專利名稱：調(diào)控由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)唾液酸化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生成的糖蛋白中唾液酸含量的方法。本發(fā)明提供了提高或降低哺乳動物產(chǎn)生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體(TNFR)-免疫球蛋白(Ig)和新的TNFR1-IgG1制劑的方法及其在診斷和治療各種炎性和免疫疾病中的用途。
相關(guān)技術(shù)目前，重組產(chǎn)生的糖蛋白其糖基化方式的差異已經(jīng)成為各科研團(tuán)體廣泛關(guān)注的課題，因為由此產(chǎn)生的重組蛋白可能用于臨床預(yù)防和治療手段。糖蛋白的寡糖側(cè)鏈影響著蛋白質(zhì)的功能(Wittwer A.和Howard.S.C.(1990)生物化學(xué)(Biochem.)294175-4180)和糖蛋白某些部分之間的分子內(nèi)反應(yīng)，這些反應(yīng)形成糖蛋白的構(gòu)象及其三維表面(Hart.(1992)，現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)期刊摘要(Curr.Op.CellBiol.)41017-1023Goochee等(1991)生物/技術(shù)(Bio/Technology)91347-1355；Parekh，R.B.，(1991)現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)期刊摘要(Curr.Op.Struct.Biol.)l750-754)。寡糖還起著使一給定的多肽根據(jù)特異性細(xì)胞糖類受體而導(dǎo)向某些結(jié)構(gòu)。(Bevilacqua，M.P.和Nelson，R.M.，(1993)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)91379-387；Nelson，R.M.，(1993)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)911157-1166；Norgard，K.E.等美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)901068-1072；Imai，Y等，(1993)自然(Nature)361555-557)。糖蛋白寡糖側(cè)鏈的末端唾液酸組分影響著糖蛋白的吸附作用、血清半衰期、從血清中被清除，以及物理、化學(xué)和免疫原性特性(Parekh，R.B.，同上；Varki，A.(1993)糖基生物學(xué)(Glycobiology)397-100；Paulson，J.(1989)TIBS.14272-276；Goochee等(1991)生物技術(shù)(Biotechnology)91347-1355；KobataA(1992)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)209483-501)。所以，維持糖蛋白中的唾液酸含量很重要，尤其在要用作治療劑的那些蛋白質(zhì)中。
人們已將大量的注意力投注于重組蛋白產(chǎn)生過程中影響糖基化作用的因素，例如培養(yǎng)模式(貼壁還是懸浮)、培養(yǎng)基配方中的胎牛血清、培養(yǎng)物密度、通氧氣、pH、純化方案等(Werner，R.和Noe，W.(1993)藥物研究(DrugRes.)431134-1249；Harter等，(1992)生物技術(shù)與生物工程(Biotech.andBioeng.)39327-335；Borys等，(1994)生物技術(shù)與生物工程(Biotech.and Bioeng)43505-514；生物技術(shù)與生物工程11720-724；Hearing等，(1989)細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)108339-353；Goochee等，生物方法的研究前沿II(Frontiers inBioprocessing II)Todd等編輯，(1992)美國化學(xué)協(xié)會(American ChemicalSociety)pp.199-240；美國專利No.5,096,816；Chotigeat，W.，(1994)細(xì)胞技術(shù)(Cytotech.)15217-227)。有幾個研究團(tuán)體已經(jīng)對影響重組蛋白產(chǎn)生的過程參數(shù)進(jìn)行了研究，尤其是培養(yǎng)基組成在重組蛋白產(chǎn)生中的影響(Park等，(1992)生物技術(shù)與生物工程(Biotech.and Bioeng.)40686-696；Cox和McClure，(1983)體外(InVitro)191-6；Mizutani等，(1992)生物化學(xué)和生物生理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)187664-669；LeGros等，1985)淋巴研究(Lymph.Res.)4(3)；221-227)。
已知，加入丁酸之類的鏈烷酸影響到外源DNA在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中的瞬時表達(dá)(Prasad和Sinha(1976)體外(In Vitro)12125-132；日本專利申請No.62-48935；日本專利申請No.55-150440；Klehr等，(1992)生物化學(xué)(Biochem.)313222-3229；Gorman和Howard，(1983)核酸研究(Nucleic acid Res.)117631-7648)。但是，丁酸鈉對于多種細(xì)胞系和培養(yǎng)基組成中的基因表達(dá)(D’Anna等，(1980)生物化學(xué)192656-2671；Hagopian，H.K.(1977)細(xì)胞(Cell)12855-860)和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(Milhaud(1980)細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell.Physol.)104163-170；英國專利申請No.GB2122207A)具有多種作用，這表明丁酸鹽能夠改變基因的表達(dá)(Yuan等，(1985)生物化學(xué)雜志.3778-3783)或抑制某些基因的表達(dá)(Yuan等，(1985)同上)。
歐洲專利No.0239292B1公開了一種在鏈烷酸或其鹽例如丁酸存在下加強(qiáng)蛋白質(zhì)生成的方法。但是，該文獻(xiàn)在選擇合適的添加劑濃度方面指導(dǎo)得很少，而且沒有談及添加劑對蛋白質(zhì)糖基化的作用。其它文獻(xiàn)談到，為了提高細(xì)胞比生產(chǎn)率而加入細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基中的低濃度(0-1.5mM)丁酸鈉會伴隨增加生成的重組蛋白中酸性糖基形式(對應(yīng)于提高的唾液酸含量)(Chotigeat等(1994)細(xì)胞技術(shù)15217-221)。
有些研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)注意到滲透摩爾濃度對細(xì)胞生長和多肽生成的影響(Ozturk和Palsson，(1991)生物技術(shù)和生物工程37989-993；Stubblefield等，(1960)癌癥研究(Cancer Research)201646-1655；Garcia-Perez等，(1989)生物化學(xué)雜志264(28)16815-16821；Miner等，(1981)侵染轉(zhuǎn)移(InvasionMetastasis)1158-174；GB2,251,249；EP481,791；美國專利No.5,151,359；美國專利No.4,724,206；美國專利No.5,122,469和WO89/04867)。已經(jīng)提出了用于細(xì)胞生長或多肽產(chǎn)生的多種滲透摩爾濃度范圍。通常，通過添加NaCl或氨基酸來提高細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度。某些情況中，環(huán)境應(yīng)力例如高鹽濃度會提高細(xì)胞產(chǎn)物的產(chǎn)出。通過溶質(zhì)應(yīng)力例如在培養(yǎng)基中添加鹽、乳酸、氨可以在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得哺乳動物蛋白質(zhì)產(chǎn)物的高表達(dá)，這樣的觀點也已有所報道(專利國際申請No.WO89/04867)。這些應(yīng)力通常是抑制細(xì)胞的生長而促進(jìn)細(xì)胞的比生產(chǎn)率。
其它文獻(xiàn)論述了重組細(xì)胞培養(yǎng)物中葡萄糖濃度對細(xì)胞生長和/或多肽產(chǎn)生的影響。例如參見Park等，(1992)生物技術(shù)和生物工程40686-696；Huang等，(1991)生物技術(shù)雜志18161-162；EP387840；Reuveny等，(1986)免疫學(xué)方法雜志(Journalof Immunological Method)8653-59；Fine等，(1976)體外12(10)693-701；Dircks等(1987)實驗眼科研究(Exp.Eye Res.)44951-958；Mizutani等，(1992)生物化學(xué)和生物生理學(xué)研究通訊187(2)664-669；Sugiura，(1992)生物技術(shù)和生物工程39953-959；WO88/01643；Graf等，(1989)DECHEMA生物技術(shù)參考(DECHEMABiotechnol.Conf.)3615-618；日本專利申請No.JP1-101882；美國專利No.3,926,723；WO87/00195；和Fleischaker，Jr，Ph.D.Thesis，MassachusettsInstitute of Technology，pp.196-229(1982，6)。但是，已有的研究沒有研究各種過程參數(shù)對成熟蛋白質(zhì)中唾液酸含量的影響，糖蛋白生成中的這一因素對臨床成功來說是十分重要的。
本發(fā)明提供了調(diào)控哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。
發(fā)明綜述本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，某些哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程參數(shù)影響著細(xì)胞的比生產(chǎn)率和生成的蛋白質(zhì)的糖基化程度和類型。更具體地說，本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些提高細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素對生成的蛋白質(zhì)中的唾液酸含量具有負(fù)作用。所以，本發(fā)明設(shè)計了多種細(xì)胞培養(yǎng)方法，以豐富哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中生成的糖蛋白的特定的糖基化形式。
所以，本發(fā)明提供了調(diào)控哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白中唾液酸含量的方法。根據(jù)本發(fā)明的這項內(nèi)容，改變細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期的生成速度會引起成熟糖蛋白中唾液酸含量的改變。更具體地說，糖蛋白生產(chǎn)期中細(xì)胞比生產(chǎn)率的提高引起成熟蛋白質(zhì)中唾液酸含量的降低。相反，細(xì)胞比生產(chǎn)率的降低引起成熟蛋白質(zhì)中唾液酸含量的升高。
在具體的實施方式之一中，本發(fā)明通過調(diào)控會影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素來在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)期改變哺乳動物宿主細(xì)胞的比生產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容之一，促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的因子的濃度受到調(diào)控。在另一實施方式中，通過將細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透摩爾濃度維持在一定的范圍內(nèi)來控制細(xì)胞的比生產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明，對以上各參數(shù)單獨或聯(lián)合加以調(diào)控來影響成熟糖蛋白中的唾液酸含量。在本發(fā)明具體實施方式
之一中，加強(qiáng)DNA轉(zhuǎn)錄的因子是某種鏈烷酸或其鹽，例如濃度約為0.1mM至約20mM的丁酸鈉。根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容之二，細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透摩爾濃度被維持在約250至600mOsm之間。在另一方面的內(nèi)容中，細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度被控制在約30℃至37℃之間。
在優(yōu)選實施方式之一中，本發(fā)明提供了提高哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的成熟糖蛋白中唾液酸含量的方法，其中包括通過調(diào)控以上過程參數(shù)中任一或全部，并可以結(jié)合以本領(lǐng)域已知的其它參數(shù)來維持低細(xì)胞比生產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明的這一項內(nèi)容，在鏈烷酸或其鹽濃度約為0.1mM至約6mM時培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并可以結(jié)合以維持細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透摩爾濃度在約300至450mOsm之間，生產(chǎn)出了高唾液酸含量的蛋白質(zhì)。
在另一優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了降低哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的成熟糖蛋白中唾液酸含量的方法，其中包括提高細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞比生產(chǎn)率。在一優(yōu)選實施方式中，通過任選在約6mM至約12mM的鏈烷酸或其鹽濃度下培養(yǎng)細(xì)胞，以及將細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透摩爾濃度維持在約450至600mOsm之間來提高細(xì)胞比生產(chǎn)率。
在
具體實施例方式
之一中，本發(fā)明還提供了包含三個細(xì)胞培養(yǎng)階段的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所以，本發(fā)明提供了調(diào)控哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白中唾液酸含量的方法，其過程包括在最大程度促進(jìn)細(xì)胞生長的條件下將表達(dá)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞在生長期培養(yǎng)一段時間。根據(jù)本發(fā)明的該項內(nèi)容，生長期之后是過渡期，在該階段選擇并使用適合成熟糖蛋白中唾液酸含量要求的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。過渡期之后是細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期，在該階段維持過渡期選用的參數(shù)，產(chǎn)生和收獲糖蛋白產(chǎn)物。在過渡期向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加濃度約為0.1mM至20mM的某種鏈烷酸或其鹽，以及使用約250至600mOsm之間的細(xì)胞培養(yǎng)物滲透摩爾濃度，或者兩者結(jié)合使用，由此改變細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期的細(xì)胞比生產(chǎn)率，產(chǎn)生了具有不同唾液酸含量的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的另一實施方式中，調(diào)控可溶性1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1)-免疫球蛋白G1(IgG1)嵌合蛋白中唾液酸含量的方法。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，在某些條件下可以獲得新的TNFR1-IgG制劑，它們具有延遲從血液中被清除的同時保持顯著的功能活性這樣的理想特性。長功能性半衰期允許使用簡單的彈丸劑型，且有助于糖蛋白產(chǎn)生的體內(nèi)效力，由此允許使用糖蛋白的低劑量劑型。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，產(chǎn)生了一種唾液酸殘基含量提高的TNFR1-IgG1糖蛋白分子。以獲得要求的唾液酸含量為目的來選用TNFR1-IgG1生產(chǎn)期的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)。在優(yōu)選實施方式之一中，生產(chǎn)期的丁酸鈉濃度約為0.1至約6mM，滲透摩爾濃度維持在約300-450mOsm。更好的是，丁酸鈉濃度約為1mM，滲透摩爾濃度維持在約300-400mOsm。
在另一實施方式中，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明方法產(chǎn)生的TNFR1-IgG1糖蛋白制劑。本發(fā)明的該項內(nèi)容提供了一種包含TNFR1-IgG1的制劑，其中該制劑的pl范圍在約5.5至7.5之間。此外還提供了一種唾液酸與蛋白質(zhì)的摩爾比約為4至7、約5至6更好的TNFR1-IgG1制劑。在其它方面的內(nèi)容中，TNFR1-IgG1制劑中每摩爾蛋白質(zhì)具有約1至2摩爾的暴露的N-乙酰基葡糖胺。在其它方面的內(nèi)容中，該制劑中唾液酸與N-乙?；咸前返哪柋燃s為0.35至0.5，約0.4至約0.45更好。
本發(fā)明還提供了包含以上制劑、可用于治療TNF-介導(dǎo)的病理狀況的治療性組合物。


圖1A和圖1B。圖1A和圖1B表示用于在生產(chǎn)期計算典型細(xì)胞培養(yǎng)的比生產(chǎn)率的方法。比生產(chǎn)率可以表示為圖1A所示活細(xì)胞計數(shù)(細(xì)胞存活天數(shù))的函數(shù)；或圖B所示收集細(xì)胞體積(PCV)的函數(shù)。給出的是90％置信區(qū)間范圍內(nèi)的比生產(chǎn)率。
圖2A和圖2B。圖2A和圖2B表示生產(chǎn)期中基于細(xì)胞存活天數(shù)(圖2A)或收集細(xì)胞體積(圖2B)的比生產(chǎn)率與收獲的產(chǎn)物中唾液酸(NANA)含量之間的關(guān)系。圖中顯示了9種不同方法(A至I)的值。數(shù)據(jù)點代表表I中各自獨立的生產(chǎn)方法。
詳細(xì)說明I.定義將參照描述寡糖的常用術(shù)語來描述本發(fā)明中糖類部分。有關(guān)使用這類術(shù)語的糖類化學(xué)綜述可見于Hubbard和Ivatt(1981)生物化學(xué)評論記要(Ann.Rev.Biochem.)50555-583。這類術(shù)語包括例如Man，代表甘露糖；GlucNAc，代表2-N-乙?；咸前?；Gal，代表半乳糖；Glc，代表葡萄糖。唾液酸的描述參照以下縮寫，NeuNAc，代表5-N-乙酰基神經(jīng)氨酸，NeuNGc，代表5-糖基神經(jīng)氨酸(生物化學(xué)雜志，1982，2573347；生物化學(xué)雜志，1982，2573352)。
“滲透(重量)摩爾濃度”是水溶液中溶解的溶質(zhì)粒子的滲透壓。溶劑粒子包括離子和非離子化分子。滲透摩爾濃度表示為溶解在1kg溶液中的滲透壓活性粒子的濃度(即滲透壓摩爾)(38℃時1mOsm/kg H2O相當(dāng)于19mmHg的滲透壓)。與之相對的是“滲透(體積)摩爾濃度”，表示溶解在1L溶液中的溶質(zhì)粒子數(shù)。本文中，縮寫“mOsm”表示“毫摩爾/kg溶液”。
本文中，“糖蛋白”指具有超過約10個氨基酸和至少一個寡糖側(cè)鏈的多肽或蛋白質(zhì)。糖蛋白可以是與宿主細(xì)胞同源的，或者最好是與使用的宿主細(xì)胞異源的，即外源的，例如由中國倉鼠卵巢細(xì)胞產(chǎn)生的人蛋白。較好的是使用哺乳動物糖蛋白(源自哺乳動物的糖蛋白)，直接分泌到培養(yǎng)基中的更好。哺乳動物糖蛋白的實例包括這樣一些分子，例如細(xì)胞因子及其受體以及包含細(xì)胞因子或其受體的嵌合蛋白，這些細(xì)胞因子或其受體包括例如α-和β-腫瘤壞死因子，它們的受體(TNFR-1；EP417,563，于1991年3月20日公開；和TNFR-2；EP417,014，于1991年3月20日公開)及其衍生物；腎素(renin)；生長激素，如人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺素；脂蛋白；α1-抗胰蛋白；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈，胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白質(zhì)C；心鈉素；肺表面活性劑；血纖維蛋白溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原激活物(t-PA)；鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)正常表達(dá)和分泌的T細(xì)胞的活化)；人巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Mullerian抑制物；松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin)；鼠促性腺素相關(guān)肽；微生物蛋白，如β-內(nèi)酰胺酶；脫氧核糖核酸酶；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)；激素或生長因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白質(zhì)A或D；類風(fēng)濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子如骨衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3，-4，-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神經(jīng)生長因子如NGF-β；血小板衍生生長因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長因子如aFGF和bFGF；上皮生長因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；脫(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子(osteoinductive factors)；免疫毒素；骨形態(tài)形成蛋白(BMP)；干擾素如α-，β-和γ-干擾素；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；嵌合蛋白，例如免疫粘附素；以及以上所述多肽的片段。
“細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”指用于生長哺乳動物細(xì)胞的營養(yǎng)溶液，通常提供下列物質(zhì)中至少一種或多種1)能量源，通常是糖類形式的，例如葡萄糖；2)所有必需氨基酸，通常是20種基本氨基酸加上半胱氨酸；3)必需的低濃度維生素和/或其它有機(jī)化合物；4)游離脂肪酸；和5)微量元素，微量元素是指通常只需很低濃度，通常為微摩爾濃度級別的無機(jī)化合物或天然元素。
營養(yǎng)溶液還可以可選性的補(bǔ)充以下物質(zhì)中的一種或多種1)激素和其它生長因子，例如胰島素、運鐵蛋白和表皮生長因子；2)鹽和緩沖液，例如鈣、鎂和磷酸鹽；3)核苷和堿基，例如腺苷、胸苷和次黃嘌呤；和4)蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物。
“哺乳動物宿主細(xì)胞”，“宿主細(xì)胞”，“哺乳動物細(xì)胞”等指來源于哺乳動物，并且能夠在包含合適的營養(yǎng)物和生長因子的培養(yǎng)基中，在單層培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)中生長和存活的細(xì)胞系。正如哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)(Mammalian CellCulture)(Mather，J.P.編輯，Plenum Press，N.Y. )和Barnes及Sato(1980)在細(xì)胞(Cell)22649中所述，無需大量實驗，憑經(jīng)驗即可方便地確定特定細(xì)胞系所必需的生長因子。通常，細(xì)胞能夠表達(dá)和向培養(yǎng)基中分泌大量人們感興趣的特定的糖蛋白。本發(fā)明中合適的哺乳動物宿主細(xì)胞實例包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，美國科學(xué)院院報，774216 )；dp12.CHO細(xì)胞(EP307,247，于1989年3月15日公開)；猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚腎細(xì)胞系(293或亞克隆的懸浮培養(yǎng)生長的293細(xì)胞，Graham等人，J.Gen Virol.3659 )；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠Sertoli細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251 )；猴腎細(xì)胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCC CCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛鼠(buffalo rat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCC CCL75)；人肝細(xì)胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細(xì)胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68 )；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝癌系(HepG2)。
優(yōu)選的是中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，美國科學(xué)院院報，774216 )；dp12.CHO細(xì)胞(EP307,247，于1989年3月15日公開)。
本文中的“蛋白胨”指一種培養(yǎng)基補(bǔ)充成份，主要是水解動物蛋白。這種蛋白質(zhì)的來源可以是屠宰場的動物副產(chǎn)物，純化明膠或植物材料。這些蛋白質(zhì)通常利用酸、加熱或各種酶制劑來水解。較好的蛋白胨混合物是例如“Primatone RL”和“Primatone HS”，以上兩種都是市售商品(Sheffield，England)。
“細(xì)胞比生產(chǎn)率”，“細(xì)胞比速度”等指產(chǎn)物的比表達(dá)速度，即與細(xì)胞個數(shù)，或細(xì)胞質(zhì)量或體積量度之比。例如，細(xì)胞比生產(chǎn)率按照每日每個細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)克數(shù)來測定?？梢愿鶕?jù)以下積分方法方便地測得細(xì)胞比生產(chǎn)率dP/dt＝qpX，或者P=qp∫Xdt]]>其中的qp是細(xì)胞比生產(chǎn)率常數(shù)，X是細(xì)胞個數(shù)或細(xì)胞體積或細(xì)胞質(zhì)量當(dāng)量，dP/dt是蛋白質(zhì)產(chǎn)出速度。所以，從產(chǎn)物濃度對活細(xì)胞的時間積分(∫Xdt“活細(xì)胞天數(shù)”)所做的圖中可以獲得qp。根據(jù)該公式，當(dāng)用產(chǎn)出的糖蛋白產(chǎn)物量對活細(xì)胞天數(shù)作圖時，斜率等于細(xì)胞比速度。有多種方法可以測定活細(xì)胞，例如生物質(zhì)量、耗氧率、乳酸脫氫酶(LDH)、收集細(xì)胞體積或濁度。
細(xì)胞培養(yǎng)的“生長期”指細(xì)胞迅速分裂的指數(shù)生長期(對數(shù)期)，在此期間，通常將細(xì)胞培養(yǎng)一定的時間，一般為1至4天，并且在最大程度細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。無需過多的實驗就可根據(jù)考慮使用的特定的宿主細(xì)胞確定其生長周期?！霸谧畲蟪潭燃?xì)胞生長的條件下培養(yǎng)一定的時間”指根據(jù)具體的細(xì)胞系確定的最適于細(xì)胞生長和分裂的培養(yǎng)條件。在生長期，通常將細(xì)胞培養(yǎng)在包含必需添加劑的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，溫度約30至40℃，大氣環(huán)境濕潤且可調(diào)節(jié)，以便獲得特定細(xì)胞系的最佳生長。將細(xì)胞在生長期維持1至4天，通常為2至3天。
細(xì)胞培養(yǎng)“過渡期”指使用生產(chǎn)期的培養(yǎng)條件的時期。在過渡期，環(huán)境因素例如培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度等由生長期向生產(chǎn)條件轉(zhuǎn)變。
細(xì)胞培養(yǎng)的“生產(chǎn)期”指細(xì)胞生長至平臺期。在生產(chǎn)期，細(xì)胞的對數(shù)生長結(jié)束，而以蛋白質(zhì)生產(chǎn)為主。在此期間，通常對培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充以支持持續(xù)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)且獲得所需的糖蛋白產(chǎn)物。
本文中的“表達(dá)”指宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和翻譯。宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物基因的表達(dá)水平可以根據(jù)存在于細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)的mRNA含量或者根據(jù)由細(xì)胞產(chǎn)生的由產(chǎn)物基因編碼的蛋白質(zhì)的含量來測定。例如，可以較好地利用Northern雜交來定量由產(chǎn)物基因轉(zhuǎn)錄得到的mRNA。Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)pp.7.3-7.57(冷泉港，1989)。定量由產(chǎn)物基因編碼的蛋白質(zhì)可以利用蛋白質(zhì)生物活性檢測，或與這些活性無關(guān)的例如Western印跡檢測或使用能夠與蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體的放射性免疫檢測。Sambrook等《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA LaboratoryManual)pp.18,1-18,88(冷泉港，1989)。
鏈烷酸或其鹽是指直鏈或支鏈/飽和或不飽和的鏈烷酸或其鹽。鏈烷酸通常包含1至10個碳原子，以3至6個碳原子為佳。鏈烷酸的實例之一j丁酸，而其相應(yīng)的鹽是丁酸鈉。
II.細(xì)胞培養(yǎng)過程本發(fā)明已經(jīng)說明在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生糖蛋白期間提高細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素對產(chǎn)出的糖蛋白中的唾液酸含量具有負(fù)作用。由于每個復(fù)合寡糖結(jié)構(gòu)表達(dá)一個或多個唾液酸殘基的蛋白質(zhì)在體內(nèi)具有較慢的被清除速度，可以通過制備過程中的總唾液酸化程度來在較寬的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)產(chǎn)出的糖蛋白的清除速度。本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白的唾液酸化程度的方法。按照本發(fā)明所述的方法，技術(shù)人員能夠根據(jù)所要求的通過哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的糖蛋白中的唾液酸含量來確定準(zhǔn)確的過程參數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞來產(chǎn)生可回收的糖蛋白產(chǎn)物。通過調(diào)控會影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)來調(diào)控糖蛋白中的總唾液酸含量。影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素在本領(lǐng)域中是眾所周知的，其中包括但不限于影響DNA/RNA拷貝數(shù)的因素，影響RNA的因素例如使RNA穩(wěn)定的因素，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物及其它補(bǔ)充成份，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的濃度，培養(yǎng)環(huán)境的滲透摩爾濃度，細(xì)胞培養(yǎng)的溫度和pH等。根據(jù)本發(fā)明，單獨或聯(lián)合調(diào)控以上因素來提高細(xì)胞比生產(chǎn)率將生成低唾液酸含量的蛋白質(zhì)。單獨或聯(lián)合調(diào)控以上因素來降低細(xì)胞比生產(chǎn)率將生成高唾液酸含量的糖蛋白。
以下將參照細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和原理來說明本發(fā)明，其中包括眾所周知的那些。
根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞來生成所需的糖蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明在選擇用于生成特定的糖蛋白的宿主細(xì)胞時，很重要的是認(rèn)識到不同的宿主細(xì)胞對于表達(dá)的蛋白質(zhì)具有特征性的和特異性的翻譯和翻譯后加工和修飾(例如糖基化或剪切)機(jī)制。必須選擇合適的細(xì)胞系來確保發(fā)生合乎要求的翻譯修飾。或者，可以對細(xì)胞加以改變，使其表達(dá)一種特異性翻譯后修飾所必需的基因產(chǎn)物。
具體地說，表達(dá)所需蛋白質(zhì)的哺乳動物細(xì)胞應(yīng)該表達(dá)或經(jīng)改進(jìn)后表達(dá)特定的酶，從而在本文所述的合適條件下在體內(nèi)發(fā)生正確的翻譯后修飾作用。這些酶包括Hubbard和Ivan同上所述為N-連接的寡糖添加和補(bǔ)全N-和O-連接的糖所必需的酶。這些酶可選性地包括寡糖轉(zhuǎn)移酶、α-葡萄糖苷酶I、α-葡萄糖苷酶II、ERα(1，2)甘露糖苷酶、高爾基體α-甘露糖苷酶I、N-乙酰基葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I、高爾基體α-甘露糖苷酶II、N-乙?；咸前坊D(zhuǎn)移酶II、α(1，6)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和β(1，4)半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶?；蛘撸拗骷?xì)胞表達(dá)基因組內(nèi)的合適的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，可以期望該酶在特定的位置以特定的連接方式接上末端唾液酸。也可以例如用編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞來使得宿主表達(dá)合適的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
以上所述的唾液酸轉(zhuǎn)移酶被預(yù)期在合適的寡糖核心結(jié)構(gòu)例如Galβ1-4ClcNac加上末端唾液酸殘基。本文中合適的唾液酸轉(zhuǎn)移酶包括但不限于催化N-和O-連接寡糖的復(fù)合唾液酸化和支鏈化的那些轉(zhuǎn)移酶。
至于培養(yǎng)表達(dá)所需蛋白并能夠在特定的位置以特定的連接方式加糖類的哺乳動物細(xì)胞，可以使用多種培養(yǎng)條件但同時需要注意具體培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。適合哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域是眾所周知的或者是技術(shù)人員容易確定的(例如可參見動物細(xì)胞培養(yǎng)實際操作方法(Animal Cell CultureA Practical Approach)第2版，Rickwood，D.和Hames，B.D.編輯，牛津大學(xué)出版社，紐約(1992))，而且隨具體選用的宿主細(xì)胞而不同。
本發(fā)明的哺乳動物培養(yǎng)物被制備在適于特定的被培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。營養(yǎng)溶液的實例有市售的例如Ham F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM(Sigma))。此外，還可以使用以下所述的任意一種作為培養(yǎng)基，Ham和Wallace(1979)酶法(Meth Enz)，5844；Barnes和Sato(1980)生物活性記要(Anal.Biochem.)102255；美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或4,560,655；國際申請WO90/03430和WO87/00195；以上文獻(xiàn)的內(nèi)容均在此參考引用。以上培養(yǎng)基都可以根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如慶大霉素TM)、微量元素(通常以微摩爾濃度級的最終濃度存在的無機(jī)化合物)、脂類(例如亞油酸或其它脂肪酸)和它們的合適載體，和葡萄糖或與之相當(dāng)?shù)哪茉?。培養(yǎng)基中還包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)濃度的其它補(bǔ)充成份。
在
具體實施例方式
之一中，哺乳動物細(xì)胞是CHO，以dp12.CHO細(xì)胞為佳，相適的培養(yǎng)基中包含基本培養(yǎng)基組分例如DMEM/HAM F-12基本配方(用于DMEM和HAMF-12的組合物，參見第6版的美國典型培養(yǎng)物的細(xì)胞系和雜交瘤保藏目錄中的培養(yǎng)基配方，1988，第346至349頁)(美國專利5,122,469中所述的培養(yǎng)基配配方尤為適用)，但改變了某些成份的濃度，例如氨基酸、鹽、糖和維生素和可選性地包含在內(nèi)的甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶、重組人胰島素、水解蛋白胨例如Primatone HS或Primatone RL(Sheffield，England)或相當(dāng)物、細(xì)胞保護(hù)劑例如Pluronic F68或其它Pluronic多元醇、慶大霉素和微量元素。
可在多種細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)表達(dá)所需蛋白的細(xì)胞來生成本發(fā)明的糖蛋白。例如，在本發(fā)明中，用于大規(guī)?；蛏倭可傻鞍踪|(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)過程都可使用。這些過程包括但不限于流化床生物反應(yīng)器，中空纖維反應(yīng)器、搖瓶培養(yǎng)，或攪拌罐反應(yīng)器系統(tǒng)均可使用，在后兩種系統(tǒng)中，可以有也可以沒有微載體，可以按分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)模式運行。
在優(yōu)選實施方式之一中，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)是在攪拌罐反應(yīng)器系統(tǒng)中用補(bǔ)料分批過程進(jìn)行的。在優(yōu)選的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，先在一開始加入哺乳動物宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基于培養(yǎng)罐中，然后在培養(yǎng)過程中連續(xù)或在間斷地補(bǔ)加培養(yǎng)基，在培養(yǎng)結(jié)束前可以間斷或不間斷地收獲細(xì)胞和/或產(chǎn)物也可以不進(jìn)行收獲。補(bǔ)料分批培養(yǎng)可以包括例如半連續(xù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)，其中相隔一定的間期放出所有的培養(yǎng)物(包括細(xì)胞和培養(yǎng)基)替換以新鮮培養(yǎng)基。補(bǔ)料分批培養(yǎng)與單批培養(yǎng)的區(qū)別在于后者所有的細(xì)胞培養(yǎng)成份(包括細(xì)胞和培養(yǎng)營養(yǎng)物)均在培養(yǎng)過程開始時加入培養(yǎng)罐中。補(bǔ)料分批也區(qū)別于灌流培養(yǎng)，前者在培養(yǎng)過程中不從培養(yǎng)容器中放出上清液(在灌流培養(yǎng)中，細(xì)胞通過過濾、包埋或與微載體固定等被保留在培養(yǎng)物中但培養(yǎng)基被連續(xù)地引入和放出培養(yǎng)罐)。
而且，可以根據(jù)特定的宿主細(xì)胞和特定的生成計劃選用合適的方法或常規(guī)操作來增殖培養(yǎng)物中的細(xì)胞。所以，本發(fā)明考慮使用一步或多步培養(yǎng)過程。在一步培養(yǎng)中，宿主細(xì)胞被接種到一定的培養(yǎng)環(huán)境中，只在細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期運用本發(fā)明的方法?；蛘?，考慮使用多步培養(yǎng)。在多步培養(yǎng)中，可以分多個步驟或階段培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以在第一步或生長期培養(yǎng)細(xì)胞，在此階段可能取自儲備物的細(xì)胞被接種到適合于促進(jìn)細(xì)胞生長和高活性的培養(yǎng)基中。可以通過在宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中添加新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞在生長期維持一段合適的時間。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選內(nèi)容之一，補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的條件被設(shè)計成加強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)生長期的生長。在生長期，細(xì)胞在一定的條件下培養(yǎng)一定的時間以使其最大程度地生長。根據(jù)特定的細(xì)胞使用特定的培養(yǎng)條件例如溫度、pH、溶解氧(dO2)等，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。通常，用酸(例如CO2)或堿(例如Na2CO3或NaOH)將pH調(diào)節(jié)在約6.5至7.5之間。適合培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞例如CHO細(xì)胞的溫度范圍在約30至38℃之間，合適的dO2在5-90％空氣飽和度。
在特定的階段，這些細(xì)胞可以用于接種細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期或生產(chǎn)步驟?；蛘撸缜八?，生產(chǎn)期或步驟可以與接種或生長期或步驟相連續(xù)。
根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境是受到調(diào)控的。根據(jù)本發(fā)明的方法，通過調(diào)控影響哺乳動物宿主細(xì)胞的細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素來獲得產(chǎn)出的糖蛋白中要求的唾液酸含量。具體地說，在細(xì)胞培養(yǎng)過程的生產(chǎn)期控制提高細(xì)胞比生產(chǎn)率的因素從而使得生成的糖蛋白產(chǎn)物中含有要求的唾液酸含量。
在優(yōu)選內(nèi)容之一中，細(xì)胞培養(yǎng)過程的生產(chǎn)期之前有一個細(xì)胞培養(yǎng)過渡期，在此期間使用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期的參數(shù)。
根據(jù)本

發(fā)明內(nèi)容
之一，某種轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子例如鏈烷酸的濃度受到調(diào)控以影響細(xì)胞比生產(chǎn)率，由此形成哺乳動物糖蛋白產(chǎn)物中的唾液酸含量。鏈烷酸可以是任意能夠增強(qiáng)哺乳動物蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的單鏈或支鏈鏈烷酸。在優(yōu)選實施方式之一中，鏈烷酸是丁酸，尤其是其鹽，即丁酸鈉。
本發(fā)明通過控制丁酸鈉的濃度來控制細(xì)胞比生產(chǎn)率。本發(fā)明使用的丁酸鈉濃度在0.1至20mM之間，根據(jù)特定的宿主細(xì)胞和產(chǎn)出的糖蛋白中要求的唾液酸含量加以改變。為了生成具有要求的唾液酸含量的蛋白質(zhì)，應(yīng)選用提高具有最佳唾液酸含量的最高細(xì)胞比生產(chǎn)率的丁酸鈉濃度。所以，根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子例如丁酸鈉的濃度選擇以獲得要求的唾液酸含量為目的。
為了提高成熟糖蛋白中的唾液酸含量，使用低濃度的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。低濃度增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，但在維持宿主細(xì)胞培養(yǎng)物活性的同時保持低細(xì)胞比生產(chǎn)率。通常使用約0.1至8mM之間的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子濃度。使用約1.0至60mM的濃度更好。在具體實施方式
之一中，使用的是約6mM的丁酸鈉。在另一實施方式中使用的是約1mM的丁酸鈉。
在另一實施方式中產(chǎn)生的是低唾液酸水平的糖蛋白。根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，哺乳動物細(xì)胞被培養(yǎng)在提高細(xì)胞比生產(chǎn)率的條件下。根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，選擇鏈烷酸或其它合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的濃度使得高細(xì)胞比生產(chǎn)率產(chǎn)生具有要求的唾液酸含量的蛋白質(zhì)。在優(yōu)先實施方式之一中，鏈烷酸或其鹽的濃度在約5至20mM之間，約6mM至12mM之間更好。在具體實施方式
之一中，丁酸鈉的濃度是約12mM。
在確定合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子例如鏈烷酸或其鹽的濃度時，可以參照圖2和實施例1的表I。根據(jù)本發(fā)明，低丁酸鹽濃度通常降低細(xì)胞比生產(chǎn)率。選擇丁酸鈉濃度時需要同時考慮其它過程參數(shù)例如生產(chǎn)期的滲透摩爾濃度。如下文所述，滲透摩爾濃度會影響細(xì)胞比生產(chǎn)率。必需同時考慮在生產(chǎn)期中維持特定的滲透摩爾濃度來選用丁酸鹽濃度。
或者，對于其它宿主細(xì)胞和其它糖蛋白，可以制備小試培養(yǎng)，測定糖蛋白產(chǎn)物的生成速度即細(xì)胞比生產(chǎn)率，可利用形成的唾液酸含量來繪制適合于培養(yǎng)的特定宿主細(xì)胞的類似表格和圖形，記住細(xì)胞比生產(chǎn)率的降低提高生成的糖蛋白中的唾液酸含量。大約在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)期開始時加入丁酸鈉之類鏈烷酸或其鹽或其它轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。最好，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中在生產(chǎn)期之前使用過渡期，在此期間使用在此所述的用于獲得要求的細(xì)胞比生產(chǎn)率并由此獲得要求的糖基形式的細(xì)胞培養(yǎng)條件。
可利用本領(lǐng)域已知的任何一種方式加入鏈烷酸或其鹽。在優(yōu)選實施方式之一中，如本文所述或如哺乳動物培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，丁酸鈉單獨或與其它營養(yǎng)物一起加入補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，除以上所述的因素之外還通過調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的滲透摩爾濃度來調(diào)節(jié)成熟糖蛋白的唾液酸化程度。在實施方式之一中，獨立于影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的其它因素之外調(diào)節(jié)滲透摩爾濃度來控制成熟蛋白質(zhì)中的唾液酸含量。在另一實施方式中，在調(diào)節(jié)影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的其它因素之外調(diào)節(jié)滲透摩爾濃度。在優(yōu)選實施方式之一中，滲透摩爾濃度和鏈烷酸濃度同時受到調(diào)控。
對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的滲透摩爾濃度進(jìn)行調(diào)控從而在細(xì)胞比生產(chǎn)率和生成的糖蛋白中唾液酸含量之間按要求形成平衡。通常，滲透摩爾濃度提高時，細(xì)胞比生產(chǎn)率提高。在選擇產(chǎn)生具有要求的唾液酸含量的蛋白質(zhì)的滲透摩爾濃度時，必需記住滲透摩爾濃度的提高通常會提高特定蛋白質(zhì)的生產(chǎn)速度。為了降低生產(chǎn)速度而提高成熟糖蛋白中的唾液酸含量，通常將滲透摩爾濃度維持在適合于特定培養(yǎng)細(xì)胞類型的較低水平。
對哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)來說，培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度通常在約290-330mOsm。但是，提高滲透摩爾濃度通常會提高蛋白質(zhì)的生產(chǎn)速度。滲透摩爾濃度的選擇需使得生產(chǎn)速度與要求的產(chǎn)物特性相對應(yīng)。為了提高唾液酸含量，生產(chǎn)速度被降低，通常根據(jù)培養(yǎng)的特定細(xì)胞將滲透摩爾濃度維持在較低的范圍。對于高唾液酸濃度來說，合適的滲透摩爾濃度在約250mOsm至約450mOsm范圍之間。根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，較好的是將滲透摩爾濃度維持在約300至450mOsm之間，更好的是維持在350至400mOsm之間，最好約為400mOsm。
為了低唾液酸含量可選用會提高生產(chǎn)速度的滲透摩爾濃度。根據(jù)本發(fā)明的這一方面內(nèi)容，滲透摩爾濃度被維持在約350-600mOsm之間，約450至550mOsm更好。
熟練的操作者懂得，培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度取決于培養(yǎng)液中的滲透壓活性粒子濃度，而且，許多變量構(gòu)成了哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基復(fù)雜的沖擊滲透摩爾濃度。培養(yǎng)基最初的滲透摩爾濃度取決于培養(yǎng)基的組成。滲透摩爾濃度可以利用滲透壓計來測定，例如Fisher Scientific，Pittsburgh，Pennsylvania出售的商品名為OSMETTE的滲透壓計(或是Precision Systems，Inc.Natick MA的Osmette 2007型)。例如，為了獲得要求范圍內(nèi)的滲透摩爾濃度，可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中不同組分的濃度。
可以加入培養(yǎng)基中提高其滲透摩爾濃度的溶質(zhì)包括蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、水解動物蛋白例如蛋白胨、非代謝聚合物、維生素、離子、鹽、糖、代謝物、有機(jī)酸、脂類等。在實施方式之一中，通過在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中結(jié)合其它培養(yǎng)基組分一起加入蛋白胨來調(diào)控滲透摩爾濃度。
根據(jù)本發(fā)明，通過添加例如除蛋白胨之外還包含氨基酸、各種鹽(例如NaCl)的基本培養(yǎng)基來維持或調(diào)節(jié)滲透摩爾濃度在一定的范圍內(nèi)。在優(yōu)選實施方式之一中，培養(yǎng)基被補(bǔ)充以例如包含過多氨基酸(參見前文美國專利5,122,469中的“超”培養(yǎng)基)、葡萄糖和蛋白胨的基本培養(yǎng)基。
但是，應(yīng)該理解，為了獲得上述滲透摩爾濃度范圍，可以改變培養(yǎng)基中其它組分的濃度。例如，在培養(yǎng)過程中間斷或連續(xù)調(diào)控培養(yǎng)基中的葡萄糖(主要能量來源)濃度可以將培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度大致維持在規(guī)定的要求范圍內(nèi)。調(diào)控葡萄糖濃度的作用在于為細(xì)胞提高足夠的碳源，同時控制宿主細(xì)胞的乳酸生產(chǎn)。其優(yōu)點在于限制了培養(yǎng)基中pH的下降，pH下降需要加入中和劑(例如Na2CO3或NaOH之類的堿)由此造成滲透摩爾濃度的升高。
可以按照任何用于維持細(xì)胞培養(yǎng)的方法補(bǔ)充培養(yǎng)基以維持滲透摩爾濃度在合適的范圍內(nèi)。在優(yōu)選實施方式之一中，培養(yǎng)系統(tǒng)是補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)，在細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期通過補(bǔ)料分批補(bǔ)加培養(yǎng)基。此外，可以按照下文所述在生產(chǎn)期補(bǔ)加培養(yǎng)基。
或者，可以進(jìn)行離線的培養(yǎng)基取樣。由此可以通過按要求調(diào)節(jié)補(bǔ)料溶液來改變培養(yǎng)基的滲透摩爾濃度。
熟練技術(shù)人員明白，本發(fā)明對細(xì)胞培養(yǎng)過程的選擇是為了獲得要求的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的唾液酸化水平。影響唾液酸化水平的過程參數(shù)除了以上所述之外還包括氧水平和葡萄糖水平。培養(yǎng)物密度、時間和保存條件例如溫度也影響著唾液酸化作用。本發(fā)明傾向于將其它最適合于加強(qiáng)唾液酸化的過程參數(shù)都包含在內(nèi)。
III.糖蛋白的回收在多肽生產(chǎn)期之后，利用本領(lǐng)域的成熟技術(shù)來從培養(yǎng)基中回收感興趣的多肽。
感興趣的多肽最好以分泌多肽的形式從培養(yǎng)基中回收得到，但是也可能從宿主細(xì)胞裂解物中進(jìn)行回收。
第一步，離心培養(yǎng)基或裂解物以去除顆粒細(xì)胞碎片。利用以下合適純化過程范例從污染性可溶蛋白和多肽中純化多肽免疫親和柱或離子交換柱上的分離；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅或陽離子交換樹脂例如DEAE上的色譜；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如Sephdex G-75的凝膠過濾；和用于去除例如IgG污染蛋白的蛋白A瓊脂糖柱。在純化過程中還可能需要使用例如苯甲酰磺酰氯(PMSF)之類的蛋白酶抑制劑來抑制蛋白質(zhì)降解。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，考慮到重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)的多肽的特性變化，可能需要修改適合感興趣的多肽的純化方法。
本發(fā)明特別優(yōu)選的是適合本發(fā)明的糖類而選用的純化技術(shù)和方法?？梢岳缤ㄟ^選擇偏酸性流份的離子交換軟凝膠色譜或使用陽離子或陰離子交換樹脂的HPLC來富集含唾液酸分子的本發(fā)明要求的糖基形式。
IV.糖蛋白分析根據(jù)需要，利用糖類分析的常規(guī)技術(shù)可方便地分析本發(fā)明方法產(chǎn)生的糖蛋白中的復(fù)合糖類部分。這樣，例如本領(lǐng)域眾所周知的凝集素印跡等技術(shù)揭示末端的甘露糖或其它糖例如葡萄糖的比例。利用本領(lǐng)域眾所周知的無水肼法或酶法和利用離子交換或大小排阻色譜或其它方法進(jìn)行的寡糖分級分離，通過糖從蛋白質(zhì)中的釋放來證實唾液酸是單、雙、三或四-觸角寡糖的未端。還可以在用神經(jīng)氨酸酶處理去除唾液酸之前或之后測定糖蛋白的pI。神經(jīng)氨酸酶處理之后pI的升高表示在糖蛋白上存在唾液酸。
本發(fā)明的糖類結(jié)構(gòu)被表達(dá)為N-連接或O-連接的糖類位于蛋白質(zhì)上。N-連接和O-連接的糖類主要區(qū)別在它們的核心結(jié)構(gòu)。N-連接的糖基化指糖部分通過GlcNAc與肽鏈中的天冬酰胺殘基連接。N-連接的糖類都含有一個Manl-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R的共有核心結(jié)構(gòu)。所以，在上述核心結(jié)構(gòu)中，R代表生成的蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基。生成的蛋白質(zhì)的肽序列將包含天冬酰胺-X-絲氨酸，天冬酰胺-X-蘇氨酸，和天冬酰胺-X-半脫氨酸，其中的X是脯氨酸之外的任意氨基酸。相對地，O-連接的糖類其特征在于GlaNAc與蘇氨酸或絲氨酸的羥基連接的共有核心結(jié)構(gòu)。對N-連接和O-連接的糖類來說最重要的是復(fù)合的N-和O-連接的糖類。這樣的復(fù)合糖類包含數(shù)個觸角結(jié)構(gòu)。單、二、三和四-外部結(jié)構(gòu)對添加末端唾液酸來說十分重要。這樣的外部鏈結(jié)構(gòu)為構(gòu)成本發(fā)明糖類的特定的糖和連接提供了額外的位點。
形成的糖類可以利用任意本領(lǐng)域的已知方法，包括本文所述的方法來分析。有數(shù)種糖基化分析方法是本領(lǐng)域已知的并被用于本發(fā)明。這些方法提供了有關(guān)與肽連接的寡糖的同一性和組成的信息。用于本發(fā)明的糖類分析方法包括但不限于凝集素色譜；使用高pH陰離子交換色譜根據(jù)電荷來分離寡糖的HPAEC-PAD；NMR；質(zhì)譜；HPLC；GPC；單糖組成分析；順序酶消化。
此外，寡糖釋放技術(shù)是已知的。這些技術(shù)包括1)酶法，通常用肽-N-糖苷酶F/內(nèi)-β-半乳糖苷酶；2)利用苛性堿環(huán)境來釋放主要為O-連接的結(jié)構(gòu)的β消去法；和3)使用釋放N-連接和O-連接的寡糖的無水肼的化學(xué)方法。
可以使用以下步驟來進(jìn)行分析1.用去離子水透析樣品，以去除所有的緩沖鹽，然后冷凍干燥。
2.用無水肼法釋放完整的寡糖鏈。
3.用無水甲醇HCl處理完整的寡糖鏈，釋放出O-甲基衍生物形式的單個單糖。
4.N-乙?；我獗匦璋被?br> 5.衍生成過氧-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。
6.在CP-SIL8柱上利用毛細(xì)GLC(氣-液色譜)分離上述衍生物。
7.利用GLC的滯留時間和質(zhì)譜，與已知標(biāo)準(zhǔn)物比較鑒定各糖苷衍生物。
8.通過利用內(nèi)標(biāo)(13-O-甲基-D-葡萄糖)的FID定量各衍生物。
可以利用高性能陰離子交換色譜結(jié)合脈沖安培計(HPAE-PAD糖系統(tǒng)，Dionex Corp.)測定中性的和氨基糖。例如，可以于100℃在20％(v/v)三氟乙酸中水解6小時來釋放糖。然后通過冷凍干燥或用Speed-Vac(Savant Instruments)干燥水解產(chǎn)物。然后將殘留物溶解在1％的三水合乙酸鈉溶液中，并在HPLC-AS6柱上如Anumula等所述(《生物化學(xué)記要》195269-280(1991))進(jìn)行分析。
可以用Yao等的方法(《生物化學(xué)記要》179332-335(1989))分別在三份樣品中直接測定唾液酸。在優(yōu)選實施方式之一中，使用的是Warren，L.J.《生物化學(xué)雜志》238(8)(1959)所述的巴比妥酸(TBA)。
或者，可以進(jìn)行免疫印跡糖類分析法。根據(jù)該方法，利用上述的聚糖檢測系統(tǒng)(Boehringer)來檢測與蛋白質(zhì)結(jié)合的糖類，該系統(tǒng)以Haselbech和Hosel所述的氧化性免疫印跡法(Haselbeck等，《糖結(jié)合物雜志》(Glycoconjugate J.)763(1959))為基礎(chǔ)。按照制造商的建議進(jìn)行染色，所不同的是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯薄膜上而不是硝酸纖維素薄膜，而且封閉緩沖液中含有溶于10mM pH7.4、含0.9％氯化鈉的Tris緩沖液中的5％胎牛血清白蛋白。用與堿性磷酸鹽結(jié)合物連接的抗洋地黃毒苷抗體進(jìn)行檢測，抗體按1∶1000稀釋在tris緩沖液中，該緩沖液使用了溶于100mM pH9.5、含100mM氯化鈉和50mM氯化鎂的tris緩沖液中的磷酸酶底物4-硝基藍(lán)四唑氯0.03％(w/v)和5-溴-3-吲哚基磷酸酯0.03％(w/v)。通常，約10至15分鐘后可以看到含糖類的蛋白質(zhì)條帶。
還可以利用肽-N-糖苷酶F來分析糖類。根據(jù)該方法，殘留物被懸浮在含0.18％SDS，18mM β-巰基乙醇，90mM磷酸鹽，3.6mM EDTA，pH8.6的14μl緩沖液中，并在100℃加熱3分鐘。冷卻至室溫后，將樣品分成兩等份。一份不經(jīng)處理作為對照。另一份調(diào)節(jié)至含1％NP-40去垢劑，然后用0.2單位肽-N-糖苷酶F(Boehringer)處理。將兩份樣品均在37℃保溫2小時，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
V.腫瘤壞死因子受體免疫球蛋白嵌合物在優(yōu)選實施方式之一中，本發(fā)明方法被用于產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體(TNFR)-免疫球蛋白(Ig)嵌合物。在這類嵌合蛋白中特別好的是可溶性1型TNFR-IgG1。生成的TNFR-IgG1常被用于治療和診斷多種由TNF介導(dǎo)或與TNF相關(guān)的疾病和紊亂?！爸委煛痹诒疚闹型瑫r包括防治(預(yù)防)、抑制(例如某種癥狀)和治療表現(xiàn)出的病癥。與TNF相關(guān)的病理狀況包括但不限于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌、內(nèi)毒素性休克、移植排斥現(xiàn)象、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性狼瘡、Crohn氏癥和其它與TNF相關(guān)的自身免疫和炎性疾病。
本發(fā)明的TNFR1-IgG1?？捎糜诒话l(fā)現(xiàn)用TNF的單克隆抗體有效的指征中。例如，在動物模型中，TNF-α的單克隆抗體被發(fā)現(xiàn)在預(yù)防性使用時具有保護(hù)作用(Tracey，K.J.等(1987)《自然》(Nature)330662)。在I期臨床研究中，據(jù)Exley，A.R.等在(1990)《柳葉刀》(Lancet)3351275中報道，針對人重組TNF-α的小鼠單克隆抗體在給嚴(yán)重敗血性休克病人使用時是安全的。TNFR1-IgG1適合用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和敗血性休克。
在治療與TNF相關(guān)的疾病或紊亂的方法中，給需要這種治療的病人使用治療有效量的TNFR1-IgG1制劑。
本發(fā)明中，用于治療疾病或紊亂的TNFR-IgG1糖基化制劑的有效量在0.01-100mg/病人的范圍內(nèi)；1mg-75mg/病人更好，最好是約10至約50mg/病人。
為了使用，需將TNFR1-IgG1制劑配制成合適的藥物或治療性組合物。這類組合物通常包含治療有效量的TNFR1-IgG1制劑和藥學(xué)上認(rèn)可的賦形劑或載體例如生理鹽水、緩沖鹽、葡萄糖或水。組合物還可以包含特定的穩(wěn)定劑例如糖，其中包括甘露糖和甘露糖醇，和針劑組合物中的局部麻醉劑，其中包括例如利多卡因。
本發(fā)明提供進(jìn)一步包含治療有效量的其它活性成份的組合物，這些成份例如與TNF生成有關(guān)的單克隆抗體(例如抗TNF抗體，Mac1或LFA1的抗體)或其它受體，例如IL-1或IL-2受體等。
一種如上所述用于單一或聯(lián)合療法的較好的組合物包含本發(fā)明新的TNFR1-IgG1制劑，它表現(xiàn)為從血液中清除被延遲，同時保持著很高的功能活性。這樣被延長的功能性半衰期允許使用簡單的彈丸劑型，而且有利于其在體內(nèi)的效力。治療組合物中較好的TNFR1-IgG1嵌合物包括TNFR1-IgG1和本文所述的制劑，例如(1)包含一個或多個唾液酸未端的復(fù)合寡糖的TNFR1-IgG1制劑；(2)經(jīng)色譜聚焦測得的制劑等電點pI范圍在5.5至7.5之間的TNFR1-IgG1制劑，在所述的測試中，pI對神經(jīng)氨酸酶處理敏感；(3)每摩爾蛋白質(zhì)具有約1至2摩爾暴露的N-乙?；咸前窔埢腡NFR1-IgG1制劑；(4)唾液酸與蛋白質(zhì)的摩爾比約為4至7，更好的是5至6的TNFR1-IgG1制劑；(5)唾液酸與N-乙?；咸前窔埢哪柋燃s為0.35至約0.5，更好的是約0.4至0.45的TNFR1-IgG1制劑。
本發(fā)明單一或合用治療組合物的使用途徑包括標(biāo)準(zhǔn)途徑，例如靜脈輸注或彈丸注射。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的TNFR1-IgG1制劑在生產(chǎn)治療人或動物的藥物中的用途。
以上已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了全面的說明，參照以下說明性實施例將對本發(fā)明有更為清晰的理解，除非另作說明，這些實施例都不對本發(fā)明構(gòu)成限制。
實施例TNF-α和TNF-β的生物作用是通過特異性受體介導(dǎo)的(Dembic等，(1990)《細(xì)胞因子》(Cytokines)2231)。分子克隆已經(jīng)證明存在著兩種不同類型的TNF，表觀分子量分別為55千道爾頓(KD)(1型)(Schall等，(1990)《細(xì)胞》(Cell)61361)和75KD(2型)(Smith等，1990《科學(xué)》(Science)2481019)，每一種天然地與TNF-α和TNF-β都結(jié)合(Loetscher等，(1990)《細(xì)胞》(Cell)61351；Shall等，(1990)《細(xì)胞》(Cell)61361；Kohno等，(1990)《美國科學(xué)院院報》878331)。兩種受體的胞外部分被發(fā)現(xiàn)在天然條件下是可溶性的TNF結(jié)合蛋白(Kohno等，同上)。已經(jīng)開發(fā)出了在多種免疫和炎性病癥中抑制TNF的損傷作用的TNF的拮抗劑(Peppel等，(1991)《實驗醫(yī)學(xué)雜志》(J.Exp.Med)1741483-1489；Ulich，(1993)《美國病理學(xué)雜志》(Am.J.Path.)1421335-1338；Howard，O.M.Z.，(1993)《美國科學(xué)院院報》902335-2339；Wooley，P.H.，(1993)《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1516602-6607)。這類拮抗劑之一合并了人的55KD1型TNF的胞外區(qū)與人免疫球蛋白G1重鏈的鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)(Wemer等，(1991)《細(xì)胞生物學(xué)雜志摘要，第20屆年會》(J.Cell.Biochem.Abstract，20th annual meeting)p.115)。
方法A.細(xì)胞系用作宿主細(xì)胞系的中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)來源于CHO-K1(ATCC No.CCL61 CHO-K1)。使用CHO-K1的突變型二氫葉酸還原酶缺陷細(xì)胞系CHO-K1DUX-B11(DHFR)(由哥侖比亞大學(xué)的L.Chasin博士提供；Simonsen，C.C.和Levinson，A.D.(1983)《美國科學(xué)院院報》802495-2499；Urlaub G.和Chasin，L.(1980)《美國科學(xué)院院報》774216-4220)，經(jīng)包含編碼前胰島素原的cDNA轉(zhuǎn)染后制得對胰島素需求降低的細(xì)胞系(Sures等，(1980)《科學(xué)》20857-59)。選出的dp12.CHO克隆其生長需要甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶，由此證實其DHFR基因型。
B.可溶性1型TNFR1-IgG1嵌合物的構(gòu)建通過將人1型TNFR的胞外區(qū)與IgG1重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2及CH3區(qū)基因融合(后文稱為TNFR1-IgG1)來構(gòu)建可溶性1型嵌合物。
從質(zhì)粒pRK-TNF-R(Schall等，《細(xì)胞》61361(1990))上獲取編碼人1型TNFR的DNA序列(參見Loetscher等，同上)。為了構(gòu)建該起始質(zhì)粒，將一段2.1kb的胎盤cDNA克隆((Schall等，同上)插入到哺乳動物表達(dá)載體pRK5中，于1989年3月15日公開的EP Pub.No.307,247中記述了該構(gòu)建物。這段cDNA起始于Loetscher等報道的序列中第64位核苷酸，在起始甲硫氨酸上游118bp。
IgG1編碼序列的來源是CD4-IgG表達(dá)質(zhì)粒pRKCD42FCl(Capon，D.J.等，《自然》(Nature)337525(1989)；Byrn等，《自然》344，667(1990))，其中含有一段編碼一種雜交多肽的cDNA序列，該多肽由成熟人CD4蛋白的1-180殘基(兩個N-末端CD4可變區(qū))和從第216位天冬氨酸開始(以第114位氨基酸作為重鏈恒定區(qū)(Kabat等，《具有免疫學(xué)意義的蛋白質(zhì)序列》(Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest)第4版(19867))的第一個殘基，該殘基在半胱氨酸殘基參與重鏈-輕鏈結(jié)合后成為IgG1鉸鏈區(qū)的第一個殘基)到第441位殘基結(jié)束之間包含IgG1的CH2及CH3區(qū)的人IgG1序列融合而成。
如下構(gòu)建TNFR-IgG1，從質(zhì)粒pRK-TNF-R和pRKCD42FC1產(chǎn)生限制性酶切片段，將它們連接，利用缺失誘變使得成熟TNFR第171位的蘇氨酸殘基與IgG1重鏈(Kabat等，同上)第216位的天冬氨酸殘基并列。形成的質(zhì)粒pRKTNFR-IgG包含了全長的TNFR-IgG1編碼序列。
C.細(xì)胞培養(yǎng)通過轉(zhuǎn)染將編碼可溶性1型TNFR1-IgG1的基因引入dp12CHO細(xì)胞。利用用于將DNA引入哺乳動物細(xì)胞的磷酸鈣技術(shù)來完成該過程。轉(zhuǎn)染后2天，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，平鋪在選擇性培養(yǎng)基(不含甘氨酸-次黃嘌呤和胸腺嘧啶的HamF12 DMEM培養(yǎng)基，1∶1 v/v，含2％透析過的血清)中。然后篩選分泌TNFR1-IgG1的分離體。在氨甲喋呤高產(chǎn)率表達(dá)克隆中擴(kuò)增表達(dá)TNFR1-IgG1的克隆，然后使之適應(yīng)無血清的培養(yǎng)基。讓這些細(xì)胞處于連續(xù)選擇壓力之下，直至轉(zhuǎn)移至用于接種物的生長和擴(kuò)增的非選擇性培養(yǎng)基中。
為了提供用于產(chǎn)生TNFR1-IgG1培養(yǎng)物的細(xì)胞，以上所述的細(xì)胞在體積不斷增加的容器中，通過連續(xù)的亞培養(yǎng)，在含氨甲喋呤的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，然后生長在不含氨甲喋呤的培養(yǎng)基中。用于本方法以上步驟的非選擇性生長培養(yǎng)基是DMEM/HAMF-12基本配方(參見例如美國專利5,122,469)，但改變其中某些組分的濃度，例如葡萄糖、氨基酸、鹽、糖、維生素、甘氨酸、次黃嘌呤和胸腺嘧啶；重組人胰島素、水解蛋白胨(Primatone HS或Primatone RL)、細(xì)胞保護(hù)劑例如Pluronic F68(Pluronic多元醇)或其它保護(hù)劑；慶大霉素；脂類和微量元素。
用CO2氣體(酸)和/或Na2CO3(堿)將培養(yǎng)物控制在pH7.2±0.4。生長期的溫度控制在近37℃。直接通空氣和/或氧氣來將溶解氧維持在空氣飽和度的5％以上。
維持接種物擴(kuò)增期的滲透摩爾濃度在約250mOsm至350mOsm之間。
每一次培養(yǎng)的生長期之后都繼之以第二期或過渡期，在此期間，培養(yǎng)參數(shù)由最適于生長向生產(chǎn)條件轉(zhuǎn)變。在過渡期，培養(yǎng)系統(tǒng)的溫度通常下降至約30至35℃之間。加入丁酸鹽并使用一定的滲透摩爾濃度范圍。分析在該生產(chǎn)期積累的產(chǎn)物中唾液酸的含量。
在一種典型的生產(chǎn)程序中，約1.2×106個來自選擇階段接種物擴(kuò)增的細(xì)胞在生長期進(jìn)行生長，起始滲透摩爾濃度為300mOsm。在生長培養(yǎng)基中補(bǔ)充微量元素、重組人胰島素和水解蛋白胨。細(xì)胞在此條件下生長2天。在第3天開始時降低細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度。在改變溫度的同時或其后在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入丁酸鈉，并通過加入各種培養(yǎng)基組分來調(diào)節(jié)到要求的生產(chǎn)滲透摩爾濃度。在此條件下并結(jié)合補(bǔ)料培養(yǎng)細(xì)胞9至10天。在必要時為細(xì)胞補(bǔ)加各種培養(yǎng)基成份。
表I說明了各生產(chǎn)過程的生產(chǎn)條件。過程 丁酸鹽生產(chǎn)期 第5至第10天的第10天TNFRl-IgG1中的濃度 滲透摩爾濃度細(xì)胞比生產(chǎn)率 唾液酸含量(mmol/l) (mOsm/kg) (pg/d) (mol/mol)A1360-420 0.6-1.5 6.4-7.2N＝4B1480-510 1.7-2.2 6.0-6.3N＝3C6460 4.8 4.7N＝1D6370-420 2.4-2.8 5.5-5.6N＝3E6350-370 1.4-2.3 5.4-6.3N＝3F12 390 4.0 5.3N＝1G12 490-510 2.9-5.2 4.0-5.2N＝4H12 400-430 2.0-2.8 5.8-6.0N＝3I12 370-380 2.0-2.2 5.5-5.9N＝3
D.TNFR1-IgG1的回收按照Capon等，同上所述，利用固定化金黃色葡萄球菌蛋白A的親和色譜將TNFR1-IgG1嵌合物純化至同源性95％以上。
E.糖類的分析利用Warren，L(1959)《生物化學(xué)雜志》2341971-1975中的方法分析唾液酸含量。
結(jié)果表I中每一批生產(chǎn)培養(yǎng)物的細(xì)胞比生產(chǎn)率都對收獲的產(chǎn)物中的唾液酸含量作圖。結(jié)果列于圖1。當(dāng)過程參數(shù)被維持在生產(chǎn)滲透摩爾濃度約360至420mOsm之間而丁酸鹽濃度約為1mM時，觀察到了最高唾液酸含量。通過調(diào)節(jié)過程參數(shù)可在一較寬的范圍內(nèi)控制唾液酸含量。
實施例II測定不同制劑的血漿藥物動力學(xué)半衰期和/或清除速度。一般，唾液酸高含量制劑表現(xiàn)出比唾液酸低含量制劑高的血漿半衰期和/或較低的總清除速度。
方法將17個重272-315g的雄性Sprague-Dawley衍生的大鼠隨機(jī)分成3個TNFR1-IgG1融合蛋白處理組(每組的N＝5或6)。利用股靜脈插管給動物靜脈輸注5mg/kg正常劑量的測試物。選擇的測試物包括兩種來自過程I的TNFR1-IgG1制劑，即生產(chǎn)期的丁酸鹽濃度為6mM而滲透摩爾濃度維持在約400mOsm，和來自過程II的第3種TNFR1-IgG1制劑，即生產(chǎn)期的丁酸鹽濃度約為12mM而滲透摩爾濃度約為500mOsm。在輸注前和輸注后5分鐘及2、6、10、24、34、48、56、72、96和120小時采集2ml的血樣加到EDTA(8.5％)上。離心血樣，收集血漿，測定血漿中TNFR1-IgG1融合蛋白的濃度。
使用酶聯(lián)免疫和生物結(jié)合測定法(ELIBA)來定量大鼠血漿中TNFR1-IgG1。該測定方法以與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的TNF-α(TNF-α-HRP)結(jié)合TNFR1-IgG1融合蛋白的受體部分的能力為基礎(chǔ)。在該測定中，用包被在微量滴定板孔中的山羊抗人IgGFc的Fab片段通過與分子的Fc部分相互作用來捕獲TNFR1-IgG1。在孔中加入TNF-α-HRP使之與捕獲到的TNFR1-IgG1的受體部分結(jié)合。通過測定過氧化物酶和過氧化物及正苯二胺(OPD)底物間反應(yīng)產(chǎn)生的顏色來定量。測定的量級為0.003至0.02mg/ml。存在于血漿樣品中的EDTA經(jīng)證明對測定的性能沒有影響。
標(biāo)定劑量以計算用藥溶液濃度差異。全部計算都以相對于120小時時間點內(nèi)時間數(shù)據(jù)的濃度為基礎(chǔ)。利用梯形法則計算曲線下的截面積(AUC0-120)，計算重量標(biāo)定的截清除速度(CL0-120/W)，即劑量/AUC0-120。
結(jié)果清除速度根據(jù)過程的不同(過程I與過程II比較)和產(chǎn)物中唾液酸含量的不同而不同。下文表II列出了由以上研究測得的動物個體的清除速度和得到的平均值與標(biāo)準(zhǔn)偏差。過程I表現(xiàn)出較低、較理想的清除速度。
表II清除0-120(ml/hr/kg)過程I過程I過程II2.12 2.08 2.1442.03 2.31 2.991.63 2.20 2.611.89 2.22 3.271.85 1.99 2.821.66 3.42平均值1.91 2.08 2.88標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.02 0.23 0.45實施例IIITNFR1-IgG1的單糖組成對實施例I中制備的TNFR1-IgG1的寡糖的糖組成和結(jié)構(gòu)測定顯示，不同過程的唾液酸含量是不同的。快速的血漿清除與GlcNAc的高度暴露、寡糖鏈上的低唾液酸含量和蛋白質(zhì)對甘露糖或半乳糖受體的(根據(jù)推斷的)可接近性相關(guān)。較慢的血漿清度與多末端唾液酸殘基相關(guān)。
A.測試物的來源按照實施例I中所述的方法生產(chǎn)TNFR1-IgG1。從在生產(chǎn)期使用6mM丁酸鹽和約400mOsm滲透摩爾濃度的細(xì)胞培養(yǎng)物制取過程I物質(zhì)。從在生產(chǎn)期使用12mM丁酸鹽和約500mOsm滲透摩爾濃度的細(xì)胞培養(yǎng)物制取過程II物質(zhì)。
B.方法利用高pH陰離子交換色譜結(jié)合以脈沖安培計檢測來測定完整的中性和氨基-糖的釋放。使用以下步驟進(jìn)行檢測1.用TNFR1-IgG1(約50μg/ml)和合適的參照樣品進(jìn)行緩沖交換，使得最終樣品被包含在1％乙酸中。
2.在于冰和乙醇浴中冷凍約90μg的TNFR1-IgG1和參照物樣品，然后通宵冷凍干燥凍結(jié)后的樣品。
3.將冷凍干燥的樣品再生在500μl三氟乙酸中，在120℃溫育1小時。
4.酸水解之后，冷卻TNFR1-IgG1和參照樣品，并蒸發(fā)至干燥。
5.樣品用水再生，至最終濃度約0.6mg/ml。
6.使用一根Dionex CarboPac PA1(4×250mm)柱(Dionex Corp.，Sunnyvale，CA)，在環(huán)境溫度下利用高pH陰離子交換色譜結(jié)合以脈沖安培計檢測來分離單糖。
7.通過與參照單糖的比較來定量各種單糖。
C.結(jié)果表III列出了兩種制劑中每種單糖的相對摩爾濃度。
表III兩種TNFR1-IgG1制劑中單糖的相對摩爾濃度單糖 過程I 過程II果糖 4.3±0.2 4.4半乳糖6.5±0.0 4.7甘露糖12.2±0.6 12.5N-乙酰基葡糖胺14.1±0.6 14.3唾液酸4.9±0.3 3.7±0.3N-乙?；肴樘前? 0.5±0.1 0.3唾液酸/GlcNAc之比 0.35 0.26
以上結(jié)果表明，選擇用于糖蛋白生產(chǎn)期的過程參數(shù)影響著成熟糖蛋白的糖組成。具有較高唾液酸含量的制劑通常表現(xiàn)出被延遲的血清半衰期。
下文表IV和V表明在過程I和過程H型條件下產(chǎn)生的TNFR1-IgG1嵌合物制劑中寡糖側(cè)鏈的糖組成。表V給出減去FC的糖基化位點后嵌合物分子受體部分的糖數(shù)據(jù)。
表IVPI PI PI PI PIIPII唾液酸5.85.85.75.83.73.5果糖 4.04.03.64.14.44.3GalNAc0.30.20.20.40.30.4Glc NAc 12.9 15.0 14.8 14.3 14.3 14.4Gal 7.47.67.17.04.74.1Man 12.0 12.0 10.0 12.0 12.5 11.9SA/GlcNAc之比 0.45 0.39 0.39 0.41 0.26 0.24表VPII PIIPI PI暴露的GlcNAc3.183.21.111.32(摩爾/摩爾)暴露的Gal 0.97-0.08 1.45-0.26(摩爾/摩爾)Gal觸角 4.474.72 6.456.24唾液酸(摩爾-1) 3.5 4.85.006.5表IV和表V中的結(jié)果表明，TNFR1-IgG1的組成是典型的唾液酸為未端的單、雙和三觸角復(fù)合寡糖?？梢酝茢啵蛇^程I制備的TNFR1-IgG1含有很高比例的唾液酸和很低比例的暴露的GlcNAc。每摩爾蛋白質(zhì)中的唾液酸表明該物質(zhì)具有比過程II產(chǎn)生的物質(zhì)低的等電點。與表II的結(jié)果比較，以上結(jié)果還證明過程I物質(zhì)較慢的血漿清除總是與較低的暴露的GlcNAc含量和較高的唾液酸含量相關(guān)。
表IV和表V表明，TNFR1-IgG1制劑包含以一個或多個唾液酸殘基為未端的復(fù)合寡糖。較佳的TNFR1-IgG1制劑包含每摩爾蛋白質(zhì)上具有約1至2摩爾暴露的N-乙?；咸前窔埢腡NFR1-IgG1分子。唾液酸與蛋白質(zhì)的摩爾比約為4至7。TNFR1-IgG1制劑的唾液酸與N-乙酰基葡糖胺的摩爾比約為0.4至0.45。
實施例IV重度唾液酸化的制劑的pI比輕度唾液酸化的制劑的低。
方法對實施例II中的各種制劑進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦凝膠電泳利用pH不同的兩性電解質(zhì)產(chǎn)生的pH梯度，根據(jù)糖蛋白的等電點pI將它們分離。在該研究中，使用10至4的pH梯度進(jìn)行制劑的分析。
結(jié)果經(jīng)色譜聚焦測定，TNFR1-IgG1制劑的等電點范圍約為5.5至7.5，在該測定中pI對神經(jīng)氨酸酶處理敏感。
不論是否具體與本文結(jié)合，以上引用的參考文獻(xiàn)都作為參考結(jié)合在本發(fā)明中。
雖然結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明進(jìn)行了說明，但顯然它還可以進(jìn)一步修改。本申請的目的在于覆蓋在總體上遵循本發(fā)明原理的任何形式的改變、用途或適應(yīng)性修改，包括雖然與在此公開的內(nèi)容不同但可以由本發(fā)明所述領(lǐng)域的已知技術(shù)或常規(guī)技術(shù)得出的結(jié)果，以及后文權(quán)利要求范圍內(nèi)的實質(zhì)性特征。
權(quán)利要求
1.調(diào)控由哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的糖蛋白中寡糖側(cè)鏈上唾液酸含量的方法，它包括i)在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入濃度約0.1mM至約20mM的鏈烷酸或其鹽；和ii)將細(xì)胞培養(yǎng)物的滲透摩爾濃度維持在約250至600mOsm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在其中提高糖蛋白中寡糖側(cè)鏈上的唾液酸含量，而其中通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在約0.1至約6mM的鏈烷酸或其鹽濃度中，并維持滲透摩爾濃度為約300至450mOsm來降低細(xì)胞培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中的鏈烷酸或其鹽是丁酸鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中產(chǎn)生的糖蛋白是哺乳動物糖蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中的糖蛋白是腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白嵌合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是用含編碼可溶性1型腫瘤壞死因子免疫球蛋白G1嵌合物的cDNA的載體轉(zhuǎn)染的dp12.CHO細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在其中降低糖蛋白中寡糖側(cè)鏈上的唾液酸含量，而其中通過將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在約6至約12mM的鏈烷酸或其鹽濃度中，并維持滲透摩爾濃度為約450至600mOsm來提高細(xì)胞培養(yǎng)物的比生產(chǎn)率。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中的鏈烷酸或其鹽是丁酸鈉。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中產(chǎn)生的糖蛋白是哺乳動物糖蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中的糖蛋白是腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白嵌合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是用含編碼可溶性1型腫瘤壞死因子免疫球蛋白G1嵌合物即TNFR1-IgG1嵌合物的cDNA的載體轉(zhuǎn)染的dp12.CHO細(xì)胞系。
14.產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白即TNFR1-IgG1嵌合蛋白的方法，它包括(a)在生長期培養(yǎng)表達(dá)TNFR1-IgG1嵌合物的哺乳動物宿主細(xì)胞，在一定的條件下培養(yǎng)一定的時間以便獲取最大程度的細(xì)胞生長；(b)在生產(chǎn)期，在有約6mM至12mM丁酸鈉存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(c)將生產(chǎn)期的滲透摩爾濃度維持在約450至600mOsm。
15.產(chǎn)生腫瘤壞死因子受體-免疫球蛋白即TNFR1-IgG1嵌合蛋白的方法，它包括(a)在生長期培養(yǎng)表達(dá)TNFR1-IgG1嵌合物的哺乳動物宿主細(xì)胞，在一定的條件下培養(yǎng)一定的時間以便獲取最大程度的細(xì)胞生長；(b)在生產(chǎn)期，在有約1mM至6mM丁酸鈉存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(c)將生產(chǎn)期的滲透摩爾濃度維持在約300至450mOsm。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中的宿主細(xì)胞是dp12.CHO細(xì)胞。
18.包含用權(quán)利要求17所述的方法產(chǎn)生的TNFR1-IgG1的制劑。
19.包含用權(quán)利要求15所述的方法產(chǎn)生的TNFR1-IgG1和藥學(xué)上可接受的賦形劑的治療組合物。
20.包含TNFR1-IgG1分子的TNFR1-IgG1制劑，其中TNFR1-IgG1分子的唾液酸與蛋白質(zhì)的摩爾比約為4至7。
21.包含TNFR1-IgG1分子的TNFR1-IgG1制劑，其中TNFR1-IgG1分子具有每摩爾TNFR1-IgG1分子約1至2摩爾的暴露的N-乙?；咸前窔埢?br> 22.包含TNFR1-IgG1分子的TNFR1-IgG1制劑，其中TNFR1-IgG1分子的唾液酸與N-乙酰基葡糖胺的摩爾比約為0.35至0.5。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的TNFR1-IgG1制劑，其中唾液酸與N-乙酰基葡糖胺的摩爾比約為0.39至0.45。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的利用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物來制備糖蛋白的方法,其中通過控制細(xì)胞培養(yǎng)條件來在一個較寬的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的糖蛋白中唾液酸的含量。本發(fā)明提供了這樣一些方法,即通過改變影響細(xì)胞比生產(chǎn)率的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)來改變糖蛋白中的唾液酸含量。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式包括在細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期調(diào)控其中的滲透摩爾濃度和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子濃度的細(xì)胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明還提供了新的可溶性1型腫瘤壞死因子免疫球蛋白G1制劑,及其在治療炎性或免疫相關(guān)性疾病中的用途。
文檔編號C07K19/00GK1186514SQ96194449
公開日1998年7月1日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者T·埃切韋里, T·里爾, W·萊斯勞爾, T·施萊特穆勒, W·里克特 申請人:基因技術(shù)股份有限公司, 豪夫邁－羅須控股公司