專利名稱：提高光合生物的蛋白質(zhì)水平的結(jié)構(gòu)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)所有的光合生物都是通過(guò)光合作用的捕獲光的反應(yīng)來(lái)提供能量，從而產(chǎn)生重要的生長(zhǎng)和代謝化合物。光合生物產(chǎn)生的富含能量的碳水化合物、脂肪酸、基本氨基酸以及其它的化合物，是所有動(dòng)物賴以生存的食物鏈的基礎(chǔ)。光合生物還是大氣中氧氣的主要來(lái)源，并在該過(guò)程中對(duì)二氧化碳進(jìn)行循環(huán)。因此，地球上的生命依賴的是光合生物，特別是植物。
植物的生產(chǎn)量受到各方面的限制，例如，資源的有限性以及植物對(duì)這些資源的利用能力等。光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能需要復(fù)雜的系統(tǒng)將捕獲光的色素結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合起來(lái)。光能對(duì)植物的價(jià)值只有在其被光合作用有效地轉(zhuǎn)換成化學(xué)能并被送入到各種生物化學(xué)過(guò)程中才可以得到實(shí)現(xiàn)。
負(fù)責(zé)將光轉(zhuǎn)換成化學(xué)能量的光合反應(yīng)的類囊體蛋白質(zhì)器是葉綠體中最為復(fù)雜的機(jī)制，并且仍然是最為難以研究的生物系統(tǒng)之一。釋放氧氣的光合生物，例如，藍(lán)細(xì)菌、藻類和植物，都具有兩套光系統(tǒng)，即PSI和PSII，它們通過(guò)一系列的合作從水中獲取電子并使它們的能級(jí)得到提高從而到達(dá)NADP+。然后，光合成產(chǎn)生的NADPH和ATP就被送到各種生物化學(xué)途徑中。將這些電子推向更高能級(jí)的力量來(lái)自與這兩個(gè)光系統(tǒng)有關(guān)的葉綠素100-300分子所吸收的能量。一對(duì)重要的葉綠素，即在每個(gè)光系統(tǒng)中心的分子調(diào)控著電子的運(yùn)動(dòng)。其余的葉綠素分子與蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)，然后組成獲取光的天線，圍繞著反應(yīng)中心并向其傳送光能[參見(jiàn)Green等人(1991)，TIBS 16181]。
對(duì)光的吸收能力，特別是在陰涼處，主要依賴于類囊體膜上面的光獲取復(fù)合體(Light Harvesting Complex，Lhc)的組成和大小。LhcII光獲取復(fù)合體是葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)(Cab)的重要地方，對(duì)光系統(tǒng)II(PSII)起著天線的作用，并且在為了光合成進(jìn)行的獲取光的過(guò)程中起重要的作用[Kuhlbrandt，W.(1984)Nature 307478]。植物可以根據(jù)可供生長(zhǎng)的光的強(qiáng)度來(lái)調(diào)節(jié)天線的尺寸。在陰涼地方，通過(guò)降低1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rbc或Rubisco)的水平，氮?dú)獾姆峙鋸幕|(zhì)中的多肽轉(zhuǎn)移到類囊體蛋白質(zhì)。氮?dú)獾脑俅畏峙涫菍?duì)低照射的補(bǔ)償反應(yīng)，平衡光吸收及對(duì)二氧化碳的固定[Evans，J.R.(1989)Oecologia 789；Stitt，M.(1991)Plant，Cell and Environment 14741]。
除了將氮?dú)夥峙涞讲煌牡鞍踪|(zhì)中的這種轉(zhuǎn)移之外，光合成生物還可以通過(guò)對(duì)光獲取復(fù)合體的分子重組來(lái)適應(yīng)低光亮的條件[Chowet al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877502；Horton et al.(1994)Plant Physiol. 106415；Melis，(1991)Biochim.Biophys.Acta.105887]。植物對(duì)光特性變化進(jìn)行補(bǔ)償所具有的重組能力決定其生產(chǎn)力。雖然存在著對(duì)低光亮條件的適應(yīng)機(jī)制，但是，由于通過(guò)電子轉(zhuǎn)移來(lái)產(chǎn)生ATP和NADPH的能力有限，所以，在不利光照條件下，植物生長(zhǎng)中的光合成明顯地降低[Dietz，K.J.and Heber，U.(1984)Biochim.Biophys.Acta.767432；ibid(1986)848392]。在這樣的條件下，產(chǎn)生ATP和NADPH的能力，以及吸收力，將決定還原二氧化碳的能力。當(dāng)光源有限時(shí)，植物將其光合成能力調(diào)整到最大；但是，這種適應(yīng)能力是有限的，受到分子參數(shù)的限制，例如，基因表達(dá)，復(fù)合體的組合，以及基質(zhì)和協(xié)作因子的來(lái)源等。
如果要提高植物和其它光合成生物的生產(chǎn)力，就必須要有提高光獲取能力但又不限制二氧化碳固定能力的方法。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供嵌合性基因結(jié)構(gòu)，它包括啟動(dòng)子區(qū)域，含有翻譯促進(jìn)子的5’未翻譯區(qū)，對(duì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA，編碼質(zhì)體蛋白質(zhì)的基因，含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。該結(jié)構(gòu)產(chǎn)生高水平的功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)和對(duì)其功能位點(diǎn)的輸入。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是35S花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)啟動(dòng)子。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子來(lái)自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亞單位的5’未翻譯區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼蛋白質(zhì)的基因是豌豆cab基因，編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)來(lái)自豌豆cab基因。
本發(fā)明還提供了提高光合植物和光合生物的獲取光的能力的方法，包括制備基因結(jié)構(gòu)，它包括啟動(dòng)子，含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)，對(duì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA，編碼質(zhì)體蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)；將該基因結(jié)構(gòu)插入到適宜的克隆載體中；用該重組的載體對(duì)光合植物或其它的光合生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。另外，該基因結(jié)構(gòu)被直接涂敷到生物顆粒中，并用該顆粒直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行攻擊。
本發(fā)明提供DNA結(jié)構(gòu)，其可以提高質(zhì)體中，特別是葉綠體中，或光合原生體細(xì)胞中的一種或多種蛋白質(zhì)的數(shù)量。這些結(jié)構(gòu)可以改變光合成器，提高植物獲取光的能力，特別是在低光照的條件下。
本發(fā)明還提供在植物或其它光合成生物中提高光合作用中對(duì)光的獲取效率以及提高光合成產(chǎn)物(例如糖類)的產(chǎn)量的方法。這些方法可以用于提高植物和種子的商業(yè)價(jià)值，還可以用于提高發(fā)酵和植物組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供含有上述結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物(TR)和轉(zhuǎn)基因光合成生物。這些轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因光合成生物具有被提高了的光合成能力和生長(zhǎng)能力，可以用于提高產(chǎn)量，組織培養(yǎng)，發(fā)酵和再生等方面。與野生型植物(WT)相比，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出了高產(chǎn)，色素增強(qiáng)，糖含量高，生物質(zhì)高，生長(zhǎng)更均勻，果實(shí)更大，莖圍大，光合成強(qiáng)，發(fā)芽快，對(duì)移植的承受力更強(qiáng)等特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了這些植物產(chǎn)生的種子，以及這些植物的局部組織，用于生產(chǎn)再生的植物和其它的副產(chǎn)品。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1A-1B是AB80(豌豆I型LhcIIb基因)(序列號(hào)1)的核苷酸序列，以及由序列號(hào)1所編碼的氨基酸序列(序列號(hào)2)圖2是載體pSSTP的結(jié)構(gòu)圖。
圖3是載體pRBCS-CAB的結(jié)構(gòu)4是載體pCAMV-RBCS-CAB的結(jié)構(gòu)圖。
圖5是土壤桿菌雙連載體(pEND4K-CAMV-RBCS-CAB)的結(jié)構(gòu)圖。
圖6是土壤桿菌雙連載體pEND4K的限制性酶切圖譜。
圖7A-7C表示在轉(zhuǎn)化的和野生型煙草植物中的穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄水平。圖7A表示在原始轉(zhuǎn)化物的T1種子衍生的植物中的轉(zhuǎn)基因mRNA的水平。圖7B表示在選擇的具有高水平可自體交叉和可供分離分析的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的T1植物中的轉(zhuǎn)基因mRNA的水平。所得到的純合子的線被用與圖7A相同的方式檢驗(yàn)。圖7C表示在轉(zhuǎn)化的(TR)和野生型(WT)煙草植物中穩(wěn)定態(tài)Cab蛋白質(zhì)的水平。
圖8A-8C表示野生型和轉(zhuǎn)化煙草植物的生長(zhǎng)和形態(tài)特征(圖8A，分別列在左邊和右邊)。野生型和轉(zhuǎn)化株的各自的第7片完全發(fā)育的葉片被用來(lái)比較它們的尺寸(圖8B)以及橫切面(圖8C)。
圖9是在固體MS介質(zhì)中4天后轉(zhuǎn)基因發(fā)芽(上面一排)和對(duì)照發(fā)芽(下面一排)的比較。
圖10是轉(zhuǎn)基因和對(duì)照野生型煙草愈傷組織在同一時(shí)間的生長(zhǎng)的比較。
圖11是野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉的葉肉組織(左邊)和葉綠體(右邊)的電鏡比較。
圖12是在兩種不同光強(qiáng)下種植的野生型()和轉(zhuǎn)基因(●)植物的光合成氧氣釋放對(duì)光的反應(yīng)曲線。(A)500μmol/m2/s(定為低)，(B)500μmol/m2/s(定為高)。
圖13A-13D表示對(duì)于野生型()和轉(zhuǎn)基因(●)植物的在空氣中的光反應(yīng)曲線，對(duì)qP為圖13A，對(duì)qN為圖13B，對(duì)Fv/Fm為圖13C，對(duì)PSII為圖13D。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在被整合到植物或光合成生物中后，提高質(zhì)體或光合成細(xì)胞的效率。本發(fā)明還涉及通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)和輸入的增強(qiáng)來(lái)提高或改善質(zhì)體代謝的產(chǎn)物的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的植物，種子，植物細(xì)胞和組織，以及其它的結(jié)合有這些DNA結(jié)構(gòu)的光合成生物。
本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)包括啟動(dòng)子，含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)，對(duì)可以增強(qiáng)和引導(dǎo)基因產(chǎn)物到達(dá)質(zhì)體或光合成器的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽進(jìn)行編碼的DNA，編碼質(zhì)體蛋白質(zhì)的基因，含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。插入這種結(jié)構(gòu)，可以提高質(zhì)體和光合成器對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和輸入。這些元件一般都在轉(zhuǎn)錄的從5’到3’方向上作為可以結(jié)合的組成部分而得到提供。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的結(jié)構(gòu)，含有5’組成型啟動(dòng)子(例如，35S花椰菜鑲嵌病毒啟動(dòng)子)，包含由序列號(hào)3的1-29殘基核苷酸序列組成的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亞單位的5’未翻譯區(qū)，對(duì)來(lái)自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亞單位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA，對(duì)葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因，以及含有來(lái)自豌豆cab基因的功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。
這種新基因結(jié)構(gòu)的組成可以同時(shí)達(dá)到高水平的轉(zhuǎn)錄，高水平的翻譯，更好的mRNA穩(wěn)定性和高水平的蛋白質(zhì)對(duì)生物光合成器或質(zhì)體的輸入，從而在植物或其它光合成生物中對(duì)選擇的蛋白質(zhì)(例如，在此為光捕獲Cab蛋白質(zhì))的大量生產(chǎn)。這種多層次的基因結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)蛋白質(zhì)輸入的增強(qiáng)，可以被廣泛地用于提高對(duì)任何蛋白質(zhì)的輸入和表達(dá)。由給出的基因結(jié)構(gòu)所代表的基因結(jié)構(gòu)可以獲得在其功能位點(diǎn)的對(duì)功能性蛋白質(zhì)(葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì))的高水平的輸入和表達(dá)。
光合作用過(guò)程中的許多不同的蛋白質(zhì)和多肽的活性都可以通過(guò)本發(fā)明的方法得到增強(qiáng)。除了提高對(duì)內(nèi)源性蛋白質(zhì)的水平之外，本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)還可以在植物或其它的光合成生物的光合成器中對(duì)外源性蛋白質(zhì)進(jìn)行輸入和表達(dá)。此外，這些DNA結(jié)構(gòu)可以含有一個(gè)信號(hào)蛋白質(zhì)編碼區(qū)，也可以含有另外的編碼區(qū)，從而對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行輸入和表達(dá)。因此，植物和光合成生物細(xì)胞的質(zhì)體可以被修飾以增強(qiáng)光合作用中對(duì)光的捕獲和/或改變光合作用暗反應(yīng)的產(chǎn)物種類或水平。
為了產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合性結(jié)構(gòu)，將對(duì)適宜的Rbcs和I型LhcIIb Cab的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的序列結(jié)合起來(lái)得到有效的嵌合性Rbcs-Cab編碼區(qū)。含有本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因煙草植物可以大量生產(chǎn)LhcIIb的I型Cab并具有增強(qiáng)了的低光強(qiáng)光合成活力和生長(zhǎng)能力。這些轉(zhuǎn)基因植物還表現(xiàn)出在形態(tài)上、發(fā)育上、生物化學(xué)上、或生理上的一種或一種以上的改變。對(duì)農(nóng)作物來(lái)講，這些改變可以增加其商業(yè)價(jià)值，優(yōu)選的是快速發(fā)芽和生長(zhǎng)，高產(chǎn)和改善外觀。通過(guò)本發(fā)明的新的基因結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的輸入和表達(dá)的提高，可以獲得這些所需的改變。通過(guò)將Rbcs-Cab基因結(jié)構(gòu)連接到強(qiáng)力CaMV 35S啟動(dòng)子上，可以促進(jìn)從頭的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。更進(jìn)一步，提高mRNA的穩(wěn)定性，可以提高穩(wěn)定態(tài)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄群體的力度。這是由于引入了cab基因的3’未翻譯的核酸序列以及編碼Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸編碼序列。這兩個(gè)核酸序列都對(duì)提高mRNA穩(wěn)定性起著重要的作用。對(duì)更高水平的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯及合成的獲得是因?yàn)橐肓撕修D(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的Rbcs5’未翻譯序列，從而提高了輸入到質(zhì)體內(nèi)部的蛋白質(zhì)前體的數(shù)量。加入到類囊體膜和LhcIIb復(fù)合體中的Cab水平由于使用了更為有效的轉(zhuǎn)運(yùn)肽而進(jìn)一步得到了提高。將I型LhcIIb Cab轉(zhuǎn)運(yùn)肽替換為1，5-二磷酸核酮糖羧化酶可以提高對(duì)葉綠體的輸入。在葉綠體內(nèi)的I型LhcIIb Cab的含量可以使LhcIIb天線結(jié)合更多的蛋白質(zhì)，結(jié)果是天線的尺寸被增大。任何能夠通過(guò)替代Cab轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)提高葉綠體內(nèi)I型LhcIIb Cab的轉(zhuǎn)運(yùn)肽都可以產(chǎn)生類似的提高效果。通過(guò)使用效率更低的轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)數(shù)量可以得到更低水平的蛋白質(zhì)輸入。本文中給出的實(shí)施例表明由于有Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽的存在，眾多的以質(zhì)體為目標(biāo)的蛋白質(zhì)前體的輸入可以得到提高，并且可能代表著迄今為止被特征化了的最為有效的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子區(qū)”指的是一種DNA序列，通常在結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)的(5’)上游，它通過(guò)對(duì)RNA聚合酶或其它的任何在正確位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄所需的因子提供識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)來(lái)控制編碼區(qū)的表達(dá)。
啟動(dòng)子一般分為兩類，即誘導(dǎo)啟動(dòng)子和組成性啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“組成性啟動(dòng)子”在本文中并不一定指某個(gè)基因在所有類型的細(xì)胞中都以同一水平被表達(dá)，而是指基因可以在眾多種類的細(xì)胞中被表達(dá)，雖然通常都可以察覺(jué)到含量上的不同。
術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)性啟動(dòng)子”是由于對(duì)誘導(dǎo)物反應(yīng)而直接或間接地激活一種或一種以上DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在沒(méi)有誘導(dǎo)物存在時(shí)，該DNA序列或基因?qū)⒉槐晦D(zhuǎn)錄。一般而言，與誘導(dǎo)性啟動(dòng)子特異性結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子(或多個(gè)蛋白質(zhì)因子)是以非活化形式存在的，然后由于誘導(dǎo)物而直接或間接地被轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)試劑，例如，蛋白質(zhì)，代謝物，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，殺草劑和酚類化合物，也可以是由于熱、冷、鹽、或毒性物產(chǎn)生的生理壓力，還可以是病源或致病物如病毒的作用而間接地產(chǎn)生。誘導(dǎo)物還可以是照射劑，例如，光、黑暗、不同的光的方面，例如，波長(zhǎng)、強(qiáng)度、方向和期限。含有誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的植物細(xì)胞可以通過(guò)將誘導(dǎo)物從外部施加而與其發(fā)生接觸，例如噴灑、澆灌、加熱或類似方法。如果需要在植物生長(zhǎng)期間的特定時(shí)間激活基因的表達(dá)，可以在那個(gè)時(shí)候施加誘導(dǎo)物。
這種誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的例子包括熱沖擊啟動(dòng)子，如黑腹果蠅(Drosphilia melanogaster)的誘導(dǎo)性hsp70熱沖擊啟動(dòng)子[Feeling，M.et al.(1985)Ann.Rev.of Genetics 19297-323]；冷誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，如來(lái)自B.napus的冷誘導(dǎo)性啟動(dòng)子[White，T.C.et al.(1994)PlantPhysiol.106917]；以及由乙醇誘導(dǎo)的醇類脫氫酶啟動(dòng)子[Nagao，R.T.et al.，Miflin，B.J.，Ed.Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology，Vol.3，p 384-438，Oxford University Press，Oxford 1986]。
在已知的提供對(duì)組成性基因進(jìn)行表達(dá)的序列中，有與土壤桿菌基因，例如，胭脂堿合成酶基因(Nos)、Mas基因、Ocs基因相關(guān)的調(diào)節(jié)區(qū)，以及對(duì)病毒基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的區(qū)域，例如，花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的35S基因區(qū)和19S基因區(qū)[Brisson et al.(1984)Nature310511-514]，以及TMV的涂敷啟動(dòng)子[Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6307-311]。
其它有用的植物啟動(dòng)子包括在植物的韌皮部和維管部高度表達(dá)的啟動(dòng)子，例如谷氨酰胺合成酶啟動(dòng)子[Edwards et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873459-3463]，玉米蔗糖合成酶1啟動(dòng)子[Yang et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 874144-4148]，來(lái)自Ri質(zhì)粒的TLDNA的Rol-C基因的啟動(dòng)子[Sagaya et al.，Plant Cell Physiol.，3649-653]，以及pRVC-S-3A啟動(dòng)子的韌皮部特異性區(qū)域[Aoyagi etal.，Mol.Gen.Genet.，213179-185(1988)]。另外，植物啟動(dòng)子，例如Rbcs啟動(dòng)子的小亞單位[Coruzzi et al.，EMBO J.，31671-1679(1984)；Broglie et al.，Science，224838-843(1984)]，或熱沖擊啟動(dòng)子，例如大豆HPS17.5-E或HPS17.3-B[Gurley et al.(1989)Mol.Cell.Biol.6559-565(1986)]也可以被使用。
可以用于本發(fā)明的其它的啟動(dòng)子包括低溫和ABA-反應(yīng)性啟動(dòng)子Kinl，cor6.6[Wang et al.(1995)Plant Mol.Biol.28605；Wang and Cutler(1995)Plant Mol.Biol.28619]；來(lái)自麥子EM基因的ABA誘導(dǎo)性啟動(dòng)子[Marcotte Jr.et al.(1989)Plant Cell 1969]；來(lái)自擬南芥的韌皮部特異性蔗糖合成酶啟動(dòng)子ASUS1[Martin et al.，(1993)Plant J.4367]；根和枝的啟動(dòng)子ACS1[Rodrigues-Pousada et al.(1993)PlantCell 5897]；來(lái)自玉米的種子特異性的22kDa的玉米醇溶蛋白質(zhì)啟動(dòng)子[Unger et al.(1993)Plant Cell 5831]；在豌豆中的ps1凝集素啟動(dòng)子[de Pater et al.(1993)Plant Cell 5877]；來(lái)自(Phaseolusvulgaris)的phas啟動(dòng)子[Frisch et al.(1995)Plant J.7503]；晚期胚胎lea啟動(dòng)子[Thomas，T.L.(1993)Plant Cell 51401]；來(lái)自西紅柿的對(duì)水果為特異性的E8基因啟動(dòng)子[Cordes et al.(1989)Plant Cell11025]；對(duì)分生組織為特異性的PCNA啟動(dòng)子[Kosugi et al.(1995)Plant J.7877]；對(duì)花粉為特異性的NTP303啟動(dòng)子[Weterings et al.(1995)Plant J.855]；對(duì)階段為特異性的晚期胚胎發(fā)生OSEM啟動(dòng)子[Hattori et al.(1995)Plant J.7913]；針對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞和莖薄壁組織細(xì)胞為特異性的ADP葡糖焦磷酸酶啟動(dòng)子[Muller-Rober et al.(1994)Plant Cell 6601]；Myb傳導(dǎo)性組織特異性啟動(dòng)子[Wissenbach et al.(1993)Plant J.4411]；以及來(lái)自擬南芥的質(zhì)體藍(lán)素啟動(dòng)子[Vorst et al.(1993)Plant J.4933]。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)中，還包括5’未翻譯前導(dǎo)序列，它起著轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的作用。對(duì)編碼序列的有效翻譯可能需要特異性的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。起始密碼子必須與編碼序列的解讀碼一致才可以保證對(duì)序列的轉(zhuǎn)譯。轉(zhuǎn)譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源不限，可以是天然的或人工的。轉(zhuǎn)譯控制信號(hào)和起始密碼子可以從轉(zhuǎn)錄起始區(qū)來(lái)，也可以從結(jié)構(gòu)基因來(lái)。該序列還可以從選擇用來(lái)表達(dá)基因的啟動(dòng)子衍生而來(lái)，并可以被特異性地修飾來(lái)提高對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)譯。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的例子之一是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的豌豆小亞單位的5’未翻譯區(qū)。作為前導(dǎo)子和5’未翻譯區(qū)而已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)過(guò)的其它表現(xiàn)出轉(zhuǎn)譯功能增強(qiáng)活性的核酸序列有來(lái)自亞鐵素(ferrodoxin)結(jié)合蛋白基因psaDb[Yamamoto et al.(1995)J.BiolChem.27012466]，鐵氧還原蛋白[Dickey et al.(1994)Plant Cell61171]，從西紅柿鑲嵌病毒(TMV)來(lái)的68堿基對(duì)前導(dǎo)子[Gallieet al.(1987)Nucleic Acids Res.153257]，和來(lái)自苜蓿鑲嵌病毒的36堿基對(duì)的前導(dǎo)子[Jobling et al.(1987)Nature 325622]。這些轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子可以在本發(fā)明中替代Rbcs轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子信號(hào)。在大多數(shù)其它的基因中，轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)活力很可能存在于5’未翻譯核酸序列中[參見(jiàn)Gallie的回顧文章1993 Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44，77]。這些核酸序列一旦表現(xiàn)出含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)效應(yīng)，就可以被用于本發(fā)明。表現(xiàn)出適宜的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)效果的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子可以用來(lái)在本發(fā)明的結(jié)構(gòu)中獲得適宜水平的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)還包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)運(yùn)肽”指的是能夠引導(dǎo)胞內(nèi)運(yùn)輸將參與的蛋白質(zhì)送到植物宿主細(xì)胞的質(zhì)體中的肽。被運(yùn)輸?shù)牡鞍踪|(zhì)可以是對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)肽為均質(zhì)的或異質(zhì)的。雖然植物細(xì)胞中很可能含有各種的質(zhì)體，例如，造淀粉粒、有色體、白色體等，但是，最主要的是葉綠體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)肽指的是可以對(duì)葉綠體和其它的質(zhì)體提供胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)肽。在很多情況下，轉(zhuǎn)運(yùn)肽還可以含有進(jìn)一步的質(zhì)體細(xì)胞器內(nèi)針對(duì)功能位點(diǎn)的定靶信息，這些功能位點(diǎn)舉例有胞質(zhì)外膜和胞質(zhì)內(nèi)膜、基質(zhì)、類囊體膜、以及類囊體腔。根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)肽的來(lái)源，前體蛋白可能在重要的行為和輸送活力上，例如在效率上表現(xiàn)出差異。這些在輸送行為上的差異并不是完全由轉(zhuǎn)運(yùn)肽的功能引起的，被運(yùn)送的蛋白質(zhì)也造成一定影響，例如，很可能這兩種蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用也產(chǎn)生影響[Ko and Ko，1992 J.Biol.Chem.267，13910]。在光合成原核生物中，例如在藍(lán)細(xì)菌中，蛋白質(zhì)可以被送到光合成膜或原生質(zhì)膜上，也可以被送到涉及糖的還原和光合成產(chǎn)物形成的生物化學(xué)反應(yīng)途徑中。
捕獲光的葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是富含絲氨酸的，特別是在靠近NH2終端處，其中前13個(gè)氨基酸殘基中的7個(gè)都是絲氨酸。對(duì)來(lái)自豌豆的Rbc的小亞單位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽也在靠近NH2終端處有著豐富的絲氨酸[Cashmore，A.R.，Genetic Engineering ofPlants，Eds.Kosuge，T.et al.(Plenum Press，New York，pp.29-38(1983)]，大豆[Berry-Lowe，S.L.et al.(1982)J.Mol.Appl.Genet.1483-498]，以及Chlamydomonas[Schmidt，G.W.et al.(1998)J.Cell Biol.83615-623)]。捕獲光的葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，以及Rbc的小亞單位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的功能都是特異性地對(duì)貫穿葉綠體被膜的多肽進(jìn)行運(yùn)輸。然而，這些多肽的最終目的地卻是完全不同的，捕獲光的葉綠素a/b蛋白質(zhì)復(fù)合體到達(dá)葉綠體的類囊體的整合膜蛋白，而Rbc小亞單位到達(dá)葉綠體基質(zhì)成為溶解蛋白的成分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)自Rbc小亞單位。在類囊體膜上和在LhcIIb復(fù)合體上加載的Cab水平被用更為有效的異源性轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)進(jìn)一步提高。用1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位來(lái)替代I型LhcIIbCab轉(zhuǎn)運(yùn)肽，提高了運(yùn)送到葉綠體的Cab水平。在葉綠體內(nèi)的I型LhcIIbCab成分的提高，使LhcIIb天線可以和額外的蛋白質(zhì)結(jié)合，結(jié)果是天線的尺寸增大。
對(duì)被轉(zhuǎn)錄和被整合到光合成生物或細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的基因并不受到具體的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將可以明察到其它的色素(例如藻膽蛋白)和色素結(jié)合蛋白(例如類胡蘿卜素結(jié)合蛋白)的編碼基因也可以被用來(lái)提高捕獲光的反應(yīng)效率。很多光合成反應(yīng)都可以被類似地增強(qiáng)。例如，在對(duì)電子運(yùn)輸中涉及的ATP合成酶的亞單位和鐵氧化還原蛋白編碼的基因都可以被整合本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)中來(lái)提高對(duì)電子的運(yùn)輸。另外，對(duì)丙酮酸激酶、乙酰輔酶A羧化酶、和?；d體蛋白進(jìn)行的表達(dá)和運(yùn)輸也可以得到增強(qiáng)，從而擴(kuò)展了生物合成的途徑，例如，擴(kuò)展了碳/脂肪的代謝。
任何對(duì)葉綠素a/b結(jié)合(Cab)蛋白進(jìn)行編碼的基因都可以被選作結(jié)構(gòu)基因。葉綠素a/b結(jié)合蛋白包括四種不同的LhcI，即LhcII的I-III型，CP29，CP26，CP24，和早期光誘導(dǎo)蛋白質(zhì)[Green B.R.(1991)Trends Biochem.Sci.16181-186]。它們包括對(duì)可能屬于復(fù)合體LhcIIa、LhcIIb、LhcIIc、LhcIId、LhcIIe、和任何其它的未被特征化的LhcII亞復(fù)合體的葉綠素a/b結(jié)合蛋白進(jìn)行編碼的基因和cDNA。同樣的基因結(jié)構(gòu)還可以被用于對(duì)LhcI的葉綠素a/b結(jié)合蛋白進(jìn)行編碼的基因和cDNA，包括光合系統(tǒng)I的LhcIa、LhcIb、和LhcIc的葉綠素a/b結(jié)合蛋白。
LhcII是最主要的復(fù)合體，含有的葉綠素a/b結(jié)合蛋白家族中的大多數(shù)的成員，占有大約生物球中葉綠素總量的50％，占有綠色植物中葉綠素b的大多數(shù)。因此，對(duì)LhcII葉綠素a/b結(jié)合蛋白編碼的基因?qū)⑹且蕴岣呷~綠素a/b結(jié)合蛋白數(shù)量為目標(biāo)的優(yōu)選基因。
在迄今為止所檢驗(yàn)過(guò)的植物中，LhcII的葉綠素a/b結(jié)合蛋白都是由多成員基因家族來(lái)編碼的，包括至少5種擬南芥基因，6種煙草基因，8種N.plumbaginifolia基因，以及多至15種的西紅柿基因[Jasson，S.et al.(1992)Plant Mol.Biol.Rep.10242-253]。因此，這些基因中的任何一種都可能適宜于提高葉綠素a/b結(jié)合蛋白的數(shù)量。表1提供了更為全面的編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因的清單，包括那些存在于核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的如Jasson等人在同上的文獻(xiàn)中的表2中所揭示的基因。
表1編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因以及同葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合體的關(guān)系
因?yàn)橐呀?jīng)有眾多的這些類的基因被克隆和序列化了，所以給出下面的文獻(xiàn)作參考。文獻(xiàn)Green et al.1991， Trends Biochem.Sci.16，181.Thornber et al.1991，InChlorophylls.Scheer，H.(ed) CRC Press pp.549-585.Bassi et al.1990，Photochem.Phototbiol.52，1187.Hoffman et al.1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，8844.Jansson & Gustafsson，1991，Mol.Gen.Genet.229，67.Palomares et al.1991，J.Photochem.Photobiol.BBiol.11，151.Ikeuchi et al.1991，Plant Cell Physiol.32，103.Knoetzel et al.1992，Eur.J.Biochem 206，209.Stayton et al.1987，Plant Mol.Biol.10，127.Pichersky et al.1988，Plant Mol.Biol.11，69.Pichersky et al.1989，Plant Mol.Biol.12，257.Schwartz et al.1991a，F(xiàn)EBS Lett.280，229.Zhang et al.1991，Plant Physiol 96，1387.Chitnis and Thornber，1988，Plant Mol.Biol.11，95.Jansson et al.1990，Biochim.Biophys.Acta.1019，110.Green et al.1992，F(xiàn)EBS Lett.305，18.Schwartz et al.1991b，Plant Mol.Biol.17，923.Brandt et al.1992，Plant Mol.Biol.19，699.Bassi & Dainese，1990，InCurrent Research in PhotosynthesisVol II，Baltscheffsky，M.(ed.)pp.209-216.Morishige & Thornber，1991，F(xiàn)EBS Lett.293183.Bassi & Dainese，1992，InRegulation of chloroplast biogenesisArgyroudi-Akoyonoglou，J.(ed.)，pp.511-520.Morishige & Thornber，1992，Plant Physiol.98，238.Henrysson et al.1989，Biochim.Biophys.Acta.977，301.Pichersky et al.1991.，Mol.Gen.Genet.227，227.Sorensen et al.1992，Plant Physiol.98，1538.Schwartz & Pichersky，1990，Plant Mol.Biol.15，157.Morishige et al.1990.FEBS Lett.264，239.Spangfort et al.1990.InCurrent Research in Photosynthesis.Vol II，Baltscheffsky，M.(ed.)pp.253-256.
由ICABPSII編碼的PSII的Cab蛋白質(zhì)是與PSII有關(guān)的捕獲光的主要天線，含有成熟的細(xì)胞質(zhì)中總?cè)~綠素的40-60％[Boardman et al.(1978)Current Topics in Bioenergetics，835-109]。進(jìn)而言之，在PSII內(nèi)，I型和II型的Cab蛋白質(zhì)之間有很高的序列同源性[Pichersky etal.(1989)Plant Mol.Biol.12257]。因此，對(duì)這個(gè)基因的改造將顯著地改變?nèi)~綠素的成分。
可以用于本發(fā)明的編碼a/b結(jié)合蛋白的基因包括a)捕獲光的復(fù)合體I——光系統(tǒng)I，例如Lhca1型，PSI的主要Cab蛋白質(zhì)，例如Lhca1*1[Hoffman et al.(1987)Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 848844]；Lhca2；Lhca3 III型；PSI的主要Cab蛋白質(zhì)，例如Lhca3*1[Pichersky et al.(1989)Plant.Mol.
Biol.12257]；Lhca4；以及b)捕獲光的復(fù)合體II——光系統(tǒng)II，例如Lhcb1；Lhcb2 II型，主要的Cab蛋白質(zhì)，例如Lhcb2*1[Pichersky et al.(1987)PlantMol.Biol.9109]；Lhcb3 III型，主要的Cab蛋白質(zhì)，例如Lhcb3*1[Schwartz et al.(1991)FEBS Lett.280229]；Lhcb4；Lhcb5；以及Lhcb6。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了從豌豆(Pisum sativum)分離出來(lái)的對(duì)光捕獲葉綠素a/b蛋白復(fù)合體的組成多肽編碼的核酸基因(Lhc IIb的I型)[Cashmore，A.R.(1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA812960-2964]。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所選擇的cab基因可以代表剩下的兩種LhcIIb蛋白或其它的LhcIb主要蛋白。因?yàn)檫@兩種蛋白是主要的光捕獲復(fù)合體LhcIIb的組成成分，所以，它們可能在低光條件下起著重要的作用，并且是優(yōu)選的。LhcIb復(fù)合體是光系統(tǒng)I的主要復(fù)合體，其組成包括兩種Cab蛋白質(zhì)，即LhcIb Cab的I型和II型。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步包括3’未翻譯區(qū)。術(shù)語(yǔ)“3’未翻譯區(qū)”指的是基因中的這樣一個(gè)部分，它含有具備多聚腺苷酸化信號(hào)的DNA片段，并且可以含有其它的能夠影響mRNA加工、mRAN穩(wěn)定性、以及基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)。多聚腺苷酸化信號(hào)的一般特征是給3’終端的mRAN前體開(kāi)辟額外的多聚腺苷酸的通道。多聚腺苷酸化信號(hào)一般的識(shí)別是存在有與正宗的5’AATAAA-3’的同源性，雖然各種變化還是比較常見(jiàn)的。
適宜的3’區(qū)的例子有3’轉(zhuǎn)錄的未翻譯區(qū)域，含有土壤桿菌腫瘤引發(fā)(Ti)質(zhì)?；?，例如Nos基因，以及植物基因，例如大豆儲(chǔ)存蛋白基因和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位基因。其它適宜的3’序列可以從任何被特征化的植物或其它生物如動(dòng)物的基因中衍生出來(lái)，只要它們?cè)谵D(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或光合成生物的細(xì)胞環(huán)境下能正常發(fā)揮功能就可以。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，3’未翻譯區(qū)來(lái)自本發(fā)明結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)基因。
當(dāng)在本發(fā)明中談到具體的序列時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些序列包括與其“基本相似”的具體序列。當(dāng)在一定長(zhǎng)度的分子內(nèi)有至少約80％，優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％的核苷酸相互對(duì)應(yīng)時(shí)，就可以說(shuō)它們是“基本相似”的序列。“基本相似”的序列包括經(jīng)過(guò)修飾后，與本發(fā)明的序列相比發(fā)生了替代、消除、和增加了核苷酸的序列，特別是由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并產(chǎn)生的替代并具有相似特征(例如，功能)的序列?；鞠嗨频腄NA序列可以在高度嚴(yán)緊條件和中度嚴(yán)緊條件下用雜交方法來(lái)鑒定和分離，例如，選擇使核酸不發(fā)生非互補(bǔ)序列雜交的條件。雜交的“嚴(yán)緊條件”是本領(lǐng)域的術(shù)語(yǔ)，指的是雜交的溫度和緩沖液的條件，即該條件使兩個(gè)核酸序列雜交時(shí)，其中的一條可以與另一條完全互補(bǔ)，或者兩條核酸雖然不是完全互補(bǔ)，但是有著相當(dāng)程度的互補(bǔ)性?！案叨葒?yán)緊條件”以及“中度嚴(yán)緊條件”對(duì)核酸雜交來(lái)講，都在《現(xiàn)行分子生物學(xué)教程》的第2.10.1-2.10.16頁(yè)和第6.3.1-6頁(yè)中給予了解釋[Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Vol.1，含有截止1995年的第29次補(bǔ)充)]，這些教導(dǎo)都通過(guò)在此引述而合并于本文。
為了幫助對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的鑒定，可以對(duì)本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步的修飾來(lái)包含植物選擇標(biāo)記的編碼基因。可用的選擇標(biāo)記包括提供對(duì)抗生素例如慶大霉素、潮霉素、卡那霉素等抗性的酶。類似地，還可以使用生產(chǎn)可被鑒別的化合物的酶，例如造成顏色改變或熒光的化合物，比如GUS(β-葡糖苷酸酶)，蟲熒光素酶等。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)可以通過(guò)病毒或細(xì)菌的感染來(lái)引入到植物細(xì)胞中，也可以通過(guò)物理或化學(xué)方法直接引入。間接引入(感染方式)和直接引入方法包括Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、微注射、電穿孔等方法。對(duì)這些技術(shù)的回顧文章請(qǐng)參見(jiàn)Weissbach和Weissbach的文章《植物分子生物學(xué)方法》[Weissbach and Weissbach，Methods forPlant Molecular Biology，Academic Press，New York，Section VIII，pp.421-463(1988)]；以及Grierson和Corey的文章《植物分子生物學(xué)》[Grierson and Corey，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Backie，London，Ch.7-9(1988)]。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”在本文中指的是用任何上述方法將基因結(jié)構(gòu)插入到植物細(xì)胞或光合成生物的細(xì)胞中。
從植物細(xì)胞來(lái)再生整株植物的方法是本領(lǐng)域已經(jīng)知道的方法[參見(jiàn)Plant Molecular Biology Manual，Eds.S.G.Gelvin and R.A.Schilperoort，Kluwer Acad.Publishers，Amsterdam(1988 and supplementsthrough 1993)]，獲得被轉(zhuǎn)化的和再生的植物的方法對(duì)本發(fā)明來(lái)講不是十分重要的。一般而言，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中可以含有選擇劑例如抗生素，并用選擇性標(biāo)記物來(lái)幫助鑒別被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一旦愈傷組織形成，可以根據(jù)已知的方法加以適當(dāng)?shù)闹参锛に貋?lái)促進(jìn)苗的生長(zhǎng)，然后，將苗轉(zhuǎn)移到根培養(yǎng)基中來(lái)再生植物。這些植物可以用來(lái)重復(fù)地再生，通過(guò)種子或使用無(wú)性繁殖技術(shù)都可以。
本發(fā)明的另一部分是含有本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)的植物和其它的光合成生物。適宜的植物包括植物綱中的單子葉植物和雙子葉植物，以及裸子植物和低等植物(例如，蕨類，苔蘚)，和地衣植物。優(yōu)選的單子葉植物的例子有稻子、麥子、燕麥和高粱。優(yōu)選的雙子葉植物的例子有豌豆、大豆、葵花、煙草、棉花、甜菜、牽牛、西紅柿、花莖甘藍(lán)、生菜、蘋果、李子、柑橘、檸檬、和玫瑰等。其它的光合成生物也可以被用做本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)的宿主，包括單細(xì)胞的原核生物和多細(xì)胞的藻類，例如，Porphyra sp.，Chondrus crispus，Gigartina sp.，Eucheuma sp.，Laminaria sp.，Macrocystis sp.，Nereocystis leutkeana，Chlamydomonas reinhardtii，Chlamydomonas moewusii，Euglene gracilis，Cryptomonasφ和Ochromonas sinensis。本發(fā)明還包括缺少質(zhì)體但是含有光合成器的原核生物，例如藍(lán)綠藻，以及光合成微球，如Anacystisnidulans，Spirulina sp.，Synechococcus sp.，Rhodobacter sphaeroides，Rhodobacter capsulatus，Chloroflexus aurantiacus，和Heliobacteriumchlorum。本領(lǐng)域的人員都知道，上述的例子都不是限定性的。
根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物可以提供植物的局部來(lái)對(duì)含有本發(fā)明所述的基因結(jié)構(gòu)的細(xì)胞和組織進(jìn)行再生和組織培養(yǎng)。用以達(dá)到這個(gè)目標(biāo)的植物局部包括葉子、莖、根、花、組織、上胚軸、分生組織、下胚軸、子葉、花粉、子房、細(xì)胞、原生質(zhì)，或其它可以用來(lái)再生轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞、原生質(zhì)和組織培養(yǎng)的植物局部。
本發(fā)明還提供轉(zhuǎn)基因植物的種子，它們可以被用來(lái)制備更多含有本發(fā)明基因結(jié)構(gòu)的植物。如果這些后代含有本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)，則不論它們是純種或是與其它的植物交叉繁殖的，都包括在本發(fā)明之中。
本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)提供了對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行基因改造的材料和方法，使它們的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值被明顯提高。農(nóng)業(yè)生物學(xué)技術(shù)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的大部分實(shí)驗(yàn)策略都是對(duì)準(zhǔn)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和使單位面積農(nóng)田獲得最大的回報(bào)。雖然優(yōu)選的方法是提高直接產(chǎn)量，但是，生產(chǎn)率也可以通過(guò)間接的方法得到提高，例如減少投入(如減少使用的肥料和水)，或者減少由于疾病、蟲害和競(jìng)爭(zhēng)造成的損失。這些間接的結(jié)果可以通過(guò)將新的可以降低對(duì)肥料的需求、提供抗病性、排斥有害昆蟲、或忍受除草劑的特征整合到農(nóng)作物中來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)生產(chǎn)率的提高還可以通過(guò)改善植物對(duì)不利環(huán)境因素的適應(yīng)力來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)分子生物學(xué)的方法或雜交還可以將這些特征結(jié)合起來(lái)，獲得對(duì)生產(chǎn)率的進(jìn)一步提高。
大多數(shù)的直接或間接的對(duì)光合成的分子學(xué)改良的結(jié)果都是抑制了光合作用。對(duì)這些研究的回顧可以參見(jiàn)Furbank和Taylor(1995)以及Stitt和Sonnewald(1995)的文章[Furbank and Taylor(1995)PlantCell 7797 and Stitt and Sonnewald(1995)Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.46341]。使用這些方法主要涉及通過(guò)反義轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生了對(duì)光合成有關(guān)途徑的酶的抑制。Ko等人介紹了對(duì)西紅柿的有益功能的改善[Ko et al.(1992)Research in Photosynthesis Vol IIIProceedings ofthe IXth International Congress on Photosynthesis，Ed.N.Murata.KluwerAcademic Press，pp 445-448]。
光捕獲復(fù)合物的結(jié)構(gòu)多樣性和所涉及的Cab蛋白質(zhì)表明，在不同的光捕獲復(fù)合物/蛋白質(zhì)之間的分子關(guān)系是植物對(duì)光條件改變的適應(yīng)力的關(guān)鍵機(jī)制之一。例如，能夠造成對(duì)低光條件的重新安排結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象就很可能是增大光捕獲復(fù)合物來(lái)增大天線的尺寸和表面積來(lái)捕獲更多的光。大的天線可以捕獲更多的光來(lái)用于轉(zhuǎn)換為化學(xué)能。因此，增強(qiáng)植物對(duì)不同光條件而重新安排光捕獲器的反應(yīng)靈活性就可以給植物帶來(lái)有益效果。對(duì)這種靈活性的限制可能歸咎于植物中對(duì)功能性Cab蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的限度；因此，提高Cab蛋白質(zhì)的水平就可以解輕這個(gè)限制。減輕這種分子水平的限制可以造成光合作用和相關(guān)活力及過(guò)程的顯著變化，提高生產(chǎn)率，使農(nóng)作物和產(chǎn)品的市場(chǎng)價(jià)值和常量得到提高。例如，針對(duì)提高光合作用的基因修飾在不論各種環(huán)境條件如光條件所找成造成的極限如何惡劣時(shí)都需要使作物生產(chǎn)有利可圖的情況下就是十分重要的。對(duì)光合作用以及相關(guān)活性的提高還可以通過(guò)對(duì)能量的提供來(lái)產(chǎn)生對(duì)非植物產(chǎn)物，例如健康產(chǎn)物的生產(chǎn)起著重要的影響。這種直接基因修飾方法是多樣化的，無(wú)法以單一經(jīng)濟(jì)價(jià)值來(lái)評(píng)估。這些工作產(chǎn)生的影響可以是巨大的，包括從對(duì)作物生產(chǎn)力的提高直到減少溫室作物生產(chǎn)所需的光的要求而產(chǎn)生的間接節(jié)省。本發(fā)明的技術(shù)不僅對(duì)農(nóng)作物有效，而且還可以使用在園藝植物上，包括室內(nèi)植物、果園植物和裝飾植物。由于對(duì)光合作用過(guò)程的普遍性被提高，本發(fā)明的技術(shù)就非?？赡軐?duì)所有光合成生物和各種植物都適用并帶來(lái)有益效果。除了對(duì)光合作用以及相關(guān)的活性的理解得到更進(jìn)一步的提高之外，本發(fā)明對(duì)農(nóng)作物和園藝學(xué)所帶來(lái)的有益效果主要有以下四個(gè)方面1)改善植物產(chǎn)物的商業(yè)價(jià)值(例如，植物顏色更綠)；2)改善在低光條件下的生產(chǎn)力；3)改善植物密度；以及4)改善產(chǎn)量。
將基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞逼供內(nèi)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整和可繁育的植物的技術(shù)的發(fā)展，提供了對(duì)某些分子學(xué)參數(shù)進(jìn)行修飾來(lái)提高植物在低光條件下的光合作用能力的方法。對(duì)光合系統(tǒng)II的捕獲光的天線的功能性Cab蛋白質(zhì)的增強(qiáng)和產(chǎn)量的提高，可以使植物識(shí)別和捕獲更多的光來(lái)進(jìn)行光合作用。對(duì)光合作用產(chǎn)生正面效果的修飾可以產(chǎn)生新的所需要的特性并對(duì)農(nóng)業(yè)和園藝業(yè)帶來(lái)廣泛的益處。這些在遺傳工程植物中的新的特性可以對(duì)大田作物、溫室植物、以及其它的任何培育形式的植物的帶來(lái)未經(jīng)修飾的常規(guī)植物所不具有的好處。有益的特征還可以通過(guò)傳統(tǒng)培育方法來(lái)提供任何所需的重組植物品系，例如提供優(yōu)良品系，并使其除了具有所需的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)重要的表型之外還帶有新的特征。
特別是，提高質(zhì)體中葉綠素結(jié)合蛋白可以使質(zhì)體中葉綠素的含量更高。顏色更綠的植物在園藝學(xué)上具有更好的商業(yè)價(jià)值，在生產(chǎn)家用和花園用的盆栽植物和室外園藝用植物中都是如此。由于引入本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的對(duì)植物的顏色和生長(zhǎng)的改進(jìn)，就可以在所有的植物中產(chǎn)生更為優(yōu)異的表型，包括草坪、地被植物、花卉、蔬菜、樹木和灌木等。更進(jìn)一步，提高葉綠素的水平還可以使新鮮的和干燥的植物產(chǎn)物在收獲后保持更好的顏色。提高類胡蘿卜素和藻膽蛋白這些色素的水平也可以產(chǎn)生同樣的商業(yè)價(jià)值效果。此外，提高類胡蘿卜素的水平還可以提高食物如胡蘿卜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以及提高植物對(duì)紫外線的有害作用的抵抗。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)了很多其它被改善的性質(zhì)。即便在高光照條件下，轉(zhuǎn)基因植物也比其野生型大。在引入了對(duì)Cab結(jié)合蛋白編碼的基因后，它們都比其野生型植物更綠并且表現(xiàn)了更強(qiáng)壯的生長(zhǎng)。本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)還給植物提供了承受移栽的能力。轉(zhuǎn)基因植物在被移栽后，恢復(fù)的比其野生型更快。
轉(zhuǎn)基因植物的種子比其野生型大，發(fā)芽快，籽苗茁壯。發(fā)芽快的結(jié)果是苗壯根多，使它們不易受危害種子和籽苗的真菌和細(xì)菌的侵害。此外，能夠迅速建立豐富和深度的根系的籽苗具有更好的抗旱能力。因此，轉(zhuǎn)基因的種子和籽苗比其自然型具有更好的商業(yè)價(jià)值。
再者，本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)和方法可以用來(lái)提高莖圍，從而提高對(duì)植株的支持。這對(duì)果實(shí)植物來(lái)講更為重要，比如，西紅柿、梨、蘋果、柑橘、檸檬等。強(qiáng)大和粗壯的莖可以產(chǎn)生能夠承擔(dān)更多果實(shí)的植物。此外，新被移栽的觀賞植物，包括喬木和灌木，由于具有更大的莖圍而都可以在它們發(fā)展出強(qiáng)大的根系之前具有更好的抗風(fēng)能力。
本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞帶來(lái)的各種有益之處都可以通過(guò)將本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)引入到單細(xì)胞光合成生物和植物組織培養(yǎng)物中來(lái)再生。因此，對(duì)于那些不易合成的植物產(chǎn)品，如taxol和其它的只在生長(zhǎng)緩慢的植物和組織培養(yǎng)物中產(chǎn)生的細(xì)胞壁產(chǎn)物等，都可以獲得更快的生產(chǎn)。此外，光合作用的提高和隨之而來(lái)在低光條件下的生長(zhǎng)的提高意味著植物的再生可以被加速，而且對(duì)組織培養(yǎng)和植物生長(zhǎng)所要求的光照可以被降低。
事實(shí)上，本發(fā)明中所描述的對(duì)光照需求的降低，可以使植物生產(chǎn)在低光照條件下更為經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行，比如，在窯洞中(目前使用在花卉生產(chǎn)中)或在更為嚴(yán)密的頂棚下進(jìn)行。更為高深的技術(shù)應(yīng)用是在宇航所用的生命支持系統(tǒng)中。航天局需要提高光合作用生物的生長(zhǎng)，降低這些生物對(duì)光的需求可以使這樣的系統(tǒng)更容易制造和使用，并且價(jià)格更為經(jīng)濟(jì)。
本發(fā)明的特別有用的實(shí)施例之一是生產(chǎn)各種耐陰草坪。這些種類的耐陰草坪可以種植在現(xiàn)有草坪無(wú)法生長(zhǎng)的地方，例如，草坪中被樹陰遮擋的部分和室內(nèi)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)等因?yàn)楣庹盏南拗贫坏貌皇褂萌嗽觳萜旱牡胤?。由于人造草坪給運(yùn)動(dòng)員帶來(lái)的傷害，橄欖球聯(lián)盟現(xiàn)在正在將室外的人造草坪改變?yōu)榛畈莶萜?。然而，室?nèi)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的光照條件受到更強(qiáng)的限制，活草無(wú)法在這些運(yùn)動(dòng)場(chǎng)上生長(zhǎng)，除非有更為耐陰的品種出現(xiàn)。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的基因結(jié)構(gòu)可以被用來(lái)生產(chǎn)植物生長(zhǎng)形式更為統(tǒng)一和均勻的植物。由于轉(zhuǎn)基因植物的各部分對(duì)可用光的利用更為有效，所以它們?cè)跍厥覂?nèi)和大田中都比其野生型品種生長(zhǎng)的更為統(tǒng)一和均勻。這個(gè)特點(diǎn)經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)更為有益，例如，玉米、大豆等，因?yàn)樗鼈兊牡臀槐酬幦~片可以更好地生長(zhǎng)，生產(chǎn)更多的生物質(zhì)，不僅有利于果實(shí)的產(chǎn)量，而且可以抑制野草的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的DNA結(jié)構(gòu)可以被用做植物轉(zhuǎn)化的標(biāo)記，即根據(jù)顏色的不同，對(duì)陰涼/低光照條件的反應(yīng)，生長(zhǎng)和/或成熟的速度，特別是在低光照條件下等來(lái)鑒別轉(zhuǎn)化植物。使用天然植物的DNA序列，可以探察在光合成細(xì)胞和生物中整合的外源性DNA，并可以避免使用外源的選擇性標(biāo)記物帶來(lái)的調(diào)節(jié)上的麻煩。特別是，它提供了對(duì)轉(zhuǎn)化植物、植物組織、或光合成生物的檢測(cè)方法，該方法包括，制備含有啟動(dòng)子區(qū)、含轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)、質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽、對(duì)表達(dá)可被探察的質(zhì)體蛋白進(jìn)行編碼的基因、含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)的DNA結(jié)構(gòu)；將該DNA結(jié)構(gòu)插入到克隆載體中；用該克隆載體對(duì)植物、組織培養(yǎng)物或光合成生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)，其中對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)是轉(zhuǎn)化的標(biāo)志。優(yōu)選的是，相對(duì)于野生型的質(zhì)體和細(xì)胞而言，對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)和蛋白質(zhì)對(duì)質(zhì)體或細(xì)胞光合成器的輸入都得到了提高。
被表達(dá)的標(biāo)記基因可以產(chǎn)生供目測(cè)的反應(yīng)，即產(chǎn)生相對(duì)于不表達(dá)選擇性標(biāo)記基因的植物或光合成細(xì)胞為獨(dú)特的外觀和生長(zhǎng)形式，使得它們可以區(qū)分于其它的植物、植物局部、光合成生物的細(xì)胞等，達(dá)到鑒定的目的。這種特征性的表型(例如，細(xì)胞的顏色更綠)，可以用來(lái)鑒定含有該結(jié)構(gòu)的原生質(zhì)、細(xì)胞、細(xì)胞群、組織、器官、植物局部、或整株植物。使用例如熒光活化細(xì)胞分離技術(shù)(FACS)可以對(duì)細(xì)胞中的綠色素驚醒測(cè)定和篩選[參見(jiàn)Galbraith，D.W.(1990)Methods CellBiol.33547-547]。如果該結(jié)構(gòu)中還加入了第二個(gè)基因，則對(duì)標(biāo)記表型的測(cè)定就可以選擇含有與標(biāo)記基因相連的第二個(gè)基因的細(xì)胞。第二個(gè)基因一般包括所需的表型并在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不是容易被鑒別的，但是，當(dāng)植物細(xì)胞或其衍生物生長(zhǎng)并成熟時(shí)則存在著，甚至在選擇性標(biāo)記表型本身并不明顯的條件下也是存在著的。
下述實(shí)施例描述了本發(fā)明的具體方面，用以反應(yīng)本發(fā)明，并描述了提供本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的方法和鑒別它們?cè)谏矬w中的功能的方法。這些實(shí)施例不應(yīng)該被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的任何的具體限制。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例實(shí)施例1體外翻譯和蛋白質(zhì)輸入的分析制備各種基因的融合，它們都顯示Rbcs5’未翻譯區(qū)(5’UTR)和Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽分別具有在鑲嵌基因結(jié)構(gòu)中更高級(jí)別的翻譯和運(yùn)輸。這些體外運(yùn)輸和翻譯的數(shù)據(jù)都總結(jié)于表2。在很多情況下，Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽對(duì)進(jìn)入葉綠體中的被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有更高水平的運(yùn)輸。Rbcs基因的5’URT的提高翻譯的效果在體外麥胚翻譯體統(tǒng)中被證實(shí)。這些數(shù)據(jù)表明Rbcs基因的5’URT是所定義的翻譯增強(qiáng)子。
對(duì)蛋白質(zhì)運(yùn)輸和相關(guān)方面如效率的分析使用了體外放射性標(biāo)記蛋白和體外運(yùn)輸檢測(cè)來(lái)完成的。放射性標(biāo)記的蛋白是從相應(yīng)的DNA模板通過(guò)轉(zhuǎn)錄還合成的，并在表2中給予描述。所有描述的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒都在大腸桿菌HB101或JM101-109品系中繁殖。各種細(xì)菌系都使用常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化[參見(jiàn)Molecular CloningA Laboratory Manual，Sambrook et al.1989，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY]。使用常規(guī)的技術(shù)將質(zhì)粒DNA從載有該質(zhì)粒的細(xì)菌系中分離出來(lái)[參見(jiàn)Sambrook et al，1989，同上]。含有不同融合的各種轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒(表2)都對(duì)基因融合DNA模板的3’端的適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)進(jìn)行線性化。根據(jù)使用的各種酶的供應(yīng)商的說(shuō)明來(lái)安排限制性酶解的緩沖液和反應(yīng)條件。對(duì)基因融合模板的建立、插入和繁殖，都可以在各種可購(gòu)買到的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中進(jìn)行，例如，pBLUESCRIPT系列(Stratagene的產(chǎn)品)、pBS系列(Stratagene的產(chǎn)品)、pGEM和pSP系列(Promega的產(chǎn)品)、以及pT7/T3系列(Pharmacia的產(chǎn)品)等。轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒通常含有進(jìn)行克隆操作的多個(gè)克隆區(qū)，以及至少一個(gè)病毒RNA聚合酶啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是T7、T3或SP6等，并使用相應(yīng)的RNA聚合酶。
對(duì)每毫克DNA加入5-10單位的限制性酶，用水將反應(yīng)混合物調(diào)整到最終體積。最終體積一般為200微升，含有10微克的質(zhì)粒DNA。充分混合后，在適宜的溫度下反應(yīng)1-3小時(shí)。使用苯酚和氯仿∶異戊醇萃取對(duì)酶解后的模板再次提純，離心(通常在離心管中進(jìn)行)，含有酶解的DNA的水相用2體積的100％乙醇并有0.3M乙酸鈉存在和pH7.0的條件下沉淀濃縮。使用的苯酚用0.1M Tris-HCl pH8.0加0.1％(w/v)羥基喹啉預(yù)先飽和化。氯仿∶異戊醇由24體積的氯仿和1體積的異戊醇組成。在每一步有機(jī)溶劑的萃取中，反應(yīng)混合物水液的體積與苯酚或氯仿∶異戊醇的體積相等。離心收取DNA沉淀，用70％(v/v)乙醇洗一次，干燥，再溶于20微升水中，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。
在體外對(duì)模板的轉(zhuǎn)錄是根據(jù)Melton等人的方法[參見(jiàn)Melton et al.(1984)Nucl.Acids Res.127035]用相應(yīng)于啟動(dòng)子的RNA聚合酶來(lái)進(jìn)行。反應(yīng)中加入未甲基化的cab類似物(GpppG)，濃度一般為0.5mM(Pharmacia的產(chǎn)品)。典型的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(總體積為200微升)通常含有DNA模板(5微升)，RNA聚合酶(40單位的SP6、T3或T7)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液(最終濃度為40mM Tris-HCl pH7.5，6mM MgCl2，2mM亞精氨，10mM NaCl)，二硫蘇糖醇(DTT，5mM)，40單位RNA酶抑制物，0.25mM的ATP、GTP、CTP或UTP。使用苯酚和氯仿∶異戊醇萃取對(duì)酶解后的模板再次提純，離心，含有RNA轉(zhuǎn)錄本的水相用750微升的100％乙醇并有0.3M乙酸鉀存在和pH7.0的條件下沉淀濃縮。轉(zhuǎn)錄本(反應(yīng)得到330微升)經(jīng)過(guò)在乙醇中離心后濃縮，用70％(v/v)乙醇/水清洗，干燥，再溶于34微升的含有20-40單位RNA酶抑制物的水中。此外，轉(zhuǎn)錄本的沉淀物可以在-70℃下保藏直至使用。
然后，該轉(zhuǎn)錄本在小麥胚提取系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)譯，該系統(tǒng)含有35S-放射性標(biāo)記的甲硫氨酸(New England Nuclear的產(chǎn)品或Amersham的產(chǎn)品)或TRAN35S-標(biāo)記(ICN)，后者同時(shí)含有放射性標(biāo)記的甲硫氨酸和半胱氨酸。小麥胚提取系統(tǒng)按照Erickson和Blobel在1983年所述的方法進(jìn)行[參見(jiàn)Erickson and Blobel(1983)Methods in Enzymol.9638]，稍有修改。具體是將3克的未經(jīng)炒熟的小麥胚(購(gòu)買自General Mill，Inc.，Minneapolis，MN)在研缽中研碎，研磨時(shí)要有液氮冷卻，直至得到細(xì)碎粉末為止。將得到的小麥胚細(xì)碎粉末轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)預(yù)冷過(guò)的研缽中，在有12毫升均化緩沖液(100mM乙酸鉀，40mM Hepes-KOHpH7.6，4mM DTT，2mM CaCl2，1mM乙酸鎂)存在的條件下繼續(xù)研磨直至化合物成為均勻的稠漿為止。然后將該勻漿物轉(zhuǎn)移到30毫升的Corex管中，在4℃以31,000xg離心10分鐘。收取上清液并在15毫升的Corex管中以相同條件再次離心10分鐘。最終的上清液被小心地取出并測(cè)定其體積(一般為8-9毫升)。對(duì)交聯(lián)葡聚糖G-25精細(xì)柱(Pharmacia的產(chǎn)品，2.5×20cm)用蒸煮法消毒，然后加載上述的上清液。該柱內(nèi)含有20克(柱內(nèi)體積為2.5×18cm)的交聯(lián)葡聚糖G-25精細(xì)顆粒，這些顆粒用冷的無(wú)菌水預(yù)先浸泡過(guò)夜并用柱緩沖液(100mM乙酸鉀，40mM Hepes-KOH pH7.6，4mM DTT，5mM乙酸鎂)在使用前平衡。用柱緩沖液以1-1.5毫升/分的速率對(duì)小麥胚提取物洗脫，在前導(dǎo)的棕色帶移動(dòng)到柱子的下三分之二的時(shí)候開(kāi)始收集各個(gè)組分。用分光光度計(jì)讀取在280nm處的吸收來(lái)監(jiān)測(cè)每個(gè)組分中蛋白質(zhì)的含量。第一個(gè)峰區(qū)內(nèi)的各個(gè)組分被合并起來(lái)并混合。用液氮將該洗脫峰的等份試樣快速冷凍，然后在-70℃保藏直至使用。典型的轉(zhuǎn)譯反應(yīng)包括從330微升的乙醇沉淀來(lái)的轉(zhuǎn)錄本，溶于34微升的水中，并含有20-40單位的RNA酶抑制物、5-6mM ATP、0.4mM GTP、64mM磷酸肌酸、0.08-0.09mM的每種氨基酸，只是不加入甲硫氨酸或甲硫氨酸及半胱氨酸，具體根據(jù)使用的35S標(biāo)記的氨基酸來(lái)決定，此外，還含有4-8單位的磷酸肌酸酶，補(bǔ)償緩沖液(最終濃度為100mM乙酸鉀，pH7.0，2mM DTT，0.3mM乙酸鎂，0.8mM亞精胺)以及小麥胚提取物(在200微升的反應(yīng)中加入80微升)。在轉(zhuǎn)譯中使用的放射性標(biāo)記的氨基酸的數(shù)量，根據(jù)放射性標(biāo)記的甲硫氨酸的數(shù)量和每次反應(yīng)不超過(guò)200微居而決定。轉(zhuǎn)譯反應(yīng)在26-27℃進(jìn)行1.5小時(shí)，在進(jìn)行運(yùn)輸檢測(cè)和其它的相關(guān)實(shí)驗(yàn)之前，先用SDS聚酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和熒光自顯影對(duì)轉(zhuǎn)譯的產(chǎn)物進(jìn)行分析。對(duì)每個(gè)轉(zhuǎn)譯反應(yīng)的1微升的樣品計(jì)數(shù)其TCA-可沉淀的放射性來(lái)確定被結(jié)合的放射性標(biāo)記的數(shù)量。
在運(yùn)輸測(cè)定中使用的完整的葉綠體是按照Bartlett等人[參見(jiàn)Bartlett et al.(1982)Methods in Chloroplast Molecular Biology，(eds.Edelman et al.)pp.1081-1091]或Cline等人[Cline et al.(1985)J.Biol.Chem.2603691]所描述的方法從豌豆籽苗中提純出來(lái)的。其生長(zhǎng)條件如前所述[Ko and Cashmore(1989)EMBO J.83187]。從200克種子發(fā)出的籽苗在生長(zhǎng)箱內(nèi)發(fā)育9-11天，溫度為21℃，熒光燈照射，光照與黑暗的比率為16小時(shí)比8小時(shí)。豌豆籽苗在收獲之后，在冷的研磨緩沖液中[50mM Hepes-KOH pH7.6，0.33M山梨醇，0.05％(w/v)小牛血清(BSA)，0.1％(w/v)抗壞血酸，1mM MgCl2，1mMMnCl2，2mM Na2EDTA]進(jìn)行2-3次每次1-10秒的攪碎，Polytron勻漿器設(shè)定在第5-6檔位。各步驟都在大約4℃的溫度下進(jìn)行。勻漿產(chǎn)物用三層的Miracloth濾布過(guò)濾，在4℃下以2,800xg離心3分鐘收集粗原生質(zhì)。粗原生質(zhì)的沉淀重懸浮于4毫升的研磨緩沖液中，然后分層在10-80％Percoll梯度上[50mM Hepes-KOH pH7.6，0.33M山梨醇，0.05％(w/v)BSA，0.1％(w/v)抗壞血酸，0.15％(w/v)聚乙二醇，0.05％(w/v)Ficoll，0.02％(w/v)谷胱甘肽，1mM MgCl2，1mM MnCl2，2mM Na2EDTA以及Percoll]。對(duì)該梯度以10,000xg在4℃離心10分鐘，收集在梯度靠下方的完整的葉綠體帶，用1x HS緩沖液(50mMHepes-KOH pH8.0，0.33M山梨醇)稀釋至少5倍。以4,350xg離心2分鐘收集完整的質(zhì)粒。重復(fù)這個(gè)步驟，葉綠體沉淀重懸浮于1x HS。最后的沉淀重懸浮與5毫升的1x HS中，選取等份試樣用于葉綠素分析。葉綠素分析按照Arnon的方法進(jìn)行[參見(jiàn)Arnon(1949)Plant Physiol.24∶1]。樣品用80％(v/v)丙酮/20％水提取。用離心機(jī)高速離心1分鐘去除不溶性物質(zhì)。取出上清液，根據(jù)Arnon的轉(zhuǎn)換公式對(duì)葉綠素進(jìn)行分光光度分析。
體外運(yùn)輸檢測(cè)是按照Bartlett等人[參見(jiàn)Bartlett et al.(1982)Methods in Chloroplast Molecular Biology，eds.Edelman et al.，pp.1081-1091]所述的方法在0.3毫升的體積中進(jìn)行的。該反應(yīng)通常都含有相當(dāng)于100微克葉綠素的葉綠體；35S-放射性標(biāo)記的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物并調(diào)整到1x HS，10mM甲硫氨酸，10mM半胱氨酸(當(dāng)使用TRAN35S-標(biāo)記物時(shí))，以及運(yùn)輸緩沖液(1x HS)。在室溫和熒光燈照射下將樣品輕輕搖動(dòng)30分鐘。運(yùn)輸檢測(cè)還可以用加入外源性ATP來(lái)替代光驅(qū)動(dòng)的ATP合成而進(jìn)行。通常，加入的ATP的兩在1mM-3mM之間。完整的葉綠體被再次分離出來(lái)用于進(jìn)一步的處理和按照Smeekens等人所述的方法進(jìn)行更細(xì)的分離[參見(jiàn)Smeekens et al.(1986)Cell 46365]。反應(yīng)完成后，運(yùn)輸檢測(cè)中的葉綠體以686xg離心3分鐘收集，重懸浮于500微升的1x HS中，用嗜熱菌蛋白酶處理(終濃度為3微克/微升)，在40％Percoll墊護(hù)下以1,940xg離心分鐘進(jìn)行再次分離。在離心管底部收集到的完整的葉綠體重懸浮于500微升的1x HS中，以686xg離心3分鐘清洗一次，在重懸浮于50微升的溶液A中(0.1M Na2CO3，0.1M β-巰基乙醇)。從按照上述的方法進(jìn)行的運(yùn)輸反應(yīng)中對(duì)葉綠體檢測(cè)的反應(yīng)物中各取5微升樣品。葉綠素成分被用來(lái)使樣品正?；缓蠹虞d到蛋白質(zhì)凝膠上。然后，對(duì)重懸浮的葉綠體沉淀加入30微升的溶液B[5％(w/v)SDS，30％(w/v)蔗糖，0.1％(w/v)溴酚藍(lán)]煮沸30秒來(lái)準(zhǔn)備進(jìn)行SDS-PAGE。對(duì)體外小麥胚轉(zhuǎn)譯和各種運(yùn)輸反應(yīng)的等份試樣使用適宜的百分密度的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分析[參見(jiàn)Laemmli，(1970)Nature 22780]。電泳完成后，使用ENHANCETM(New EnglandNuclear的產(chǎn)品)并根據(jù)廠商的說(shuō)明對(duì)凝膠進(jìn)行處理，然后對(duì)KodakXARTMX-光底片曝光來(lái)進(jìn)行熒光自顯影。對(duì)運(yùn)輸?shù)乃胶捅贿\(yùn)輸物的分配用LKB ULTRASCAN XL激光光密度計(jì)從熒光顯影片上進(jìn)行計(jì)算。蛋白質(zhì)融合的結(jié)果總結(jié)于表2中。
表2對(duì)各種構(gòu)造的體外運(yùn)輸和轉(zhuǎn)譯結(jié)果的總結(jié)A)植物
B)試管分析
表2(續(xù)表
1豌豆2豌豆3擬南芥4蕓苔Brassica napus5菠菜Spinacea oleracea6蠶豆Vicia faba7鼠8蓖麻Ricinus cummunis9煙草Nicotiana tabacum
實(shí)施例2Rbcs-Cab基因結(jié)構(gòu)的制備為了產(chǎn)生具有通過(guò)提高I型LhcIIB Cab蛋白水平而增強(qiáng)了低光條件下光合成能力的轉(zhuǎn)基因煙草植物，進(jìn)行了對(duì)轉(zhuǎn)錄本、mRNA能力、轉(zhuǎn)譯和蛋白輸入的增強(qiáng)?；蚪Y(jié)構(gòu)的編碼部分是一個(gè)DNA序列(圖1，序列號(hào)1)的融合，編碼來(lái)自豌豆的I型LhcIIb Cab蛋白(圖1，序列號(hào)2)的成熟部分。該序列中相對(duì)于天然轉(zhuǎn)運(yùn)肽的部分被去除，并用編碼來(lái)自豌豆Rbcs的小亞單位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的部分取代[參見(jiàn)A.R.Cashmore，in Genetic Engineering of Plants，T.Kosugi，C.P.Meredith，A.Hollaender，Eds.(Plenum Press，New York，1983)pp.29-38]。在該基因結(jié)構(gòu)中使用的I型LhcIIb cab基因序列的5’和3’終端在圖1中給出。表3中給出了Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽(序列號(hào)4)和相應(yīng)的基因序列(序列號(hào)3)，有一個(gè)短的連接序列將轉(zhuǎn)運(yùn)肽和Cab肽連接起來(lái)。在緊靠豌豆Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼區(qū)上游的地方產(chǎn)生的一個(gè)29個(gè)堿基對(duì)的5’未翻譯DNA序列(5’UTR)被用做轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子。該序列在表3中給出，包含在序列號(hào)3的序列中(核苷酸1-29號(hào))。對(duì)基因結(jié)構(gòu)的表達(dá)由強(qiáng)CaMV35S啟動(dòng)子促進(jìn)[參見(jiàn)Odell，J.T.et al.(1985)Nature 313810]，而且轉(zhuǎn)譯終止信號(hào)從豌豆Cab基因中產(chǎn)生[參見(jiàn)A.R.Cashmore(1984)ProcNatl.Acad.Sci.USA 812960]。對(duì)該基因結(jié)構(gòu)總結(jié)于表3中。
表335SCAMV-Rbcs-Cab基因結(jié)構(gòu)的總結(jié)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)部分Rbcs(5’未翻譯序列)-豌豆Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽-豌豆Cab蛋白體關(guān)鍵部分的被公開(kāi)了的遺傳名稱SS3.6(5’未翻譯序列)-SS3.6 Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽-AB80 Cab蛋白體關(guān)鍵部分的序列ACGTTGCAATTCATACAGAAGTGAGAAAA ATG GCT TCT ATG ATA TCCM A S M I STCT TCC GCT GTG ACA ACA GTC AGC CGT GCC TCT AGG GGG CAA TCC GCCS S A V T T V S R A S R G N S AAAG AAG GTC AAC ACT GAC ATT ACT TCC ATT ACA AGC AAT GGT GGAK K V Q T E I T S I T S Q G GAGA GTA AAG TGC ATG GAT CCT GTA GAG AAG TCT ......R V K C M D P L E K SRbcs←→Cab啟動(dòng)子35S CaMV終止子Cab終止序列[參見(jiàn)Cashmore(1984)Proc.Nat.Acad.Sci，USA 812960-2964]雙連載體EcoRI-PvuII CAMV-Rbcs-Cab進(jìn)入pEND4K(抗卡那霉素)的平整末端BamHI/blunt[參見(jiàn)Klee et al.(1985)Biotechnology3637-642]。土壤桿菌LBA4404土壤桿菌的轉(zhuǎn)化凍-融方法[參見(jiàn)Holster et al.(1978)Mol.Gen Genet.163181-187。轉(zhuǎn)化程序葉子圓片程序[參見(jiàn)Horsch et al.(1985)Science 2271229-1231]。
克隆由建造pSSTP載體開(kāi)始，該載體含有對(duì)Rbcs 5’UTR和轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA序列(圖2)。用HindIII內(nèi)切酶將含有所需成分的DNA從質(zhì)粒pSSNPT中取出[參見(jiàn)A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA]。在按照實(shí)施例1所述的每一步DNA操作后，用苯酚和氯仿∶異戊醇提取，在有0.1M NaCl存在的條件下進(jìn)行乙醇沉淀，并用70％的乙醇清洗，目的是對(duì)酶滅活并濃縮DNA。離心收集DNA沉淀，干燥，重新溶于10毫升水中。用大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段(Promega的產(chǎn)品)將HindIII終端平整化。該反應(yīng)含有1單位的Klenow片段，dATP、dCTP、dGTP、和dTTP各0.1mM，50mM Tris-HCl pH7.5，10mM MgCl2，5mM DTT，和從上述步驟獲得的DNA，在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。用有機(jī)溶劑萃取重新提純后，DNA用BamHI酶切，將所需的DNA片段從質(zhì)粒pSSNPT的其它的部分中分離出來(lái)。對(duì)HindIII-BamHI DNA用凝膠提純并連接到pGEM4(Promega的產(chǎn)品)的SmaI和BamHI位點(diǎn)，這些位點(diǎn)預(yù)先經(jīng)過(guò)酶切并用小牛腸堿磷酸酶(Pharmacia的產(chǎn)品)脫磷酸。對(duì)DNA的提純使用的是標(biāo)準(zhǔn)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠和苯酚萃取方法(Sambrook et al.1989，同上)。低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自BRL(Gaithersburg，MD，USA)。將DNA從相應(yīng)的低熔點(diǎn)瓊脂糖中回收出來(lái)，使用預(yù)熱至37℃的苯酚，然后加熱到65℃，離心。重復(fù)苯酚萃取，將DNA水相調(diào)整到0.1M NaCl中，離心10分鐘。對(duì)上清液按如上所述的方法用氯仿∶異戊醇萃取，然后用乙醇沉淀。DNA沉淀物用離心收集，用70％乙醇清洗，干燥，重懸浮于水中。
成熟的I型LhcIIb Cab編碼DNA序列(豌豆AB80)含在Xbal-Pstl DNA片段中，用Xbal和Pstl(圖3)對(duì)質(zhì)粒pDX80[參見(jiàn)A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA]酶切將其提取出來(lái)。該DNA片段再用凝膠提純，并通過(guò)Xbal和Pstl位點(diǎn)將其插入到質(zhì)粒載體pSSTP(圖2)中。連接之前，加入0.5單位的小牛腸堿磷酸酶，用3.5微升1M Tris-HCl，pH8.0調(diào)整酶切反應(yīng)，對(duì)這些位點(diǎn)脫磷酸。在37℃培養(yǎng)30分鐘后，脫磷酸的載體進(jìn)行有機(jī)溶劑萃取和乙醇沉淀。得到的質(zhì)粒被命名為pRBCS-CAB(圖3)。
來(lái)自質(zhì)粒pCAMV的帶有35S CaMV啟動(dòng)子的經(jīng)過(guò)凝膠提純的EcoRI-HindIII片段[參見(jiàn)A.R.Cashmore，Univ.Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA]被插入到pRBCS-CAB(圖4)的EcoRI-Asp718位點(diǎn)使Rbcs-Cab鑲嵌基因與35S CaMV組成啟動(dòng)子進(jìn)行融合。用DNA聚合酶I的Klenow片段對(duì)相應(yīng)的HindIII和Asp718限制性位點(diǎn)進(jìn)行末端平整化。然后將35S CaMV-Rbcs-Cab結(jié)構(gòu)作為EcoRI-PvuII DNA片段轉(zhuǎn)移到雙連載體pEND4K的BamHI位點(diǎn)(圖5和6)[參見(jiàn)Klee，H.et al.(1985)Biotechnology 3637]。限制性酶造成的所有末端都用Klenow片段在此步驟中平整化。
所有的連接步驟都是在15℃用T4 DNA連接酶過(guò)夜完成。連接反應(yīng)中包括兩種適宜的靶標(biāo)DNA分子，連接酶緩沖液(50mM Tris-HClpH7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，1mM ATP)，以及1-3單位的酶?；驑?gòu)件過(guò)程中任何適宜的步驟都被使用標(biāo)準(zhǔn)CaCl2細(xì)菌轉(zhuǎn)化程序[參見(jiàn)Sambrook et al.1989，同上]和大腸桿菌HB101引入到細(xì)菌中。所有重組的質(zhì)粒都在HB101細(xì)菌中繁殖，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離(參見(jiàn)Sambrook et al.1989，同上)。使用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和聚酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)DNA片段進(jìn)行分辨。
實(shí)施例3對(duì)植物的轉(zhuǎn)化和選擇使用凍-融方法將pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab質(zhì)粒引入到土壤桿菌中[參見(jiàn)Holsters et al.(1978)Mol.Gen.Genet.163181-187]。制取感受態(tài)LBA4404細(xì)胞，即用500微升過(guò)夜培養(yǎng)物接種50毫升LB肉汁(50微克/毫升)，然后在28℃搖動(dòng)培養(yǎng)，直到在650nm的光密度讀數(shù)為0.7OD為止。在4℃以2000xg離心5分鐘收獲細(xì)胞，用冰冷0.1M CaCl2清洗，并重懸浮于1毫升冰冷20mM CaCl2中。感受態(tài)LBA4404細(xì)胞的150微升等份試樣與1微克的質(zhì)粒DNA在離心管中混合，然后立即用液氮冷凍。這些細(xì)胞在37℃的水浴中或在恒溫箱中培養(yǎng)5分鐘，加入1毫升LB肉汁培養(yǎng)基，將這個(gè)混合物在28℃搖動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)。以2000xg離心5分鐘回收細(xì)胞，重懸浮于100微升LB肉汁培養(yǎng)基。將細(xì)胞加到含有100微克/微升卡那霉素和50微克/毫升利福霉素的LB培養(yǎng)盤上，在28℃培養(yǎng)2天。從一個(gè)抗卡那霉素的菌落中得到的質(zhì)粒用Southern印跡分析證實(shí)了pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab質(zhì)粒的存在。含有50微克/毫升利福霉素和100微克/毫升卡那霉素的YEB肉汁培養(yǎng)基3毫升用抗卡那霉素菌落接種，并在28℃搖振培養(yǎng)過(guò)夜。對(duì)1.5毫升的過(guò)夜培養(yǎng)物離心30秒。細(xì)胞重懸浮于1.0毫升的GTE溶液(50mM葡萄糖，10mM Na2EDTA，25mM Tris-HCl pH8.0)和4毫克毫升的溶菌酶中，在室溫下培養(yǎng)10分鐘。加入預(yù)先用2體積1％(w/v)SDS，0.2N NaOH平衡過(guò)的苯酚30微升?；旌衔镙p緩渦旋直至發(fā)粘，室溫下培養(yǎng)10分鐘。溶解的細(xì)胞用3M乙酸鈉、pH4.8(150微升)中和，在-20℃培養(yǎng)15分鐘，然后將混合物離心3分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入2體積的乙醇，混合物在-80℃培養(yǎng)15分鐘來(lái)對(duì)DNA沉淀。離心后，DNA沉淀重懸浮于90微升的水中。加入10微升pH為7.0的3M乙酸鈉，再加入等體積的苯酚/氯仿，對(duì)混合物進(jìn)行渦旋。在離心管中離心5分鐘后，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入2體積100％乙醇對(duì)DAN沉淀。離心后，沉淀用70％乙醇清洗，干燥，重懸浮在50微升的TE(10mM Tris-HCl pH8.0，1mMNa2EDTA)中。
在土壤桿菌中的pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab質(zhì)粒的完整性，從對(duì)上述分離的質(zhì)粒的酶解和Southern印跡分析得到證實(shí)，并與Sambrook等人在1989年的上面引述的文章相符。一個(gè)被篩選出來(lái)的含有完整pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab的土壤桿菌菌落被用來(lái)對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
按照基本如Horsch等人[參見(jiàn)Horsch et al.(1985)Science2271229]所述的葉子圓片轉(zhuǎn)化程序，用質(zhì)粒pEND4K-CAMV-Rbcs-Cab對(duì)煙草植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。僅僅使用生長(zhǎng)了一個(gè)月的植物的3-7英寸長(zhǎng)的沒(méi)有完全伸展的嫩葉。對(duì)剪切下來(lái)的葉子的表面用10％(v/v)次氯酸鈉，0.1％(v/v)Tween消毒，用無(wú)菌去離子水洗4次。從這一步以后，對(duì)材料和基質(zhì)都采用標(biāo)準(zhǔn)的消毒技術(shù)處理。直徑6毫米的葉子圓片用無(wú)菌紙打孔制備，在含有pEND4K-CaMV-Rbcs-Cab結(jié)構(gòu)的土壤桿菌的過(guò)夜培養(yǎng)物按1∶5稀釋的液體中培養(yǎng)10-20分鐘。接種后，用無(wú)菌濾紙輕沾來(lái)去除多余的細(xì)菌，將葉子圓片轉(zhuǎn)移到含有“根培養(yǎng)基”的培養(yǎng)皿中[參見(jiàn)Horsch et al.(1988)in Plant Molecular Biology Manual，(Eds.S.B.Gelvin，R.A.Schilperoort)Kluwer Acad.Publishers，A51-9]。用石蠟密封培養(yǎng)皿，放在生長(zhǎng)箱中培養(yǎng)(24℃，并配以“生長(zhǎng)”混合式熒光燈管)。兩天后，在葉子圓片上生長(zhǎng)的土壤桿菌用含在液體“根培養(yǎng)基”中的500毫克/毫升的頭孢氨噻殺死，葉子圓片被轉(zhuǎn)移到含有500毫克/毫升的頭孢氨噻和100毫克/毫升卡那霉素的新鮮“根培養(yǎng)基”中，對(duì)轉(zhuǎn)化的煙草植物的生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。
葉子圓片在上述的條件下培養(yǎng)3-5周，每周轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中。在此期間，從60個(gè)葉子圓片中生長(zhǎng)出大約40棵綠苗，將它們切下來(lái)并轉(zhuǎn)移到含有100微克/毫升卡那霉素的“根培養(yǎng)基”中[參見(jiàn)Horschet al.(1988)同上]。在有卡那霉素存在的條件下長(zhǎng)根的苗被確認(rèn)具有高水平的NptII活性[參見(jiàn)McDonnell，R.E.et al.(1987)Plant Mol.Riol.Rep.5380]并被移植到土壤中。選擇的轉(zhuǎn)化株進(jìn)行自花受精并收集種子。7個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草品系顯示了高水平的NptII活性，它們的T1種子被在低光照條件(50-100μmol/m2/s)下繁殖，從而確定哪個(gè)品系具有高水平的穩(wěn)定態(tài)的轉(zhuǎn)基因mRNA。
同樣的結(jié)構(gòu)被引入到另外的2個(gè)擬南芥品系、3個(gè)蕓苔品系、西紅柿、生菜和苜蓿中。所有這些品系都顯示了比其野生型更高的生長(zhǎng)，特別是在低光照條件下更是如此。這些植物具有更好的陰涼回避反應(yīng)。它們比其野生型生長(zhǎng)快，長(zhǎng)得大，對(duì)光的追求能力強(qiáng)。在65μmol/m2/s的光照強(qiáng)度下生長(zhǎng)的西紅柿和生菜，以及在5μmol/m2/s光照條件下生長(zhǎng)的擬南芥都證實(shí)了這些結(jié)果。
實(shí)施例4RNA分析對(duì)全部RNA的分離以及隨后的印跡雜交分析的方法參見(jiàn)A.R.Cashmore等人所述[A.R.Cashmore，1982 in Method in ChloroplastMolecular Biology，M.Edelman，R.B.Hallick，N.H.Chua，Eds.(ElsevierBiomedical Press，pp.533-542)and Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.，andSambrook，J.，Molecular CloningA Laboratory Manual，(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982)]。對(duì)每一個(gè)主要轉(zhuǎn)化物，從它們的20株T1植物中分離全部RNA。在1100a.m.和100p.m.之間采集葉子樣品。用甲醛變性凝膠溶解RNA，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上，方法參見(jiàn)Sambrook等人1989的文章，出處同上。對(duì)RNA印跡(圖7A)用豌豆Cab DNA探針(記為探針1)檢測(cè)，剝離，再與豌豆Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽-特異性DNA探針(記為探針2)雜化。1-7號(hào)表明原始轉(zhuǎn)化體含有RbcS-Cab轉(zhuǎn)基因并且顯示高水平的NptII活性。7-12號(hào)植物代表著用對(duì)照豌豆Cab結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的植物。13號(hào)植物代表野生型未轉(zhuǎn)化的煙草植物(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)。由豌豆Cab DNA探針檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄水平被標(biāo)準(zhǔn)化，并用激光密度計(jì)定量。3號(hào)和5號(hào)轉(zhuǎn)化品系的植物的豌豆cab mRNA含量最小，而品系1、2和7的含量最高。用豌豆Rbcs轉(zhuǎn)運(yùn)肽-特異性DNA探針得到的結(jié)果一樣(圖7A)。從野生型植物得到的全部RNA不與任何一種DNA探針雜化。
從具有最高的觀察到的轉(zhuǎn)基因mRAN水平的品系的T1個(gè)體植物進(jìn)行自花授粉并進(jìn)行分離分析。對(duì)后代純合品系的轉(zhuǎn)基因mRNA水平的分析與對(duì)原始轉(zhuǎn)基因品系的一樣(圖7B)。在濕的濾紙上以24℃的溫度使種子發(fā)芽，轉(zhuǎn)移到含有按1∶1混合的土壤和蛭石的混合物的盆穴中，放入生長(zhǎng)箱內(nèi)，光照為50-100μmol/m2/s，14小時(shí)光照，10小時(shí)黑暗，光照時(shí)的溫度為24℃，黑暗時(shí)的溫度為18℃。每日澆水，使用的是含有10mM硝酸鹽和2mM銨的完全營(yíng)養(yǎng)溶液。有幾個(gè)后代純合品系顯示了高水平的轉(zhuǎn)基因mRAN，并且表現(xiàn)了相應(yīng)的表型。
實(shí)施例5蛋白質(zhì)和葉綠素分析從轉(zhuǎn)基因2號(hào)品系衍生的純合品系的類囊體蛋白質(zhì)的情況與野生型進(jìn)行比較，確定額外的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄可以造成穩(wěn)定態(tài)Cab水平的總體提高。從原始轉(zhuǎn)化2號(hào)品系(TR)衍生的純合轉(zhuǎn)基因品系和野生型植物(WT)各取9片葉子圓片樣品。樣品的采集時(shí)間是上午1100到下午100之間。分離類囊體[參見(jiàn)K.E.Steinback，et al.in Methods inChloroplast Molecular Biology，M.Edelman，R.B.Hallick，N.H.Chua，Eds.(Elsevier Biomedical Press，Amsterdam，1982)pp.863-872；Vernon，L.P.(1960)Anal.Chem.321144]，用標(biāo)準(zhǔn)免疫印跡技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。對(duì)Cab/Oeel的比率用激光密度計(jì)由相應(yīng)的免疫印跡帶確定。標(biāo)記相應(yīng)于Oeel的和Cab的帶。對(duì)總體Cab蛋白質(zhì)水平的提高，用抗PSII氧氣制造復(fù)合物(Oeel)的33kDa蛋白質(zhì)的抗體和抗Cab的抗體同時(shí)對(duì)印跡檢測(cè)來(lái)確定(圖7C)。Cab與Oeel的比率被用來(lái)確定Cab相對(duì)PSII單位的水平，利用Oeel作為PSII水平的內(nèi)部標(biāo)記。密度計(jì)的結(jié)果表明，Cab蛋白質(zhì)相對(duì)于Oeel來(lái)說(shuō)被提高了2-3倍，說(shuō)明對(duì)每單位的PSII有了更多的Cab蛋白質(zhì)。當(dāng)LhcII復(fù)合物被分離后，對(duì)葉綠素成分的平行提高是明顯的[參見(jiàn)K.E.Steinback，(1982)同上；L.P.Vernon(1960)同上]。每克鮮重的葉子中回收的葉綠素增加了1.5倍，LhcII復(fù)合物增加了2-3倍，表明額外的Cab蛋白質(zhì)發(fā)揮了結(jié)合葉綠素的功能。
實(shí)施例6形態(tài)學(xué)和發(fā)育分析轉(zhuǎn)基因植物，不論是原始轉(zhuǎn)基因植物還是自花授粉的后代純合品系，都在各種實(shí)驗(yàn)條件下顯示了與野生型不同的生長(zhǎng)和外型差異，例如，在溫室或生長(zhǎng)箱中都是如此。所有的植物都是處于同樣的發(fā)育階段，并且按照前述進(jìn)行繁殖。轉(zhuǎn)基因植物在低光照條件下顯示了更高水平的生長(zhǎng)(50-80μmol/m2/s)(圖8A)。
轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高光照的反應(yīng)得到了增強(qiáng)。它們產(chǎn)生更多的生物質(zhì)，生長(zhǎng)形式更迅猛，取決于繁殖期間的光照強(qiáng)度。在高光照條件下，例如在溫室中，轉(zhuǎn)基因植物比其野生型長(zhǎng)的大。另外，轉(zhuǎn)基因植物與其野生型相比，莖圍更大，生長(zhǎng)形式的差異小。進(jìn)而言之，大田實(shí)驗(yàn)表明，在田間的全日照條件下，轉(zhuǎn)基因植物在生物質(zhì)和尺寸上與野生型植物一樣好。在這樣的條件下，轉(zhuǎn)基因植物沒(méi)有任何有害現(xiàn)象。
對(duì)Cab的提高，引起了一系列的變化，最突出的是葉片寬大和平整，葉子邊緣連續(xù)，生物質(zhì)量高，花期晚。除了葉子整體增大以外，葉柄的基部也比野生型的寬(比較了轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物的第七片完全發(fā)育的葉子)(圖8B)。轉(zhuǎn)基因植物的葉片厚，并且胞間隙大(圖8C)。光顯微照相(圖8C)顯示了葉片中部的樣品情況。葉子的切片用FAA50固定，并用光顯微照相檢查[參見(jiàn)D.A.Johansen，PlantMicrotechnique，(McGraw-Hill Book Co.，New York，1940)]。
選擇葉子樣品如上所述進(jìn)行，用2.5％戊二醛緩沖液、0.1％磷酸緩沖液(pH7.5)固定，固定后，用1％四氧化鋨處理2小時(shí)。在乙醇系列中脫水后，將葉子樣品放入Spurr樹脂中，切片后，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色[參見(jiàn)Spurr，A.R.(1969)J.Ultrastr.Res.2631；Reynolds，E.S.(1963)J.Cell Biol.17208；Watson，M.L.(1958)J.Biophys.Biochem.Cytol.4475]。在野生型和轉(zhuǎn)基因植物的葉肉組織的照相中使用的是相同的標(biāo)尺。以每個(gè)細(xì)胞為基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)基因植物的葉子細(xì)胞含有的葉綠體數(shù)量高，并且質(zhì)體大，具有相當(dāng)?shù)膱A形(圖11)。在所用的方法中，沒(méi)有顯示出質(zhì)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，例如類囊體的堆積等的差異。對(duì)線粒體、液泡和細(xì)胞核來(lái)說(shuō)，任何水平的方法都沒(méi)有顯示出差異。
轉(zhuǎn)基因植物的種子發(fā)芽率與野生型的極為不同。在固體培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因種子平均比野生型早1-3天(圖9)，而且新冒出的轉(zhuǎn)基因籽苗已經(jīng)是綠色的，出芽后，生長(zhǎng)比野生型快。野生型的籽苗冒出的時(shí)候是黃色的，1天后才變成綠色。含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的愈傷組織比含有野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)快2-3倍(圖10)。
轉(zhuǎn)基因植物移栽后，比野生型植物的承受力強(qiáng)?；謴?fù)快，更快地進(jìn)入正常生長(zhǎng)形式。
實(shí)施例7生理學(xué)和生物化學(xué)分析提高Cab蛋白質(zhì)對(duì)光合成活性以及功能的影響按照下述四項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了評(píng)定1)氣體交換特征；2)代謝水平的改變；3)糖含量；以及4)PSII電子轉(zhuǎn)運(yùn)效率。
對(duì)在有限光照條件下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物和野生型植物的光合成率進(jìn)行了比較。植物是在兩種不同的光強(qiáng)度下培養(yǎng)的，50μmol/m2/s[即低光照，(圖12A)]，和500μmol/m2/s[即高光照，(圖12B)]。在25℃飽和的5％二氧化碳條件下，用葉子圓片氧氣電極(LD2/2Hansatech，UK)對(duì)光合成進(jìn)行了測(cè)定。由在葉子圓片電極的基部氈墊中的200微升的2M KHCO3/K2CO3混合物(pH9.3)提供5％CO2[參見(jiàn)Walker，D.A.(1987)The use of the oxgen electrode and fluorescenceprobes in simple measurements of photosynthesis，University of Sheffield，Sheffield，U.K.]。光照由Novomat 515 AF幻燈機(jī)提供(Braun，Germany)。數(shù)據(jù)表示每個(gè)表型的5株植物的結(jié)果。平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。
轉(zhuǎn)基因植物的光合成反應(yīng)曲線表現(xiàn)出與野生型不同的特性(圖12A)。在低光照(20-100μmol/m2/s)下，轉(zhuǎn)基因植物展現(xiàn)出比野生型植物更高的光合成率；而在高光照條件下的結(jié)果相反(圖12A)。隨著光照強(qiáng)度的提高，反應(yīng)曲線逐漸趨于接近，在大約300μmol/m2/s處交叉，即轉(zhuǎn)基因組織到達(dá)的飽和的速率低。在相同的光照條件下，野生型組織的光合成提高的大并且沒(méi)有達(dá)到飽和。野生型組織的飽和發(fā)生在大約450μmol/m2/s處。
在更高的光照條件下(500μmol/m2/s)，植物表現(xiàn)出了相同的反應(yīng)(圖12B)。在20-500μmol/m2/s的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因組織的提高率比野生型的大，在更高的光強(qiáng)度處達(dá)到飽和，而野生型在1000μmol/m2/s處仍未達(dá)到飽和。轉(zhuǎn)基因組織的低光照光合成能力的提高被空氣中二氧化碳水平證實(shí)，并且在100μmol/m2/s的光強(qiáng)度下也得到證實(shí)，轉(zhuǎn)基因組織顯示的平均光合成率比野生型高50％(分別為3.3±0.8vs.2.2±0.8 O2/m2/s)。
代謝物和腺苷酸水平的改變也是光合成能力變化的指標(biāo)。在低光照條件下，光合成的能力主要受到轉(zhuǎn)運(yùn)電子產(chǎn)生ATP和NADPH的能力的限制，即同化力FA[參見(jiàn)Heber，U.et al.(1986)Biochim.Biophys.Acta 852144；Heber et al.，in Progress in Photosynthesis Research，J.Biggins，Ed.，(Martinus Nijhoff，Dordrecht)Vol.3(1987)pp.293-299]。同化力FA的強(qiáng)度可以由PGA(3-磷酸甘油酸)對(duì)TP(磷酸丙糖)的比率來(lái)估算[參見(jiàn)Dietz，K.J.and Heber，U.(1984)Biochim.Biophys.Acta.767432，ibid 848392(1986)]。進(jìn)行測(cè)定的光強(qiáng)度是100-1000μmol/m2/s，850微巴的外部二氧化碳濃度，使光呼吸限制為最小(表4)。當(dāng)光合成到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，將葉子冷凍破碎，準(zhǔn)備進(jìn)行代謝物的提取。轉(zhuǎn)基因葉子在100μmol/m2/s時(shí)的二氧化碳同化率比野生型葉子高53％。PGA葉子的水平在轉(zhuǎn)基因葉子和野生型葉子之間，但是，轉(zhuǎn)基因的磷酸丙糖的含量高33％。因此，PGA/TP比率在野生型中高，表明在野生型植物中依靠提供ATP和NATP來(lái)使PGA轉(zhuǎn)化為TP的能力受到了限制。腺苷酸的變化表明，在轉(zhuǎn)基因葉子中觀察到的APT含量是野生型葉子的兩倍，而ADP的含量在這兩種植物中相似。在葉綠體中ATP/ADP的比率比細(xì)胞溶質(zhì)的低，一般計(jì)算結(jié)果為1.5-3.0之間[參見(jiàn)Stitt，M.et al.(1 982)Plant Physiol.70971；Giersch，C.et al.(1980)Biochim.Biophys Acta.59059；Neuhaus，N.E.and Stitt，M.(1989)Planta 17951]。隨著光強(qiáng)度的增加，該比率進(jìn)一步降低(Dietz andHeber，同上)。ATP/ADP的比率在轉(zhuǎn)基因植物中高于野生型植物(分別為2.2和0.8)。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植物在低光照條件下的產(chǎn)生ATP的能力得到了提高，導(dǎo)致PGA還原的增強(qiáng)，以及光合成率的提高。
還觀察到了磷酸己糖含量的改變，野生型的植物比轉(zhuǎn)基因植物的磷酸己糖的含量高。G6P/F6P比率是磷酸己糖在細(xì)胞中分布的指標(biāo)，比率值為1-2則表示葉綠體分室化作用并主要合成淀粉，比率值為3-5則表示胞質(zhì)的分布并主要合成蔗糖[參見(jiàn)Gerhardt，R.et al.(1987)PlantPhysiol.83399]。因此，低光照下野生型和轉(zhuǎn)基因植物的G6P/F6P比率值低表明對(duì)碳的固定主要產(chǎn)生淀粉。
光吸收能力的提高，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物在高光照條件下的光合成代謝有副作用。此時(shí)，野生型植物的光合成率比轉(zhuǎn)基因植物高37％。代謝物水平和比率的改變表明在轉(zhuǎn)基因植物中發(fā)生了光合成調(diào)節(jié)機(jī)制的重要變化，補(bǔ)償在高光照條件下光吸收能力的增強(qiáng)。兩種植物的PGA/TP比率相等，ATP/ADP比率在轉(zhuǎn)基因植物中比較低，這些都說(shuō)明光磷酸化作用限制了光合成。有G6P/F6P比率提高指明的分配上的改變(對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因型分別為2.9和3.9)，表明在轉(zhuǎn)基因植物中蔗糖的合成被提高了，為的是補(bǔ)償對(duì)無(wú)機(jī)磷(Pi)的需求的增加。轉(zhuǎn)基因植物顯得在高光照條件下通過(guò)蔗糖合成循環(huán)無(wú)機(jī)磷的效率比較低。
表4在50μmol/m2/s光照下生長(zhǎng)的植物的光合作用及代謝物含量100μmol/m2/s 代謝率代謝物含量 (mol/mol)(nmol/mg葉綠體)
光合成活性的改變反映在糖的含量上。在兩種光照條件(50和500μmol/m2/s)下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因和野生型植物的嫩葉子中的淀粉和蔗糖的含量相對(duì)平衡，沒(méi)有明顯的分配變化(表5A)。蔗糖和淀粉的生產(chǎn)量相等，只是轉(zhuǎn)基因植物中糖的總量比野生型的高2-3倍。開(kāi)始于低光照然后轉(zhuǎn)為高光照條件下從種子發(fā)育出的植物，轉(zhuǎn)基因植物的淀粉含量比野生型的高2倍。對(duì)于嫩葉，光的改變似乎對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型植物的總糖量沒(méi)有影響。
完全發(fā)育的野生型植物的葉子具有類似的情況(表5B)，淀粉和蔗糖的水平基本平衡，并與光無(wú)關(guān)。然而，總糖量比嫩葉高。在相同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)基因植物的葉子對(duì)兩種光照的反應(yīng)不同，淀粉和蔗糖生產(chǎn)的水平發(fā)生變化。低光照時(shí)，蔗糖的水平高，而高光照時(shí)，淀粉含量高。在高光照時(shí)，雖然總糖量的提高在轉(zhuǎn)基因和野生型植物葉子中都得到提高，但是，轉(zhuǎn)基因植物葉子的總糖量比野生型高49％。
表5在嫩葉和全發(fā)育葉子中的糖含量(A)在嫩葉中的淀粉和糖含量。數(shù)據(jù)是4株植物±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
淀粉 蔗糖 總糖量植物類型 μmol己糖等當(dāng)量·mg-1Ch1在光照為50μmol/m2/s下的植物野生型 0.6±0.2 0.8±0.1 1.4±0.3轉(zhuǎn)基因 1.3±0.2 1.6±0.4 3.0±0.6在光照為500μmol/m2/s 下的植物野生型 0.6±0.3 0.4±0.1 1.0±0.4轉(zhuǎn)基因 1.8±0.5 1.4±0.4 3.2±0.9
表5(續(xù)表)(B)在完全發(fā)育葉中的淀粉和糖含量。數(shù)據(jù)是6株植物±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
淀粉 蔗糖 總糖量植物類型 μmol己糖等當(dāng)量·mg-1Ch1在光照為50μmol/m2/s下的植物野生型 1.2±0.4 1.8±1.2 3.0±1.6轉(zhuǎn)基因 1.2±0.5 2.1±1.4 3.3±1.9在光照為500μmol/m2/s下的植物野生型 4.1±1.9 3.8±1.9 7.9±3.8轉(zhuǎn)基因 7.0±2.8 4.8±1.8 11.8±4.6對(duì)葉子用HClO4提出后，用分光光度儀對(duì)可溶性糖進(jìn)行分析。對(duì)淀粉的測(cè)定是將不溶性葉子提取物用0.5M MES-HCl(pH 4.5)洗，重懸浮在0.5毫升的相同緩沖液中，用淀粉酶(4單位/毫升)-淀粉葡糖酶(14單位/毫升)酶解。離心后，對(duì)上清液進(jìn)行葡萄糖分析(參見(jiàn)Jones，M.G.K.et al.(1977)Plant Physiol.60379)。
圖13給出了光反應(yīng)曲線，qP(圖13A)、qN(圖13B)、Fv/Fm(圖13C)、φPSII(圖13D)，是在發(fā)芽后生長(zhǎng)了6-8周的野生型和轉(zhuǎn)基因植物的空氣中測(cè)定的。每種表型的植物各測(cè)定4株。平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5％。葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定是用的脈沖放大調(diào)節(jié)熒光儀(PAM101，Heinz Walz，Effeltrich，Germany)。F0(黑暗下底物的熒光)用適應(yīng)黑暗(30-60分鐘)的葉子測(cè)量，光源為弱調(diào)節(jié)測(cè)量光(大約1μmol/m2/s)，由葉室下方窗戶處安裝的光纖維探測(cè)器提供(大約距離葉子5毫米)，同時(shí)收集熒光信號(hào)。為了測(cè)定最大熒光(Fm)，使用飽和脈沖光(7500μmol/m2/s)，由PAM103控制開(kāi)關(guān)提供，每隔30秒發(fā)出1秒的光。穩(wěn)定態(tài)熒光(Fs)用有光化的燈照射后測(cè)定。光化學(xué)(qP)和非光化學(xué)的(qN)抑制參數(shù)根據(jù)Schreiber等人的方法進(jìn)行確定[參見(jiàn)Schreiber et al.(1986)Photosynth，Res.1051]。通過(guò)PSIIφPSII的電子流的光子效率由qP產(chǎn)物和打開(kāi)的PSII反應(yīng)中心(Fv/Fm)的激發(fā)捕獲的效率決定[參見(jiàn)Genty et al.(1989)Biochim.Biophys.Acta.99087]。
對(duì)不同光照由額外的Cab蛋白質(zhì)通過(guò)PSII(φPSII)對(duì)電子轉(zhuǎn)運(yùn)的效率的影響的測(cè)定，是由測(cè)定在φPSII穩(wěn)定態(tài)光合作用時(shí)的葉綠素?zé)晒馓卣鱗參見(jiàn)Genty，et al.(1989)同上]而決定的(圖13)。測(cè)定用的植物是在低光照(50μmol/m2/s)條件下培養(yǎng)的。隨著光照的增強(qiáng)，φPSII相應(yīng)降低(圖13D)，在轉(zhuǎn)基因植物中的降低就比較小。隨著光照強(qiáng)度的增加，開(kāi)放PSII反應(yīng)中心(Fv/Fm)的光子效率也降低；但是，轉(zhuǎn)基因植物在100-600μmol/m2/s時(shí)的表現(xiàn)則不同(圖13C)。在轉(zhuǎn)基因植物中Fv/Fm的降低在這個(gè)光強(qiáng)范圍內(nèi)比野生型小，而在這個(gè)范圍之上，則變的與野生型更近似。φPSII的效率可由Fv/Fm的產(chǎn)物和光化學(xué)對(duì)葉綠素?zé)晒?qP)的抑制來(lái)確定。qP值反映主要接受器QA的氧化態(tài)[參見(jiàn)Schreiber，U.et al.(1986)同上]。隨著光強(qiáng)度的增加也觀察到了qP值的降低(圖13A)。轉(zhuǎn)基因植物保持著比野生型更為顯著的氧化態(tài)，除了在高光照時(shí)之外。葉綠素?zé)晒鈹?shù)據(jù)也指出將轉(zhuǎn)基因植物暴露于高光照并不導(dǎo)致光抑制，因?yàn)镕v/Fm比率在轉(zhuǎn)基因和野生型植物中是相似的。
在100-600μmol/m2/s時(shí)，非光化學(xué)的抑制(qN)在野生型植物中更高(圖13B)。明顯的是，在轉(zhuǎn)基因植物中，對(duì)PSII功能的調(diào)節(jié)受到光吸收的能力提高的影響。在轉(zhuǎn)基因植物中由PSII進(jìn)行的低光電子運(yùn)輸?shù)牧鲃?dòng)效率比較高，看起來(lái)可以主要?dú)w因于較高的Fv/Fm和較低的qN。相反，在光強(qiáng)度大于600μmol/m2/s時(shí)的轉(zhuǎn)基因植物中，光化學(xué)抑制(qP)就成為決定較高的PSII(φPSII)的主要因素。
這些數(shù)據(jù)表明，通過(guò)遺傳操作提高I型LhcIIb Cab蛋白質(zhì)的水平，對(duì)植物產(chǎn)生了明顯和重要的影響。LhcII被認(rèn)為對(duì)去往PSII的吸收的激發(fā)能量起著關(guān)鍵的作用。通常，用來(lái)還原二氧化碳的ATP和NADPH的產(chǎn)生所需要的電子運(yùn)輸?shù)哪芰υ诘凸庹諚l件下限制了光合作用；但是，提高Cab蛋白質(zhì)水平可以使轉(zhuǎn)基因植物通過(guò)在低光照條件下的電子運(yùn)輸系統(tǒng)而獲得更多的能量。LhcIIb Cab蛋白質(zhì)的提高還對(duì)還原產(chǎn)物和光合作用的激發(fā)壓力有貢獻(xiàn)。
轉(zhuǎn)基因植物的較高的光合成能力獨(dú)立于耕作的光參數(shù)。在低光照和中光照條件生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出的光合成能力類似于低光照時(shí)的光合成能力，在飽和的及在大氣水平的二氧化碳條件下表現(xiàn)的光反應(yīng)曲線的較大的起始斜率證明了這一點(diǎn)(圖12和13)。這就意味著由代謝物比率反映的較高的ATP和NADPH生產(chǎn)能力在穩(wěn)定態(tài)光合作用中發(fā)生了變化。在轉(zhuǎn)基因植物中的較低的PGA/TP比率和較高的ATP/ADP比率表明，提高Cab蛋白質(zhì)導(dǎo)致ATP合成的提高，從而增強(qiáng)了PGA的還原。葉綠素?zé)晒鈪?shù)也表示轉(zhuǎn)基因植物的電子運(yùn)輸更為有效。開(kāi)放的PSII中心捕獲的激發(fā)能量的效率(Fv/Fm比率)在500μmol/m2/s光照條件下的轉(zhuǎn)基因植物中比較高，與野生型植物相比，非光化學(xué)的抑制(qP)有相關(guān)的降低。對(duì)捕獲光的能力的提高與葉子的解剖學(xué)上的變化有關(guān)，例如，增大了胞間隙，這就可能有助于二氧化碳向葉綠體的擴(kuò)散，導(dǎo)致更高速率的光合作用和糖的合成。
在本文中所有給出的引述的文獻(xiàn)和資料都合并于本發(fā)明。等同物本領(lǐng)域的技術(shù)人員人將知道或者通過(guò)不多的例行試驗(yàn)就能確定許多與本文介紹的具體實(shí)施方案等價(jià)的方案。這些方案和其他等價(jià)方案都在本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括(a)啟動(dòng)子；(b)含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)；(c)對(duì)提高蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA；(d)對(duì)質(zhì)體蛋白質(zhì)編碼的基因；以及(e)含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的結(jié)構(gòu)，在整合到植物細(xì)胞或光合生物的細(xì)胞中時(shí)，使這些植物細(xì)胞或光合生物細(xì)胞的光合作用或質(zhì)體功能比它們的在相同條件下的野生型細(xì)胞的高。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述啟動(dòng)子區(qū)是組成啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述的組成啟動(dòng)子是35S花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子是對(duì)1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位的5’未翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子具有與序列號(hào)3的第1-29殘基基本相似的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽來(lái)自1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽具有與序列號(hào)3的第30-215殘基基本相似的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的基因編碼色素或色素結(jié)合蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的基因編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的基因編碼選自Lhcal、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5、和Lhcb6中的葉綠素a/b結(jié)合蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白的基因是豌豆cab基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA結(jié)構(gòu)，其中所述的含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)來(lái)自豌豆cab基因。
14.一種轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因光合成生物，它們含有的DNA結(jié)構(gòu)包括(a)啟動(dòng)子；(b)含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)；(c)對(duì)提高蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA；(d)對(duì)質(zhì)體蛋白質(zhì)編碼的基因；以及(e)含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
16.從權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物衍生的植物局部，其中所述的植物局部含有所述的DAN結(jié)構(gòu)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物局部選自包括葉子、莖、根、花、組織、上胚軸、分生組織、下胚軸、子葉、花粉、子房、細(xì)胞、和原生質(zhì)的一組。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的光合成生物或植物的后代，其中所述的后代含有所述的DNA結(jié)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的后代，其中所述的基因編碼色素或色素結(jié)合蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物是單子葉植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物是雙子葉植物。
22.據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因光合成生物，其中所述的植物或生物進(jìn)一步包括另外的外源性核苷酸序列。
23.一種轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因光合成生物，它們含有的DNA結(jié)構(gòu)包括(a)啟動(dòng)子；(b)含有1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位的5’未翻譯區(qū)的5’未翻譯區(qū)；(c)對(duì)具有與序列號(hào)3的第20-215殘基基本相似的核苷酸序列的轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA；(d)對(duì)色素結(jié)合蛋白編碼的基因；以及(e)含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物的種子。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物衍生的植物局部，其中所述的植物局部含有所述的DNA結(jié)構(gòu)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的植物局部，選自包括葉子、莖、根、花、組織、上胚軸、分生組織、下胚軸、子葉、花粉、子房、細(xì)胞、和原生質(zhì)的一組。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物或光合成生物的后代，其中所述的后代含有所述的DNA結(jié)構(gòu)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的后代，其中所述的基因編碼葉綠素a/b結(jié)合蛋白。
29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物是單子葉植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的植物是雙子葉植物。
31.根據(jù)權(quán)利要求23所述的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因光合成生物，其中所述的植物或光合成生物進(jìn)一步包括另外的外源性核苷酸序列。
32.一種細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，它們含有的DNA結(jié)構(gòu)包括(a)啟動(dòng)子；(b)含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)；(c)對(duì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)馁|(zhì)粒特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA；(d)對(duì)質(zhì)體蛋白編碼的基因；以及(e)含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物再生的植物。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，它們含有另外的外源性核苷酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物再生的植物
36.一種提高植物、組織培養(yǎng)物或光合成生物的光合成或生物合成能力的方法，所述的方法包括(a)制備DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括啟動(dòng)子，含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)，對(duì)提高蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA，編碼質(zhì)體蛋白質(zhì)的基因，和含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)；(b)將該DNA結(jié)構(gòu)插入到克隆載體中；以及(c)用所述的克隆載體對(duì)植物、組織培養(yǎng)物或光合成生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
37.一種檢測(cè)植物、組織培養(yǎng)物或光合成生物的轉(zhuǎn)化的方法，所述的方法包括(a)制備DNA結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括啟動(dòng)子，含有轉(zhuǎn)譯增強(qiáng)子的5’未翻譯區(qū)，對(duì)提高蛋白質(zhì)輸入的質(zhì)體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼的DNA，編碼其表達(dá)可被檢測(cè)的質(zhì)體蛋白質(zhì)的基因，和含有功能性多聚腺苷酸化信號(hào)的3’未翻譯區(qū)；(b)將該DNA結(jié)構(gòu)插入到克隆載體中；以及(c)用所述的克隆載體對(duì)植物、組織培養(yǎng)物或光合成生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使蛋白質(zhì)被表達(dá)，其中所述的蛋白質(zhì)的表達(dá)是轉(zhuǎn)化的指標(biāo)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是色素或色素結(jié)合蛋白。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)是葉綠素a/b結(jié)合蛋白。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的表達(dá)，與其在同等條件下的野生型植物相比，在下述的一種或多種特征上被表現(xiàn)出來(lái)產(chǎn)量提高、顏色增強(qiáng)、生物質(zhì)增加、糖含量增加、生長(zhǎng)更均勻、種子及果實(shí)更大、莖圍增加、在低光照下的光合作用被增強(qiáng)、發(fā)芽快、對(duì)移植的承受能力增強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的基因結(jié)構(gòu),它們能夠提高植物細(xì)胞和其它光合成生物細(xì)胞的效率。本發(fā)明還提供了對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行更高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí),給出了在植物和其它光合成生物中提高質(zhì)體蛋白數(shù)量的方法。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1203631SQ96198658
公開(kāi)日1998年12月30日 申請(qǐng)日期1996年12月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月6日
發(fā)明者肯頓·凱歐, 哲登卡·W·凱歐, 卡洛斯·雷貝特, 安東尼奧·格拉尼爾 申請(qǐng)人:金斯敦皇后大學(xué)