ml Sal I銜接子(GIBCO-BRL)，100U/ml T4 DNA聚合酶)中，16℃反應(yīng)16個小時，以與SalI銜接子接合。SalI銜接子是序列表中序號4和5中所示DNA退火了的雙鏈DNA。將所得cDNA插入到pSPORTl載體的NotI和SalI位點的中間，制成cDNA文庫。(2)信號序列捕獲用cDNA文庫的制備用GIBCO-BRL的cDNA合成系統(tǒng)、5′RACE系統(tǒng)和cDNA克隆系統(tǒng)，參照文獻(J.Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約(1989))中的常規(guī)方法，從PHA刺激的人外周血單核細胞制備mRNA 5′末端近區(qū)富集的cDNA，用以制備信號序列捕獲文庫。
首先，用從PHA刺激的人外周血單核細胞獲得的poly(A)+RNA作模板，按以下的方法合成mRNA 5′末端近區(qū)富集的cDNA，以5mgpoly(A)+RNA作模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶SUPER SCRIPT II RT(GIBCO-BRL)，在反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl、pH8.3，75mM KCl，3mMMgCl2，10mM DTT，500μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，150μg隨機引物(GIBCO-BRL)，2萬U/ml逆轉(zhuǎn)錄酶SUPER SCRIPTIl RT)中，37℃反應(yīng)1小時，合成單鏈DNA。向該反應(yīng)液中加入6NNaOH，終濃度為0.4N，再在65℃反應(yīng)30分鐘，在模板poly(A)+RNA水解后，加入6N醋酸，終濃度為0.4N去中和混合物。然后加入等量的Tris-HCl、pH8.0飽和的酚/氯仿混合液(1∶1)，攪拌后用TOMY離心機MRX-150在12000轉(zhuǎn)離心5分鐘。取出其水層，加入0.2倍的3M醋酸鈉、2倍乙醇，-80℃冷卻1小時后，再用TOMY離心機MRX-150(TOMY精工)在12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，用滅菌蒸餾水溶解沉淀物。將該單鏈DNA在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl、pH8.4，50mMKCl，1.5mM MgCl2，200μM dCTP，400U/ml末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)中，37℃反應(yīng)10分鐘，在3′端結(jié)合上Oligo-dC層。再在70℃處理5分鐘，使末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶失活。將結(jié)合有Oligo-dC層的單鏈DNA在反應(yīng)緩沖液(25mM Tris-HCl、pH7.5，100mM KCl，5mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4、1.2mM DTT，0.15mM β-NAD+，250μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，500μg錨式引物(序列表中序號6)，65U/ml DNA連.接酶，250U/ml DNA聚合酶I和BU/ml RNASEH)中，16℃反應(yīng)2小時，合成雙鏈DNA。錨式引物用DNA合成儀(Cyclone Plus DNA synthesiser，Miligen/Biosearch)合成。合成時用Miligen/Biosearch的β-連接的β-氰乙基磷酰亞胺試劑。合成后用2ml氨水(28％，Nacalai Tesque)從柱中洗脫合成的核苷酸，之后在60℃處理5小時，脫去保護基。在脫去了保護基的核苷酸中加入10倍的正丁醇，用TOMY離心機(TOMY精工)在3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，回收沉淀。將回收的核苷酸溶解到無菌水中，測定260nm處的吸光度，確定含量。
用冰冷卻雙鏈DNA，用TOMY超聲波破碎儀UD-201(TOMY-精工)以最大輸出量部分降解150秒鐘，加入T4 DNA聚合酶，終濃度達65U/ml，在160℃反應(yīng)5分鐘后，在反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％PEG 8000，200μg/mlUNI-Amp銜接子，1000U/ml T4 DNA聚合酶)中，再在16℃反應(yīng)16小時，與UNI-Amp銜接子結(jié)合(Clontech)。UNI-Amp銜接子是序列表中序號7和8中所示DNA的退火產(chǎn)物。將所得到的部分降解的雙鏈DNA作模板，在反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.1％明膠，200μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，400nM UAP引物(GIBCO-BRL)，400nM UNI-Amp引物(Clontech)，100U/ml Am pliTaq DNA聚合酶I)中進行PCR反應(yīng)。UAP引物和UNI-Amp引物的序列分別如序列表中序號9和10所示。用購自寶酒的Ampli Taq試劑盒在DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmor)下進行PCR。反應(yīng)如下進行94℃預(yù)處理3′后，94℃45″、58℃45″、72℃2′重復(fù)30個循環(huán)，最后在72℃處理3分鐘。
將這樣制備的在mRNA 5′末端近區(qū)富集的cDNA插入到單獨制備的pDREF-CD4ST載體(Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters 360155-159，1995)SaII和XbaI位點的中間，制備信號序列捕獲文庫。按照如下的方法，將信號序列捕獲文庫導(dǎo)入人B細胞株Raji，通過鑒定細胞表面表達cD4的克隆，選擇保持信號序列的片段。(3)信號序列捕獲將上面(2)中制備的來源于PHA刺激的人外周血單核細胞，由mRNA 5′末端近區(qū)濃縮的cDNA構(gòu)成的信號序列捕獲cDNA文庫10μg，懸浮到500μl PBS中，用電穿孔法導(dǎo)入1×107個Raji細胞中。用BioRad的Gene Pluser在250V電壓、500μF靜電容量下進行電穿孔。在潮霉素(200μg/ml)存在的條件下將導(dǎo)入了cDNA文庫的Raji細胞培養(yǎng)1周，通過選擇有耐藥性的細胞而獲得。將具有耐藥性的細胞與小鼠抗人CD4抗體(OKT4，從ATCC獲得)在4℃反應(yīng)30分鐘，洗凈后再與磁珠標記的羊抗小鼠IgG抗體(Dynabeads、Dynal)在4℃反應(yīng)30分鐘。用磁性分選器分離磁珠標記的、細胞表面表達CD4的細胞。磁性分選進行3次，最終得到45％的細胞在細胞表面表達CD4的細胞團。
用Magic Minipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)從細胞團回收質(zhì)粒DNA，再次導(dǎo)入大腸桿菌DH10B。將大腸桿菌接種到LB-氨芐青霉素-瓊脂板上(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g瓊脂，50μg/ml氨芐青霉素/1ml蒸餾水)，37℃培養(yǎng)一晚上。用MagicMinipreps DNA純化系統(tǒng)(Promega)從培養(yǎng)液中純化質(zhì)粒DNA，再次通過電穿孔法導(dǎo)入到懸浮于500μl PBS中的1×107個Raji細胞中。將這些Raji細胞與小鼠的抗CD4抗體(OKT4，ATCC)在4℃反應(yīng)30分鐘，洗凈后再與FITC標記的兔抗小鼠IgG(Fab′)2抗體(購自Dako)在4℃反應(yīng)30分鐘。用Fac Star Plus(Becton-Dickinson)鑒定FITC標記的表達CD4的細胞。檢查100個大腸桿菌的克隆，最后得到42個克隆在細胞表示誘導(dǎo)CD4表達。
根據(jù)Sanger法，用Pharmacia公司的Autoread Sequence試劑盒和A.L.F.II自動測序儀檢測這些克隆的堿基序列。所得克隆序列與已有的數(shù)據(jù)庫相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆98在推測的信號序列斷裂位點9氨基酸的下游有2個連續(xù)的半胱氨酸，是一種細胞遷移性趨化因子，具有結(jié)構(gòu)上與CC型趨化因子相一致的特征。(4)人TARC全長cDNA的克隆為了獲得克隆98的全長cDNA，用多引物DNA標記系統(tǒng)(Amersham Japan)以32P標記207bp克隆98的cDNA片斷，用它作探針，通過菌落雜交法篩選(1)中制備的PHA刺激的人外周血單核細胞的cDNA文庫。菌落雜交法參照文獻(J.Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約，(1989)).中已有的方法進行。
將含有人PHA活化的外周血單核細胞cDNA文庫的大腸桿菌DH10B接種到LB-氨芐青霉素-瓊脂板中(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g瓊脂，50μg/ml氨芐青霉素/ml蒸餾水)，37℃培養(yǎng)一晚上。將平皿中生長的大腸桿菌菌落轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond-N+，Amersham Japan)，然后用SDS處理(10％SDS)，堿變性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)，洗滌(2×SSC)。用32P標記的菌落98作探針與尼龍膜進行雜交。用6×SSC(1×SSC0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)、50％甲酰胺、0.5％SDS、5倍的Denhardt’s溶液，100μg/ml鮭魚精子作雜交溶液，在42℃雜交一晚上。用2×SSC，0.1％SDS緩沖液在室溫下洗膜10分鐘，用0.2×SSC、0.1％SDS緩沖液在60℃洗30分鐘，洗2次，之后用X光膠片(Kodak)感光，顯影，鑒定與探針進行反應(yīng)的菌落，最終得到一個cDNA克隆(CloneD3A)。根據(jù)Sager法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自動測序儀測定插入到克隆D3A中的cDNA的序列，再進行下面的各種檢測，結(jié)果證實，該cDNA是編碼目的新型CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)(TARC)的。II.人TARC的結(jié)構(gòu)的確定(1)分析hTARC cDNA的堿基序列及其編碼的氨基酸序列根據(jù)Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自動測序儀檢測上面I.(4)中得到的克隆D3A的堿基序列。cDNA克隆D3A的堿基序列和內(nèi)部不包括翻譯終止密碼子的開放讀框的氨基酸序列如圖1所示。
如圖1所示，它表明插入到克隆D3A中的基因含有由94個氨基酸組成的開放閱讀框，N末端有以信號肽為特征的、強疏水性氨基酸序列。這94個氨基酸形成的蛋白質(zhì)的分子量為10,507。另外，根據(jù)計算，推定的信號肽切斷位點在Ala-23和Ala-24間，如圖1中的垂直棒所示。從該切斷位點到9氨基酸下游有CC型趨化因子特征的兩個連續(xù)的半胱氨酸。
此外，推測信號肽切斷后，由71個氨基酸組成的推定成熟型蛋白質(zhì)是分泌型蛋白質(zhì)。由這71個氨基酸組成的推定的成熟型分泌型蛋白質(zhì)的分子量計算為8,083，通過計算，等電點為9.7。(2)與CC型趨化因子在序列上的相似性應(yīng)用FASTA和Clustal V程序，將hTARC的氨基酸序列與已知的CC型趨化因子的氨基酸序列進行比較。結(jié)果如圖2所示。圖2中，包括hTARC在內(nèi)的所有CC型趨化因子中保存的氨基酸用粗線圍著的陰影表示，而大多數(shù)的趨化因子保存的氨基酸只用陰影表示。另外，hTARC與其它CC型趨化因子的同源程度用％在右側(cè)表示。
圖2表明hTARC的成熟型分泌蛋白質(zhì)的氨基酸序列屬于CC型趨化因子，與RNATES、MIP-Ia、MIP-Ib、I-309、MCP-1、MCP-2、MCP-3的同源性分別為29％、26％、28％、24％、24％、24％、28％。另外還表明在所有CC型趨化因子中保存的4個半胱氨酸，在hTARC中也保存著。以上結(jié)果暗示，所得氨基酸序列是新型的人CC型趨化因子的。III.用Northern印跡分析法分析hTARC mRNA的表達從各種人組織分離poly(A)+RNA 2μg，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(多組織印跡)，從Clonetech公司購入該產(chǎn)品。另外，用PHA刺激人外周血單核細胞，0、4、24和72小時后，用quickprepmicro mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從中抽提poly(A)+RNA。將分離的poly(A)+RNA 1μg進行瓊脂糖凝膠電泳，膠中含0.66M甲醛，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond-N+)(Amersham Japan)。用多引物DNA標記系統(tǒng)(Amersham Japan)以32P標記的hTARC cDNA克隆D3A的SmaI-Pst I片段作探針與這些膜進行雜交。雜交溶液是5×SSPE(1×SSPE為0.18M NaCl，0.01M磷酸鈉、pH7.5，1mM EDTA)、50％甲酰胺、2％SDS、10×Denhardt’s溶液，100μg/ml鮭魚精子DNA，在42℃雜交一晚。洗膜用2×SSC、0.1％SDS緩沖液，在室溫洗10分鐘，用0.2×SSC、0.1％在60℃洗30分鐘，洗2次，之后用X光膠片(Kodak)感光，顯影，進行分析。PHA刺激后的時間及TARCmRNA的表達結(jié)果如圖3A所示，在各種人組織中TARC mRNA的表達如圖38所示。
圖3B中可看出，hTARC的mRNA在胸腺中大量表達，在肺、大腸和小腸中較少表達，而在其它組織中幾乎檢測不到。
這些結(jié)果提示，hTARC與其它的CC型趨化因子不同，只在胸腺組織中組成型表達，在免疫學(xué)刺激下可誘導(dǎo)其產(chǎn)生。實施例2重組人TARC在蠶細胞中的表達(1)構(gòu)建在蠶細胞中表達hTARC DNA用的重組載體pVL-TARC用EcoRI和NotI同時消化實施例1中的克隆D3A，可得到0.5kb的DNA片段，該片段兩端有EcoRI和NotI位點，包括從翻譯起始密碼子到翻譯終止密碼子長度的hTARC序列。將該DNA片段插入到制備重組型桿狀病毒時應(yīng)用的pVL1393(Invitrogen)的EcoRI位點和NotI位點之間，可得到重組載體PVL-TARC。該重組載體pVL-TARC的基因圖如圖4所示。(2)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)接著將重組載體pVL-TARC與具有致死性缺失、線性的AcNPVDNA同時導(dǎo)入sf9昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒，用有限稀釋法純化所得的重組桿狀病毒，在M.O.I.＝0.1時再感染sf9昆蟲細胞，得到種病毒。在M.O.I.＝10-20時用種病毒感染Tn5B-4昆蟲細胞(Invitrogen)(每150cm2培養(yǎng)瓶1.2×107個)，在無血清的EX-CELL 400培養(yǎng)基(JRHBiosciences)(每150cm2培養(yǎng)瓶30ml)上，27℃培養(yǎng)2天。(3)產(chǎn)物的分離和純化回收培養(yǎng)上清，通過0.22μm的濾膜。向濾液中加入1/10體積的500mM MES(pH6.5)，過A緩沖液(50mM MES(pH6.5)/100mMNaCl)平衡了的1ml Resouce-S 柱(Pharmacia)。用A緩沖液沖洗含有hTARC蛋白質(zhì)的柱子，然后用A緩沖液和B緩沖液(50mM MES(pH6.5)/100mM NaCl)配制的NaCl鹽濃度梯度液進行洗脫。用SDS-PAGE和銀染色鑒定含hTARC蛋白質(zhì)的級分。SDS-PAGE的結(jié)果如圖5B所示。圖5B中F和H分別是FPLC級分(終了一步前的一純化步)和HPLC級分的結(jié)果。
在含hTARC蛋白質(zhì)的級分中加入終濃度為0.1％的TFA，上A緩沖液(0.1％TFA)平衡過的Cosmosil 5CA 300柱(Nacalai Tesque)，用緩沖液A和緩沖液B(0.1％TFA，60％乙腈)配成的乙腈梯度液進行洗脫。hTARC蛋白質(zhì)的洗脫帶如圖5A所示。收集含hTARC蛋白質(zhì)的級分，在真空干燥中揮發(fā)乙腈，對不含內(nèi)毒素的PBS進行透析，得到純化的終產(chǎn)品。用BCA試劑盒(Pierce)，以BSA作對照來測定蛋白質(zhì)的濃度。從300ml培養(yǎng)上清中獲得300μg純化的hTARC蛋白質(zhì)，表達量良好。用鱟裂解物測定(QCL-1000，Bio Whitaker)對混入的內(nèi)毒素進行定量，在4pg/μg以下。用氨基酸測序儀(島津)檢測純化hTARC蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列，為ARGTNVGRE。如圖5所示，該氨基酸序列與71個氨基酸組成的成熟分泌型蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列一致，而71個氨基酸是從堿基序列上切斷預(yù)測的信號肽后形成的。實施例3重組人TARC在大腸桿菌中的表達(1)構(gòu)建在大腸桿菌中表達hTARC DNA用的載體-pGEMEX-TARC以實施例1中的克隆D3A作模板，通過PCR可獲得0.2kb的DNA片段，該片段兩端有NdeI和NotI位點，含有成熟型hTARC的序列，從起始密碼子到終止密碼子。PCR中所用的2個核苷酸序列如序列表中序號11和12所示。用購自寶酒的AmpliTaq kit，在DNA ThermalCycler(Perkin-Elmer)上進行PCR。反應(yīng)以克隆D3A的DNA作模板，在反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.1％明膠，200μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，400μM引物和100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)進行。反應(yīng)這樣進行94℃預(yù)處理3分鐘后，在94℃45′、55℃45″、72℃1′進行15個循環(huán)，最后在72℃處理3分鐘。用NdlI和NotI同時消化反應(yīng)生成物，插入到pGEMEXI(Promega)的NdeI位點和NotI位點之間，得到表達載體pGEMEX-TARC。該載體的基因圖如圖6所示。(2)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)用導(dǎo)入了表達載體pGEMEX-TARC的大腸桿菌BL21表達末端有甲硫氨酸的成熟型TARC蛋白質(zhì)。大腸桿菌BL21的培養(yǎng)在添加了1mMIPTG的LB培養(yǎng)基上進行，在37℃培養(yǎng)3小時。(3)產(chǎn)物的分離、純化將大腸桿菌懸浮到Tris緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，1mM 2-ME，50mM NaCl，0.2mM PMSF)中，凍融5次。接著加入終濃度為10μg/ml的DNaseI、10mM的MgCl2，室溫放置10分鐘。在4℃、10000轉(zhuǎn)、15分鐘離心，用洗液(0.5％ Triton X-100，10mMEDTA)洗滌沉淀的hTARC蛋白質(zhì)，洗3次，可得到部分純化的重組型hTARC蛋白質(zhì)。表示hTARC純化的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖7所示。圖7中，S是離心后上清的結(jié)果，W1、W2、W3是用洗液洗滌離心所得沉淀物分別洗1、2、3次時的洗脫物的結(jié)果，P是含hTARC的洗凈后的沉淀物的結(jié)果。實施例4分離編碼小鼠TARC的DNAI.小鼠TARC基因組DNA的克隆為了獲得小鼠TARC的基因組DNA，用實施例1中人TARC cDNA克隆D3A的SmaI-PstI片段作探針，用多引物DNA標記系統(tǒng)(Amersham Japan)以32P標記，通過斑點雜交法篩選Balb/C小鼠來源的基因組DNA文庫(Clontech)。斑點雜交法按照文獻(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約、(1989))的方法進行。
將Balb/C小鼠基因組DNA文庫的噬菌體液和大腸桿菌LE392接種到LB平皿(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g瓊脂/1L蒸餾水)，30℃培養(yǎng)一晚上。將平皿上生長的噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N+，Amershan Japan)上，SDS處理(10％SDS)、堿變性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)、隨后進行洗滌(2×SSC)。以32P標記的hTARC的cDNA克隆D3A的SnaI-PstI片段作探針，與尼龍膜進行雜交。雜交溶液為5×SSPE(1×SSPE包括0.18M NaCl，0.01M磷酸鈉，pH7.5，1mM EDTA)，30％甲酰胺，2％SDS，10×Denhart’s溶液，100μg/ml鮭魚精子DNA，在42℃雜交一晚上。洗膜用2×SSC、0.1％SDS在室溫洗10分鐘，2×SSC、0.1％SDS在60℃洗30分鐘洗2次，之后X光膠片(Kakak)感光，顯影，鑒定與探針進行反應(yīng)的斑點。最后得到8個基因組克隆。
根據(jù)Sanger法，用Pharmacia公司的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自動測序儀測定其中1個克隆(Clone #3)的4234個堿基序列?？梢钥吹接?個區(qū)域與人TARC有高度同源性。推測這3個區(qū)域為外顯子，連結(jié)的堿基序列有一個由93個氨基酸組成的開讀框，與人TARC具有高同源性，可達64.4％，因此可以判斷該DNA是小鼠TARC的基因組DNA。II.小鼠TARC cDNA的克隆(1)由PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞制備cDNA文庫由PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞制備cDNA文庫，可參照文獻(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約(1989))，應(yīng)用GIBCO-BRL的cDNA合成系統(tǒng)和cDNA克隆系統(tǒng)，按下面的方法進行。
首先，用quickprep micro mRNA純化試劑盒(Pharmacia)從PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞抽提poly(A)+RNA。用給予的細胞裂解液裂解PHA24小時刺激的Balb/C小鼠脾細胞2×107個。接著加入oligo-dT樹脂，混和3分鐘，poly(A)+RNA結(jié)合樹脂后，用TOMY離心機MRX-150(TOMY-精工)在12000轉(zhuǎn)離心1分鐘。用高鹽濃度洗液洗所得沉淀物3次，用低鹽濃度洗液洗5次，之后用洗脫液洗脫。在洗脫液中加入0.1倍量3M醋酸鈉和2倍的乙醇，-80℃冷卻1小時，用TOMY離心機MRX-150(TOMY精工)在12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，將沉淀的poly(A)+RNA溶解到無菌蒸餾水中。測定260nm處的吸光度，計算回收的poly(A)+RNA的量。從PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞獲得10μg的poly(A)+RNA。
然后以純化的poly(A)+RNA為模板，按下面的方法合成cDNA。首先，以4μg poly(A)+RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄酶SUPER SCRIPT II RT(GIBCO-BRL)在反應(yīng)緩沖液中(50mM Tris-HCl、pH8.3，75mMKCl，3mM MgCl2，1OmM DTT，500μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，50μg/ml Not I引物-銜接子(GIBCO-BRL)，和2萬U/ml逆轉(zhuǎn)錄酶SUPER SCRIPT II RT)，37℃反應(yīng)1小時，合成單鏈DNA。Not I引物-啟動子的序列如序列表的序列號3所示。以該單鏈DNA為模板，在反應(yīng)緩沖液(25mM Tris-HCl、pH7.5，100nM KCl，5mMMgCl2，10mM(NH4)2SO4，1.2mM DTT，0.15mM β-NAD+，250μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，65U/ml DNA連接酶，250U/ml DNA，聚合酶和13U/ml Rnase H)中，16℃反應(yīng)2小時，合成cDNA。然后，加入DNA聚合酶，終濃度達65U/ml，再在16℃反應(yīng)5分鐘，形成雙鏈。將該雙鏈DNA在反應(yīng)緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP，5％ PEG 8000，200μg/ml EcoRI銜接子(GIBCO-BRL)，100U/ml T4 DNA聚合酶)中，16℃反應(yīng)16個小時，以與SalI銜接子接合。EcoRI銜接子是序列表中序號13和14中所示DNA退火了的雙鏈DNA。將所得cDNA插入到λExcell載體的NotI和EcoRI位點的中間，制成cDNA文庫。(2)探針的制備以上面(1)中制備的由PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞而來的cDNA文庫作模板，在反應(yīng)緩沖液中(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mMKCl，1.5mM MgCl2，0.1％明膠，200μM dNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，400nM mG98外顯子上游引物，400nM mG98外顯子下游引物，100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)中進行聚合酶鏈式反應(yīng)。mG98外顯子上游引物和mG98外顯子下游引物是在上面1中所得小鼠基因組DNA的基礎(chǔ)上設(shè)計的。這些引物的序列分別在序列表的序列號15和16中表示。mG98外顯子上游引物和mG98外顯子下游引物用DNA合成儀(Cyclone Plus DNA Synthesizer，Miligen/Biosearch)合成。合成時用Miligen/Biosearch公司的β-聯(lián)接的β-氰乙基磷酰亞胺試劑進行。合成后用2ml氨水(28％，Nacalai Tesque)從柱中洗脫合成的核苷酸，之后在60℃處理5小時，脫去保護基。在脫去保護基的核苷酸中加入10倍的正丁醇，用TOMY離心機(TOMY精工)在3000轉(zhuǎn)離心10分鐘，回收沉淀。將回收的核苷酸溶解到無菌水中，測定260nm處的吸光度，確定含量。
用購自寶酒造的Ampli Taq試劑盒在DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmor)下進行PCR。反應(yīng)如下進行94℃預(yù)處理3′后，94℃45″、60℃45″、72℃1′重復(fù)40個循環(huán)，最后在72℃處理3分鐘。所得321bp的DNA片段用作探針以獲取小鼠TARC的全長cDNA。(3)小鼠TARC全長cDNA的克隆為了獲得小鼠TARC的全長cDNA，用多引物DNA標記系統(tǒng)(Amersham Japan)以32P標記上面(2)中得到的321bp的cDNA片斷，用它作探針，通過菌落雜交法篩選(1)中制備的PHA刺激的Balb/C小鼠脾細胞的cDNA文庫。菌落雜交法參照文獻(J.Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室，紐約，(1989))。中己有的方法進行。
將PHA刺激Balb/C小鼠脾細胞而來的cDNA文庫的噬菌體液和大腸桿菌LE392接種到LB平皿(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl，15g瓊脂/1L蒸餾水)，30℃培養(yǎng)一晚上。將平皿上全長的噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond-N+，Amersham Japan)，然后用SDS處理(10％SDS)，堿變性(0.5N NaOH，1.5M NaCl)，洗滌(2×SSC)。用32P標記的321bp的DNA片段作探針與尼龍膜進行雜交。用5×SSPE(1×SSPE0.18M NaCl，0.01M磷酸鈉、pH7.5，1mM EDTA)、50％甲酰胺、2％SDS、10倍的Denhardt’s溶液，100μg/ml鮭魚精子作雜交溶液，在42℃雜交一晚上。用2×SSC，0.1％SDS緩沖液在室溫下洗膜10分鐘，用0.2×SSC、0.1％SDS 緩沖液在60℃洗30分鐘，洗2次，之后用X光膠片(Kodak)感光，顯影，鑒定與探針進行反應(yīng)的菌落，最終得到一個cDNA克隆(Clone#1)。根據(jù)Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自動測序儀測定插入到克隆#1中的cDNA的序列，再進行下面的各種檢測，結(jié)果證實，該cDNA是編碼目的新型CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)(mTARC)的。II.小鼠TARC的結(jié)構(gòu)的確定(1)分析mTARC cDNA的堿基序列及其編碼的氨基酸序列(根據(jù)Sanger法，用Pharmacia的Autoread Sequence kit和A.L.F.II自動測序儀檢測上面I.(4)中得到的克隆D3A的堿基序列。)上面II(3)中得到的小鼠cDNA克隆#1的堿基序列和內(nèi)部不包括翻譯終止密碼子的開讀框的氨基酸序列如圖8所示。
如圖8所示，它表明插入到克隆#1中的基因含有由93個氨基酸組成的開讀框，N末端有以信號肽為特征的、強疏水性氨基酸序列。這93個氨基酸形成的蛋白質(zhì)的分子量為10,466。另外，根據(jù)計算，推定的信號肽切斷位點在Ala-23和Ala-24間，如圖8中的垂直棒所示。從該切斷位點到9氨基酸下游有CC型趨化因子特征的兩個連續(xù)的半胱氨酸。
此外，推測信號肽切斷后，由70個氨基酸組成的推定成熟型蛋白質(zhì)是分泌型蛋白質(zhì)。由這70個氨基酸組成的推定的成熟型分泌型蛋白質(zhì)的分子量計算為7916，通過計算，等電點為10.2。(2)與人TARC的相似性可以證明成熟型分泌小鼠TARC蛋白質(zhì)的氨基酸序列與人TARC有65％的同源性。另外證明小鼠TARC開放閱讀框的堿基序列與人TARC有70％的同源性。證明在所有CC型趨化因子中保存的4個半胱氨酸在小鼠TARC中也保存著。這些結(jié)果暗示小鼠TARC是人TARC的小鼠同源基因和蛋白質(zhì)。實施例5重組小鼠TARC在蠶細胞中的表達(1)構(gòu)建在蠶細胞中表達hTARC DNA用的重組載體pVL-mTARC用EcoRI和NotI同時消化Clone#1，可得到0.5kb的DNA片段，該片段兩端有EcoRI和NotI位點，包括從翻譯起始密碼子到翻譯終止密碼子長度的mTARC序列。將該DNA片段插入到制備重組型桿狀病毒時應(yīng)用的pVL1393(Invitrogen)的EcoRI位點和NotI位點之間，可得到重組載體pVL-mTARC。該重組載體pVL-TARC的基因圖如圖9所示。(2)轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)接著將重組載體pVL-mTARC與具有致死性缺失、線性的AcNPVDNA同時導(dǎo)入sf9昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒，用有限稀釋法純化所得的重組桿狀病毒，在M.O.I.＝0.1時再感染sf9昆蟲細胞，得到種病毒。在M.O.I.＝10-20時用種病毒感染Tn5B-4昆蟲細胞(Invitrogen)(每150cm2培養(yǎng)瓶1.2×107個)，在無血清的EX-CELL 400培養(yǎng)基(JRHBiosciences)(每150cm2培養(yǎng)瓶30ml)上，27℃培養(yǎng)2天。(3)產(chǎn)物的分離和純化回收培養(yǎng)上清，通過0.22μm的濾膜。向濾液中加入1/10體積的500mM MES(pH6.5)，過A緩沖液(50mM MES(pH6.5)/100mMNaCl)平衡了的1ml Resouce-S柱(Pharmacia)。用A緩沖液沖洗給含有mTARC蛋白質(zhì)的柱子，然后用A緩沖液和B緩沖液(50mM MES(pH6.5)/100mM NaCl)配制的NaCl鹽濃度梯度液進行洗脫。用SDS-PAGE和銀染色鑒定含mTARC蛋白質(zhì)的級分。SDS-PAGE的結(jié)果如圖10B所示。圖10B中F和H分別是FPLC級分(終了一步前的一個純化步驟)和HPLC級分的結(jié)果。
在含mTARC蛋白質(zhì)的級分中加入終濃度為0.1％的TFA，上A緩沖液(0.1％TFA)平衡過的Cosmosil 5CA 300柱(Nacalai Tesque)，用緩沖液A和緩沖液B(0.1％TFA，60％乙腈)配成的乙腈梯度液進行洗脫。mTARC蛋白質(zhì)的洗脫帶如圖10A所示。收集含mTARC蛋白質(zhì)的級分，在真空干燥中揮發(fā)乙腈，對不含內(nèi)毒素的PBS進行透析，得到純化的終產(chǎn)品。用BCA試劑盒(Pierce)，以BSA作對照來測定蛋白質(zhì)的濃度。從300ml培養(yǎng)上清中獲得168μg純化的mTARC蛋白質(zhì)，表達量良好。用鱟裂解物測定(QCL-1000，Bio Whitaker)對混入的內(nèi)毒素進行定量，在2pg/μg以下。用氨基酸測序儀(島津)檢測純化hTARC蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列，為ARATNVGRE**LDYF。如圖10所示，該氨基酸序列與70個氨基酸組成的成熟分泌型蛋白質(zhì)N末端的氨基酸序列一致，而70個氨基酸是從堿基序列上切斷預(yù)測的信號肽后形成的。實施例6由小鼠TARC誘導(dǎo)白細胞浸潤在小鼠皮下施用實施例5中的小鼠TARC誘導(dǎo)白細胞浸潤。
將純化的小鼠TARC蛋白質(zhì)在Balb/C小鼠背部皮內(nèi)施用，通過檢查有無白細胞浸潤來證實mTARC的趨化因子樣活性。具體地講，將小鼠TARC的純品50ng溶解到不含內(nèi)毒素的PBS中，達50μl，在Balb/C小鼠的背部皮內(nèi)施用。用50μl不含內(nèi)毒素的PBS作陰性對照。施用后4、24小時后，脫頸椎處死小鼠，切下施用部位的皮膚，用10％甲醛固定。其后，用石蠟包埋固定的皮膚，用切片機制備5μm厚的切片，用蘇木精-伊紅染色。圖11為mTARC的結(jié)果，圖12為對照的結(jié)果。圖11和12中，A為施用24小時后顯微鏡照片的100倍，B為400倍。如圖11A和B所示，施用了小鼠TARC的皮下組織中，在施用TARC 24小時后可看到淋巴細胞和單核細胞的浸潤。而如圖12A和12B中所顯示的只施用PBS則看不到這種變化。實施例7檢測表達TARC受體的細胞用碘標記的人TARC檢測表達TARC受體的細胞。用125I標記Bolton-Hunter試劑(Amersham Japan)以125I標記實施例2中在昆蟲細胞表達的純化的人TARC蛋白質(zhì)。用Bio-Gel96(Bio-Rad)過濾125I標記的hTARC，求得比活性為81.6μCi/μg。用標記的hTARC進行與各種細胞的結(jié)合試驗。
用結(jié)合緩沖液(PRMI 1640、20mM HEPES(pH7.4)、1％BSA、0.02％NaN3)洗滌1×106～8×106個被檢測細胞，之后懸浮到100μl的結(jié)合緩沖液中。向該細胞懸液中加入100μl的結(jié)合緩沖液，使加入的125I標記的hTARC終濃度為0.66nM，室溫結(jié)合1小時。結(jié)合反應(yīng)完成后將反應(yīng)液重鋪到300μl的鄰苯二甲酸二丁基酯橄欖油(4∶1)溶液上，通過離心分離與細胞結(jié)合了的125I標記的TARC和未結(jié)合的125I標記的TARC，然后用γ計數(shù)儀測定與細胞結(jié)合的125I標記的TARC的放射量。從不存在非標記TARC的情況下結(jié)合的125I標記TARC的值減去200nM非標記hTARC存在下非特異結(jié)合的125I標記TARC的值，可得到與人TARC細胞的特異性結(jié)合。圖13是每106個不同種類的細胞125I標記TARC的特異結(jié)合。
圖13表明，在一部分T細胞株(Jurkat，Molt3、CEM、Hut78、MT2、MT4、Hut102)、外周血淋巴細胞、活化的外周血T細胞中可看到相當(dāng)特異的結(jié)合。在其它T細胞株(Molt4、HPB-ALL、TCL-Kan、TLOml)單核細胞株(U937、THPl)、或紅細胞株(K562)、外周血單核細胞中很難看到特異性結(jié)合。在B細胞株(Raji)、胎兒腎臟來源的細胞株(293E)、外周血顆粒細胞中幾乎看不到特異性結(jié)合。
以上結(jié)果顯示，TARC受體可在某種T細胞上大量表達。實施例8 TARC與受體的結(jié)合特性用T細胞株Jurkat更詳細地分析TARC受體。(1)結(jié)合常數(shù)和受體數(shù)為了求出結(jié)合常數(shù)和受體數(shù)，檢測能達到結(jié)合平衡的條件，結(jié)果證明125I標記的人TARC與Jurkat細胞的特異結(jié)合在15℃、1小時達到平衡。因此通過125I標記TARC濃度的變化，檢測與4×106個Jurkat細胞特異結(jié)合量的變化。特異性結(jié)合量可用不存在非標記TARC的條件下結(jié)合的125I標記TARC的值減去存在1μM非標記TARC的條件下非特異結(jié)合的125I標記TARC的值來求出。其結(jié)果如圖14A所示，125I標記的TARC與Jurkat細胞的特異結(jié)合用飽和曲線描繪。用Scatehard分析的結(jié)果如圖14B所示。Jurkat細胞上與125I標記TARC的特異性結(jié)合位點是1種，根據(jù)計算，結(jié)合常數(shù)為2.1nM，每個細胞的結(jié)合數(shù)為603。
接著，將125I標記TARC的濃度固定在2nM，通過變化非標記TARC的濃度來檢測與4×106個Jurkat細胞特異性結(jié)合量的變化。特異性結(jié)合量可通過各種濃度非標記TARC存在的條件下結(jié)合的125I標記TARC的值減去1μM非標記TARC存在的條件下非特異結(jié)合的125I標記TARC的值而求出，非標記TARC不存在的條件下特異性結(jié)合量以100％計算。結(jié)果如圖15A所示。Scatchard分析的結(jié)果為Jurkat細胞上125I標記TARC的特異性結(jié)合位點是1種，根據(jù)計算，結(jié)合常數(shù)為2.1nM，每1個細胞的結(jié)合數(shù)為948。(2)其它CC型趨化因子的結(jié)合抑制檢查TARC與Jurkat細胞的結(jié)合是否與其它的趨化因子間存在競爭。125I標記hTARC的濃度為0.66nM，不存在非標記趨化因子的條件下或存在200nM IL-8、RANTES、MCP-1、MCP-1α、(全部購自PreproTech)或TARC的情況下在室溫下與4×106個Jurkat細胞結(jié)合1小時。結(jié)果如圖15B所示?？梢钥吹?，125I標記TARC的結(jié)合只在非標記TARC存在的情況下受到競爭抑制，而其它的趨化因子不抑制結(jié)合。因此，這些表明Jurkat細胞上的TARC受體與其它趨化因子的受體不同，是一種獨立的受體。(3)與紅細胞上受體的結(jié)合活性。
已知紅細胞上存在各種趨化因子可結(jié)合的受體-Dutty抗原/趨化因子受體(Duffy Antigen/receptor for chemokine(DARC))。固定125I標記TARC的濃度為0.66nM，變化非標記的其它趨化因子IL-8、RANTES、MCP-1、MCP-1α或TARC的濃度，檢測與108個紅細胞特異結(jié)合量的變化。特異結(jié)合量可用存在各種濃度非標記趨化因子的條件下結(jié)合的125I標記TARC值減去存在1μM非標記TARC的情況下非特異結(jié)合的125I標記TARC值求出，不存在非標記TARC的情況下特異的結(jié)合量以100％計算。結(jié)果如圖16所示?？梢钥吹?25I標記TARC的結(jié)合受到非標記TARC、IL-8、RANTES、MCP-1等競爭抑制，而MCP-1α幾乎不發(fā)生競爭抑制。Scatchard分析的結(jié)果如圖17所示。紅細胞上125I標記TARC的特異性結(jié)合位點為1種，根據(jù)計算，結(jié)合常數(shù)為17nM。TARC的結(jié)合常數(shù)及競爭抑制模式與其它的趨化因子如IL-8的DARC的結(jié)合常數(shù)及競爭抑制模式相同，由此表明TARC與紅細胞上的DARC結(jié)合。實施例9TARC的免疫測定(1)制備谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和TARC的融合蛋白用表達該融合蛋白的載體pGEX-TARC制備谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移(GST)和TARC的融合蛋白。
以實施例1中克隆D3A作模板，通過PCR可獲得一個0.2kb的DNA片段，該片段兩端有BamHI和NotI位點，含有成熟型TARC從起始密碼子到終止密碼子的序列。PCR中所用的兩個寡核苷酸序列如序列表中序列號17和18中表示。用購自寶酒的AmpliTaq kit，在DNA ThermalCycler(Perkin-Elmer)上進行PCR。反應(yīng)中以克隆D3A的DNA作模板，在反應(yīng)緩沖液(10mM Tris-HCl、pH8.3，50mM NaCl，1.5mMMgCl2，0.1％明膠，200μM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，400μM引物，和100U/ml AmpliTaq DNA聚合酶I)中進行。反應(yīng)這樣進行94℃預(yù)處理3分鐘，在94℃45″、55℃45″、72℃1′為1循環(huán)重復(fù)進行15個循環(huán)，最后在72℃處理3′。用BamHI和NotI同時消化反應(yīng)生成物，插入到pGEX4T-3(pharmacia)的Bam HI位點和NotI位點之間，得到表達載體pGEX-TARC。
用導(dǎo)入了表達載體pGEX-TARC的大腸桿菌表達氨基酸末端添加了GST的成熟型TARC蛋白質(zhì)。在加入了終濃度為0.1mM IPTG、含0.2％葡萄糖的2×YT培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)大腸桿菌JM109 4小時。隨后將大腸桿菌懸浮到STE緩沖液(10mM Tris-HCl、pH8.0、1mMEDTA，100mM NaCl，1mM PMSF，100μg/ml溶菌酶)，冰上放置15分鐘。接著加入終濃度為5mM的DTT、1.4％的N-月桂酰肌氨酸鈉，在冰上冷卻，用TOMY超聲波破碎儀UD-210(TOMY-精工)以最大功率處理300秒。以10,000轉(zhuǎn)、5分鐘，4℃的條件離心，在上清中加入終濃度為2.5％的TritonX-100，之后加入谷胱甘肽Sepharose 4B樹脂，4℃進行一晚上結(jié)合反應(yīng)。用PBS沖洗與GST-TARC融合蛋白結(jié)合的樹脂，洗5次，然后加入與樹脂等體積的含1％SDS的PBS，在100℃處理5分鐘，釋放GST-TARC融合蛋白。在所得GST-TARC融合蛋白質(zhì)溶液中加入9倍體積的PBS，用作抗原。(2)抗TARC抗體的制備使用豚鼠，將100μg的GST-TARC融合蛋白質(zhì)與等體積的完全弗氏佐劑混合，然后施用到豚鼠皮下來制備抗體。每2周進行一次增強免疫，將100μg GST-TARC融合蛋白質(zhì)與等體積的完全弗氏佐劑混合，之后皮下施用。共免疫3次，收集血清。(3)抗TARC抗體的純化和標記用以下方法制備生物素化的抗TARC抗體。向Affi-Gel 15樹脂(BioRad)中加入3倍體積的純化GST-TARC融合蛋白質(zhì)或GST蛋白質(zhì)溶液，4℃放置一晚上。除去蛋白質(zhì)溶液后，向樹脂中加入封閉液(10mM乙醇胺、pH8.0)，4℃放置1小時。用20倍體積的PBS沖洗樹脂，然后加入結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl、pH7.2，0.5MNaCl)。在所得血清中加入等體積的飽和硫銨，4℃放置1晚后，在12000轉(zhuǎn)，20分鐘、4℃的條件下離心。向所得沉淀物中加入PBS溶解，對結(jié)合緩沖液進行透析，首先置于GST蛋白質(zhì)結(jié)合樹脂中，室溫放置2小時，除去抗GST的抗體。所得流過溶液置于GST-TARC融合蛋白質(zhì)結(jié)合樹脂中，4℃放置1晚上，用20倍體積的結(jié)合緩沖液洗滌樹脂，用0.1M甘氨酸洗脫抗TARC的抗體。向該抗體溶液中加入1MTris-HCl、pH9.5、對0.1M NaHCO3進行透析，加入NHS-LC-Biotin(Pierce)，4℃放置2.5小時。將該生物素化的抗體對50mM Tris-HCl、pH7.5進行透析，然后用PBS透析。
固相抗TARC抗體的純化如下進行。向抗血清中加入終濃度為100mM的Tris-HCl、pH8.0，上Hitrap-protein柱，用柱子10倍體積的100mM Tris-HCl、pH8.0洗柱，接著用10倍體積的100mM Tris-HCl、pH8.0洗柱。用0.1M甘氨酸洗脫結(jié)合的抗體，加入1M Tris-HCl、pH9.5后對PBS進行透析。II.TARC蛋白質(zhì)的免疫測定TARC蛋白質(zhì)的定量按以下所謂夾心法(三明治法)進行，用生物素化抗體確定與固相抗體結(jié)合的TARC的量。首先用50mM Tris-HCl pH8.0緩沖液將待固定抗體溶解為10μg/ml，96孔板(Maxisorb，Nunc)每孔中加入50μl，4℃放置1晚。去除抗體溶液后，加入100μl含1mg/mlBSA的PBS，室溫放置1小時，用含0.02％Tween-20的PBS洗1次。將Triton X-100以終濃度0.5％加到昆蟲細胞中表達的濃度已知的純化重組人TARC中或加到含有未知量抗原的試樣中，然后每孔加入50μl，室溫放置1小時，用Tx-PBS溶液(0.5％Triton X-100)洗3次，然后用Tx-PBS溶液將生物素化抗TARC抗體稀釋1000倍，每孔加入50μl，室溫放置30分鐘。用Tx-PBS洗液洗3次后，用Tx-PBS溶液將過氧化酶標記的鏈霉抗生物素蛋白(Vector)稀釋400倍，每孔加入50μl，室溫放置30分鐘。用Tx-PBS溶液洗3次，用PBS洗1次后，加入底物溶液(100mM NaOAc、pH5.5，1mM EDTA，6.72mg/ml，TMBZ，0.03％H2O2)100μl，進行顯色反應(yīng)。加入50μl 1N H2SO4終止反應(yīng)，在450nm處測定吸光度。接著用濃度已知的重組人TARC作標準曲線，根據(jù)標準曲線可知道樣品中TARC蛋白質(zhì)的量。檢測靈敏度為50pg/ml。實施例10 具有TARC誘導(dǎo)活性的物質(zhì)(1)鑒定誘導(dǎo)TARC蛋白質(zhì)的刺激將正常人外周血單核細胞加入到96孔板(Coaster)，每孔加入2.5×105個，不加刺激物質(zhì)或?qū)⒋碳の颬HA(GIBCO-BRL)作100倍稀釋，加入終濃度為10μg/ml的抗CD3抗體(OKT3)或LPS(L4391、Sigma)100ng/ml，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培養(yǎng)。培養(yǎng)6、12、24、36、48、72小時后回收培養(yǎng)液，用0.45μm的濾器過濾，用所得濾液進行TARC蛋白質(zhì)的定量。結(jié)果如圖21所示，如圖21所示，TARC蛋白質(zhì)在PHA、抗CD3抗體的刺激下時間依賴性的表達，在72小時時表達量直線增加。PHA刺激12小時、抗CD3抗體刺激24小時可檢測出表達，PHA以16ng/ml、抗CD3抗體以2.5ng/ml刺激72小時可表達。LPS和不刺激時幾乎檢測不到表達。(2)能誘導(dǎo)TARC蛋白質(zhì)的細胞因子的鑒定由于PHA比抗CD3抗體有更強的誘導(dǎo)TARC表達的作用，所以認為誘導(dǎo)與細胞因子相關(guān)。
將正常人外周血單核細胞加到96孔板(Coaster)，每孔加入2.5×105個細胞，不加細胞因子或加入下列細胞因子10ng/ml IL-1α(R&D)、100U/ml IL-2，(Sionogi制藥公司)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、50ng/ml(PeproTech)、50ng/ml IL-7(PeproTech)、50ng/ml IL-10(Genzyme)、10ng/ml GM-CSF(Genzyme)、50ng/mlTNFα(Pepro Tech)、1000U/ml IFN-γ(Sionogi制藥公司)、10ng/mlM-CSF(R&D)，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后回收培養(yǎng)液，用0.45μm濾器進行過濾，用所得溶液進行TARC蛋白質(zhì)的定量。其結(jié)果如圖22所示。如圖22所示，GM-CSF、IL-3、IL-4能誘導(dǎo)TARC蛋白質(zhì)表達，表達量分別為12、6、2ng/ml。
同樣檢測GM-CSF、IL-3、IL-4的濃度依賴性。結(jié)果如圖23所示。如圖23所示，GM-CSF的ED50為0.7ng/ml，表達最大達3.3ng/ml，在更高的濃度下反而不誘導(dǎo)表達。描繪IL-3、IL-4的飽和曲線，ED50為0.5、0.8ng/ml。
以上結(jié)果顯示，TARC的表達與TNF-α、IPN-γ誘導(dǎo)的大多數(shù)趨化因子的表達相比，極具有特征。實施例11 表達TARC蛋白質(zhì)的細胞的鑒定(1)為了鑒定表達TARC的細胞，將正常人外周血單核細胞分為CD14陽性單核細胞和CD14陰性淋巴細胞，用PHA、PHA/PMA、GM-CSF、IL-3、IL-4進行刺激。將濃度為2×107/ml的正常人外周血單核細胞懸浮到冰冷的分離緩沖液(5mM EDTA、1％FCS、PBS)中，加入1/450量的FITC標記的抗CD14抗體(Becton-Dickinson)，在冰上放置30分鐘。用分離緩沖液洗滌，以107細胞/80ml的終濃度懸浮到分離緩沖液中，加入20μl含107細胞的磁珠標記的抗小鼠IgG抗體(Miltenyi-Biotec)，4℃放置15分鐘。用分離緩沖液洗滌，懸浮到500μl分離緩沖液中，用NACS(Miltoyi-Biotec)分離CD14陽性單核細胞和CD14陰性淋巴細胞。在96孔板(Coaster的每孔中加入正常人外周血單核細胞和2.5×105個CD14陰性淋巴細胞、1.8×105個CD14陽性單核細胞，不進行刺激或加入刺激物100倍稀釋的PHA(GIBCO-BRL)、100倍稀釋的PHA(GIBCO-BRL)和50ng/mlPMA、50ng/ml IL-4(PeproTech)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、10gn/mlGM-CSF(Genzyme)，在250μl RPMI-1640/10％FCS中培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后回收培養(yǎng)液，用0.45μM的濾器過濾，用所得濾液進行TARC蛋白質(zhì)的定量。其結(jié)果如圖24所示。如圖24中的圖所示，GM-CSF、IL-3、IL-4只刺激單核細胞分泌TARC。相反，PHA、PHA/PMA只刺激淋巴細胞表達，PHA的刺激誘導(dǎo)表達，在加入PMA后受到顯著抑制。(2)用Northern印跡分析法分析TARC mRNA的表達不刺激或用100倍稀釋了的PHA(GIBCO-BRL)、100ng/ml LPS(L4391、Sigma、10ng/ml IL-4(PeproTech)、10ng/ml IL-3(Genzyme)、4ng/ml GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血單核細胞，24小時后，用TRIZOL RNA純化試劑盒(GIBCO-BRL)抽提RNA。將所得5μg RNA進行含0.66M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond-N+)(Amershan Japan)上。用多引物DNA標記系統(tǒng)(Amersham Japan)以32P標記TARC cDNA克隆B3A的SmaI-PstI片段，以它作探針與尼龍膜進行雜交。雜交溶液用QuickHyb液(Stratagene)、100μg/ml的鮭魚精子DNA，在68℃雜交1.5小時。用2×SSC，0.1％SDS緩沖液室溫洗膜10分鐘，0.2×SSC、0.1％SDS緩沖液于55℃洗膜30分鐘，洗2次，之后將X光膠片(Kodak)感光，顯像分析。從圖25的結(jié)果可以看出，沒有刺激或在LPS刺激下人外周血單核細胞幾乎不表達TARC的mRNA，但GM-CSF、IL-3的刺激約能誘導(dǎo)400倍的表達，IL-4、PHA的刺激約能誘導(dǎo)40倍的表達。
以上結(jié)果表明，GM-CSF、IL-3、IL-4刺激外周血單核細胞表達TARC，不是通過促進分泌顆粒釋放蓄積的蛋白質(zhì)，而是主要通過增加mRNA實現(xiàn)的。實施例12 來源于人PBMC的TARC對T細胞的遷移活性用以下方法檢測細胞因子刺激下從正常人外周血單核細胞分泌的TARC對T細胞的遷移活性。
用48孔趨化性盒(chemotaxis chamber，Neuro Probe)測定細胞遷移活性。不刺激或用在50ng/ml IL-4(PeproTech)、50ng/ml IL-3(Genzyme)、10ng/ml GM-CSF(Genzyme)刺激人外周血單核細胞，36小時后回收培養(yǎng)液，用0.45μm的濾器過濾，用所得濾液測定細胞遷移活性。培養(yǎng)濾液加在下孔，而將懸浮在緩沖液(RPMI-1640、20nM Hepes(pH7.4)、1％BSA)中的4×105個T細胞株HUT78加到上孔。用IV型膠原溶液(5μg/ml水溶液)室溫下包被1小時的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(孔徑5μm，Neuro Probe)隔離上下孔。37℃培養(yǎng)2小時后，取下膜，用PBS沖洗上側(cè)，固定，染色。
用放大800倍的顯微鏡，從每孔隨機選擇5個視野來測定遷移細胞的數(shù)目。結(jié)果如圖26所示。如圖26的圖所示，IL-3和GM-CSF刺激的培養(yǎng)液能引起HUT78細胞很強的遷移，不刺激或IL-4刺激的培養(yǎng)液未引起遷移。
此外，當(dāng)用10μg/ml豚鼠抗TARC抗體(TARC Ab)處理GM-CSF刺激的培養(yǎng)上清時，其對HUT78細胞的遷移活性幾乎消失。
這些結(jié)果提示具有遷移活性的TARC是在細胞因子的刺激下從單核細胞分泌的。實施例13 細胞因子抑制TARC的表達由于與誘導(dǎo)體液免疫相關(guān)的Th2型細胞因子IL-4能誘導(dǎo)TARC的表達，因此研究了抑制Th2誘導(dǎo)的Th1型細胞因子IFN-γ、抑制全身免疫反應(yīng)的細胞因子IL-10對TARC表達誘導(dǎo)的影響。將正常人外周血單核細胞加到96孔板(Coaster)，每孔加2.5×105個，加入細胞因子10ng/ml IL-4(PeproTech)、10ng/ml IL-3(Genzyme)、5ng/mlGM-CSF(Genzyme)，再在存在50ng/ml IL-10(Genzyme)或1000U/ml IFN-γ(Sionogi制藥公司)的250μl RPMI-1640/10％FCS中培養(yǎng)。48小時后回收培養(yǎng)液，用0.45μm濾器過濾，用所得濾液進行TARC蛋白質(zhì)的定量。結(jié)果如圖27所示。如圖27中的圖所示，GM-USF、IL-3、IL-4的刺激能誘導(dǎo)外周血單核細胞表達TARC，這種作用被IFN-γ、IL-10所抑制。因此我們認為誘導(dǎo)體液免疫的刺激能誘導(dǎo)TARC的分泌，誘導(dǎo)細胞免疫的狀態(tài)下抑制其分泌。實施例14 TARC對表達CCR4的293/EBNA-1細胞的結(jié)合活性用TARC與分泌的堿性磷酸酶(SEAP)-(組氨酸)6的融合蛋白探討TARC與293/EBNA-1細胞表示表達的CCR4受體的結(jié)合活性。(1)制備融合蛋白質(zhì)(TARC-SEAP)表達TARC與SEAP的融合蛋白的載體-PDREF-SEAP(His)6如圖28所示。首先說明制備該載體的方法。以Clontech公司的質(zhì)粒pSEAP-EnHancer作模板，用5′-XbaI-AP引物(序列號19)和3′-AP(His)6-NotI引物(序列號20)通過PCR擴增六個組氨酸聯(lián)結(jié)的序列-(His)6部分的編碼區(qū)域，用限制性酶XbaI和NotI裂解所得PCR產(chǎn)物，導(dǎo)入到pDREF-Hyg(Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters 360155-159，1995)的XbaI和NotI位點之間，制備pDREF-SEAP(His)6。
接著，如圖28所示，在pDREF-SEAP(His)6載體的SalI和XbaI位點之間插入TARC cDNA的ORF，制備載體-PDREF-TARC-SEAP(His)6，它能編碼TARC與介入了5個氨基酸形成的接頭(Ser-Arg-Ser-Ser-Gly)的SEAP-(His)6形成的融合蛋白。下面說明該載體的制作方法。
以編碼TARC堿基序列的TARC cDNA作模板，用TY98F引物(序列號3)和TY98R引物(序列號4)進行PCR擴增，用限制性酶SalI和XbaI裂解所得PCR產(chǎn)物，之后導(dǎo)入到pDREF-SEAP(His)6的SalI和XbaI位點之間，制成pDREF-TARC-SEAP(His)6。通過lipofetamin(Gibco-BRL)將該載體導(dǎo)入293/EBNA-1細胞(Inviterogen)。培養(yǎng)3-4天后，回收培養(yǎng)上清，通過0.45μm孔徑的濾器，加入20mM HEPES(pH7.4)和0.02％疊氮鈉，4℃保存。(2)融合蛋白質(zhì)的(TARC-SEAP)的測定用夾心型酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)分析所產(chǎn)生的融合蛋白(TARC-SEAP)。
即用單克隆型抗胎盤堿性磷酸酶(placental alkaline phosphatase)(anti-PLAP)(Medix Biotech)(2mg/ml，50mM Tris-HCl，pH9.5)鋪蓋96孔微量試驗板(Maxsorb)(Nunc)，用牛血清白蛋白(BSA)(1mg/ml，磷酸緩沖鹽溶液)封閉。用稀釋液(含0.02％Tween-20的PBS)稀釋樣品，加到微量板中，室溫反應(yīng)1小時后，用稀釋液洗滌，然后加入500倍稀釋了的生物素化的兔抗PLAP抗體，反應(yīng)1小時。再洗滌后，加入過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白(Vector)，反應(yīng)30分鐘。洗滌后用3.3′-5.5′-四甲基聯(lián)苯胺檢測結(jié)合的過氧化酶活性。用1N H2SO4終止反應(yīng)，測定450nm的吸光度。
用化學(xué)發(fā)光法，使用Great EscApe Detection Kit(Clontech)測定堿性磷酸酶活性)，求出相對光單位(RLU)。用純化PLAP(CosmoBio)制作AP標準曲線。當(dāng)使用的SEAP和TARC-SEAP為1pmol時，分別為8.7×107RLU/s和1.2×108RLU/S。(3)制備表達CCR4的293/EBNA-1細胞以人胎盤基因組DNA(Clontech)作模板，用CKR4-XbaF引物(序列號23)和CKR4-XbaR引物(序列號24)通過PCR擴增編碼CCR4的區(qū)域，用限制性酶XbaI裂解所得引物后，導(dǎo)入Pbluescript SK+(Stratagene)的XbaI位點。用SalI和NotI從所得質(zhì)粒裂解編碼CCR4的區(qū)域后，導(dǎo)入PDREF-Hyg(Yoshida等，F(xiàn)EBS Letters 360155-159，1995)的SaII和NotI位點之間，制備pDREF-CCR4。用Lipofectamine(Gibco-BRL)將該質(zhì)粒導(dǎo)入293/EBNA-1細胞(Invitrogen)。在潮霉素(200μg/ml)存在的條件下培養(yǎng)導(dǎo)入了CCR4的293/EBNA-1細胞，培養(yǎng)1周，選擇具有耐藥性的細胞。(4)TARC-SEAP融合蛋白與表達CCR4的293/EBNA-1細胞的特異性結(jié)合。
將TARC-SEAP的濃度固定在1nM，變化非標記TARC的濃度，觀測與表達CCR4的293/EBNA-1細胞的特異性結(jié)合量的變化。結(jié)合實驗在含20mM HEPES(pH7.4)，1％BSA，0.02％疊氮化鈉的RPMI-1640 200μl中進行。競爭性結(jié)合實驗為向4×105個細胞中加入1nM的TARC-SEAP和各種濃度的非標記TARC，室溫反應(yīng)1小時，洗滌后，用含50μl 1％/Triton X-100的10nM Tris-HCl(pH8.0)溶解細胞，在65℃處理10分鐘滅活細胞來源的磷酸酶，離心后，測定25μl上清中的AP活性。用1nM SEAP測定非特異性結(jié)合。用各種濃度的非標記TARC存在時結(jié)合的TARC-SEAP的值，減去非特異結(jié)合的SEAP的值求出的特異性結(jié)合量，非標記TARC不存在時的特異性結(jié)合量以100％計算。結(jié)果如圖29所示。代表結(jié)合強度的50％抑制濃度為3nM，由此可知TARC與CCR4很強地結(jié)合。(5)其它趨化因子對TARC-SEAP融合蛋白與表達CCR4的293/EBNA-1細胞特異性結(jié)合的影響。
探討TARC與表達CCR4的293/EBNA-1細胞的特異性結(jié)合是否與其它的趨化因子發(fā)生競爭。
將TARC-SEAP的濃度固定在1nM，不存在非標記趨化因子或存在200nM MCP-1、PANTES、MIP-1α、MIP-1β(全部為PeproTech產(chǎn)品)、LARC或TARC的條件下，與4×105個表達CCR4的293/EBNA-1細胞結(jié)合，室溫下結(jié)合1小時。結(jié)果如圖30所示。可以看出TARC-SEAP的結(jié)合只被非標記TARC競爭抑制，而其它的趨化因子不抑制結(jié)合。該結(jié)果表明CCR4是一受體，它只與TARC進行強烈結(jié)合，而不與其它趨化因子進行強結(jié)合。實施例15 hTARC對表達CCR4的293/EBNA-1細胞的遷移活性應(yīng)用48孔趨化性小室(chemotaxis chamber，Neuro Probe)測定人TARC對表達CCR4的293/EBNA-1細胞的遷移活性。參照實施例2，用緩沖液(RPMI-1640、20mM Hepes(pH7.4)、1％BSA)稀釋昆蟲細胞中表達的純化重組人TARC，加入下孔，將1×105個表達CCR4的293/EBNA-1細胞加入上孔。用IV型膠原溶液(20μg/ml)37℃包被了4小時的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜(孔徑8μm，Neuro Probe)隔離上下孔。37℃培養(yǎng)4小時后，取出膜，用PBS洗滌上側(cè)，固定、染色。
在放大400倍的顯微鏡下，每孔隨機選擇5個視野(HPF)測定遷移細胞數(shù)。結(jié)果如圖31所示。如圖31中圖顯示的，表達CCR4的293/EBNA-1細胞的遷移對TARC有濃度依賴性。縱軸上的四角箭頭表示不加TARC的對照結(jié)果。而與TARC不同的其它趨化因子RANTES和MIP-1α對表達CCR4的293/EBNA-1細胞沒有明顯的遷移活性。
序列表序列號1序列長度582序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性序列種類cDNA到mRNA來源生物名人序列特征表示特征的記號CDS位點53..334特征決定方法S序列CCCTGAGCAG AGGGACCTGC ACACAGAGAC TCCCTCCTGG GCTCCTGGCA CC ATG GCC58Met Ala1CCA CTG AAG ATG CTG GCC CTG GTC ACC CTC CTC CTG GGG GCT TCT CTG 106Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu5 10 15CAG CAC ATC CAC GCA GCT CGA GGG ACC AAT GTG GGC CGG GAG TGC TGC 154Gln His Ile His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys20 25 30CTG GAG TAC TTC AAG GGA GCC ATT CCC CTT AGA AAG CTG AAG ACG TGG 202Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp35 40 45 50TAC CAG ACA TCT GAG GAC TGC TCC AGG GAT GCC ATC GTT TTT GTA ACT 250Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr
55 60 65GTG CAG GGC AGG GCC ATC TGT TCG GAC CCC AAC AAC AAG AGA GTG AAG298Val Gln Gly Arg Ala Ile Cys Ser Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys70 75 80AAT GCA GTT AAA TAC CTG CAA AGC CTT GAG AGG TCT TGA AG CCTCCTCACC 349Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg Ser85 90CCAGACTCCT GACTGTCTCC CGGGACTACC TGGGACCTCC ACCGTTGGTG TTCACCGCCC 409CCACCCTGAG CGCCTGGGTC CAGGGGAGGC CTTCCAGGGA CGAAGAAGAG CCACAGTGAG 469GGAGATCCCA TCCCCTTGTC TGAACTGGAG CCATGGGCAC AAAGGGCCCA GATTAAAGTC 529TTTATCCTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 582序列號2序列長度558序列類型核酸鏈型雙鏈拓撲學(xué)線性序列種類來源生物名人序列特征表示特征的記號CDS位點2..280特征決定方法S序列C ATG AGG TCA CTT CAG ATG CTG CTC CTG GCT GCT CTG CTT CTG GGG ACT49Met Arg Ser Leu Gln Met Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Leu Gly Thr1 5 10 15TTT CTG CAG CAT GCC AGA GCT GCT CGA GCC ACC AAT GTA GGC CGA GAG 97Phe Leu Gln His Ala Arg Ala Ala Arg Ala Thr Asn Val Gly Arg Glu20 25 30TGC TGC CTG GAT TAC TTC AAA GGG GCC ATT CCT ATC AGG AAG TTG GTG 145Cys Cys Leu Asp Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Ile Arg Lys Leu Val35 40 45AGC TGG TAT AAG ACC TCA GTG GAG TGT TCC AGG GAT GCC ATC GTG TTT 193Ser Trp Tyr Lys Thr Ser Val Glu Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe50 55 60CTG ACT GTC CAG GGC AAG CTC ATC TGT GCA GAC CCC AAA GAC AAA CAT 241Leu Thr Val Gln Gly Lys Leu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Asp Lys His65 70 75 80GTG AAG AAG GCC ATC AGA TTG GTG AAA AAC CCA AGG CCG TGA CCTTCCCGC 292Val Lys Lys Ala Ile Arg Leu Val Lys Asn Pro Arg Pro85 90TGAGGCATTT GGAGACGCCA GGGCTGCTGT CCATGGTTTC AACATAAAGC GGCCTGTGAC 352CAGCAGAGCC CAAGAGCAGC CACAGAGCAG AAGTCCCTGT TCCCTTTTTT ATGGACTCTT 412ATGCACTACA GGCGAACACA AAAAAAAGCA ACGGAATAAA GCCTTCCTCC CTCAAAAAAA 472AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 532AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA558序列號3序列長度45序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列GATTAGTTCT AGATCGCGAC GCGGCCGCCC TTTTTTTTTT TTTTT45序列號4序列長度16序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列TCGACCCACG CGTCCG 16序列號5序列長度12序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGGACGCGTG GG12序列號6序列長度48序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CTACTACTAC TAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGGGGGG GGGGGGGG 48序列號7序列長度31序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATAGTCTAG A31序列號8序列長度35序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列5′P-CTCTAGACTA TCGATTCTGG AACCTTCAGA GGTTT-3′ 35序列號9序列長度32序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CTACTACTAC TAGGCCACGC GTCGACTAGT AC 32序列號10序列長度25序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CCTCTGAAGG TTCCAGAATC GATAG25序列號11序列長度27序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCCATATGG CTCGAGGGAC CAATGTG 27序列號12序列長度29序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAAGACCT CTCAAGGCT 29序列號13序列長度14序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列AATTCGGCAC GAGG14序列號14序列長度10序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列5′P-GGAGCACGGC-3′ 10序列號15序列長度24序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CTCTGCTTCT GGGGACTTTT CTGC 24序列號16序列長度24序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列GGTCACAGGC CGCTTTATGT TGAA 24序列號17序列長度27序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCGGATCCG CTCGAGGGAC CAATGTG27序列號18序列長度29序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAAGACCT CTCAAGGCT 29序列號19序列長度42序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCTCTAGAA GCTCCGGAAT CATCCCAGTT GAGGAGGAGA AC 42序列號20序列長度53序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCGCGGCCG CTCAGTGATG GTGATGGTGA TGACCCGGGT GCGCGGCGTC GGT 53序列號21序列長度27序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCGTCGACG GCACCATGGC CCCACTG27序列號22序列長度27序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGCTCTAGAA GACCTCTCAA GGCTTTG27序列號23序列長度38序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列GCTCTAGAGC CACCATGAAC CCCACGGATA TAGCAGAT38序列號24序列長度32序列類型核酸鏈型單鏈拓撲學(xué)線性序列種類其它核酸合成的DNA序列CGTCTAGACT ACAGAGCATC ATGGAGATCA TG 3權(quán)利要求
1.具有下列特征的蛋白質(zhì)1)在免疫學(xué)刺激存在時能從外周血單核細胞誘導(dǎo)表達，2)無刺激時主要在胸腺表達，且不在脾臟表達，且3)具有CC型趨化因子特征性的相鄰的2個半胱氨酸殘基。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，其中免疫學(xué)刺激是植物血凝素或能誘導(dǎo)體液免疫的刺激。
3.權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)，其中能誘導(dǎo)體液免疫的刺激是以生理濃度存在的選自GM-CSF、IL-3和IL-4的細胞因子。
4.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，在誘導(dǎo)細胞免疫的條件下其表達受到抑制。
5.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，對外周血單核細胞不表現(xiàn)出任何遷移活性。
6.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)，它對表達權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)特異受體的細胞具有遷移活性。
7.權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)，表達特異受體的細胞是表達CCR4的細胞。
8.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其中表達CCR4的細胞選自外周血淋巴細胞和活化的外周血T細胞、Hut78和Hut102。
9.權(quán)利要求7的蛋白質(zhì)，其中表達CCR4的細胞選自T細胞株，Jurkat、MT2和MT4。
10.一種具有序列號1中氨基酸殘基24～94的氨基酸序列的人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)；或者含有前面序列中氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上等同的功能或活性的變異體。
11.一種具有序列號1中氨基酸殘基1-94氨基酸序列的人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)；或者含有前面序列中的氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與這種人CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性的變異體。
12.一種具有序列號2中氨基酸24-94氨基酸序列的小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)；或者含有前面序列中氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性的變異體。
13.一種序列號2中氨基酸殘基1-93氨基酸序列的小鼠CC型趨化因子樣蛋白質(zhì)；或者含有前面序列中的氨基酸或氨基酸序列發(fā)生替換、插入、缺失的序列，且具有與該小鼠CC型，趨化因子樣蛋白質(zhì)基本上同等的功能或活性的變異體。
14.編碼權(quán)利要求1-13中任一項中蛋白質(zhì)或其變異體的DNA。
15.含有權(quán)利要求14中DNA的表達載體。
16.將權(quán)利要求15中的表達載體導(dǎo)入宿主細胞而獲得的轉(zhuǎn)化體。
17.權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)化體，其中宿主細胞為蠶細胞。
18.權(quán)利要求1-13任一項中的蛋白質(zhì)或其變異體的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)化體，并從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
19.含有權(quán)利要求1-13任一項中的蛋白質(zhì)或其變異體的醫(yī)藥組合物。
20.抗權(quán)利要求1-13任一項中的蛋白質(zhì)或其變異體的單克隆抗體。
21.產(chǎn)生權(quán)利要求20中單克隆抗體的雜交瘤細胞。
22.篩選權(quán)利要求1-13任一項中之蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑的方法，包括將推測含有這種激動劑或拮抗劑的樣品與分泌該蛋白質(zhì)的細胞及誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)分泌的細胞因子混合，測定該蛋白質(zhì)的分泌量。
23.篩選權(quán)利要求1-13任一項中之蛋白質(zhì)的激動劑或拮抗劑的方法，包括將推測含有這種激動劑或拮抗劑的樣品與該蛋白質(zhì)特異的受體進行反應(yīng)，測定其結(jié)合活性和/或反應(yīng)性。
全文摘要
分離的新型CC型趨化因子樣蛋白質(zhì),它是在免疫學(xué)刺激物的作用下從外周血單核細胞表達的,具有細胞遷移活性;編碼該蛋白質(zhì)的DNA;含有該DNA的表達載體和轉(zhuǎn)化體;用該轉(zhuǎn)化體制備重組蛋白質(zhì)的方法;和含有該蛋白質(zhì)的醫(yī)藥組合物。
文檔編號C07K14/435GK1202906SQ96198552
公開日1998年12月23日 申請日期1996年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月27日
發(fā)明者今井俊夫, 吉田哲也, 義江修 申請人:鹽野義制藥株式會社