動(dòng)物中性成熟的控制的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本專利申請(qǐng)要求于2012年10月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/720, 187號(hào)和于 2013年8月27日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/870, 510號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其在此通過(guò)引入并入本 文。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦政府支持的研究的聲明
[0004] 本文所記載的工作的方面由國(guó)立健康研究所撥款號(hào)1R43RR033149-01A1和 USDA-國(guó)立食品和農(nóng)業(yè)研究所生物技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目競(jìng)爭(zhēng)撥款號(hào)2012-33522-19766支持。 美國(guó)政府可具有本發(fā)明的某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
技術(shù)領(lǐng)域 [0005] 涉及生產(chǎn)和飼養(yǎng)動(dòng)物（包括家畜）的方法，其中家畜是遺傳修飾的，從而 它們保持性不成熟的，除非經(jīng)過(guò)處理而變得成熟。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 在優(yōu)化育種和分娩方面，常規(guī)家畜飼養(yǎng)實(shí)踐關(guān)注性成熟在家畜中的作用。例如，對(duì) 于牛群而言，已知在性成熟時(shí)期管理小母?？梢燥@著地影響其終生的生產(chǎn)能力且應(yīng)該精心 策劃。性發(fā)育的最佳過(guò)程已經(jīng)成為許多研究的對(duì)象，傳統(tǒng)知識(shí)認(rèn)為早于第一年繁殖和產(chǎn)犢 的小母牛具有更佳的生存期產(chǎn)量，以及生產(chǎn)總花費(fèi)的降低成本高達(dá)初始產(chǎn)犢。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本文提供了 一種與傳統(tǒng)實(shí)踐不同的方法，該方法無(wú)限期地、永久地延緩家畜 (livestock)的性成熟，或直到當(dāng)經(jīng)過(guò)處理時(shí)才性成熟。已經(jīng)用這些方法處理魚(yú)和豬，這些 處理的結(jié)果在本文中列出，包括活的克隆的建立者動(dòng)物（founder animals)。高效和精確的 基因編輯在某些商業(yè)上重要的基因座中得以實(shí)現(xiàn)。編輯的效率足夠高使得無(wú)需連鎖的選擇 標(biāo)記即可做出這些改變。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動(dòng)物，所述基因組 包含性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因的失活（inactivation of a neuroendocrine gene selective for sexual maturation)，該失活的基因阻止動(dòng)物性成熟。
[0011] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動(dòng)物，所述基因組在 性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因的失活上是雜合的，其中失活基因純合的子代因而被阻止 成為性成熟（wherein progeny homozygous for the inacitivated gene are thereby prevented from becoming sexually mature)〇
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為一種生產(chǎn)家畜動(dòng)物的方法，包括向選自由家畜細(xì)胞和家 畜胚胎組成的組的生物（orgainsm)中引入試劑（agent)，其特異結(jié)合細(xì)胞染色體革EU立點(diǎn)并 導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂以失活性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因，且所述試劑選自由TALEN、鋅指 核酶和重組酶融合蛋白組成的組。
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為一種飼養(yǎng)家畜動(dòng)物的方法，包括向動(dòng)物施用藥劑以使 動(dòng)物性成熟，該藥劑補(bǔ)償動(dòng)物性成熟的遺傳失能（with the agent compensating for a genticinabilityoftheanimaltosexuallymature)〇
[0014] 下列專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用以所有目的并入本文；發(fā)生沖突時(shí)，本說(shuō)明書(shū)約束： US2010/0146655、US2010/0105140、US2011/0059160、US2011/0197290 和 US2013/0117870。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1.是生產(chǎn)和使用為了控制成熟而遺傳修飾的動(dòng)物的方法的示例圖。
[0017] 圖2 :通過(guò)測(cè)序確認(rèn)Belgian Blue的基因滲入（introgression)。圖示了 Wagyu野 生型⑶F8和Belgian Blue模板（BB-HDR)。用位于同源臂外部的引物（c和d)對(duì)5個(gè)PCR 陽(yáng)性集落進(jìn)行PCR，接著進(jìn)行克隆及用引物b'測(cè)序。與野生型序列的比較證實(shí)了在5個(gè)集 落的4個(gè)中，存在預(yù)期的Belgian Blue等位基因（雜合）特征性的11個(gè)堿基對(duì)的缺失。
[0018] 圖3:使用mRNA編碼的TALENs和ssODN將天然存在的等位基因從一個(gè)物種 (species)基因滲入到另一個(gè)物種。皮埃蒙特肌肉生長(zhǎng)抑制素（Piedmontese Myostatin) 等位基因C313Y被基因滲入Ossabaw中。
[0019] 圖4:革巴定基因（targeted gene)的修飾。每個(gè)圖表（chart)展示了革巴向成纖維 細(xì)胞中特定基因座的結(jié)果（即，ssIL2RG;"ss"代表野豬（Sus scrofa)，且"bt"代表普 通牛（Bos taurus))。（插圖）寡核酸（oligo)模板的圖表（diagrams)，其中陰影框代表 TALEN-結(jié)合位點(diǎn)且間隔子以白色示出。通過(guò)RFLP分析在第3天和第10天檢測(cè)HDR (Day3 % HDR和DaylO% HDR)。每個(gè)棒展示了三次重復(fù)的平均值和SEM。
[0020] 圖5 :TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析。源于TALEN mRNA和經(jīng)寡核酸轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞群的靶位點(diǎn)側(cè)翼的PCR擴(kuò)增子（共200-250bp)通過(guò)ILLUMINA測(cè)序儀測(cè)序。每樣本 的總讀取計(jì)數(shù)從10, 〇〇〇到400, 000。完美的預(yù)期的HR讀數(shù)計(jì)數(shù)相對(duì)于野生型測(cè)序數(shù)據(jù)被 繪制為插入（小圖a)和SNP等位基因（小圖b)。在下面表明靶基因座、時(shí)間點(diǎn)和是否BMs 包括在寡核酸中。小圖c)對(duì)bt⑶F8和p65的讀數(shù)（reads)分選靶SNP的摻入，然后分類 目的的（iSNP)與那些具有額外突變的（iSNP+Mut)，并針對(duì)總讀數(shù)進(jìn)行作圖。
[0021] 圖6 :具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆豬。㈧分別源于DAZL-和APC-修 飾的landrace和Ossabaw成纖維細(xì)胞的克隆小豬的RFLP分析。DAZL建立者（founder)的 預(yù)期RFLP產(chǎn)物為312、242和70bp (空心三角形），以及對(duì)APC的預(yù)期RFLP產(chǎn)物為310、221 和89bp (實(shí)心三角形）。WT和DAZL建立者之間312bp條帶大小的差異反映了預(yù)期的缺失 等位基因。（B)序列分析確定了 HDR等位基因存在于8個(gè)DAZL建立者中的3個(gè)中，以及6 個(gè)APC建立者中的6個(gè)中。供體模板（HDR)中的BMs以箭頭表示，且插入的堿基封閉在塊 中。頂端WT序列中的粗體字表示TALEN結(jié)合位點(diǎn)。
[0022] 圖7 :豬GPR54和用于敲除的基因靶向策略的圖示描述于小圖a中。經(jīng)設(shè)計(jì)以結(jié) 合外顯子3的TALENs (下劃線的文字）和經(jīng)設(shè)計(jì)以引入提前終止密碼子和Hindlll限制位 點(diǎn)的寡核酸同源模板（HDR)共轉(zhuǎn)染。小圖b:將2微克的TALENs編碼mRNA加0. 2nMol的 HDR模板轉(zhuǎn)染到作為克隆生長(zhǎng)的豬成纖維細(xì)胞中，并通過(guò)Hindlll RFLP檢測(cè)分析同源性依 賴性修復(fù)。PCR結(jié)果顯示：每個(gè)道代表一個(gè)集落。231和158bp的剪切產(chǎn)物代表同源性依賴 性修復(fù)。具有389bp親本條帶的集落歸類于HDR敲除等位基因雜合子（空心三角形），不具 有389bp親本條帶的的集落歸類于HDR敲除等位基因的純合子（實(shí)心三角形）。
[0023] 圖8:小圖a:編碼羅非魚(yú)親吻肽（tilapia kisspeptin)的mRNA的核苷酸和推導(dǎo) 的翻譯氨基酸序列。kiss基因的組織結(jié)構(gòu)是保守的，且包含兩個(gè)編碼外顯子，一個(gè)編碼信號(hào) 肽和親吻肽前體的一部分，另一個(gè)編碼包含親吻肽10序列的前體剩余部分。用三角形符號(hào) 表示內(nèi)含子的位置。示出了用于靶區(qū)域（442bp)PCR擴(kuò)增的正向和反向引物的位置。用黑色 和灰色框表示兩個(gè)修飾的TALEN對(duì)（即Kissl. la和Kissl. lb)的結(jié)合位點(diǎn)。小圖b顯示了 靶定的kiss基因組區(qū)域的圖示，所述區(qū)域顯示親吻肽10生物活性肽以及每個(gè)kissl. la和 lb TALENs識(shí)別位點(diǎn)的位置。也顯示了用于插入缺失（indels)分析的PCR(442bp)和qPCR 引物對(duì)（138bp擴(kuò)增子）。
[0024] 圖9 :小圖a :編碼羅非魚(yú)GPR-24mRNA的核苷酸和mRNA的推導(dǎo)翻譯的氨基酸序列。 kissr基因的組織結(jié)構(gòu)是保守的，并包含五個(gè)編碼外顯子。用三角形符號(hào)表示所有4個(gè)內(nèi)含 子的位置。KissRE2和KissRE3TALENs靶向的基因座分別位于編碼外顯子2(白色框）和 3(灰色框）中。在框中顯示了有義左和反義右TALENs識(shí)別位點(diǎn)的位置。小圖b顯示了羅 非魚(yú)GPR-24基因組區(qū)域的圖示，其顯示了內(nèi)含子（Stroked goalpost)、包含kissRE2和RE4 基因座（白色框）的編碼外顯子2和3(黑色箭頭）的位置。還顯示了用于PCR和qPCR分 析的引物位置以及相應(yīng)的擴(kuò)增子的大小。
[0025] 圖10:包含kiss和kissRE3基因座的100-120bp qPCR產(chǎn)物的解鏈分析。小圖a 和b顯示了擴(kuò)增子的解鏈曲線，所述擴(kuò)增子產(chǎn)生自提取自用kissl. la和kissRE3TALENs對(duì) 處理的魚(yú)鰭的gDNA。普通箭頭指示解鏈數(shù)據(jù)圖表（profile)(小圖a)或（小圖b)，其顯著 不同于那些獲得自未處理的魚(yú)（虛線箭頭）的，并對(duì)應(yīng)于候選突變魚(yú)kiss#41，RE3#1，4,6 和11。小圖c :從TALEN處理的魚(yú)#41PCR擴(kuò)增含有靶向Kiss基因座的442bp基因組片段。 PCR產(chǎn)物克隆到T0P0 2. 1TA載體中，且手工挑選轉(zhuǎn)化子集落用于直接QPCR分析。普通箭頭 指向挑選的來(lái)自于集落的解鏈曲線圖形，所述集落含有在kiss基因座上的不同缺失。小圖 d :為了更好地觀察所克隆的各種突變，我們對(duì)我們的QPCR集落進(jìn)行作圖，在Cts相對(duì)解鏈 溫度的散點(diǎn)圖上進(jìn)行篩選，其中每個(gè)克隆由數(shù)據(jù)點(diǎn)（x，y)表示，其中x表示其Ct以及y表 示其解鏈溫度。所述圖表示包含擴(kuò)增自魚(yú)RE3#4的702bpPCR片段的集落。低于野生型序 列的解鏈溫度均含有kissRE3擴(kuò)增子，所述擴(kuò)增子在靶位點(diǎn)具有各種突變。Cts :循環(huán)閾值。
[0026] 圖11:由工程化的TALENs在kiss基因（位點(diǎn)kissl. la)(小圖a)和kissR基因 位點(diǎn)（KissRE3)(小圖b)誘導(dǎo)的體細(xì)胞突變的描述。野生型序列示于每個(gè)小圖的頂端，其 中以粗體深灰色尚殼顯不有義左和反義右TALEN識(shí)別兀件位點(diǎn)并以文本下劃線尚殼顯不 有義間隔子。缺失用破折號(hào)顯示以及插入用淺灰高亮的小寫(xiě)字母顯示。由每個(gè)插入缺失 突變引起的長(zhǎng)度的凈變化在每個(gè)序列的右側(cè)（+，插入；一，缺失）。一些改變具有序列的缺 失和插入兩種。分離每個(gè)突變的等位基因的次數(shù)顯示于括號(hào)中。
[0027] 圖12:小圖a:來(lái)自KissRE3#ll系的兩個(gè)同胞子代（sibling progeny)的PCR產(chǎn) 物的選擇性的測(cè)序色譜。這些圖表示同時(shí)閱讀kissRE3突變和WT等位基因突變的存在。 框表示與突變和WT等位基因匹配的核苷酸，以及箭頭指示序列發(fā)生分歧并由此缺失在此 開(kāi)始的位置。為了表征突變，我們分析了序列中獨(dú)特核苷酸閱讀的模式（其中色譜顯示上 述背景非重復(fù)的核苷酸閱讀）。通過(guò)移碼（shift)WT序列和增加缺失序列的大小，我們發(fā) 現(xiàn)7bp和5bp缺失在這些色譜上重現(xiàn)了單核苷酸閱讀的模式。小圖b :所有遺傳插入缺失 突變的描述，所述突變工程化的TALENs在kiss基因（kissl. la位點(diǎn)，頂部）和kissr基因 (KissRE3位點(diǎn)，底部）誘導(dǎo)。野生型序列示于頂部，并用粗體字淺灰高亮顯示有義左和反義 右TALEN識(shí)別元件以及用下劃線文字高亮顯示有義間隔子。缺失用破折號(hào)顯示。由每個(gè)插 入缺失突變引起的長(zhǎng)度上的凈變化在每個(gè)序列的右側(cè)（一，缺失）。分離每個(gè)突變的等位基 因的次數(shù)示顯示于括號(hào)內(nèi)。小圖C:在kiss和kissRE3位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)的最為嚴(yán)重的損傷的描 述。位于kissl.la基因座上18nt的缺失導(dǎo)致6AA的缺失（下劃線），其中的3個(gè)來(lái)自親吻 肽10活性肽的核心序列（灰色高亮）。kissRE3基因座上的7nt的缺失（下劃線）導(dǎo)致基 因產(chǎn)物的顯著改變，所述產(chǎn)物具有緊接著終止密碼子的兩個(gè)氨基酸的替換。獲得的蛋白在 C-末端由215氨基酸截?cái)唷?br>[0028] 發(fā)明詳述
[0029] 期望以節(jié)約環(huán)境和能源來(lái)源的方式生產(chǎn)家畜。性未成熟的動(dòng)物通常比成熟或正處 于成熟的動(dòng)物每鎊重量消耗更少的食物。一般而言，在成熟前家畜并未達(dá)到期望的重量。然 而文本所列出的是在成熟前能夠生長(zhǎng)到期望的大小的動(dòng)物。
[0030] 事實(shí)上，本文記載了方法，其中動(dòng)物根本不能性成熟。其可以生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)正常的成熟 年齡而不經(jīng)歷青春期。性未成熟的動(dòng)物是不育的。由于有性繁殖是成本有效的，并且即使 是輔助的生殖技術(shù)（ATRs)也需要成熟的動(dòng)物來(lái)提供卵子和精子，因此不育動(dòng)物的有效率 的生產(chǎn)是一項(xiàng)顯著的挑戰(zhàn)。在一些實(shí)施方式中，家畜動(dòng)物不進(jìn)入青春期并保持永久的性未 成熟，除非特異地處理以使其進(jìn)入性成熟。在處理誘導(dǎo)成熟后，這種動(dòng)物可用于育種。
[0031] 生產(chǎn)不能成熟的家畜的優(yōu)勢(shì)在于其不能繁殖。例如，在有性育種或遺傳修飾的魚(yú) 中，消除了它們意外流入野外的擔(dān)憂。類似修飾的其它動(dòng)物也將不能繁殖，從而可以銷售具 有有價(jià)值的遺傳性狀的動(dòng)物而不必?fù)?dān)心買(mǎi)家對(duì)動(dòng)物的不受控制的育種。此外，在很多農(nóng)場(chǎng) 動(dòng)物（如牛、禽類和魚(yú)）中，不育將增加產(chǎn)率和肉質(zhì)，改善脂肪含量、色素和質(zhì)地。術(shù)語(yǔ)母牛 (cow)是牛（cattle)的口語(yǔ)術(shù)語(yǔ)；牛是大型有蹄類動(dòng)物，是牛屬（genusBos)中最廣泛分布 的物種。母牛（cow)或牛（cattle)指牛（Bosprimigenius)的成員。且在魚(yú)的情況中，通 過(guò)生長(zhǎng)保存能量而不是性腺發(fā)育和性分化，不育的魚(yú)在培養(yǎng)中應(yīng)表現(xiàn)出更高的性能。目前， 通過(guò)倍性操作（ploidymanipulation)(特別是三倍性，其添加了一套額外的染色體）不育 是唯一的商業(yè)上可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖者的可升級(jí)技術(shù)。然而不一致的結(jié)果引發(fā)了關(guān)于該技術(shù)效 率的關(guān)注。另外，一般來(lái)說(shuō)，三倍體誘導(dǎo)經(jīng)常負(fù)面影響處理群體的存活和/或表現(xiàn)。且該技 術(shù)的應(yīng)用是高勞動(dòng)強(qiáng)度的、邏輯上是復(fù)雜的和昂貴的。
[0032] 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式為一種含有基因組的遺傳修飾的家畜動(dòng)物，所述基因組包 含性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因的失活，所述基因的失活阻止動(dòng)物成為性成熟。所述基 因選擇地針對(duì)性成熟過(guò)程，如果動(dòng)物基因敲除，該動(dòng)物將與野生型動(dòng)物在其發(fā)育上進(jìn)行比 較直到野生型動(dòng)物經(jīng)歷性成熟的時(shí)間為止，所述的發(fā)育通過(guò)測(cè)量大小和體重。術(shù)語(yǔ)基因指 基因組序列上可定位的區(qū)域，對(duì)應(yīng)于遺傳單元，其與調(diào)控區(qū)、轉(zhuǎn)錄區(qū)和或其它功能序列區(qū)域 相關(guān)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)基因包括功能序列區(qū)域以及那些編碼蛋白或其它因子的部分。本 文所使用的術(shù)語(yǔ)敲除，指直接或間接破壞基因，其失活所產(chǎn)生的蛋白的功能或消除蛋白產(chǎn) 品的生廣。
[0033] 由于遺傳修飾針對(duì)特定基因或基因產(chǎn)物以阻止性成熟，因此成熟所需的因素是已 知的并且常規(guī)能提供的。
[0034] 性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因
[0035] 可通過(guò)阻斷性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因來(lái)阻止動(dòng)物的性發(fā)育。當(dāng)下丘腦開(kāi)始 分泌促性腺激素釋放激素（GnRHl)時(shí)，啟動(dòng)了性發(fā)育、生長(zhǎng)加速和腎上腺成熟。基因GnRHl 編碼GnRHll前體。在哺乳動(dòng)物中，線性的十肽終產(chǎn)物通常自92氨基酸的前激素原合成。促 性腺激素釋放激素（GnRHl)，也被稱為促黃體生成激素-釋放激素（LHRH)和luliberin而 知曉，其負(fù)責(zé)促卵泡激素（FSH)和促黃體生成激素（LH)的釋放。GnRHl屬于促性腺激素釋 放激素家族。本發(fā)明的實(shí)施方式包括在家畜動(dòng)物中失活GnRHl?？蓪⒋傩韵偌に蒯尫偶に?或類似物施用給動(dòng)物以使其性成熟?？缍鄠€(gè)物種的GnRHl的序列是已知的，如普通牛（Bos Taurus)的基因 IDs 768325、雞（Gallus gallus)的 770134 或豬（Sus scrofa)的 397516。 GPR54,也被稱為親吻肽受體（還被稱為GpR54、KiSSR、KiSSlR、ki SSR等），其結(jié)合至激素親 吻肽（之前稱為metastin)。親吻肽是來(lái)自KiSSl基因的產(chǎn)物（還稱為Kiss、Kissl、KiSS、 kissl等）。親吻肽-GPR54信號(hào)（signaling)具有啟動(dòng)GnRHl分泌的作用。親吻肽是一種具 有多種功能的RFamide神經(jīng)肽，包括各種全身生理系統(tǒng)并在所有水平的生殖軸一腦、垂體、 性腺（BPG)和附屬器官中起作用。親吻肽可直接刺激GnRH釋放（Messager et al.，2005)、 傳達(dá)類固醇激素正和負(fù)反饋信號(hào)至GnRH神經(jīng)元、作為青春期起始的直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào) 節(jié)（gatekeeper)，和傳達(dá)光周期信息。
[0036] 本發(fā)明的實(shí)施方式包括在家畜動(dòng)物中失活基因GPR54和/或KiSSl?？墒┯糜H吻 肽以彌補(bǔ)KiSSl的喪失并由此實(shí)現(xiàn)性成熟?；颍种芀iSSl和/或GPR54,并將促性腺激素 釋放激素施用到動(dòng)物中使其性成熟。另一實(shí)施方式為通過(guò)插入顯性負(fù)調(diào)控GPR54到家畜動(dòng) 物的基因組中來(lái)失活親吻肽-GPR54間的相互作用。顯性負(fù)調(diào)控GPR54的表達(dá)干擾了受體的 下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻止信號(hào)傳播和GnRHl的釋放。跨多個(gè)物種的GPR54的序列是已知的，如人 (Homo sapiens)的 84634、斑馬魚(yú)（Danio rerio)的 561898 或豬（Sus scrofa)的 733704。 跨多個(gè)物種的Kissl的序列是已知的，如普通牛（Bos Taurus)的615613、豬（Sus scrofa) 的 733704 或綿羊（Ovis aries)的 100294562。
[0037] Gpr54/Kiss途徑在絕大多數(shù)脊椎物種中是高度保守的且已知其在人和小鼠中是 青春期的直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)（Seminara et al.，2003)。由于人或小鼠中Gpr54和 /或Kiss基因失活的不育已經(jīng)通過(guò)異位GnRH施用而恢復(fù)。小鼠和人中的研究表明，失 活Gpr54有效地導(dǎo)致由于性腺機(jī)能減退而產(chǎn)生的兩性不育（d'Anglemont de Tassigny et al.，2007 ;de Roux et al.，2003)。Kiss_Gpr54系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物中是高度保守的 (Tena-Sempere et al.，2012)特別是在僅存在一個(gè)Kiss和Gpr54基因的哺乳動(dòng)物中。然 而在魚(yú)中確定了多種不同的Kiss基因，在調(diào)查的所有物種中除了一個(gè)物種外受體Gpr54均 由一個(gè)基因編碼。帶有Gpr54突變的人和小鼠所表現(xiàn)出下丘腦GnRH的正常水平，這提示 Kiss/Gpr54信號(hào)負(fù)責(zé)釋放GnRH進(jìn)入血流（Seminara et al.，2003)。這代表了通過(guò)直接將 GnRH或促性腺激素注射到Gpr54缺陷個(gè)體來(lái)繞過(guò)Kiss/Gpr54信號(hào)的機(jī)會(huì)。的確，Gpr54缺 陷的人對(duì)GnRH有反應(yīng)（Seminara et al.，2003)，這表明青春期的下游信號(hào)組分保持完好無(wú) 損。
[0038] 在生殖生物學(xué)發(fā)表物中目前沒(méi)有魚(yú)親吻肽作用的直接證據(jù)。然而，kiss肽的施 用已經(jīng)顯示出刺激垂體促性腺激素基因在性成熟的雌性斑馬魚(yú)（Kitahashi et al. 2008) 和石斑魚(yú)中表達(dá)，或刺激LH和FSH在歐洲鱸魚(yú)（Felip et al.，2008)和金魚(yú)中的分泌。 因此，理論上，可通過(guò)外源遞送親吻肽類似物（如親吻肽10)或促性腺激素類似物（LH或 FSH)拯救帶有GPR54和/或KiSS敲除的性未成熟和不育魚(yú)的生育。在該概念下，如果 施用正確的激素，確保生育的可逆地控制，可以繁育純合的kiss或kiss受體敲除的親魚(yú) (knockout-broodstock)。該K0親魚(yú)的子代繼承了改變。這將提供經(jīng)濟(jì)和環(huán)境益處。
[0039] 可通過(guò)一些方法失活性成熟選擇性的神經(jīng)內(nèi)分泌基因?；虻氖Щ钭柚褂稍摶?編碼的功能因子，如蛋白或RNA的表達(dá)。一種失活包括在編碼性成熟因子和/或啟動(dòng)子和/ 或操縱子的序列中插入、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)堿基，所述的性成熟因子和/或啟動(dòng)子和/ 或操縱子在動(dòng)物中因子的表達(dá)是必須的。失活可以是基因的敲除?；蚩赏ㄟ^(guò)從動(dòng)物基因 組中去除基因的至少一部分、改變基因以阻止由基因編碼的功能因子的表達(dá)、干擾RNA(由 動(dòng)物的基因組或動(dòng)物的多個(gè)細(xì)胞中的基因表達(dá)），或外源基因的顯性負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)而 失活。
[0040]另一個(gè)可恢復(fù)的-不育*SSTac3/TacR3(Young，J.，Bouligand，J.，F(xiàn)rancou，B. ,Raff in-Sanson, M. L. , Gaillez, S. , Jeanpierre, M. , Grynberg, M. , Kamenicky, P. , Chanson ,P. , Brailly-Tabard, S. , et al. (2010)。TAC3和TACR3缺陷導(dǎo)致人類中下丘腦先天性性 腺功能減退。J Clin Endocrinol Metab 95,2287-2295。對(duì)于 Kiss/Gpr54,對(duì)這些基因缺 陷的人表現(xiàn)出性腺機(jī)能減退，其通過(guò)脈動(dòng)的（pulsatile)GnRH治療是可恢復(fù)的（Young et al.，2010)?？墒褂妹枋隽说幕虮疚膮⒖剂说姆椒ㄊЩ頣ac和/或Tac3。
[0041] 本發(fā)明的實(shí)施方式包括在選自由牛、羊、豬、雞、火雞、山羊、羊、魚(yú)、水牛、鴯鹋、兔、 有蹄類動(dòng)物、鳥(niǎo)類、鼠類和家畜組成的組的動(dòng)物中失活一種或多種選自由GnRHl、GPR54、 KiSSl、Tac和Tac3組成的組的基因。可在細(xì)胞和/或胚胎失活該基因和并且在動(dòng)物中由 此產(chǎn)生。本文中描述了各種方法，如使用TALENs或鋅指核酸酶敲除細(xì)胞或胚胎中的基因， 和克隆和/或在代孕者中植入細(xì)胞/胚胎以制備建立者動(dòng)物。
[0042]圖1描述了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，在體外修飾牛細(xì)胞并用于克隆小牛。可飼養(yǎng) 小牛到適合屠宰的重量或使用因素處理小牛以允許其進(jìn)入成熟期，所述因素為例如促性腺 激素類似物或直接提供敲除遺傳因子的因素。
[0043] 實(shí)施例1描述了用TALENs系統(tǒng)制造細(xì)胞改變的技術(shù)。實(shí)施例2描述了用于表1結(jié) 果的稀釋克?。╠ilution cloning)技術(shù)。實(shí)施例3描述了突變檢測(cè)和RFLP分析技術(shù)。實(shí) 施例4(圖2)描述了將11個(gè)堿基對(duì)缺失基因滲入牛⑶F8外顯子3 (Belgium Blue突變）。 圖3描述了類似過(guò)程的結(jié)果，所述過(guò)程為將來(lái)自于一個(gè)物種的一個(gè)等位基因基因滲入另一 個(gè)物種。實(shí)施例5描述了使用寡HDR測(cè)試相同以及將等位基因基因滲入牛細(xì)胞。在實(shí)施例5 中，TALEN-誘導(dǎo)的同源重組消除了連鎖的選擇標(biāo)記的需要。當(dāng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)，bt⑶F8. 1TALEN 對(duì)在靶位點(diǎn)切割多達(dá)16%的染色體。共轉(zhuǎn)染攜超螺旋同源DNA修復(fù)帶有l(wèi)lbp缺失的模板， 其導(dǎo)致在期望的事件的未選擇下，于第3天0. 5到5%的基因轉(zhuǎn)換頻率（HDR)。在1. 4%的 經(jīng)PCR篩選的分離克隆中鑒定了基因轉(zhuǎn)換，所述PCR是鑒定成功轉(zhuǎn)換的快速方法。實(shí)施例 6(圖4)描述了豬和牛成纖維細(xì)胞中4個(gè)目的位點(diǎn)的修飾。實(shí)施例7(圖5)顯示了對(duì)基因 八卩(：、〇)1^453465和^〇^8修飾的分析。實(shí)施例8(表1)顯示了10-64%(平均，45%) 目的插入缺失的恢復(fù)率，高達(dá)32%的克隆純合子用于修飾。實(shí)施例9(圖6)描述了克隆 豬，所述克隆豬是用修飾的在azoospermia-like (DAZL)中缺失的和修飾的大腸腺瘤息肉 (APC)基因生產(chǎn)的。實(shí)施例10 (圖7)描述了根據(jù)指定的基因靶向策略所制備的GPR54敲 除；實(shí)施例11詳述了生產(chǎn)具有GPR54敲除的修飾動(dòng)物的方法。實(shí)施例12描述了使用定制 的CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶所生產(chǎn)的修飾。
[0044] 這些結(jié)果證實(shí)了修飾目的基因而無(wú)需連鎖的