專利名稱：：免疫原性腫瘤蛋白和肽及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的領(lǐng)域是腫瘤病人選擇性免疫原性的腫瘤特異性抗原、蛋白質(zhì)或肽。這些免疫原性蛋白質(zhì)或肽可根據(jù)腫瘤病人血清中特異于那些蛋白質(zhì)和/或肽的抗體的出現(xiàn)來識(shí)別。本發(fā)明還涉及從其它腫瘤識(shí)別和分離對(duì)患那些腫瘤的病人為選擇性免疫原性的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和/或肽的方法。本發(fā)明還涉及在個(gè)體腫瘤病人中預(yù)見哪一種蛋白質(zhì)或肽最適于產(chǎn)生用于繼承性免疫治療或用于配制特異性疫苗之效應(yīng)T細(xì)胞的方法。發(fā)明背景腫瘤免疫學(xué)中已經(jīng)描述了分離和擴(kuò)增對(duì)自體腫瘤反應(yīng)性的和具有陽性治療效果的人T淋巴細(xì)胞的方法。參見Greenberget.al.，AdoptiveTCellTherapyofTumorsMechanismOperativeintheRecognitionandEliminationofTumorCells，ADV.inImmunol.V.49，281(AeademicPress，Inc.1991)。Greenberg和Cheever描述了在小鼠腫瘤模型中過繼性T細(xì)胞治療的進(jìn)展，還同時(shí)，甚至更早地描述了對(duì)人腫瘤類似功能的治療進(jìn)展。對(duì)小鼠模型的一種Friend病毒誘導(dǎo)的紅白血病(FBL)的最初研究說明，播散的抗原性腫瘤可以被對(duì)腫瘤有特異反應(yīng)性的T細(xì)胞的過繼性轉(zhuǎn)移而根除。Cheever，MA.，etal.，J.Immunol.1261318-1322(1981)；Cheever，M.A.，etal.，LBiol.ResponseMod，3(5)462-7(1984)；Cheever，M.A.，etal.，J.Biol.ResponseMod，3(2)113-27(1984)；Cheever，M.A.，etal.，Immunol.132(5)2259-65(1984)；Cheever，M.A.，etal.，J.Immunol.134(6)3895-900(1985)；Cheever，M.A.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res.24449-58(1987)；Cheever，M.A.，etal.，J.Exp.Med.163(5)110-12(1986)；Cheever，M.A.，etal.Immunobiology172(3-5)365-82(1986)；Chen，W.，etal.，J.Immunol.144(10)3659-66(1990)；Chen，W.，etal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA89(4)1468-72(1992)；Crossland，K.D.，etal.，J.Immunol.146(12)4414-20(1991)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Immunol.123(2)515-22(1979)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Exp.Med.154(3)952-63(1981)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Immunol.1262100-2103(1981)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Biol.ResponseMod.3(5)455-61(1984)；Greenberg，P.D.，etal.J.Immunol.133(6)3401-7(1984)；Greenberg，P.D.，etal.，Surv.Immunol.Res.40283-96(1985)；Greenberg，P.D.，etal.，J.Exp.Med161(5)1122-34(1985)；Greenberg，P.D.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res.244127-35(1987)；Greenberg，P.，etal.，Symp.PrincessTakamatsuCancerRes.Fund19287-301(1988)；Greenberg，P.D.，etal.，Prog.Exp.TumorRes.32104-27(1988)；Greenberg，P.，etal.，Int.Symp.PrincessTakamatsuCancerRes.Fund19287-301(1988)；Kern，D.E.，etal.，J.Immunol.136(11)4303-10(1986)；Kern，D.E.，etal.，J.Immunol.141(8)2824-30(1988)；Kern，D.E.，etal.，CancerRes.50(19)6256-63(1990)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immunol.1384012-4017(1987)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immuno1.142(7)2187-91(1989)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Exp.Med.169(2)457-67(1989)；Peace，D.J.，etal.J.Exp.Med.169(1)161-73(1989)。后來的研究說明，少量腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的有限的治療活性能夠通過在體外培養(yǎng)出大量T細(xì)胞并用大量細(xì)胞處理而大大增強(qiáng)(Cheever，M.A.，etal.，Prog.Clin.Biol.Res，24449-58(1987)；Cheever，M.A.，etal.，J.Exp.Med，163(5)110-12(1986)；Klarnet，J.P.，etal.，J.Immunol.1384012-4017(1987))。而且，大量成功的研究確定了產(chǎn)生CD4+和CD8+抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的要求，因?yàn)閭€(gè)體要求對(duì)于兩種細(xì)胞類型是完全不相同的。到目前為止，各種研究已表明對(duì)自體腫瘤特異性的人效應(yīng)T細(xì)胞可被分離并可在體外擴(kuò)充(Ioannides，C.G.，etal.，J.Immunol.146(5)1700-7(1991)；Mukherji，B.，etal.，Immunol.Rev.11633-62(1990)；Viale，M.，etal.，Tumori76(5)488-94(1990))。然而，在能夠?qū)腇BL模型獲得的所有知識(shí)經(jīng)驗(yàn)用于人體上仍然存在很大的限制。要克服的主要障礙是(1)鑒定腫瘤蛋白質(zhì)抗原，所述抗原由腫瘤細(xì)胞合成并能被病人T細(xì)胞識(shí)別(免疫原性蛋白質(zhì))，但最低限度地被或完全不被對(duì)照受實(shí)驗(yàn)者T細(xì)胞識(shí)別；(2)具有足夠的免疫原性蛋白質(zhì)(潛在的免疫原性蛋白質(zhì)庫)以提供大多數(shù)細(xì)胞的足夠識(shí)別物，所述細(xì)胞構(gòu)成個(gè)體腫瘤，因?yàn)槊總€(gè)病人的腫瘤由單個(gè)細(xì)胞亞型組成，該亞型可能合成或可能不合成任何一種給定的蛋白質(zhì)抗原；(3)確定包含在免疫原性蛋白質(zhì)庫中的哪一種抗原真正是由各病人的腫瘤合成的；(4)確定免疫原性蛋白質(zhì)庫中的哪一種蛋白質(zhì)或肽可由個(gè)體病人擁有的MHC分子給出并且因此對(duì)該病人是免疫原性的，因受MHC的限制，不是所有病人的T細(xì)胞都能對(duì)任何給定的蛋白質(zhì)抗原或其組成肽表位作出相同的反應(yīng)。迄今，已報(bào)導(dǎo)了很少幾種抗原的針對(duì)共同腫瘤的高特異性體液和或細(xì)胞免疫反應(yīng)。針對(duì)腫瘤的體液免疫反應(yīng)的文獻(xiàn)記載的例子有Davidoff，A.M.，Iglehart，J.D.，Marks，J.R.，SocialSciences893439-3442(1992)描述了對(duì)由乳腺癌過度表達(dá)的p53蛋白質(zhì)的人血清抗體反應(yīng)，并且Ben-Maharez，K.Thierry，D.，Sorokine，Danna-Muller，A.，Kohiyama，M.，Br.J.Cancer57529-534(1988)和其他文獻(xiàn)描述了針對(duì)患有乳腺癌和結(jié)腸直腸癌的病人體內(nèi)c-myb和c-myc蛋白質(zhì)的循環(huán)抗體。就Davidoff的研究來說，由于沒有試驗(yàn)與年齡和性別相配合的對(duì)照血清，因而難以確定腫瘤病人相對(duì)于正常受試者的免疫原特異性。就Ben-Maharez，Sorokine和其他人所作的描述來說，則缺乏在腫瘤病人和正常受試者之間表現(xiàn)出絕對(duì)定性的免疫原性特異性。定量特異性也太低以致不能在診斷或治療上應(yīng)用。針對(duì)人腫瘤抗原的細(xì)胞免疫反應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的例子有Finn描述了上皮粘蛋白的核心蛋白質(zhì)，vanderBruggen，P.，Traversari，C.，Chomez，P.，Lurquin，C.，DePlaen，E.，vandenEynde，B.，Knuth，A.，Boon，T.，Science2541643-1647(1991)描述黑素瘤、乳腺癌和其它腫瘤的MAGE抗原。上皮粘蛋白是一種正常上皮細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)抗原和某些腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞外抗原。尚未描述MAGE抗原的細(xì)胞定位，而且該抗原也遠(yuǎn)不是由所有黑素瘤或乳腺癌細(xì)胞系合成的。在每一種情況下，描述的細(xì)胞免疫反應(yīng)都是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。雖然粘蛋白的CTL反應(yīng)不是MHC限制性的，但針對(duì)MAGE的CTL反應(yīng)僅限于HLA-A1單元型。沒有試驗(yàn)過MAGE或粘蛋白在產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)中的實(shí)用性。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種經(jīng)包含下列步驟的方法制備的腫瘤特異性抗原(a)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的選擇性免疫原性蛋白質(zhì)；和(b)分離和純化該蛋白質(zhì)。優(yōu)選的鑒定方法包括篩選對(duì)照和腫瘤病人血清以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。所述抗體可以是IgA、IgE、IgG和IgM免疫球蛋白。本發(fā)明也注意到可由這種方法制備的腫瘤特異性抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗原是SCC抗原，例如SCC抗原3.3、16.116.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗原是乳腺癌特異性抗原例如磷酸化的dbl，該dbl優(yōu)選地包括SEQIDNO2的氨基酸殘基序列。在各種不同實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括一個(gè)或多個(gè)磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，該殘基優(yōu)選位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，所述殘基優(yōu)選位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上。在磷酸化的dbl包括至少三個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，所述殘基優(yōu)選位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9或者436、438和442上。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基時(shí)，該殘基優(yōu)選位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403或406上。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基時(shí)，所述殘基優(yōu)選位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基時(shí)，該殘基優(yōu)選位于SREQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。磷酸化的dbl也可以包括多于一種類型的磷酸化的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，優(yōu)選的是，其中(a)兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25上，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38上；(b)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2氨基酸殘基位置編號(hào)402上，并且兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上或者(c)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406上。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基時(shí)，所述殘基優(yōu)選的位置為其中一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202上，且一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基位于位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括位于SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、3536、37或38的氨基酸殘基序列。另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中對(duì)腫瘤病人選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是SCC細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述功能性蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞是選擇性功能性的。另一方面，本發(fā)明提供了一種制備腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(a)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是對(duì)腫瘤病人選擇性免疫原性的和(b)分離和純化該蛋白質(zhì)。本發(fā)明也注意到由這種方法制造的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，制備腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)對(duì)分離和純化的蛋白質(zhì)測(cè)序(d)制備編碼所述已測(cè)序之蛋白質(zhì)的多核苷酸(e)用包含所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；(f)在足以表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；和(g)收集所述的蛋白質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供了一種增加腫瘤相關(guān)抗原之免疫原性特異性的方法，該方法包括磷酸化處理腫瘤相關(guān)抗原。優(yōu)選的腫瘤抗原是乳腺癌抗原，例如包含SEQIDNO2之氨基酸殘基序列的dbl。另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)對(duì)腫瘤特異性抗原有免疫反應(yīng)性之抗體存在的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含足夠量的至少用于一次試驗(yàn)的腫瘤特異性抗原。腫瘤特異性抗原較好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3或者磷酸化的dbl。該試劑盒還包括用于檢測(cè)與腫瘤特異性抗原發(fā)生免疫反應(yīng)之抗體的工具。所述抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)存在于生物體液中的對(duì)腫瘤特異性抗原有免疫反應(yīng)活性的抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)用體液的樣品和腫瘤特異性抗原制成混合物；(b)在生物反應(yīng)條件下將混合物保留一段足夠時(shí)間，以足以使存在于樣品中的抗體與腫瘤特異性抗原之間形成結(jié)合物(conjugate)(c)檢測(cè)結(jié)合物的存在。所述腫瘤特異性抗原優(yōu)選是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了一種制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)分離含有純凈的非抗原致敏的T細(xì)胞的自體T細(xì)胞群(b)鑒定免疫原性腫瘤特異性抗原；和(c)用免疫原性腫瘤特異性抗原致敏非抗原致敏的T細(xì)胞。所述腫瘤特異性抗原優(yōu)選是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述T細(xì)胞優(yōu)選的是T輔助淋巴細(xì)胞或特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞群的方法，包括以下步驟(a)分離對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞；和(b)誘導(dǎo)致敏的T細(xì)胞大量擴(kuò)增。誘導(dǎo)較好是于腫瘤特異性抗原，以及如果必要時(shí)于抗原呈現(xiàn)細(xì)胞存在下完成。用于這一方法的T細(xì)胞較好是從循環(huán)淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)或腫瘤中分離的。該方法還可以進(jìn)一步包括如下步驟(c)繼代培養(yǎng)T細(xì)胞，以鑒定對(duì)特定腫瘤特異性表位敏感的T細(xì)胞。所述免疫原性腫瘤特異性抗原較好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了建立腫瘤特異性體液抗原的肽文庫的方法。該方法包括以下步驟(a)從腫瘤細(xì)胞中分離一種或多種選擇性免疫原性蛋白質(zhì)；(b)在每一種選擇性免疫原性蛋白質(zhì)中鑒別對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的一個(gè)或多個(gè)表位；(c)就每一個(gè)表位制備含有該表位的肽，其中沒有單個(gè)肽含有被非腫瘤受試者識(shí)別的表位；(d)形成肽文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離包括以下步驟(a)從腫瘤細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)；(b)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；和(c)分離并純化選擇性免疫原性蛋白質(zhì)。鑒定較好包括以下步驟(a)限定蛋白質(zhì)中的潛在表位；(b)合成含有所述蛋白質(zhì)之一部分的肽，該部分含有一個(gè)表位；和(c)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，并且由此鑒定對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)中的表位。選擇性免疫原性蛋白質(zhì)可以是磷酸化的蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及到由這一方法制備的文庫。另一方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種建立乳腺癌特異性體液抗原之肽文庫的方法，該方法包括以下步驟(a)鑒定存在于乳腺癌細(xì)胞中的，對(duì)乳腺癌病人為選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)；(b)限定該蛋白質(zhì)的潛在磷酸化位點(diǎn)；(c)合成包含該蛋白質(zhì)之一部分的肽，該部分含有至少一個(gè)磷酸化位點(diǎn)并且其中至少一個(gè)磷酸化位點(diǎn)是磷酸化的；(d)篩選所述肽，以鑒定對(duì)乳腺癌病人為選擇性免疫原性的磷酸化的肽；(e)形成磷酸化的選擇性免疫原性肽的文庫。在這一方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是dbl，并且潛在的磷酸化位點(diǎn)包括(a)一個(gè)在位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、426、438或442上的磷酸化的絲氨酸殘基；(b)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基；(c)至少三個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9或者436、438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基；(d)一個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403或406上的磷酸化的蘇氨酸殘基(e)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上的磷酸化的蘇氨酸殘基；(f)至少一個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上的磷酸化的酪氨酸殘基；(g)至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，其中(i)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38上；(ii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2氨基酸殘基位置編號(hào)402上，以及兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上；或者(iii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，以及一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406上；或(h)至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基，其中磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202上，且磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。上述方法中蛋白質(zhì)部分較好包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸殘基序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是一種癌基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)、一種細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或底物蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及用該方法制得的文庫。再一方面，本發(fā)明提供一種用于診斷受檢者體內(nèi)腫瘤存在的試驗(yàn)試劑盒，該試劑盒包含足夠用于至少一次試驗(yàn)量的腫瘤特異性體液抗原的肽文庫。在腫瘤是SCC時(shí)，該文庫優(yōu)選地包括下列的兩種或多種SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在腫瘤是乳腺癌時(shí)，該文庫較好包括下列的兩種以上的肽SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38。附圖簡(jiǎn)要說明圖1顯示出31/65頭和頸肉瘤病人(SCCPts)和40/65對(duì)照受試者(對(duì)照)的鱗狀上皮細(xì)胞癌(SCC)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)特異性IgE值的分布。用于該試驗(yàn)系統(tǒng)的來源抗原是從SCC細(xì)胞中提取的所有細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的混合物。圖2表明病人(17/65)較年齡和性別配對(duì)的對(duì)照(1/65)表現(xiàn)出更高優(yōu)勢(shì)的結(jié)合到SCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)上的血清IgA。標(biāo)繪圖說明頭和頸肉瘤病人(SCCPts)和對(duì)照組受試者(對(duì)照)的SCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)特異性IgA的分布。來源抗原與附圖1中所使用者相同。圖3A顯示個(gè)別病人血清IgE對(duì)IgA的作圖。更具體地說，該圖說明SCC病人在對(duì)由SCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)引起的免疫刺激發(fā)生反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生IgE的能力和他們產(chǎn)生IgA和/或IgG的能力之間的反比關(guān)系。來源抗原如附圖1中所使用者相同。圖3B顯示個(gè)別病人血清IgE對(duì)IgG的作圖。來源抗原如附圖1中所使用者相同。圖4顯示由異型特異性抗原抑制研究證實(shí)的結(jié)合到SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)上的血清免疫球蛋白的特異性。使用隨機(jī)免疫球蛋白陽性血清檢測(cè)每類異型。IgE陽性血清用8％人血清白蛋白稀釋至1∶2。IgA和IgG陽性血清用純凈的羊血清稀釋至1∶2。相應(yīng)于每一稀釋度的等分樣摻加2.5mg/mlSCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。所有待檢血清的免疫球蛋白信號(hào)均經(jīng)摻加特異性抗原而被抑制。作圖說明在一個(gè)病人樣品中，與未摻加稀釋液(空心方塊)者相比較，摻加抗原的稀釋樣品(實(shí)心方塊)的特異性IgE信號(hào)全部消失。圖5A顯示對(duì)SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行Western印跡分析以鑒定高特異性腫瘤抗原(HSTA)。圖解說明了針對(duì)14個(gè)SCC病人的24份待試HSTA和10份年齡與性別匹配的對(duì)照血清的IgA結(jié)合特征。圖5B表示對(duì)SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，借以鑒定高特異性腫瘤抗原(HSTA)。圖解說明了針對(duì)14個(gè)SCC病人的24份待試HSTA和10份年齡與性別匹配的對(duì)照血清的IgA結(jié)合特征。圖6顯示了p66dbl體液免疫原性。用來源于患有I和II期乳腺癌之病人的血清試驗(yàn)IgA反應(yīng)性，同時(shí)試驗(yàn)患有良性乳腺損傷的年齡相當(dāng)?shù)呐允茉囌叩难濉D7顯示了p66dbl與乳腺癌病人血清而不是與對(duì)照血清的IgG反應(yīng)性。dbl和IgA＋I(xiàn)gG之間的反應(yīng)性定量也顯示乳腺癌病人血清也較對(duì)照血清顯著。圖8顯示與非磷酸化的樣品(FT)比較，用磷酸化的p66dbl(2＋3)時(shí)乳腺癌特異性IgA反應(yīng)性。使用FTdbl作為摻加抗原和2＋3作為印跡抗原進(jìn)行的抗原抑制研究，其中顯示出對(duì)腫瘤病人血清的絕對(duì)特異性。圖9顯示用抑制型p66試驗(yàn)檢測(cè)的大量乳腺癌病人血清和對(duì)照血清的敏感性和特異性。在所有乳腺癌階段均顯示有良好的試驗(yàn)敏感性。圖10顯示帶有潛在的可磷酸化絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的p66dbl氨基酸序列的滾動(dòng)總數(shù)分析。劃下線部分為表面肽序列。潛在的可磷酸化殘基用黑體標(biāo)示。圖11顯示許多具有細(xì)胞內(nèi)部分的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和受體蛋白質(zhì)經(jīng)歷磷酸化過程。給出了210個(gè)分子的部分序列表。發(fā)明的詳細(xì)描述發(fā)明迄今為止，腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的鑒定和分離僅通過使用四或五種困難的方法來完成轉(zhuǎn)染分析；癌基因產(chǎn)物復(fù)合物形成；DNA/RNA探針雜交單克隆抗體產(chǎn)生和篩選以及DNA文庫產(chǎn)生和篩選。按照轉(zhuǎn)染分析方法，用從腫瘤細(xì)胞分離和純化的DNA轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞(例如，3T3成纖維細(xì)胞)。用腫瘤細(xì)胞DNA中的轉(zhuǎn)化基因(例如，致癌基因)轉(zhuǎn)化那些被轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞(初級(jí)轉(zhuǎn)染體)。初級(jí)轉(zhuǎn)染體的DNA可用于產(chǎn)生也由轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化的第二和第三代轉(zhuǎn)染體。從被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離DNA/RNA并鑒定那些負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化的核酸。然后，測(cè)定那些轉(zhuǎn)化核酸的序列，并鑒定所編碼的腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。已使用轉(zhuǎn)染分析法鑒定了B細(xì)胞淋巴瘤致癌基因(Eva&Aaronson，IsolationofNewhumanoncogenefromadiffuseB-celllymphoma，Nature，1985316273-275)、來源于化學(xué)轉(zhuǎn)化之細(xì)胞的轉(zhuǎn)化基因(Cooperetal.，Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline，Nature，1984，31129-33)、惡性黑素瘤(Paduaetal.，Anoveltransforminggeneinahumanmalignantmelanomacellline，Nature，1984，311671-673)、淋巴瘤(Takahashietal.，ActivationofaNovelHumanTransformingGene，ret，byDNARearrangement，Cell，1985，42581-588)、乳腺癌(Fasanoetal.，NewHumanTransformingGeneDetectedbyaTumorigenicityAssay，MolecularandCellular.Biology.1984.4(9)1695-1705)及各種其他致癌基因(CooperandLane，CellularTransformingGenesandOncogenesis，BiochimicaetBiophysicaActa，1984，7389-20；Schechteretal，Theneuoneogeneanerb-B-relatedgeneencodinga185，000-Mrtumourantigen，Narure，1984，312513-516；Martin-Zanca，Ahumanoncogeneformedbythefusionoftruncatedtropomyosinandproteintyrosinekinasesequences，Nature，1986，319743-748；Shimizuetal.，Molecularcloningofanactivatedhumanoncogene，homologoustov-raf，fromprimarystomachcancer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1985，825641-5645；Landetal.，CellularOncogenesandMultistepCarcinogenesis，Science，1983，222771778)。腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)也可以通過確定腫瘤細(xì)胞中的哪一種蛋白質(zhì)與免疫復(fù)合物中的已知腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)共沉淀的方法來鑒定。已用這一方法鑒定了兩種與勞斯肉瘤病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相關(guān)的磷酸化的蛋白質(zhì)(Oppermannetal.，TwoCellularProteinsthatImmunoprecipitatewiththeTransformingProteinofRousSarcomaVirus，Virology，1981，113736-751)。在第三種建立的方法中，腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)是通過使用DNA/RNA雜交探針而鑒定的。制備已知與轉(zhuǎn)化病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒)相關(guān)的標(biāo)記(例如32P)的DNA或RNA分子。然后使該標(biāo)記的多核苷酸與來自正?；虮晦D(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA/RNA接觸。鑒定雜交的多核苷酸并測(cè)定其序列。這一方法已被用于鑒定鳥髓細(xì)胞瘤(myelocytomatosis)病毒之推定的轉(zhuǎn)化基因的脊椎動(dòng)物同源性(Sheinessetal.，TheVertebrateHomologofthePutativeTransformingGeneofAvianMyelocytomatosisVirusCharacteristicsoftheDNALocusandItsRNATranscript，Virology，1980，105415-424)；一種與鳥肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因相關(guān)的RNA分子(Spectoretal.，UninfectedAvianCellContainRNARelatedtotheTransformingGeneofAvianSarcomaViruses，cell，1978，13371-379)和V-raf(Rappetal.，StructureandbiologicalactivityofV-raf，auniqueoncogenetrasducedbyaretrovifus，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，804218-4222)。多核苷酸探針也已被用于篩選DNA文庫(Quintrelletal.，IdentificationofaHumanGene(HCK)ThatEncodesaProtein-TyrosineKinaseandIsExpressedinHemopoieticCells，MolecularandCellularBiology，1987，7(6)2267-2275)。單克隆抗體也已被用于鑒定腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)。按照這一方法，破碎腫瘤細(xì)胞以產(chǎn)生含有腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的組合物。用所述組合物免疫小鼠。從被免疫的小鼠分離和純化脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生永久化的雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系產(chǎn)生和分泌抗特定抗原的單克隆抗體。然后用所述單克隆抗體篩選推定的腫瘤細(xì)胞抗原的群體。所述抗原與一種或多種上述抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。然后純化以這一方法鑒定的腫瘤細(xì)胞抗原并確定其特征(例如測(cè)序)。已用單克隆抗體確定了肉瘤相關(guān)抗原p102的特征(Brownetal.，MonoclonalAntibodyCharacterizationofSarcoma-AssociatedAntigenp102，AnticancerResearch.1991，111565-1570)。與上述使用有許多且復(fù)雜步驟的方法相反，本發(fā)明提供了一種鑒定腫瘤特異性抗原的簡(jiǎn)單方法，這一方法依賴于由腫瘤受試者/病人產(chǎn)生抗所述抗原的抗血清。具體地說，本發(fā)明涉及在腫瘤病人血清中引起體液免疫反應(yīng)的腫瘤特異性抗原蛋白質(zhì)或肽。為了清楚說明而不是以任何方式限制本發(fā)明，將本發(fā)明的詳細(xì)描述部分分為以下幾個(gè)小部分(A)鑒定/制備腫瘤特異性抗原的方法和用這一方法制得的腫瘤特異性抗原。(B)鑒定/制備腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法和用這一方法制得的功能性蛋白質(zhì)。(C)檢測(cè)抗腫瘤特異性抗原之抗體的試劑盒和方法。(D)制造/制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞群體的方法。(E)增加腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)之免疫特異性的方法。(F)制備腫瘤特異性抗原肽文庫的方法。(G)檢測(cè)受檢者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在的試劑盒。A.腫瘤特異性體液抗原一方面，本發(fā)明提供了一種腫瘤特異性抗原，該抗原可由和優(yōu)選地由包括以下步驟的方法制備(a)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的選擇性免疫原性蛋白質(zhì)；(b)分離和純化該蛋白質(zhì)。優(yōu)選的鑒定方法包括篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。所述抗體可以是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白?？乖辉~包括得自病人腫瘤樣品，或合成的或重組產(chǎn)生的抗原片段。按照本發(fā)明，也可使用具有與抗原實(shí)質(zhì)上的同源的抗原蛋白或其片段。此外，還試圖包括抗原類似物。腫瘤一詞包括癌、肉瘤、骨髓惡性腫瘤、淋巴惡性腫瘤和神經(jīng)源惡性腫瘤。這樣，術(shù)語腫瘤特異性抗原即包括能夠誘導(dǎo)MHC限制性T細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)質(zhì)上純的組合物。這些腫瘤抗原與正常情況下發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或肽的不同在于它們是選擇性免疫原性的。這些蛋白質(zhì)或多肽是選擇性免疫原性的，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤細(xì)胞中被特異性地表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中以異常高的數(shù)量被表達(dá)和/或在腫瘤細(xì)胞中它們是免疫學(xué)上被暴露的而在正常細(xì)胞中它們是避開免疫系統(tǒng)的。腫瘤抗原可以包括蛋白質(zhì)或多肽，或其片段。腫瘤抗原較好衍生于與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化相關(guān)的胞質(zhì)蛋白質(zhì)p145abl，p105akf，p22arf，p160bcr，p33cdc2，p34cdc2，p25cdc42，p25cdc42GAP，P66db1，P45ERK4，p54MAPK，p42MAPK1(ERK2)，p44MAPK2(ERK1)，p39pim，p21rab1，p21rab2，p25rab3A，p74raf，p68raf-1，p74raf-1，p21ras(失活)，p120rasGAP，p295rasGAP，p35ras交換蛋白質(zhì)，p160ras交換蛋白質(zhì)，p100-160ras交換蛋白質(zhì)，p53.內(nèi)膜表面附著的分子srcgenefamily-p60src，p62yes，p60yrk，p56lck，p60fgr，p57Hck，p59fyn，p58lynandp55blk；abl基因家族-p145ablandp145arg；和Fps基因家族-p93fes.膜生長(zhǎng)因子受體的內(nèi)膜部分神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體家族p140trk、p145trkB和p145trkC；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子p195met；表皮生長(zhǎng)因子受體家族p185erbB2、p160erbB3和p170erbB1(EGF-R)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體家族p150FGF-R1/flg、p150FGF-R2/bek、p125FGF-R3和p140FGF-R4。p32-src受體DNA合成的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)p42細(xì)胞周期蛋白C、p34細(xì)胞周期蛋白D、p33cdk2、p60細(xì)胞周期蛋白A、p45細(xì)胞周期蛋白E、p34cdc2、p33mos、p62細(xì)胞周期蛋白B1/B2和p34細(xì)胞周期蛋白D/PRAD1/bcl-1。DNA結(jié)合和基因表達(dá)蛋白質(zhì)p62fos，p62fosB，p46fra1，p39jun，p39junB，NF-kB，rhoB和p17max.核致癌基因和轉(zhuǎn)錄因子p50ets-1，p53ets-2，p75ski，p72sno，p145evi-1，p135cb1，p80rel，p43CREB，p39c-jun，p98lyt，p52erbAalpha，p52erbAbeta，p88糖皮質(zhì)素受體，p66雌激素-R，p145ab1，和p145arg.其他具有高特異性腫瘤抗原特征的目前還未知的蛋白質(zhì)或其片段也被本發(fā)明包括。一些腫瘤衍生的蛋白質(zhì)明顯地存在于腫瘤細(xì)胞中，而不存在于或以非常低的量存在于正常細(xì)胞中。因此，這些蛋白質(zhì)作為抗腫瘤體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的高特異性靶存在，并因此稱為高特異性腫瘤抗原(HSTA)。更具體地說，高特異性腫瘤抗原是指能夠誘導(dǎo)MHC限制性T細(xì)胞反應(yīng)的基本上純的組合物?？梢杂帽绢I(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法分離蛋白質(zhì)。例如使用三步驟分離方法。首先，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用了多個(gè)腫瘤細(xì)胞系。典型地，至少使用10個(gè)腫瘤細(xì)胞系以獲得腫瘤細(xì)胞。特定腫瘤的細(xì)胞系是商業(yè)上可獲得的。例如，實(shí)施例1提供了25個(gè)SCC細(xì)胞系。其他從ATCC可獲得的SCC細(xì)胞系的例子是CRL-1550CCL-23、CRL-1554HTB-54、CRL-1555HTB-58、HTB-31CRL-1623、HTB-32CRL-1624、HTB-33CRL-1628、HTB-34CRL-1629和HTB-35。將等量的各腫瘤細(xì)胞系混合在一起。破碎細(xì)胞膜釋放出胞質(zhì)蛋白質(zhì)，也釋放出松散附著在內(nèi)胞質(zhì)膜表面上的蛋白質(zhì)。經(jīng)超離心從膜和胞質(zhì)細(xì)胞器中分離這些胞質(zhì)蛋白質(zhì)。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞處于細(xì)胞分裂(有絲分裂)的不同階段和/或因?yàn)樗鼈兂３Ｈ狈四?，所以該蛋白質(zhì)混合物也包含可溶的核蛋白質(zhì)。使胞質(zhì)蛋白質(zhì)的混合物共價(jià)結(jié)合到紙圓盤上。將該圓盤與癌癥病人和對(duì)照的血清一起保溫以測(cè)定IgA、IgE、IgM和/或IgG抗體水平。其次，經(jīng)離子交換層析(HPLC)將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)混合物分離成小的組分。將各組分中的蛋白質(zhì)混合物共價(jià)偶聯(lián)到供抗體檢測(cè)的紙圓盤上。其中有些部分在腫瘤病人中誘發(fā)較高的抗體水平和/或滴度。進(jìn)一步用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離對(duì)腫瘤病人誘發(fā)較高血清抗體水平的亞組分達(dá)到單個(gè)分子水平。將以上步驟中獲得的各陽性蛋白質(zhì)組分經(jīng)PAGE處理后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。切下蛋白質(zhì)印跡陽性(僅腫瘤病人陽性)帶，進(jìn)行NH2末端測(cè)序或中間肽區(qū)域氨基酸序列分析。然后，用各蛋白質(zhì)的氨基末端序列(或內(nèi)部末端序列)構(gòu)建核酸探針和/或免疫原性肽，以分離完整蛋白質(zhì)分子的DNA模板序列。然后用模板序列構(gòu)建產(chǎn)生大量特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)。用已知方法在微生物、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制含有模板序列的載體。一旦分離后，即用對(duì)照和腫瘤病人血清篩選腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)，以鑒定那些與腫瘤病人血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。確定抗原和血清(抗體)間免疫反應(yīng)性的方法是本領(lǐng)域公知的。測(cè)定與特定免疫球蛋白(例如，IgA、IgE、IgG和IgM)的免疫反應(yīng)性的方法也是本領(lǐng)域已知的。例如，用IgA/IgG血清試驗(yàn)檢測(cè)抗原。這些試驗(yàn)可以用結(jié)合到固相支持物上的抗原以夾心方式進(jìn)行。使固相支持物與含有抗體的血清接觸。加入與結(jié)合的抗體有免疫反應(yīng)性的標(biāo)記的抗體。除去未結(jié)合的反應(yīng)物。標(biāo)記的量可與針對(duì)抗原的IgA或IgG抗體相互關(guān)聯(lián)。這一試驗(yàn)也可以指示出哪一種蛋白質(zhì)抗原或肽對(duì)特定的個(gè)體是免疫原性的(即，哪一種蛋白質(zhì)或肽在不同個(gè)體中消除特異性T輔助細(xì)胞)。在這一實(shí)施方案中，至少一種類型的高特異性腫瘤抗原能結(jié)合到固相支持物上和被篩選，以確定對(duì)血清中IgA到IgG抗體的免疫反應(yīng)性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了IgE血清試驗(yàn)。在該試驗(yàn)中，將抗原結(jié)合到固相支持物上。使固相支持物與血清接觸。將IgE抗體連接到與固相結(jié)合的抗原上。加入對(duì)IgE抗體有免疫反應(yīng)性的標(biāo)記的抗體以結(jié)合IgE。除去未結(jié)合的反應(yīng)物。抗原反應(yīng)性IgE的存在或量與標(biāo)記的抗體的數(shù)相關(guān)。這一試驗(yàn)也可以用來指示哪一種腫瘤抗原或肽對(duì)特定個(gè)體免疫原性的(哪一種蛋白質(zhì)或肽在不同個(gè)體中已經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性T輔助細(xì)胞，并且因此哪一種自身蛋白質(zhì)或肽是可被病人T細(xì)胞免疫系統(tǒng)識(shí)別的)。在血清與抗原接觸之前，較好(但不是必需的)使用常規(guī)技術(shù)將抗原固相化。在一個(gè)可替代的實(shí)施方案中，可以使用下文詳細(xì)描述的基于脂質(zhì)體的檢測(cè)法。就常規(guī)固相化來說，例如可將聚苯乙烯板與按本發(fā)明制得的抗原懸液一起保溫。另外，例如可按已知方法將在電泳凝膠上作為蛋白質(zhì)帶分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝化纖維素片上(參見Towbinetal.，Proc.Nat′l.Acad.Sci.，764350-54(1979)；Burnetteetal.，Biochem.，11295-203(1981))。將抗原結(jié)合到基本上惰性的底物上的許多其他方法是本領(lǐng)域已知的。使結(jié)合的抗原與待檢血清樣品接觸以試驗(yàn)抗該抗原之抗體的存在?？乖脱遢^好至少保溫5到15分鐘。當(dāng)保溫是在或接近人體溫(約37℃)下進(jìn)行時(shí)則需要較短時(shí)間。在其它溫度例如在4℃下保溫時(shí)也是合適的，不過需要額外的保溫時(shí)間。在37℃下的保溫時(shí)間是從約5分鐘到過夜?？焖贆z測(cè)也可在室溫下完成。然后洗滌結(jié)合的抗原以除去任可未結(jié)合的抗體。即那些對(duì)抗原非特異性的抗體。最好用緩沖溶液(例如PBST、PBSTT或Tris/Tween/氯化鈉/疊氮化合物)洗滌。較好進(jìn)行多次洗滌。保溫期間，腫瘤特異性抗體結(jié)合到固相化抗原上以產(chǎn)生抗原/抗體復(fù)合物。在洗滌過程中，所有未結(jié)合的抗體基本上被除去。由于本發(fā)明的抗原的高特異性，所以對(duì)腫瘤非特異性的抗體基本上被洗滌除去。當(dāng)然，如果試驗(yàn)樣品不含有特異性抗體，固相化的抗原便會(huì)基本上不與人抗體結(jié)合，續(xù)而有關(guān)抗原/抗體復(fù)合物的試驗(yàn)將不會(huì)指示出這種復(fù)合物實(shí)質(zhì)上地存在。另一方面，如果供試驗(yàn)樣品富含抗體，這些抗體應(yīng)結(jié)合在固相化的抗原上以形成大量供續(xù)后檢測(cè)的抗原/抗體復(fù)合物?？乖?抗體復(fù)合物的檢測(cè)可用許多已知方法完成。優(yōu)選的方法包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附法、乳膠凝集法、Western印跡技術(shù)或間接免疫熒光法。一般來說，與固相化抗原復(fù)合的特異性抗體可通過與標(biāo)記的或其他可檢測(cè)的對(duì)待試免疫球蛋白特異性的第二抗體接觸來檢測(cè)如果試驗(yàn)樣品是人血清，例如，可檢測(cè)的第二抗體則是對(duì)人免疫球蛋白特異性的。第二抗體較好與固相化的抗原一起保溫約5分鐘到過夜。加入免疫學(xué)過量的抗體，即足夠量的抗體或其片段以結(jié)合已被結(jié)合的抗原。然后，用緩沖溶液洗(優(yōu)選地是多次洗)抗原以除去所有未結(jié)合的標(biāo)記的抗體。洗滌將基本上除去除結(jié)合到存在于抗原上的免疫球蛋白上的標(biāo)記的抗體外的所有標(biāo)記的抗體。當(dāng)然，基本上只有存在于這一點(diǎn)上的人免疫球蛋白才是腫瘤特異性抗體。因此，可間接地通過確定標(biāo)記的第二抗體的存在或不存在來檢測(cè)腫瘤特異性抗體的存在。有許多用于檢測(cè)該標(biāo)記的已知技術(shù)，這些技術(shù)可依據(jù)所使用的標(biāo)記類型而不同。例如，熒光素標(biāo)記的抗體可通過掃描熒光素的特征性波長(zhǎng)處的發(fā)射光來檢測(cè)。另外，酶標(biāo)記可通過與合適的底物保溫并檢測(cè)酶活性(優(yōu)選地是引起顏色變化的活性)來檢測(cè)。該活性可由肉眼觀察確定，或者可在合適波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)自動(dòng)讀取。另外，酶標(biāo)記可以是辣根過氧化物酶，底物可以是H2O2和2，2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)，所述磺酸在酶的存在下產(chǎn)生可由分光光度計(jì)在414nm檢測(cè)的化合物。在Western印跡分析中，當(dāng)酶結(jié)合到第二抗體上時(shí)即可檢測(cè)到陽性信號(hào)。與合適底物保溫，酶促產(chǎn)生顯色產(chǎn)物，用這一方法分辨的抗原帶即與該產(chǎn)物很接近。可通過肉眼觀察來確定反應(yīng)活性帶的存在。在間接免疫熒光試驗(yàn)中，熒光素標(biāo)記的第二抗體可以由熒光激活的檢測(cè)器或由肉眼觀察檢測(cè)出來。基于脂質(zhì)體的檢測(cè)法可涉及包在脂質(zhì)體內(nèi)的熒光素、酶或底物，其中腫瘤抗原在所述脂質(zhì)體表面上表達(dá)。將這些脂質(zhì)體與稀釋的待試體液樣品一起保溫，并充分洗滌之。在表面上有形成抗原抗體復(fù)合物之免疫球蛋白的任何脂質(zhì)體可被結(jié)合到含有脂質(zhì)體之聚苯乙烯管的內(nèi)壁上的對(duì)待檢免疫球蛋白特異性的第二抗體識(shí)別。帶有結(jié)合到其表面的抗體的脂質(zhì)體將固定在管壁上，而非固相化的脂質(zhì)體則將被洗掉。脂質(zhì)體例如可被去污劑或補(bǔ)體溶解，酶或原來在內(nèi)部的底物即成為游離的，以便與管中溶液內(nèi)的互補(bǔ)底物(或酶)反應(yīng)。酶活性，優(yōu)選地是顏色變化反應(yīng)可經(jīng)肉眼觀察到或經(jīng)分光光度法檢測(cè)出來。超過預(yù)測(cè)定的陽性值外的酶活性指示腫瘤特異性抗體的存在。任何可能含有抗體的樣品都可以按本文提出的方法來檢測(cè)。待試樣品較好是體液，例如血液、血清、尿、眼淚及唾液等。除了人的樣品外，還可以從哺乳動(dòng)物例如非人靈長(zhǎng)目動(dòng)物、馬、豬等取得樣品。由于所描述的試驗(yàn)的靈敏性，在試驗(yàn)前稀釋樣品是可能的?？杉尤肱c各樣品相溶的任何體液、待試抗體和抗原組合物來稀釋。當(dāng)以血清作為樣品時(shí)，例如可以用選自下列一組的一種或多種液體稀釋磷酸鹽緩沖的鹽水，pH7.0-7.4(以下稱作“PBS”)加有吐溫20的PBS(以下稱作“PBST”)含有硫汞撒的PBST(下文稱之為“PBSTT”)；含有明膠的PBSTT(此后稱作“PBSTTGG”)。當(dāng)試驗(yàn)IgG抗體時(shí)，稀釋比率可以高至從約1∶100到約1∶1000。一旦經(jīng)篩選鑒定了腫瘤特異性抗原，即可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離并純化那些抗原。下文實(shí)施例中詳細(xì)描述從SCC和乳腺癌中鑒定和制備腫瘤特異性抗原。本發(fā)明還涉及可用這一方法制備的腫瘤特異性抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備了可用這一方法制備的抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗原是SCC抗原，例如SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤特異性抗原是乳腺癌特異性抗原，例如磷酸化的dbl。在一個(gè)實(shí)施方案中，dbl是p66dbl，該dbl較好包含SEQIDNO2的氨基酸殘基序列。在不同的實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包含一個(gè)或多個(gè)磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基。在磷酸化的dbl包含至少一種磷酸化的絲氨酸殘基的情況下，該殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442處。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基的情況下，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442處。在磷酸化的dbl包括至少三個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基的情況下，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9或者436、438和442處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基的情況下，該殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403和406處。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基的情況下，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基的情況下，該殘基較好位于SEQIDNO3的氨基酸殘基位置編號(hào)201處。磷酸化的dbl也可以包括多于一種類型的磷酸化的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，優(yōu)選地是，其中(a)兩個(gè)磷酸化絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25處，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38處；(b)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402處，并且兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406處或者(c)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402處，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基時(shí)，所述殘基較好位置為一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202處，且一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸殘基序列。B.腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒定腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是SCC細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述功能性蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞是選擇性功能性的。這里使用的術(shù)語腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)意指在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在保持腫瘤細(xì)胞存活力中起作用。腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)也可以在正常的、非腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞中可以是選擇性功能性的。在后一種情況下，該蛋白質(zhì)不在正常細(xì)胞中表達(dá)，以不同于在腫瘤細(xì)胞中之形式的形式表達(dá)，或以低的水平在正常細(xì)胞中表達(dá)以致于該蛋白質(zhì)不能以可檢測(cè)的程度參與正常細(xì)胞功能。另一方面，本發(fā)明提供了一種制造腫瘤細(xì)胞的功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(a)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤病人是選擇性免疫原性的(b)分離并純化該蛋白質(zhì)。本發(fā)明還將包括以這種方法制造的蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種制造腫瘤細(xì)胞的功能性蛋白質(zhì)的方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)測(cè)定分離和純化的蛋白質(zhì)的序列(d)制備編碼所述已測(cè)序之蛋白質(zhì)的多核苷酸(e)用包含所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(f)在足以表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(g)收集所述蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易了解到，腫瘤特異性抗原可以是腫瘤細(xì)胞的選擇性功能性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還公開了選擇性功能性腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)。如下列實(shí)施例1中所提出的，SCC抗原3.3很可能是這樣一種功能性蛋白質(zhì)。已測(cè)定了SCC3.3的氨基末端序列，并發(fā)現(xiàn)具有部分氨基酸殘基序列Gln-Phe-Pro-Phe-Gly-Ala-Gly-Glu-Thr(SEQIDNO1)。該序列與人乳頭瘤病毒E6蛋白質(zhì)相匹配，所述蛋白質(zhì)是一種在促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)育中起作用的致癌基因產(chǎn)物。如上所述，本發(fā)明已鑒定了作為乳腺癌特異性抗原的磷酸化的dbl。dbl很可能是一種乳腺癌選擇性功能性蛋白質(zhì)。dbl致癌基因產(chǎn)物是分布在胞質(zhì)和與細(xì)胞骨架基質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞膜部分之間的66kD胞質(zhì)磷蛋白(Srivastavaetal.，IdentificationoftheproteinencodedbythehumandiffuseB-celllymphoma(dbl)oncogene.ProcNatlAcadSciUSA1986，86(23)8868-72)，該蛋白Eva和Aaronson使用人B-細(xì)胞淋巴瘤DNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞而分離的(Evaetal.，IsolationofahumanoncogenefromadiffuseB-celllymphoma，Nature1985，316(6025)273-5)。其正常的同系物是包含925個(gè)氨基酸的115kD原致癌基因產(chǎn)物(p115dbl)(Ronetal.，Molecularcloningandcharacterizationofthehumandblproto-oncogeneevidencethatitsoverexpressionissufficienttotransformNIH/3T3cell.EmboJ1988，7(8)2465-73)。p66dbl由478個(gè)氨基酸組成(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductsdefineadistinctclassoftransformingproteins.Proc.NatlAcadSciUSA1988.85(7)2061-5)。它是一種融合蛋白，其末端428個(gè)氨基酸相當(dāng)于p115分子的末端殘基。p66dbl具有dbl原致癌基因產(chǎn)物中不存在的額外的50個(gè)氨基酸部分(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins.Proc.NatlAcadSciUSA1988，85(7)2061-5)，但這些殘基從一尚未知的基因來源滲入的。p66和p115dbl兩者均在絲氨酸殘基上被磷酸化，并偶有某些蘇氨酸的磷酸化(Grazianietal.，Thehumandbl-proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)。與原致癌基因產(chǎn)物的1小時(shí)相比，p66dbl具有6小時(shí)的磷酸化細(xì)胞內(nèi)半壽期(Grazianietal.，Thehumandbl-proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)。p66dbl也已顯示含有比p115dbl更多的磷酸化的殘基。與相應(yīng)的p115原致癌基因產(chǎn)物一樣，p66dbl很可能發(fā)揮類-ras多肽(例如見于酵母細(xì)胞中的cdc24)之GDP-GTP交換因子的功能(Adamsetal.，Thehematopoieticallyexpressedvavproto-oncogeneshareshomologywiththedblGDPPro-GTPexchangefactor，thebcrgeneandayeastgene(CDC24)involvedincytoskeletalorganizationOncogene1992，7(4)611-8)。C.檢測(cè)抗腫瘤特異性抗原之抗體的試劑盒和方法另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)與腫瘤特異性抗原有免疫反應(yīng)活性的抗體的存在的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含足夠量的至少用于一次試驗(yàn)的腫瘤特異性抗原。用于試劑盒中的腫瘤特異性抗原與以上提到的相同。腫瘤特異性抗原優(yōu)選地是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3或者磷酸化的dbl。該試劑盒還包括用于檢測(cè)與腫瘤特異性抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體(例如，抗原-抗體結(jié)合物或復(fù)合物)的方法。所述抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的方法是如上文提出的。再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)存在于生物體液中的對(duì)腫瘤特異性抗原有免疫反應(yīng)活性的抗體的方法。該方法包括以下步驟(a)使體液樣品與腫瘤特異性抗原形成混合物(b)將混合物在生物反應(yīng)條件下保留一段時(shí)間，使之足以在存在于樣品中的抗體與腫瘤特異性抗原之間形成結(jié)合物(c)檢測(cè)結(jié)合物的存在。所述腫瘤特異性抗原較好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。如上文提到的檢測(cè)抗原抗體結(jié)合物形成的優(yōu)選技術(shù)包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、間接免疫熒光法、乳膠凝集法和基于脂質(zhì)體的檢測(cè)法。另外，也可使用Western印跡法，在這種情況下，通過肉眼觀察來確定電泳帶，暗色帶的實(shí)質(zhì)性出現(xiàn)可以看作是陽性指征?？煽醋麝栃孕盘?hào)(即包含SCC特異性抗體之試驗(yàn)樣品的指征)的抗原/抗體復(fù)合物的檢測(cè)范圍依據(jù)所選用的檢測(cè)方法而異，但一般可限定為大于平均數(shù)加上用陰性對(duì)照組樣品所觀察之結(jié)果1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的值。而所有其它參數(shù)(樣品的稀釋度、保溫時(shí)間等)保持恒定。在某些實(shí)施方案(其中需較高的特異性)中，可以使用平均值加2個(gè)或平均值加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。陰性對(duì)照組應(yīng)包含已知無腫瘤特異性抗原的個(gè)體。D.制造/制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞群的方法本發(fā)明提供了鑒定可用于產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞之腫瘤抗原的方法。腫瘤抗原可以是能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)育的，而所述T細(xì)胞在識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞上有效的。作為背景，細(xì)胞例如B和T淋巴細(xì)胞起著免疫系統(tǒng)之效應(yīng)細(xì)胞的作用。這些淋巴細(xì)胞分別參與發(fā)動(dòng)抗外來抗原的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。成熟的B和T細(xì)胞帶有對(duì)不同的抗原特異的受體。成熟T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3細(xì)胞表面分子。T細(xì)胞的兩種主要類別，即CD8＋T細(xì)胞細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)和CD4＋T細(xì)胞(T輔助細(xì)胞)可在腫瘤治療中起重要作用。一般說來，CD8+細(xì)胞被認(rèn)為是介導(dǎo)直接殺傷，而CD4+細(xì)胞被認(rèn)為是通過分泌細(xì)胞因子介導(dǎo)抗腫瘤作用。所述細(xì)胞因子例如包括具有直接和/或間接抗腫瘤活性的白細(xì)胞介素2、腫瘤壞死因子、淋巴毒素、干擾素、集落刺激因子和巨噬細(xì)胞活化因子。然而，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞可以具有重疊功能(即CD4+細(xì)胞能夠通過直接胞溶殺傷，CD8+細(xì)胞能通過分泌細(xì)胞因子起作用)。CD8+和CD4+T細(xì)胞間的主要區(qū)別在于，CD8+T細(xì)胞識(shí)別由I類MHC分子呈現(xiàn)的抗原，而CD4+T細(xì)胞識(shí)別由II類MHC分子呈現(xiàn)的抗原。一般說來，由靶細(xì)胞合成的內(nèi)部抗原進(jìn)入I類MHC抗原呈現(xiàn)途徑以排阻外部細(xì)胞環(huán)境中的抗原。在外細(xì)胞環(huán)境中的抗原，包括分泌的自身蛋白質(zhì)和由腫瘤細(xì)胞死亡和破壞所釋放的內(nèi)蛋白質(zhì)，進(jìn)入II類MHC抗原加工途徑并刺激CD4+細(xì)胞。在大多數(shù)正常免疫反應(yīng)中，CD8+和CD4+T細(xì)胞兩者均參與。但每單獨(dú)的亞群也能介導(dǎo)腫瘤治療。因此，本發(fā)明提供了一種制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟(a)分離對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞(b)誘導(dǎo)致敏的T細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增。誘導(dǎo)最好在腫瘤特異性抗原，且必要時(shí)在抗原呈現(xiàn)細(xì)胞存在下完成。用于這一方法的T細(xì)胞較好從循環(huán)淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)或腫瘤組織中分離。該方法還可進(jìn)一步包括以下步驟(c)繼代培養(yǎng)T細(xì)胞，以鑒定對(duì)特定腫瘤特異性表位敏感的T細(xì)胞。已開發(fā)出擴(kuò)增免疫T細(xì)胞以擴(kuò)充其數(shù)量的技術(shù)，該技術(shù)包括在體外用抗原進(jìn)行特異性激活，接著用抗原、單核飼養(yǎng)細(xì)胞和IL-2進(jìn)行重復(fù)周期性再刺激(參見Cheeveretal.，J.Immunol，1261318(1981)；Cheeveretal.，J.Exp.Med.155968(1982)和Cheeveretal.，J.Exp.Med.1631100(1986))。應(yīng)注意的是，在人中真正同基因的腫瘤細(xì)胞僅從完全相同的雙生子獲得。由于變種和其他各種原因，包括不充足的腫瘤樣品和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增的困難。常常不能得到自體腫瘤細(xì)胞。雖然飼養(yǎng)細(xì)胞的供給從理論上可經(jīng)照射自身的白趨細(xì)胞(leukophoresedcell)而實(shí)現(xiàn)，但抗原可獲得性問題仍然沒有解決。本發(fā)明提供了對(duì)這一問題的一種解決辦法，所說的問題中將涉及足以引起各腫瘤類型所有衍生細(xì)胞之免疫原性總體內(nèi)容的抗原文庫。下文給出了對(duì)腫瘤特異性抗原肽文庫的描述。更具體地說，SCC抗原是由特異性T輔助淋巴細(xì)胞識(shí)別的，因?yàn)檫@些免疫細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgA、IgE和IgG所需要的。本發(fā)明提供了被腫瘤反應(yīng)性T輔助(Th)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別的抗原。可以使用顯示與個(gè)別病人的MHCI或II分子結(jié)合的抗原肽克隆和擴(kuò)充這些淋巴細(xì)胞，以提供自身Th細(xì)胞和/或CTL?？梢岳鋬隹寺〉牧馨图?xì)胞以提供多個(gè)處理組。所述處理將包括大量注入腫瘤靶向Th細(xì)胞和/或CTL以起到腫瘤細(xì)胞殺傷和消除作用。這一處理方法的另一個(gè)益處是在腫瘤消除后保留T輔助記憶細(xì)胞以防止腫瘤復(fù)發(fā)。培養(yǎng)中的細(xì)胞可擴(kuò)增至大約108至1010個(gè)細(xì)胞繼承性能轉(zhuǎn)移多達(dá)5×1010個(gè)細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯毒性。所述免疫原性腫瘤特異性抗原較好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在病人不能以可回收的量產(chǎn)生免疫T細(xì)胞時(shí)可以在體外激活淋巴細(xì)胞。因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種制造對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟(a)分離含有純凈的非抗原致敏的T細(xì)胞的自體T細(xì)胞群；(b)鑒定免疫原性腫瘤特異性抗原；(c)用免疫原性腫瘤特異性抗原致敏非抗原致敏的T細(xì)胞。所述腫瘤特異性抗原較好是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2、50.3或磷酸化的dbl。所述T細(xì)胞較好是T輔助淋巴細(xì)胞或特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞?？捎脤?duì)腫瘤表達(dá)的抗原特異的T細(xì)胞治療惡性腫瘤。作為一個(gè)例子，可以分離對(duì)特定類型的腫瘤特異的T細(xì)胞并將其用于患有腫瘤的病人?？梢栽隗w外產(chǎn)生腫瘤特異性T細(xì)胞并用于治療癌癥病人(參見Rosenbergetal.，N.Engl.J.Med.3191767(1988))。已將這種類型的治療稱作繼承性免疫治療?？蓮氖苤委熣唧w內(nèi)分離對(duì)某些腫瘤抗原特異的T細(xì)胞，擴(kuò)增并再以足可消除腫瘤細(xì)胞的量重新用于病人。(參見Riddleetal.，J.Immunol.Neth.128189(1990))。更詳細(xì)的說明參見實(shí)施例1，J.iv和v。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用腫瘤抗原開發(fā)用于預(yù)防癌癥的疫苗。在該實(shí)施方案中，構(gòu)建了牛痘病毒(Vaccinia)或另一載體病毒，所述病毒含有編碼與個(gè)別病人MHC構(gòu)架匹配之腫瘤抗原的核酸(參見Mackett，Proc.Nat′lAcadSci.USA797415-19(1982)；Mackett，J.Virol.49857-65(1984))。該疫苗可以加在一種藥學(xué)上可接受的載體中使用。E.提高腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)免疫特異性再一方面，本發(fā)明提供了包括磷酸化腫瘤相關(guān)抗原在內(nèi)的提高腫瘤相關(guān)抗原之免疫原性特異性的方法。優(yōu)選的腫瘤抗原是乳腺癌抗原例如，包含SEQIDNO2的氨基酸殘基序列的dbl。如上文所提出的，磷酸化的dbl是一種乳腺癌特異性抗原。與來源于正常的、非乳腺癌病人的血清相比，磷酸化的p66dbl與來源于腫瘤病人的血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。實(shí)施例2給出了有關(guān)增加磷酸化的dbl之免疫特異性的詳細(xì)描述。導(dǎo)致對(duì)腫瘤血清之免疫特異性增加的dbl磷酸化是由于絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的增加或異常的磷酸化。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，該殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442處。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442處。在磷酸化的dbl包括至少三個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基時(shí)，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9或者436、438和442處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基時(shí)，該殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、280、403或406處。在磷酸化的dbl包括至少兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基時(shí)，所述殘基較好位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基時(shí)，該殘基較好位于SEQIDNO3的氨基酸殘基位置編號(hào)201處。磷酸化的dbl也可以包括多于一個(gè)類型的磷酸化的氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，較好是，其中(a)兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25處，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38處；(b)一個(gè)磷酸化絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402處，并且兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406處或者(c)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402處，并且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406處。在磷酸化的dbl包括至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基時(shí)，所述殘基較好的位置為一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202處，且一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基位于SRQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，磷酸化的dbl包括位于SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、3536、37或38的氨基酸殘基序列。F.腫瘤特異性抗原的肽文庫本發(fā)明提供了建立腫瘤特異性體液抗原肽文庫的方法。該方法包括以下步驟(a)從腫瘤細(xì)胞分離一種或多種選擇性免疫原性蛋白質(zhì)(b)在每一種選擇性免疫原性蛋白質(zhì)中鑒定對(duì)腫瘤病人為選擇性致免疫原的一個(gè)或多個(gè)表位。(c)就每一個(gè)表位制備含有該表位的肽，其中各單個(gè)肽都不含有被非腫瘤受試者識(shí)別的表位。(d)形成肽文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離包括以下步驟(a)從腫瘤細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)；(b)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)(c)分離和純化選擇性免疫原性蛋白質(zhì)。上文已提出了從腫瘤細(xì)胞分離蛋白質(zhì)和用對(duì)照和腫瘤病人血清篩選那些蛋白質(zhì)以確定與腫瘤病人血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)之所述蛋白質(zhì)的方法。鑒定方法較好包括以下步驟(a)限定蛋白質(zhì)中的潛在表位(b)合成含有所述蛋白質(zhì)之一部分的肽，該部分含有一個(gè)表位；(c)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，并且由此鑒定對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性之蛋白質(zhì)中的表位。可用本領(lǐng)域中已知的各種方法鑒定腫瘤特異性抗原中的潛在表位。舉例來說，可以測(cè)定抗原的氨基酸殘基序列，并將該序列與現(xiàn)有已鑒定的表位比較。在表位涉及到磷酸化的殘基時(shí)，可用滾動(dòng)總合分析(rollingsumanalysis)鑒定潛在的磷酸化位點(diǎn)。下文給出如用于磷酸化dbl的這種滾動(dòng)總合分析的說明。一旦限定了潛在表位，即制得含有至少一個(gè)這樣的表位的肽。盡管一個(gè)單獨(dú)的肽可以包含多于一個(gè)的潛在表位，但單個(gè)肽不含有與非腫瘤受試者血清發(fā)生免疫反應(yīng)的表位。合成蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中已知的。構(gòu)建長(zhǎng)度達(dá)20個(gè)氨基酸的，其中包含那些氨基酸殘基序列以及加到每個(gè)個(gè)別肽上的額外的非特異性間隔氨基酸殘基(甘氨酸或丙氨酸)的肽，以使其從與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合的位點(diǎn)上伸出(Eminieta1.，Primingforandinductionofanti-poliovirusneutralizingantibodiesbysyntheticpeptides。Nature1983304(5928)699-703McMillanetal.，Syntheticidiotypesthethirdhypervariableregionofmurineanti-dextranantibodies。Cell1983，35(3Pt2)859-63Makelaetal.，InWeirDM，ed.Handbookofexperimentalimmunology.OxfordBlaekwellScientificPublications，19861)。此外，每一肽在其氨基或羧基末端具有非特異性半胱氨酸，以通過N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸鹽連接鍵共價(jià)偶聯(lián)到其載體HSA上(Carlssonetal.，Proteinthiolationandreversibleprotein-proteinconjugation。N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate，anewheterobifuctionalreagent.BiochemJ1978，173(3)723-37Leeetal.，Amethodforpreparingbeta-hCGCOOHpeptide-carrierconjugatesofpredictablecomposition。MolImmunol1980，17(6)749-56)。在肽已具有半胱氨酸殘基的情況下，不加入特異性接頭氨基酸。一種可替換的方法是，使用碳化二亞胺方法將每個(gè)肽連接到HSA上(VanRegenmorteletal.，Synthetiepolopeptidesasantigens.Amsterdam，NewYork&londonElservier，1988(BurdenRH，VanKnippenbergPH，ed.LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology)。各肽最好是共價(jià)偶聯(lián)到HSA上。需要有載體分子以便可預(yù)定地提供足量的用于分析的肽，并且也給每一種肽更多的天然突出位點(diǎn)以利于抗體偶聯(lián)。采用可預(yù)見的連接方法(61-66)將個(gè)別肽以高摩爾比率(＞10∶1，肽∶HSA)偶聯(lián)到HSA上。HSA用作優(yōu)選的載體分子，因?yàn)榕c使用非自身載體蛋白質(zhì)(例如，牛血清白蛋白(BSA))相比，它能與自體抗體發(fā)生最小的反應(yīng)。最好將肽偶聯(lián)到HSA分子表面的游離氨基基團(tuán)上。對(duì)腫瘤病人和對(duì)照血清進(jìn)行抗HSA-肽結(jié)合物之混合物的試驗(yàn)。用我們標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡法分析該HSA-肽混合物。利用所有可能的肽取代物的混合物用于鑒定那些與任何個(gè)別肽反應(yīng)的腫瘤和對(duì)照血清。為了盡可能地減少非癌癥特異性表位反應(yīng)，可用肽的非表位等同物抑制每份試驗(yàn)的血清樣品。那些肽被結(jié)合到HSA上并以混合物形式使用，以抑制識(shí)別各肽之非特異性表位的血清抗體。那些與腫瘤特異性表位反應(yīng)的抗體(很可能僅存在于腫瘤病人血清中)則可能未受到抑制。所試驗(yàn)的抗體同種型是IgA、Igd、IgM和IgE。在對(duì)任何給定的免疫原性蛋白質(zhì)反應(yīng)中，個(gè)別病人很可能產(chǎn)生不同的反應(yīng)性抗體同種型?；加性缙陔A段疾病的病人與患有晚期階段病人相比，前者中產(chǎn)生占優(yōu)勢(shì)的IgM有力地說明，即使在癌癥原位(CIS)階段，也有可能通過測(cè)定IgM活性進(jìn)行早期檢測(cè)。分析IgE反應(yīng)活性以試驗(yàn)這樣一種前題，即IgG生成性致敏需要更長(zhǎng)時(shí)間的抗原暴露，因此其在早期腫瘤檢測(cè)中不可能是有用的同型。因此須在腫瘤發(fā)育階段的整個(gè)過程中分析被試血清的任何這種反應(yīng)性。試驗(yàn)來源于腫瘤發(fā)育所有階段之病人的血清樣品，同時(shí)試驗(yàn)來源于具有良性損害病人的和健康受試者的對(duì)照樣品。針對(duì)個(gè)別HSA-肽結(jié)合物試驗(yàn)所有初始反應(yīng)性病人和對(duì)照者的血清。用與HSA-肽結(jié)合物的混合物起陽性反應(yīng)的血清試驗(yàn)各單個(gè)結(jié)合物的體液反應(yīng)性。試驗(yàn)方法學(xué)上是相同的。然而，在每一種情況下，添加抗原是相應(yīng)的非表位HSA結(jié)合物且不是添加結(jié)合物混合物。進(jìn)一步分析那些只與腫瘤病人血清反應(yīng)的肽。畫出最長(zhǎng)的，在各表位兩邊的可能的腫瘤特異性氨基酸序列的序列圖譜。這一工作的一個(gè)成功結(jié)論提供了作為腫瘤特異性免疫原發(fā)揮作用并且也用作在不需制備性抗原添加的情況下進(jìn)行腫瘤特異性血清抗體檢測(cè)的理想的來源抗原的肽。即使在其表位區(qū)域的結(jié)構(gòu)識(shí)別方面發(fā)生微小變化，對(duì)最大可能的腫瘤特異性免疫原性區(qū)域的描繪也會(huì)給出足夠的與大多數(shù)可獲得的血清抗體反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。這將增加試驗(yàn)的敏感性。因此在這一過程中，我們可以在特定表位以外達(dá)5-6個(gè)氨基酸處發(fā)現(xiàn)有表位特異性。由于由在表位和遠(yuǎn)端氨基酸間的鹽橋?qū)е铝诉h(yuǎn)端肽構(gòu)象的變化，所以這種情況是可能發(fā)生的(Otovosetal.，Phosphorytationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.J.ProteinChem1988，7(4)365-76)。合成鑒定為腫瘤特異性的肽的各種較短變體，并進(jìn)行抗陽性腫瘤血清和對(duì)照血清試驗(yàn)。待檢對(duì)照血清包含統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義數(shù)目的從良性損傷病人和健康受試者獲得的樣品。本發(fā)明還將涉及用這一方法制得的文庫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表位包含一個(gè)異常磷酸化的氨基酸殘基序列。能夠經(jīng)受細(xì)胞內(nèi)磷酸化的蛋白質(zhì)是一大類靶分子。這一類分子的代表性例子示于附圖11中。其成員包括編碼癌基因的蛋白質(zhì)，磷酸化的受體蛋白質(zhì)、細(xì)胞激酶、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白質(zhì)。候選分子很可能包括(1)對(duì)腫瘤細(xì)胞而不是正常細(xì)胞在性質(zhì)上和/或數(shù)量上特異的蛋白質(zhì)(2)在正常細(xì)胞中有很短磷酸化期限，而在腫瘤細(xì)胞中則保持較長(zhǎng)磷酸化期限的蛋白質(zhì)(3)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白質(zhì)和(4)在胚胎組織中產(chǎn)生的并在正常胎后組織中缺少的，但在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)?；诳萍嘉墨I(xiàn)中的詳述選擇候選的蛋白質(zhì)。為描述定性和定量特異性而分析涉及癌基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)、磷酸化的受體、細(xì)胞激酶、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和其他磷酸化的蛋白質(zhì)的引述文獻(xiàn)。基于免疫組織化學(xué)分析、RNA和/或DNA雜交以及特異性蛋白質(zhì)分離工作描述相對(duì)特異性。還基于我們進(jìn)行的對(duì)乳腺癌組織的免疫化學(xué)分析選擇候選的蛋白質(zhì)。起始的候選蛋白質(zhì)是在其他腫瘤系統(tǒng)中試驗(yàn)陽性的癌基因編碼的蛋白質(zhì)、其他癌基因編碼的蛋白質(zhì)、磷酸化的受體、細(xì)胞激酶、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子及與細(xì)胞增殖和/或分化相關(guān)的其他蛋白質(zhì)。也可以基于來源于嘗試從乳腺癌細(xì)胞分離用作選擇性特異性體液免疫原的胞質(zhì)蛋白的信息選擇候選蛋白質(zhì)。將建立的細(xì)胞系，例如BThr-20、BThr-474、BThr-483、MCF-7、MDAla-MB-134、MDAla-MB-157、MDAla-MB-231、MDAla-MB-453、MDAla-MB-468和SKBArg-3(AmericanTissueTypeCollection，Rockyille，MD)培養(yǎng)至50ml細(xì)胞堆積體積。以含水緩沖液從每細(xì)胞沉淀物中提取可溶性蛋白質(zhì)，并使用幾種不同的層析步驟進(jìn)行再分離。用DEAE陰離子交換層析法分離，接著用SP陽離子交換層析法分離可溶性蛋白質(zhì)。將得自DEAE和SP層析的單個(gè)含蛋白質(zhì)組分在7.5％和15.0％的聚丙烯酰胺膠(PAGE)上電泳，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素紙上進(jìn)行單個(gè)乳腺癌細(xì)胞蛋白質(zhì)的Western印跡分析。一旦被這樣鑒定后，便將這些蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到聚亞乙烯氟膜上，并用于部分氨基酸序列測(cè)定。推導(dǎo)的氨基酸序列得以鑒定全部氨基酸序列已知的蛋白質(zhì)。如果推導(dǎo)的氨基酸序列不是以前描述的蛋白質(zhì)，則它們即被用作在描述那些分子的基因組序列中使用的模板。如上所述，磷酸化的dbl已被鑒定為一種乳腺癌特異性抗原。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了一種建立乳腺癌特異性體液抗原肽文庫的方法，該方法包括以下步驟(a)鑒定存在于乳腺癌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)對(duì)乳腺癌病人是選擇性免疫原性的；(b)確定該蛋白質(zhì)的潛在的磷酸化位點(diǎn)(c)合成包含該蛋白質(zhì)部分的肽，每一種蛋白質(zhì)均含有至少一個(gè)磷酸化位點(diǎn)并且其中至少一個(gè)磷酸化位點(diǎn)是磷酸化的(d)篩選所述肽，以鑒定對(duì)乳腺癌病人為選擇性免疫原性的磷酸化的肽(e)形成磷酸化的選擇性免疫原性肽的文庫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是癌基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其他調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或底物蛋白質(zhì)。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是dbl，并且潛在的磷酸化位點(diǎn)包括(a)一個(gè)在SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上的磷酸化的絲氨酸殘基(b)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和433、436和442或者438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基(c)至少三個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9或者436、438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基(d)一個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403和406上的磷酸化的蘇氨酸殘基(e)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上的磷酸化的蘇氨酸殘基；(f)至少一個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上的磷酸化的酪氨酸殘基(g)至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，其中(i)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38上；(ii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，且兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上或者(iii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406上；或(h)至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基或至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基，其中磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202上，且磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。上述方法的蛋白質(zhì)部分較好包括SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸殘基序列。篩選大量合成的對(duì)乳腺癌特異性血清抗體有反應(yīng)活性的候選肽，制得腫瘤特異性肽文庫。然后，用該文庫作為來源抗原，用該抗原進(jìn)行高敏感性和特異性的血清學(xué)試驗(yàn)，以在大多數(shù)病人中檢測(cè)早期乳腺癌。p66dbl的完全氨基酸序列已由Eva描述過(Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins.ProcNatlAcadSciUSA1988，85(7)2061-5)。使用概略性的用于描述表面肽的四種單獨(dú)的方法，我們已繪制出那些很可能認(rèn)定為磷酸化候選位點(diǎn)的氨基酸殘基的圖譜。利用7個(gè)連續(xù)殘基的滾動(dòng)總合分析法(rollingSumanalysis)時(shí)，用于構(gòu)成一致性分析的個(gè)別方法包括確定親水性指標(biāo)(Hoppetal.，Predictionofproteinantigenicdeterminantsfromaminoacid-sequences.ProcNatlAcadSciUSA1981；78(6)3824-3828)，HPLC肽保留指標(biāo)(Parkeretal.，Newhydrophilicityscalederivedfromhigh-performanceliquidchromatographypeptideretentiondatacorrelationofpredictedsurfaceresidueswithantigenicityandx-ray-derivedaccessibilitysites.Biochemistry1986；255425-5432)，疏水性指標(biāo)(FauchereJL，PliskaV.Hydrophobicparameterspiofamino-acidsidechainsfromthepartitioningofAsn-acetyl-amino-acidamides.EurJMedChem1983；18(4)369-375)，和可及性指標(biāo)(Fragaetal.，Predictionofthesecondarystructureandfunctionalsitesofmajorhistocompatibilitycomplexmolecules.JMolRecognit1990；3(2)65-7347).潛在的磷酸化位點(diǎn)包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。與乳腺癌相關(guān)的dbl的異常磷酸化可以發(fā)生在許多位點(diǎn)并涉及到多于一種類型的殘基。p66的聯(lián)合滾動(dòng)總合分析圖解顯示于圖10中。適合外部暴露要求的肽區(qū)域圖解顯示于圖10中?；谝陨戏治觯哂凶畲蠼z氨酸磷酸化潛在性的p66dbl肽序列包括SEQIDNOs3-10所指定的那些序列，其中磷酸化殘基下面畫線標(biāo)示Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO3)Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO4)Ala-Pro-Gly-Arg-Ser-Ala-Ala(SEQIDNO5)Cys-Gln-Asn-Lys-Pro-Arg-Ser(SEQIDNO6)Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNO7)Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO8)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO9)andAla-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Gln(SEOIDNO10).具有最大蘇氨酸磷酸化可能性的p66dbl肽序列包括SEQIDNOs3-10所指定的那些序列，其中磷酸化殘基下面畫線標(biāo)示Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO11)Lys-Lys-Gly-Ala-Thr-Lys-Met-Lys-Asp-Leu-Ala-Arg(SEQIDNO12)Val-Lys-Lys-Arg-Lys-Gln-Gln-Asp-Gln-Leu-Thr-Glu-Arg-Asp-Lys-Phe(SEQIDNO13)和Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO14).具有最大酪氨酸磷酸化可能性的p66dbl肽序列是Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNO15).某些p66dbl序列具有包含絲氨酸和蘇氨酸潛在磷酸化位點(diǎn)之殘基的組合。那些殘基是Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO16)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO17).一個(gè)p66dbl序列具有包含絲氨酸和酪氨酸潛在磷酸化位點(diǎn)之殘基的組合Glu-Leu-Leu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Asp-Cys-Glu-Gly(SEQIDNOl8).試驗(yàn)了所有包括那些含磷酸化蘇氨酸和/或酪氨酸殘基在內(nèi)的可能的磷酸化肽置換，因?yàn)楫惓Ａ姿峄豢赡軆H限于絲氨酸殘基。以上列出的16個(gè)肽加上在額外的帶有磷酸化殘基位點(diǎn)的其它肽。假如附加肽具有兩種或多種能夠經(jīng)受磷酸化的氨基酸殘基，則它們包括那些肽的不同磷酸化/去磷酸化的組合。Szendrei的工作預(yù)示了對(duì)分析在5個(gè)氨基酸跨度(理想的表位大小)內(nèi)含有一個(gè)磷酸化的氨基酸的變化之各表位的需要(Szendreietal.，RecognitionoftheminimalepitopeofmonoclonalantibodyTau-1dependsuponthepresenceofaphosphategroupbutnotitslocation.J.NeurosciRes1993，34(2)249-9)，Szendrei已證明單個(gè)氨基酸殘基的去磷酸化阻止特異性單克隆抗體結(jié)合到由那些殘基限定的表位上。所除外的是其中可磷酸化的殘基被多于六個(gè)不可磷酸化的殘基(即，肽SEQIDNO6中的第二個(gè)S和T)相互分開的置換，因?yàn)檫@些置換會(huì)限定兩個(gè)分離的和不同的表位區(qū)域。所述附加肽和其衍生構(gòu)建體包括Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO19)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO20)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO21)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO22)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO23)Met-Ser-Ser-Gly-Arg-Arg-Gly-Ser(SEQIDNO24)；Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO25)Ser-Pro-Ser-Arg-Asp-Lys-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Arg-Pro-Gly-Thr(SEQIDNO26)；Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO27)Cys-Lys-Arg-Arg-Val-Glu-Ser-Gly-Glu-Gly-Ser-Asp-Arg(SEQIDNO28)；Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO29)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO30)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO31)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO32)Ala-Ser-Gln-Ser-Vsl-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO33)Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Glu-Ile-Ser-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu(SEQIDNO34)；Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO35)Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO36)；Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO37)；和Ser-Thr-Glu-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-His(SEQIDNO38).有關(guān)合成含有磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和/或酪氨酸殘基之肽的基本技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(Carpenteretal，Phosphoinositide3-kinaseisactivatedbyphosphopeptidesthatbindtotheSH2domainsofthe85-kDasubunit.JBiolChem1993；268(13)9478-83；Ottingeretal.，Synthesisofphosphotyrosine-containingpeptidesandtheiruseassubstratesforproteintyrosinephosphatases.Biochemistry1993；32(16)4354-61；Otovosetal.，Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.JProteinChem1988；7(4)365-76；Andrewsetal.，Solid-phasesynthesisofarangeofO-phosphorylatedpeptidesbypost-assemblyphosphitylationandoxidation.IntJPeptProteinRes1991；38(5)469-75；Garbay-Jaureguiberryetal.，Solidphasesynthesisofpeptidescontainingthenon-hydrolyzableanalogof(O)phosphotyrosine，p(CH2PO3H2)Phe.Applicationtothesynthesisof344-357sequencesofthebeta2adirenergicreceptor.IntJPeptProteinRes1992；39(6)523-7；Escobedoetal.，Aphosphatidylinositol-3kinasebindstoplatelet-derivedgrowthfactorreceptorsthroughaspecificreceptorsequencecontainingphosphotyrosine.MolCellBiol1991；11(2)1125-32；Kwonetal.，StereochemistryspecifiestheregiochemistryofphosphorylationintwocAMP-dependentproteinkinasesubstrates.JBiolChem1993；268(22)16725-9).很容易構(gòu)建含有單個(gè)或多個(gè)磷酸化殘基的肽?？捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)HPLC技術(shù)將單個(gè)肽純化達(dá)到＞95％的純度。使用已知的標(biāo)準(zhǔn)HPLC法以及質(zhì)譜分析法完成氨基酸組合物和單個(gè)肽序列的認(rèn)定(Garbay-Jaureguiberryetal.，Solidphasesynthesisofpeptidescontainingthenon-hydrolyzableanalogof(O)phosphotyrosine，p(CH2PO3H2)Phe.Applicationtothesynthesisof344-357sequencesofthebeta2adrenergicreceptor.IntJPeptProteinRes1992；39(6)523-7；Kwonetal.，StereochemistryspecifiestheregiochemistryofphosphorylationintwocAMP-dependentproteinkinasesubstrates.JBiolChem1993；268(22)16725-9；Stachowiaketal.，PeptidemappingusingthermosprayLC/MSdetectionrapididentificationofnemoglobinvariants.PeptRes1989；2(4)267；Khandkeetal.，InfluenceofionsoncyclizationoftheaminoterminalglutamineresiduesoftrypticpeptidesofstreptocccalPepM49protein.ResolutionofcyclizedpeptidesbyHPLCandcharacterizationbymassspectrometry.IntJPeptProteinRes1989；34(2)118-23).Szendrei已指出，檢測(cè)被單個(gè)單克隆抗體識(shí)別的表位上的磷酸鹽取代是可能的(Szendreietal.，RecognitionoftheminimalepitopeofmonoclonalantibodyTau-1dependsuponthepresenceofaphosphategroupbutnotitslocation.J.NeurosciRes1993；34(2)243-9)。而且，其他研究已經(jīng)闡明，由于磷酸鹽分子的鹽橋接，相互的最接近的殘基的磷酸化可以提供表位改變構(gòu)象變化(OtovosLJr.，HollosiM，PerczelA，DietzscholdB，F(xiàn)asmanGD.Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sizedsubunit.JProteinChem1988；7(4)365-76).單個(gè)人血清抗體的表位結(jié)合敏感性用于確定由異常磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和/或酪氨酸殘基的新抗原表位是否存在于p66dbl中。合成SEQIDNOs3-38所指定的肽，結(jié)合到HSA并按如上文提出的方法分析之。簡(jiǎn)單地說，進(jìn)行乳腺癌和對(duì)照血清抗HSA-磷酸化肽結(jié)合物之混合物的試驗(yàn)。用Western印跡法分析HSA-肽混合物。利用所有可能的肽置換的混合物鑒定那些與任何單個(gè)肽反應(yīng)的腫瘤和對(duì)照血清。為了盡可能減少非腫瘤特異性表位反應(yīng)，向各待試血清樣品中添加具有SEQIDNOs3-10、12和13所示肽的未磷酸化的等同物。將這些肽結(jié)合到HSA上并用于混合物中，以抑制識(shí)別各磷酸化肽之非特異性表位的血清抗體。那些與腫瘤特異性表位反應(yīng)的抗體(很可能僅在腫瘤病人血清中)很可能仍是未被抑制的。所檢測(cè)的抗體同型是IgA、IgG、IgM和IgE。在對(duì)任何給定的免疫原性蛋白質(zhì)反應(yīng)中，個(gè)別病人很可能產(chǎn)生不同的反應(yīng)性抗體同型。與患有II、III和IV期疾病的病人相比，患有I期疾病的病人中產(chǎn)生占優(yōu)勢(shì)的IgM強(qiáng)有說明，即使在原位腫瘤(CIS)階段也可能通過測(cè)定IgM反應(yīng)活性進(jìn)行早期診斷。分析IgE反應(yīng)性，以試驗(yàn)這樣一種前題IgG產(chǎn)生致敏需要延長(zhǎng)的抗原暴露時(shí)間并且因此在早期乳腺癌檢測(cè)中不可能是有用的同型。因此，應(yīng)在待檢血清的乳腺癌相應(yīng)發(fā)展階段的全過程中分析任何這種反應(yīng)活性。試驗(yàn)來源于導(dǎo)管和小葉癌癥所有階段的病人的血清樣品以及來源于包括良好損傷病人和健康受試者的對(duì)照樣品。對(duì)所有發(fā)生反應(yīng)的病人和對(duì)照血清再進(jìn)行抗個(gè)別HSA-磷酸化肽結(jié)合物的試驗(yàn)。用與HSA-肽結(jié)合物反應(yīng)陽性的血清試驗(yàn)每一單個(gè)結(jié)合物的體液反應(yīng)性。試驗(yàn)方法學(xué)是相同的。然而，在每一種情況下，添加抗原是相應(yīng)的非磷酸化HSA結(jié)合物而不是添加結(jié)合物的混合物。進(jìn)一步分析那些只與乳腺癌血清反應(yīng)的磷酸化的肽。繪出最長(zhǎng)的，在各變異磷酸化氨基酸殘基兩邊的可能的乳腺癌特異性氨基酸序列序列圖譜。這一工作的成功結(jié)論提供了作為腫瘤特異性免疫原發(fā)揮作用并且也用作在不需制備性抗原添加的情況下進(jìn)行腫瘤特異性血清抗體檢測(cè)之理想來源抗原的肽。即使在其磷酸化殘基識(shí)別區(qū)域的結(jié)構(gòu)識(shí)別方面發(fā)生微小變化，對(duì)最大可能性的腫瘤特異性免疫原性區(qū)域的描繪也會(huì)給出足夠的與大多數(shù)可獲得的血清抗體反應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。如此將增加試驗(yàn)的敏感性。異常殘基磷酸化可以賦予表位特異性延至磷酸化殘基外5-6個(gè)氨基酸處。由于磷酸化殘基和遠(yuǎn)端氨基酸間的鹽橋?qū)е铝诉h(yuǎn)端肽構(gòu)象的改變，所以這種情況是可能發(fā)生的(Octovosetal.，Phosphorylationloopsinsyntheticpeptidesofthehumanneurofilamentproteinmiddle-sjzedsubunjt.J.ProteinChem1988，7(4)365-76)。合成鑒定為乳腺癌特異性的肽的各種較短的變體，并進(jìn)行抗dbl-陽性乳腺癌血清試驗(yàn)。待檢對(duì)照血清包含統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義數(shù)目的從良性損傷病人和健康受試者獲得的樣品。在沒有制備性血清添加的情況下檢驗(yàn)全長(zhǎng)度肽。如發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的陽性反應(yīng)性是對(duì)腫瘤血清特異性的，便將證實(shí)總的肽特異性。如果腫瘤和對(duì)照血清分享所測(cè)得的反應(yīng)性，所研究的肽則在超出最近之磷酸化殘基5個(gè)氨基酸的一端和另一端縮短2個(gè)氨基酸。重新試驗(yàn)各新的肽，如果必要時(shí)，可進(jìn)一步縮短直至出現(xiàn)所需的特異性抗體反應(yīng)性。最終的結(jié)果是獲得異常磷酸化肽的文庫，以其作為乳腺癌特異性體液抗原的來源。然后，可用這些抗原建立檢測(cè)早期乳腺癌的基于抗體的篩選試驗(yàn)。G.檢測(cè)腫瘤存在的試劑盒期望的檢測(cè)水平是檢測(cè)原位癌(C-I-S)。假如所提供的分子(例如p66dbl)能鑒定其他76％的乳腺癌病人，則可能是在目前沒有可靠的等同物的I期癌癥檢測(cè)。提供了一種基于ELISA的原型篩選試驗(yàn)。其來源抗原是本發(fā)明的腫瘤特異性抗原。將特異性肽共價(jià)偶聯(lián)到HSA上以可靠地包被微滴定孔。用中性的、非反應(yīng)性接頭氨基酸序列合成各肽，以利于其連接到HSA上，以為其提供遠(yuǎn)離HSA分子的足夠的凸出部分，從而可隨意得到血清抗體結(jié)合。經(jīng)特異性優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分別確定每一結(jié)合物的包被量。用得自定量的個(gè)別抗原鋪涂的信息構(gòu)成成比例抗原混合物配方。使用HSAla-肽結(jié)合物混合物以提供高靈敏性和特異性。將源于足夠大和不同腫瘤特異性抗原組的抗原混合在一起。也考慮肽-HSA混合物的組合看哪一種抗原最適合早期腫瘤識(shí)別。因此，針對(duì)早期腫瘤病人血清和C-I-S病人血清篩選免疫原性肽。也試驗(yàn)個(gè)別抗體同型以確定哪一個(gè)異型是最適于早期檢測(cè)的。實(shí)施例1HSTA的鑒定缺少特異性的，可作為靶的鱗狀細(xì)胞癌(SCC)抗原已大大限制了免疫治療。例如疫苗和繼承性能轉(zhuǎn)移腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的開發(fā)。這一實(shí)施例表明，大多數(shù)SCC病人和受試者具有抗SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)的血清IgA、IgE和IgG抗體。這些蛋白質(zhì)中的某些似乎可用作高特異性腫瘤抗原，因?yàn)楫?dāng)用Western印跡技術(shù)分析時(shí)它們可與病人IgA和IgG抗體高排他性地結(jié)合。在該實(shí)施例中，鑒定了30份HSTA腫瘤抗原。個(gè)別HSTA與不同病人的血清和不同陽性/陰性組合受試者血清的IgA或IgG發(fā)生反應(yīng)。所有病人血清都表現(xiàn)出具有一定量與某些HSTA反應(yīng)的免疫球蛋白，而病人血清則不含與所有HSTA反應(yīng)的抗體。因此可從病人體內(nèi)分離和擴(kuò)增分化SCC抗原的文庫。更具體地說，本實(shí)施例顯示(1)25個(gè)單個(gè)SCC系的擴(kuò)增；(2)從這些細(xì)胞系的混合物中分離可溶性胞質(zhì)蛋白和其他分子；(3)SCC胞質(zhì)蛋白結(jié)合到CNBr活化紙盤上；(4)試驗(yàn)各種SCC病人和對(duì)照血清中結(jié)合到胞質(zhì)抗原上的IgA、IgE和IgG；和(5)抗原抑制研究，以證實(shí)各檢測(cè)法的特異性。使用不同腫瘤來源的單克隆SCC細(xì)胞系的混合物，以通過稀釋減少抗原的作用。所述抗原以不足以形成足夠免疫原性的量存在于各細(xì)胞類型中，或者僅存在于很少幾種細(xì)胞系中并因此被認(rèn)為是小的或少的抗原。使用偶聯(lián)到試驗(yàn)抗原上的CNBr活化的紙盤，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^游離的氨基基團(tuán)提供蛋白質(zhì)的偶聯(lián)，從而避免將碳水化合物和核酸作為抗原。與IgG一起測(cè)定IgA和IgE同型，因?yàn)樗鼈冇葿細(xì)胞表達(dá)也需要有T細(xì)胞的共同參與。A.血清樣品來源分析了65份患有頭和頸SCC的病人的血清和65份年齡和性別相配的對(duì)照對(duì)象的血清。25份病人血清來源于患有第I或II期疾病的受試者，43份血清樣品來源于患有III和IV期疾病的病人。對(duì)照樣品從年齡和性別相配的健康受試者收集。B.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)以約相等的量擴(kuò)增25份已建立的SCC細(xì)胞系，以給出等于35ml的合并的細(xì)胞沉淀物。所有細(xì)胞系都來源于頭部和頸部各不同位置的腫瘤。細(xì)胞系包括UM1、5、6、8、9、10、11、12、14、15、16、17和18(從Dr.T.Carey，UniversityofMichigan，AnnArbor獲得)，SCC-21、23、24、25、26、28、29、30、31(NorthwesternUniversity)以及HTB-43、CCL-23和138(ATCC，Rockville，MD)。所有細(xì)胞系均用MEM＋NNEAA＋7％FBS＋SerXtend培養(yǎng)基(CultureFacility，U.C.S.F)培養(yǎng)和擴(kuò)增。在大約70％匯合時(shí)，用加在Puck′s鹽水中的0.1％胰蛋白酶和0.4％EDTA的溶液在37℃處理5-10分鐘，從組織培養(yǎng)瓶分離出用于擴(kuò)增目的或胞質(zhì)蛋白分離的細(xì)胞單層。然后加入新鮮培養(yǎng)基并輕輕攪動(dòng)單層以釋放單個(gè)細(xì)胞。以1500RPM離心所形成的細(xì)胞懸液，抽取并棄去上清液，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在組織培養(yǎng)介質(zhì)中以進(jìn)一步擴(kuò)增，或者用PBS(50mM磷酸鈉，pH7.5，＋150mMNaCl)洗滌兩次以進(jìn)行胞質(zhì)蛋白質(zhì)分離。C.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離將洗滌過的并離心沉淀的腫瘤細(xì)胞懸浮在含有PBS和1mM芐脒、1mMEDTA、1mMPMSF及1mM冷卻到4℃的亮抑蛋白酶肽(leupeptin)的溶液中。當(dāng)混合物足夠達(dá)到起泡的條件下用超聲波將細(xì)胞懸液處理15秒鐘，同時(shí)在冰水浴中冷卻混合物。然后將超聲處理的懸液以100,000g在4℃下離心60分鐘。將上清液放置在一邊，并重新懸浮細(xì)胞沉淀。將超聲處理-離心步驟重復(fù)七次。合并所有上清液并棄去含有細(xì)胞膜、完整核和大的細(xì)胞器的最終的細(xì)胞沉淀物。使用3,500MW孔隙透析管將合并的上清液溶液對(duì)含有3種蛋白酶抑制劑的PBS透析。使用Bio-Rad蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(BioRad，Richmond，Ca)測(cè)定經(jīng)加工之溶液的蛋白質(zhì)含量。然后等分樣品，并將不立即使用的樣品置于-20℃下冷凍。D.對(duì)病人和對(duì)照血清的RAST分析對(duì)血清樣品進(jìn)行特異性IgE分析(Ceska，etal.，Allerg.Clain.Immun.491-19(1972))。CNBr活化的紙盤按每盤用10微克的量與SCC蛋白質(zhì)偶聯(lián)?？寡迨?25I標(biāo)記的親和純化羊抗-人IgE。血清和抗血清保溫步驟延長(zhǎng)至20小時(shí)，并將洗滌緩沖液改變成含有0.1％吐溫20的PBS。用25IUIgE/ml標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)(Nalebuff，etal.，CarlsbadCASymposiaFoundation35-48(1989))。相對(duì)SCC蛋白質(zhì)偶聯(lián)的圓盤和空白圓盤檢測(cè)各血清樣品(每圓盤100μl)?？瞻讏A盤是已用50mM乙醇胺猝滅的CNBr活化的圓盤。大于或等于相應(yīng)空白圓盤獲得的平均本底值之上2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的試驗(yàn)值被看作陽性。在用過量非特異性IgE(1,000IU/ml人骨髓瘤IgE(ScrippsLaboratory，SanDiego，Ca)試驗(yàn)，確定本底圖型在它們與SCC蛋白質(zhì)偶聯(lián)的圓盤間存在的凈本底無差異后，即將空白紙盤用作本底展示物。E.IgE-陽性血清的RAST抑制作用從腫瘤病人和對(duì)照受試者隨機(jī)選擇10份SCCIgE陽性樣品進(jìn)行SCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)抑制分析。抑制溶液含有2.5mg/mlSCC蛋白質(zhì)加上在PBS中的8％人血清。每份血清樣品單獨(dú)用SCC抗原溶液和8％HSA/PBS溶液作1∶2系列稀釋。每份樣品在與SCC蛋白質(zhì)偶聯(lián)的紙盤保溫前均在4℃保溫18小時(shí)。其它步驟按用于測(cè)定IgE抗體的步驟完成。F.測(cè)定對(duì)SCC胞質(zhì)蛋白特異性的血清IgA和IgG抗體將血清樣品用純凈的羊血清稀釋至1∶2000。稀釋樣品加蓋并于室溫輕輕攪動(dòng)下保溫4小時(shí)。用100微升稀釋的病人和對(duì)照血清用于復(fù)制SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)偶聯(lián)的紙盤并復(fù)制空白紙盤。加血清的盤在25-27℃保溫20小時(shí)。然后用275微升50mMPBS，pH7.3，0.1％吐溫20(洗滌緩沖液)將紙盤洗3次。最后一次洗滌是將紙盤浸漬10分鐘。將整個(gè)洗滌周期重復(fù)3次以上。以每盤50微升將125I標(biāo)記(BoltonHunter方法)的，親和純化的羊抗人IgA或抗人IgG(KirkegaardandPerry，Gaithersburg，Md)加樣于每個(gè)紙盤上。將每種放射標(biāo)記的抗血清用純凈的羊血清稀釋以達(dá)到40,000-45,000計(jì)數(shù)/分鐘/50微升樣品。圓盤再在25-27℃下保溫20小時(shí)，如前以4次10分鐘周期洗滌，然后在8計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)2分鐘。按以下公式確定各被分析樣品的特異活性抗原盤的平均值減(平均值＋空白盤的2.5SD)/50微升放射性核素溶液的平均計(jì)數(shù)。G.IgA、IgG-陽性血清的RAST抑制對(duì)從腫瘤病人和對(duì)照組中隨機(jī)挑選的10份SCCIgA陽性血清樣品和10份IgG陽性樣品用SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)抑制法分析。抑制溶液含有加在純凈羊血清中的2.5mg/mlSCC蛋白質(zhì)。已經(jīng)用純凈羊血清稀釋至1∶100的每份血清樣品再用SCC抗原溶液和單用純凈羊血清按1∶2稀釋。將這樣處理的每份樣品在4℃下保溫18小時(shí)，然后與SCC蛋白質(zhì)偶聯(lián)的紙盤一起保溫。其余步驟與用于測(cè)定IgA和IgG的步驟相同。H.SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)的離子交換分級(jí)分離將按實(shí)施例1，C部分的所述方法制得的胞質(zhì)蛋白質(zhì)混合物對(duì)20mM磷酸鈉緩沖液，pH8.2透析(3,500孔透析管)。將所形成的物質(zhì)加于用20mM磷酸鈉緩沖液pH8.2(緩沖液A)預(yù)平衡過的Bio-RadDEAE半制備性HPLC柱(Bio-Rad，Richmond，CA)上，以2ml/分鐘的流速進(jìn)行12小時(shí)的線性遞度洗脫，最終達(dá)到100％緩沖液B(緩沖液A＋1MNaCl)。收集75管含蛋白質(zhì)的部分。然后將流出的材料加于Bio-RadSP離子交換柱上并在相似條件下洗脫，收集25管。然后使用Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒確定各管的蛋白質(zhì)含量，等分各管內(nèi)容物并在-20℃下冷凍。I.篩選抗分級(jí)分離之抗原的病人和對(duì)照血清將CNBr活化的紙盤與按實(shí)施例1，H部分所述的方法分離的各SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)部分的材料以每紙盤相等于5微克蛋白質(zhì)的量一起保溫并按實(shí)施例1，H部分所述的方法處理之。10份病人和10份對(duì)照血清與代表每一洗脫部分的一起保溫，并檢測(cè)其IgA結(jié)合。檢測(cè)另一組10份病人和10份對(duì)照血清的IgG結(jié)合。選擇當(dāng)針對(duì)與整個(gè)胞質(zhì)蛋白質(zhì)混合物偶聯(lián)的紙盤試驗(yàn)時(shí)已登記為對(duì)一份或其他蛋白質(zhì)呈陽性反應(yīng)的血清。就用于測(cè)定IgA的對(duì)照血清來說，一個(gè)例外是僅一份呈現(xiàn)陽性。在試驗(yàn)序號(hào)1中一起檢測(cè)所有樣品的IgA結(jié)合，并在試驗(yàn)編號(hào)2中檢測(cè)所有樣品的IgG結(jié)合。使用空白紙盤確定各血清樣品的中值本底。利用空白紙盤計(jì)算每個(gè)受試組分值的分?jǐn)?shù)。使用下列公式計(jì)算每一受試組分值的分?jǐn)?shù)部分值(序號(hào)計(jì)數(shù))/中值病人本底(序號(hào)計(jì)數(shù))。將SCC病人血清作為一組與年齡和性別匹配對(duì)照組比較以計(jì)算每一部分的中值分?jǐn)?shù)。為了確定哪一種部分最可能是具有腫瘤特性蛋白質(zhì)，從相應(yīng)的SCC病人分?jǐn)?shù)中減去相當(dāng)于特定部分的各病人中值分?jǐn)?shù)。鑒定那些產(chǎn)生凈的陽性分?jǐn)?shù)的部分以按J部分所述進(jìn)行PAGE分級(jí)分離和Western印跡分析。J.使用病人和對(duì)照血清分級(jí)分離的SCC胞質(zhì)蛋白質(zhì)的放射自顯影Western印跡分析按照Laemmli所述方法，用10％分離膠和最大電泳格式(HoeferScientificInstrument，SanFrancisco，CA)進(jìn)行SDS-PAGE。分離膠的體積是142mm寬×140mm長(zhǎng)×1mm厚。樣品孔寬度是6mm。將從DEAE離子交換層析柱上回收的可溶性SCC抗原對(duì)1mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2透析(3500MW孔透析管)，并且以1ml等份分離在聚丙烯管中。向每支管中加入三種酶抑制劑(各1mM)以盡可能減少SCC蛋白質(zhì)的降解。所有各部分均用Speed-Vac(SarantInstruments，F(xiàn)armingdale，NY)完全干燥，然后在-20℃下保存。重新溶解10微克形式的各所需蛋白質(zhì)部分，與樣品緩沖液混合并煮沸4分鐘，得到各孔上樣的10微升樣品。各凝膠在20mA(恒定電流)下開始電泳25分鐘，直到所有蛋白質(zhì)進(jìn)入分離的膠為止。然后將電流提高到25MA約3小時(shí)或者直到溴苯酚鹽染料達(dá)到凝膠的底部為止。i.凝膠轉(zhuǎn)移電泳后移出凝膠并在輕輕攪動(dòng)下在轉(zhuǎn)移緩沖液(100mMTris-甘氨酸，pH8.8，10％甲醇)中平衡10分鐘。將一張14×16cm的硝化纖維素紙片和六張Whatman3號(hào)濾紙(15×16cm)浸入裝有兩塊相近尺寸海綿的11轉(zhuǎn)移緩沖液中。將凝膠置入有紙和兩塊海綿的轉(zhuǎn)移緩沖液中。將凝膠放在硝化纖維素紙的頂上，接著是3張Whatman濾紙和一層海綿。然后將3張Whatman濾紙和另一塊海綿置入膠的頂上。在轉(zhuǎn)移裝配時(shí)，注意不要在硝化纖維素和膠之間留下氣泡。組裝好后置入轉(zhuǎn)移小室中，供給40伏(恒定電壓)過夜，第二天增加到400伏持續(xù)電泳45分鐘。在整個(gè)電泳過程中使用冷卻處理。使用非接觸(no-touch)技術(shù)剪下相應(yīng)于電泳通道的6mm凝膠條并在5％脫脂牛奶粉、50mMPBS和0.05％NaN3溶液中封閉2小時(shí)。ii.第一抗體步驟病人或?qū)φ昭逵煤?％脫脂牛奶粉和0.05％NaN3的純凈羊血清稀釋至1∶200，并在室溫下輕輕攪動(dòng)2小時(shí)，在輕輕攪動(dòng)下將各條與稀釋的病人血清，對(duì)照受試者血清和單獨(dú)的稀釋劑室溫保溫20小時(shí)。每一凝膠條用3ml含有0.1％吐溫20的PBS洗滌5次，使每次洗滌間有10分鐘的浸漬間隙。iii.第二抗體步驟125I標(biāo)記的親和純化的羊抗-人IgA或IgG(KirkegaardandPerry，Gaithersburg，MD)用5％脫脂奶粉、50mMPBS、0.05％NaN3充分稀釋以給出50,000CPM/50微升。每個(gè)條與2ml標(biāo)記的抗-IgA或抗-IgG溶液在室溫下保溫20小時(shí)。然后將各個(gè)條洗滌5次，干燥，并在X-光膠片上曝光48小時(shí)。iv.從自體外周血、淋巴結(jié)和腫瘤組織制備HSTA致敏的淋巴細(xì)胞群從單個(gè)SCC病人獲得新抽取的、肝素化的外周血。該血液用Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)稀釋至1∶2并加在FicollHypaque密度梯度管(Hystopaque，SigmaChemicals，St.Louis)上。這樣制得的樣品在2,500rpm下離心20分鐘，從Ficoll和HBSS界面回收淋巴細(xì)胞，然后用HBSS洗滌三次。將這些新制備的淋巴細(xì)胞懸浮在含有30％人AB血清和10％DMSO的RPMI1640中，并在液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩Ｑ兴榱馨徒Y(jié)(LN)組織，并通過相近尺寸的不銹鋼篩以獲得單細(xì)胞懸液。按上述方法分離LN淋巴細(xì)胞并在液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩＝鈨龊?，將淋巴?xì)胞重新懸浮在20％AB血清中，然后用含有10％人AB血清的RPMI-1640(此后稱作完全界質(zhì)或CM)洗滌3次以除去DSMO。L，抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生將新鮮的或新解凍的2×106淋巴細(xì)胞懸浮在2mlCM中，在體外用可溶性HSTA肽或蛋白質(zhì)致敏。其中每份加在24孔平板之單個(gè)孔的樣品均在37℃于5％CO2環(huán)境下保溫24天后，從每一孔中取出1ml培養(yǎng)基，并換成1mL含1微克/mlrIL-2的培養(yǎng)基。第11天，在照射過的抗原呈現(xiàn)細(xì)胞(APC)存在下用抗原并用相似量的IL-2進(jìn)行第2次體外致敏。APC是同種PBL(大于105個(gè))或樹突細(xì)胞。在經(jīng)所需數(shù)量的抗原/rIL-2重復(fù)刺激步驟導(dǎo)致T細(xì)胞增殖后，進(jìn)行特異性靶細(xì)胞殺傷和/或抗原特異性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。M.使用增殖試驗(yàn)和鉻釋放試驗(yàn)確定抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)i.增殖試驗(yàn)在96孔平底平板中，在有自體或MHC匹配抗原呈現(xiàn)細(xì)胞的5微克/ml特異性肽或肽混合物存在下.將一式三份懸浮在CM中的105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)三天，向陽性對(duì)照孔中加入植物血凝素(PHA)代替特異性抗原，陰性對(duì)照孔則使用單獨(dú)的培養(yǎng)基。在收獲前用3H胸苷(0.5μCl/孔)脈沖處理細(xì)胞18小時(shí)。用自動(dòng)收獲器和含有分別轉(zhuǎn)移之NYLON(DuPont)圓盤的試管收獲細(xì)胞并在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)放射活性。ii.細(xì)胞毒性試驗(yàn)在37℃下用250μCiCr51將1×106個(gè)SCC靶細(xì)胞標(biāo)記60分鐘。SCC細(xì)胞是自體的或與MHC密切匹配的細(xì)胞。保溫后用HBSS洗三次以除去未結(jié)合的Cr51。以不同的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(E∶T)比例(即50∶1、25∶1、5∶1、1∶1)混合標(biāo)記的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。將所得到的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞混合物懸浮在200μlCM中，并以500rpm離心3分鐘使細(xì)胞與細(xì)胞接觸。保溫4小時(shí)后，將微量滴定板以1000rpm離心5分鐘，除去100μl上清液并在γ計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。V.從自體外周血和/或淋巴結(jié)制備未致敏的淋巴細(xì)胞群從未經(jīng)受治療的SCC病人體內(nèi)獲得新抽取的、肝素化的含有未致敏淋巴細(xì)胞的外周血。用Hank′s平衡鹽溶液(HBSS)將血液按1∶2稀釋，并加到Ficoll-Hypaque密度梯度管(Hystopaque，SigmaChemicals，St，Louis)上。將這樣制得的樣品以2,500rpm離心20分鐘，從Ficoll和HBSS間的界面上回收淋巴細(xì)胞，然后用HBSS洗3次。將這些新制備的淋巴細(xì)胞懸浮在含有30％人AB血清和10％DMS0的RPMI1640中。如果不立即使用，則將其冷凍保留在液氮中。研碎淋巴結(jié)(LN)組織，并通過相近孔隙的不銹鋼篩，以獲得單細(xì)胞懸液。按上述方法分離LN淋巴細(xì)胞并在液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩＝鈨龊?，將淋巴?xì)胞重新懸浮在20％AB血清中，然后用含有10％人AB血清的RPMI-1640(此后稱作完全介質(zhì)或CM)洗滌3次以除去DMSO?？乖禺愋訲細(xì)胞的產(chǎn)生將新鮮的或新解凍的2×106個(gè)淋巴細(xì)胞懸浮在2mlCM中，并在體外用可溶性HSTA肽或蛋白質(zhì)致敏，其中每份樣品均在5％CO2環(huán)境下于37℃在24孔平板的單個(gè)孔中保溫處理。4天后，從各孔中除去1ml培養(yǎng)基并換成1ml含1μg/mlrIL-2的培養(yǎng)基。第11天，在照射過的抗原呈現(xiàn)細(xì)胞(APC)存在下用抗原和用相似量的IL-2進(jìn)行第2次體外致敏。APC是同種PBL(大于105個(gè))或樹突細(xì)胞。在經(jīng)所需數(shù)量的抗原/rIL-2重復(fù)刺激步驟導(dǎo)致T細(xì)胞增殖后，進(jìn)行特異性靶細(xì)胞殺傷和/或抗原特異性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。使用增殖試驗(yàn)和鉻釋放試驗(yàn)確定抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)增殖試驗(yàn)在96孔平底平板中，將一式三份懸浮在CM中的105個(gè)細(xì)胞與自體或MHC匹配抗原呈現(xiàn)細(xì)胞一起，在5微克/ml特異性肽或肽混合物存在下培養(yǎng)3天，向陽性對(duì)照孔中加入植物血凝素(PHA)代替特異性抗原，并在陰性對(duì)照孔中單獨(dú)使用培養(yǎng)基。用3H胸苷(0.5μCi/孔)對(duì)細(xì)胞施加脈沖18小時(shí)，然后收獲細(xì)胞。使用自動(dòng)收獲器和含有分別轉(zhuǎn)移之NYLON(Dupont)圓盤的試管收獲細(xì)胞，以在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)放射活性。細(xì)胞毒性試驗(yàn)在37℃下將1×106個(gè)SCC靶細(xì)胞用250μCiCr51標(biāo)記60分鐘。SCC靶細(xì)胞是自體的或與MHC匹配的細(xì)胞。培養(yǎng)后，用HBSS洗滌三次以除去未結(jié)合的Cr51。以不同的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞(E∶T)比例(即50∶1、25∶1、5∶1、1∶1)混合標(biāo)記的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。將所得到的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞混合物懸浮在200μ1CM中，并以500rpm離心3分鐘使細(xì)胞與細(xì)胞接觸。保溫4小時(shí)后，將微滴定板以1000rpm下離心5分鐘，除去100μ1上清液并在γ計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。結(jié)果大多數(shù)病人和對(duì)照受試者(分別為40/65和46/65)血清中部具有IgA、IgE或IgG細(xì)胞內(nèi)SCC蛋白質(zhì)特異性抗體。65個(gè)腫瘤病人中的30個(gè)和65個(gè)對(duì)照個(gè)體中的40個(gè)是IgE陽性的(參見附圖1)。65個(gè)病人中的18個(gè)，和65個(gè)對(duì)照個(gè)體中的僅1個(gè)受試者的血清是IgA-陽性的(參見附圖2)。65個(gè)病人中的17個(gè)個(gè)體和14個(gè)對(duì)照個(gè)體的血清是IgG-陽性的。在SCC病人和對(duì)照組間，男性和女性受試者間未發(fā)現(xiàn)IgE和/或IgG抗體陽性優(yōu)勢(shì)的統(tǒng)計(jì)差異性。此外，在各種所研究的類別之間未記錄到平均IgE和/或IgG值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。IgA-陽性優(yōu)勢(shì)出現(xiàn)在SCC組(27.7％)超過對(duì)照組(1.5％)。一個(gè)有趣的觀察結(jié)果是病人與對(duì)照個(gè)體在產(chǎn)生IgE和產(chǎn)生抗SCC細(xì)胞內(nèi)抗原之JgA和/或IgG的能力之間存在明顯的反比關(guān)系(圖3a、b)。所有抗體同型抑制研究均為陽性，表明特異性抗原/抗體偶聯(lián)的高度可能性，并因此導(dǎo)致高程度的個(gè)體試驗(yàn)的特異性。圖4以這樣一個(gè)病人舉例說明了這一點(diǎn)。該研究證明，存在明顯的針對(duì)鱗狀上皮細(xì)胞癌之細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的體液免疫反應(yīng)。還了解到，在大多數(shù)病人和對(duì)照受試者血清中存在抗自身蛋白質(zhì)的抗體。雖然尚不知道這些抗體的功能，但就其性質(zhì)來說某些基本的結(jié)論還是可能做出的。首先，很可能是大多數(shù)IgE和IgG抗體識(shí)別對(duì)SCC和正常細(xì)胞二者共同的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，條件是給出相等的抗體陽體優(yōu)勢(shì)和兩組受試者共有組平均血清抗體值。其次，SCC組的更高IgA陽性優(yōu)勢(shì)表明某些SCC胞內(nèi)蛋白質(zhì)在正常細(xì)胞中沒有足夠呈現(xiàn)。抗自身抗體可以是正常的，自身穩(wěn)定機(jī)制的一部分，例如對(duì)正常細(xì)胞更新期間釋放的細(xì)胞內(nèi)分子的結(jié)合。抗體與自身抗原的連接可以維持細(xì)胞碎片的清除，途徑是將其摻入到免疫復(fù)合物中并使這些免疫復(fù)合物結(jié)合到Fc或巨噬細(xì)胞及其他清除細(xì)胞的補(bǔ)體受體上。如果有過度高數(shù)量的免疫復(fù)合物形成并且以廣泛和非特異的方式沉積到正常組織上，則增加了細(xì)胞死亡時(shí)這一過程可能是有害的。另外，如果免疫復(fù)合物沉淀增加和/或補(bǔ)體固定優(yōu)先發(fā)生在腫瘤部位，從而導(dǎo)致高度的定點(diǎn)炎癥和繼后的抗腫瘤免疫反應(yīng)，則自身抗原結(jié)合過程可能有利于SCC病人存活。后者可能由細(xì)胞內(nèi)SCC抗原驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞介導(dǎo)的。此外，這一研究得到的結(jié)論是(1)抗自身IgE存在于大多數(shù)受試者的血清中(2)在IgE的產(chǎn)生和IgA或IgG抗體產(chǎn)生間存在反比關(guān)系。IgE特異性或自身蛋白質(zhì)的鑒定與我們目前對(duì)IgE功能的了解相反。在經(jīng)典的I型免疫反應(yīng)中，在對(duì)外源蛋白質(zhì)和半抗原化小分子如青霉素引起的免疫反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的IgE只達(dá)到較小的程度。大多數(shù)IgE自由循環(huán)。少量(少于總體IgE的0.01％)被特異性Fc受體結(jié)合到嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面膜上。暴露于特異性抗原(變應(yīng)原)導(dǎo)致IgE對(duì)抗原和抗原-IgE抗體復(fù)合物對(duì)肥大細(xì)胞的多聚結(jié)合。這種復(fù)合物的結(jié)合導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒和血管活性及趨化分子的釋放。隨著顯著量的IgE積聚和胞內(nèi)SCC抗原的伴隨存在(作為恒定細(xì)胞更新的結(jié)果)，在IgE-陽性腫瘤病人中可能發(fā)生顯著的自我定向的超敏感性反應(yīng)，例如過敏反應(yīng)，但顯然沒有發(fā)生。比較而言，在外源抗原例如蜂毒存在下，具有相似水平的特異性IgE可導(dǎo)致嚴(yán)重的和潛在的致命性過敏反應(yīng)。有可能存在另一種且總體上不同的IgE介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因?yàn)樗莾?nèi)在靶向的，該免疫反應(yīng)促進(jìn)正常的體內(nèi)平衡功能。一種可能的功能可以是自家免疫現(xiàn)象的下調(diào)，其中IgE的產(chǎn)生可以是免疫途徑的一種活性組分，該途徑將繞過或減慢抗自身IgA和/或IgG的產(chǎn)生。這一功能可能是對(duì)阻止受良好調(diào)節(jié)的IgA、IgG抗自身抗體反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樘岣叩暮褪Э刂频姆磻?yīng)所必需的控制和平衡系統(tǒng)的一部分。這可以解釋Berczi的早期觀察結(jié)果(Bzrezi，I.，Holford，S.V.Warsi，Z.H.，McMorris，L.S.，Thorlakson，R.H.，Thorlakson，T.K.，Sehon，A.H.，Tumor-reactiveIgEantibodiesinplasmaofpatientswithgastrointestinalcarcinomas.CancerImmunol.Immunother1983.14(3)180-4)，其中他注意到一種對(duì)那些具有高血清水平抗自身IgE的腫瘤病人存活的有害作用。然而，這一研究的最主要的結(jié)論是，存在被宿主T淋巴細(xì)胞識(shí)別的SCC相關(guān)胞內(nèi)抗原，(這是真實(shí)的，因?yàn)檠錓gA、IgE或IgG抗體的存在需要抗原特異性輔助細(xì)胞在產(chǎn)生那些抗體同型中發(fā)揮相關(guān)功能)，其以顯著的量釋放到腫瘤外周，如果正確處理的話，可以用于產(chǎn)生自體抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞。(b)這一研究表明，顯著量的SCC胞內(nèi)蛋白質(zhì)以高的獨(dú)占性結(jié)合到SCC病人的IgA和IgG抗體上，并因此被稱為高特異性腫瘤抗原(HSTA)。所述HSTA經(jīng)一系列的分離步驟被鑒定，這些步驟包括(1)用離子交換層析法根據(jù)組成分子的等電點(diǎn)不同，將SCC細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)混合物細(xì)分成100個(gè)次級(jí)混合物(2)將代表量的每一次級(jí)混合物偶聯(lián)到CNBr一活化紙盤上(3)利用單個(gè)盤試驗(yàn)病人和對(duì)照血清以確定IgA和IgG抗體結(jié)合(4)選擇SCC胞內(nèi)蛋白質(zhì)次級(jí)混合物，其相應(yīng)的紙盤在腫瘤病人血清間引起較高的IgA和/或IgG結(jié)合(5)利用聚丙烯酰胺膠電泳法分離各優(yōu)選次級(jí)混合物內(nèi)的個(gè)體分子；(6)進(jìn)行放射自顯影western印跡分析以鑒別哪一種個(gè)體蛋白質(zhì)優(yōu)先與病人血清中的IgA或IgG反應(yīng)(7)選擇與SCC病人血清的IgA或IgG反應(yīng)，但不與對(duì)照血清的IgA或IgG反應(yīng)的分子作為HSTA。這項(xiàng)研究基于明顯的病人IgA或IgG結(jié)合提供了30種HSTA。那些結(jié)合IgA的HSTA(圖5A和5B)似乎是更有希望的抗原候選者，因?yàn)樵趩蝹€(gè)腫瘤病人血清間它們可比結(jié)合病人IgG的分子以更高的頻率被識(shí)別?；谒鼈兊腃NBr和考馬斯蘭結(jié)合特征，HSTA似乎主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的。與來源于病人和對(duì)照受試者的抗體反應(yīng)的分子多達(dá)HSTA的兩倍。所有IgA和IgG反應(yīng)性分子的組合仍比經(jīng)考馬斯蘭染色以PAGE法鑒定的蛋白分子數(shù)目少(少25％)，這意味著并不是所有存在于細(xì)胞膜內(nèi)部的分子都是對(duì)病人或?qū)φ帐茉囌哂忻庖咴缘?。大多?shù)SCCHSTA的大小在50,000和80,000(道爾頓)MW之間。一種HSTA(35.1)是令人感興趣的，因?yàn)樗Y(jié)合所有10份SCC病人被檢血清中的IgA，而不結(jié)合相應(yīng)10份對(duì)照血清中的抗體。其它HSTA(3.3、27.3、37.2、39.1、39.2、39.4、40.3、47.3、47.4、49.2、50.1和50.2)各自地與不同病人組合血清中的IgA反應(yīng)。這些結(jié)果也是令人感興趣的，因?yàn)閷⑵鋀estern印跡試驗(yàn)結(jié)果累積起來時(shí)(圖5A和5B)，它們也以絕對(duì)特異性100％地鑒定出SCC病人。已用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定了一種HSTA3.3的序列并發(fā)現(xiàn)其具有SEQIDN01中所示的部分序列。該肽與人乳頭瘤病毒的E6蛋白質(zhì)匹配。E6蛋白質(zhì)是一種癌基因產(chǎn)物，其在促進(jìn)腫瘤生成中起作用。背景絕大多數(shù)自體抗原是細(xì)胞內(nèi)的、廣泛分布的并似乎都是蛋白質(zhì)。如基于免疫組織化學(xué)的研究中所描述的，這些抗原在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞兩者中表達(dá)。(Pfaffetal.，Humanmonoclonalantibodyagainstatissuepolypeptideantigen-relatedproteinfromapatientwithasignet-ringcellcarcinomaofthestomach.CancerRes1990；50(16)5192-8；Abeetal.，Humanmonoclonalantibodiesagainstcytokeratin18generatedfrompatientswithgastriccancer.JpnJCancerRes1989；80(3)271-6；Furukawaetal.，Twohumanmonoclonalantibodiesreactingwiththemajorgangliosidesofhumanmelanomasandcomparisonwithcorrespondingmousemonoclonalantibodies.CancerRes1989；49(1)191-6；Skaletskyetal.，Ahumanmonoclonalantibodytocytokeratinintermediatefilamentantigensderivedfromatumordraininglymphnode.Hybridona1988；7(4)367-76；ImamA，MitchellMS，ModlinRL，TaylorCR，KempfRA，KanMJ.Humanmonoclonalantibodiesthatdistinguishcutaneousmalignantmelanomasfrombenignneviinfixedtissuesections.JInvestDermatol1986；86(2)145-8；PickeringJW，MisraRP.Humanmonoclonalantibodiestocytokeratinsassociatedwithsquamouscellcarcinoma.ClinImmunolImmunopath1984；32253-60).大多數(shù)針對(duì)表面膜抗原的人單克隆抗體是IgM同型的(Pigattoetal.，Occupationaldermatitisinbakersaclueforatopiccontactdermatitis.ContactDermatitis1988；16(5)263-71；Janssonetal.，ThehumanrepertoireofantibodyspecificitiesagainstThomsen-FriedenreichandTn-carcinoma-associatedantigensasdefinedbyhumanmonoclonalantibodies.CancerImmunolImmunother1992；34(5)294-8；Imametal.，Generationandimmunohistologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiestomammarycarcinomacells.CancerRes1985；45(1)263-7l；和Houghtonetal.，Detectionofcellsurfaceandintracellularantigensbyhumanmonoclonalantibodies.Hybridcelllinesderivedfromlymphocytesofpatientswithmalignantmelanoma.JExpMed1983；158(1)53-65)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)定向細(xì)胞表面抗原都是碳水化合物(Furukawaetal.，Twohumanmonoclonalantibodiesreactingwiththemajorgangliosidesofhumanmelanomasandcomparisonwithcorrespondingmousemonoclonalantibodies.CancerRes1989；49(1)191-6；Miyakeetal.，F(xiàn)irstestablishmentofahumanmonoclonalantibodydirectedtosulfatedglycosphingolipidsSM4s-GalandSM4g，fromapatientwithlungcancer.CancerRes1992；52(8)2292-7；Danetal，Humanamtigliomamonoclonalantibodiesfrompatientswithastrocytictumors.JNeurosurg1992；76(4)660-9).盡管已確定了很少數(shù)幾種被人單克隆IgG結(jié)合的相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)抗原的特征，可能是蛋白質(zhì)但因?yàn)镮gG的表達(dá)需要鄰近T輔助細(xì)胞的共同作用，故有理由推測(cè)其一定是蛋白質(zhì)(Senetal.，TcellsurfacemoleculesregulatingnoneognateBlymphocyteactivation.RoleofCD2andLFAla-1.J.Immunol1992，148(4)1037-42)。T輔助細(xì)胞致使IgM生成B細(xì)胞轉(zhuǎn)換成同型IgA、IgE和/或IgG生成細(xì)胞。T輔助細(xì)胞本身則只識(shí)別蛋白質(zhì)(肽)抗原。在可用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中而不是在正常細(xì)胞中的某些自體抗原(Imametal.，Generationandimmunohistologicalcharacterizationofhumanmonoclonalantibodiestomammarycarcinomacells.CancerRes1985；45(1)263-71；McKnightetal.，Humanmonoclonalantibodiestonuclearantigens.HumAntibodiesHybridomas1990；1(2)77-82；Werneretal.，Humanmonoclonalantibodiesdirectedagainstovariancarcinoma.GynecolOncol1989；34(2)148-54；Kanetal.，Humanmonoclonalantibodiesdiectedagainstmelanomatumor-associatedantigens.CancerRes1986；46(5)2490-6).這些研究表明，某些細(xì)胞內(nèi)腫瘤細(xì)胞分子在正常細(xì)胞中不存在或者以降低的量存在于正常細(xì)胞內(nèi)。因此，這些分子可以用作腫瘤選擇性免疫原。這些分子可以包括惡性轉(zhuǎn)化抗原。(Kanetal.，Tumor-reactivehumanimmunoglobuiinGmonoclonalantibodyfromamelanomapatient.CancerRes1989；49(16)4536-41；Vollmersetal，SC-1，afunctionalhumanmonoclonalantibodyagainstautologousstomachcarcinomacells.CancerRes1989；49(9)2471-6)與細(xì)胞增殖和增殖調(diào)節(jié)作用相關(guān)的蛋白質(zhì)分子例如p53(Labrecqueetal.，Analysisoftheanti-p53antibodyresponseincancerpatients.CancerRes1993；533468-3471)融合蛋白例如bcr-abl(Vollmersetal.，SC-l，afunctionalhumanmonoclonalantibodyagainstautologousstomachcarcinomacells.CancerRes1989；49(9)2471-6；Chenetal.，T-cellimmunitytothejoiningregionofp210BCArg-ABLprotein.ProcNatlAcadSciUSA1992；89(4)1468-72)癌基因表達(dá)產(chǎn)物例如mybandmyc(Ben-Mahrezetal.，Circulatingantibodiesagainstc-myconcogeneproductinseraofcolorectalcancerpatients.IntJCancer1990；46(1)35-8；Sorokineetal.，Presenceofcirculatinganti-c-myboncogeneproductantibodiesinhumansera.IntJCancer1991；47(5)665-9)以及不完全合成的分子例如乳腺粘蛋白核心蛋白(Barndetal.，Specific，majorhistocompatibilitycomplex-unrestrictedrecognitionoftumor-associatedmucinsbyhumancytotoxicTcells.ProcNatlAcadSciUSA1989；86(18)7159-63).腫瘤特異性分子的定性的或定量的存在很可能是由于高度癌細(xì)胞增殖、去分化、遺傳不穩(wěn)定性及代謝過程不協(xié)調(diào)的結(jié)果。如用組織化學(xué)法檢測(cè)到的表現(xiàn)出高腫瘸特異性的自體抗原可以被病人和正常人B淋巴細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體所識(shí)別(Posneretal.，AnIgGhumanmonoclonalantibodlyreactivewithasurfacemembraneantigenexpressedonmalignantbreastcancercells.HumAntibodiesHybridomas1991；2(2)74-83)。在這一引證文獻(xiàn)中，作者描述了人單克隆抗體的產(chǎn)生，所述抗體獨(dú)占性地與白血病細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)抗原反應(yīng)，但其衍生于正常受試者，EBV轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞。實(shí)施例2乳腺癌特異性體液抗原基于其各自的功能差異和可獲得性選擇潛在的腫瘤特異性蛋白質(zhì)。被檢分子是dbl、erbB1、erb-B2(HER-2/neu)、erbB-3、fos、HSP70、jun、lck、lyn、p13、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes。已知這些蛋白質(zhì)中有些是與乳腺癌密切相關(guān)的(erbB-2、fos、jun和ras)。其中有些很可能與乳腺癌細(xì)胞無關(guān)(dbl、erbB-3、lck、lyn和yes)，并可在第一亞組都是抗體反應(yīng)性的情況下被選來作為對(duì)照。某些則以相同的頻率見于腫瘤和正常上皮中(erbB-1、HSP70、p13、p190、rapGAP和rasGAP)。選擇這些蛋白質(zhì)是為了確定與正常存在的胞內(nèi)蛋白有特異反應(yīng)活性的血清抗體是否常規(guī)存在于患有或不患有乳腺癌的受試者中。有些蛋白質(zhì)見于不同的細(xì)胞成分或結(jié)構(gòu)中細(xì)胞膜(dbl、erbB1、erbB-2和erbB-3)、胞質(zhì)溶膠(dbl、HSP70、lck、lyn、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes)或細(xì)胞核(fos、jun和p13)。有些具有可影響其免疫原性潛能的不同功能細(xì)胞膜受體(erbB-1、erbB-2和erbB-3)、激酶或激酶效應(yīng)物(dbl、lck、lyn、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes)、反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(fos、jun和p13)或其他蛋白質(zhì)(HSP70)。有些具有細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外成分(erbB-1、erbB-2和erbB-3)。如果是抗體反應(yīng)性的，則這些蛋白質(zhì)是令人感興趣的，因?yàn)樗鼈兡転樵囼?yàn)我們的愿望提供方便的工具，即預(yù)期細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)或其部分具有啟動(dòng)免疫識(shí)別的能力，而細(xì)胞外的蛋白質(zhì)或其部分則沒有。或者，如果膜蛋白的胞外區(qū)域是抗體反應(yīng)性的，其反應(yīng)性程度要比其內(nèi)在部分低得多。為此目的，我們已獲得erbB-3的細(xì)胞外區(qū)域，用它試驗(yàn)?zāi)切┡c完整的erbB-2分子呈陽性反應(yīng)的血清。初步結(jié)果表明，erbB-2(Disisetal.，ExistentTcellandantibodyimmunitytoher-2/neuproteininpatientswithbreastcancer，CancerRes.，1993)和p21ras(Husebyetal.，Detectionofantibodyresponsedtorasproteinsinpatientswithcoloncancer，CancerRes.，1993)可以用作體液免疫原。用放射自顯影Western印跡分析法檢測(cè)乳腺癌病人和良性乳腺損傷病人的特異性體液免疫反應(yīng)性。用這一方法檢測(cè)了對(duì)16種被檢蛋白質(zhì)的血清IgA反應(yīng)性。檢測(cè)IgA是由于在我們以前的SCC研究中其表現(xiàn)有較高的優(yōu)勢(shì)。由15個(gè)患有小葉乳腺癌的女性病人和15個(gè)年齡相當(dāng)?shù)幕剂夹匀橄贀p傷(纖維腺瘤或纖維囊性疾病)的女性患者中獲得篩選血清。使用如此選擇出的對(duì)照血清，試圖描述是否所檢測(cè)的乳腺癌血清中的蛋白質(zhì)特異性抗體反應(yīng)性都是腫瘤特異性的。以各種方式提供被檢蛋白質(zhì)。有些是在微生物或昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組體蛋白質(zhì)fos、HSP70、jun、lck、lyn、p13、p190、rapGAP、ras、rasGAP和yes(附錄IV)。其他的則是在NIH/3T3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中表達(dá)的蛋白質(zhì)即dbl、erbB-1、erbB-2和erbB-3(Di-Fioreetal.，erbB-2isapotentoncogeneWheneverexpressedinNIH/3T3cell，Science，1987，237(4811)178-82Evaetal.，ThepredictedDBLoncogeneproductdefinesadistinctclassoftransformingproteins，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85(7)2061-5)。后者是從單獨(dú)培養(yǎng)并勻漿化的NIH/3T3轉(zhuǎn)染體中半純化的。簡(jiǎn)單地說，培養(yǎng)單個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，用20mMTris-HCl，pH8.5洗滌3次，在冰水浴中冷卻，經(jīng)超聲處理制成勻漿并離心。對(duì)erbB受體來說，然后均用0.1％SDS從超聲處理后的沉淀中提取各蛋白質(zhì)樣品，接著以三個(gè)連續(xù)步驟用丙酮(25％、50％和85％丙酮)沉淀。在50％丙酮沉淀物發(fā)現(xiàn)每一種erbB蛋白質(zhì)。就dbl來說，于相同的條件下沉淀水溶性部分，但在85％丙酮沉淀物中回收該蛋白質(zhì)。癌基因編碼的蛋白質(zhì)dbl表現(xiàn)有對(duì)乳腺癌選擇性免疫原性之分子的功能。如圖6所描繪的，13種蛋白質(zhì)與血清IgA抗體反應(yīng)。未反應(yīng)的蛋白質(zhì)是erbB-1、erbB-3和lck。在陽性反應(yīng)者中，dbl看來是最特異的(6/15陽性腫瘤病人血清對(duì)1/15陽性良好損傷血清)。其余的IgA反應(yīng)性蛋白質(zhì)當(dāng)乳腺癌病人血清試驗(yàn)時(shí)不比用良性病人血清試驗(yàn)時(shí)有更明顯的陽性結(jié)果。這一結(jié)果對(duì)于已有文獻(xiàn)說明其在乳腺癌中起癌基因作用的蛋白質(zhì)erbB-2、fos、jun和ras來說是特別真實(shí)的。通過在乳腺癌細(xì)胞和正常上皮中表達(dá)的所有蛋白質(zhì)同樣是血清抗體反應(yīng)性的。這一點(diǎn)證實(shí)了我們的關(guān)于普遍存在胞質(zhì)蛋白質(zhì)特異性自體血清抗體的鱗狀上皮細(xì)胞癌研究的早期觀察結(jié)果。某些原來認(rèn)為不被乳腺癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)是抗體反應(yīng)性的(dbl、fyn、lyn和yes)而其他一些則不是(erbB-3、lck)。就dbl卷入乳腺癌的理由來說，是其表現(xiàn)出有利于檢測(cè)乳腺癌病人血清的較高抗體陽性優(yōu)勢(shì)。造血蛋白質(zhì)fyn、lyn和yes同樣與腫瘤病人血清和對(duì)照血清發(fā)生反應(yīng)，說明這些蛋白質(zhì)在其他惡性腫瘤損傷中不大可能是腫瘤特異性免疫原。在erbB-2的內(nèi)部和外部區(qū)域之間存在明顯不同的反應(yīng)性。在所試驗(yàn)的三種表皮生長(zhǎng)因子受體中，僅erbB-2是抗體反應(yīng)性的(4/15陽性癌癥病人血清對(duì)2/15陽性良性損傷血清)。這可能是由于其與乳腺癌損傷的高定量關(guān)聯(lián)。然后，6份erbB-2陽性血清對(duì)erbB-2的細(xì)胞外區(qū)呈陰性試驗(yàn)結(jié)果。這一數(shù)據(jù)強(qiáng)化或進(jìn)一步說明，細(xì)胞外自身蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜邊界之后避開免疫監(jiān)視是其免疫原性的一個(gè)關(guān)鍵要素。然而，除外膜受體組，在位于不同胞內(nèi)間隔中的蛋白質(zhì)之間沒有免疫原性潛能的明顯不同。在基于其細(xì)胞內(nèi)功能，各蛋白質(zhì)間也無差異。也試驗(yàn)了dbl的IgG-特異性反應(yīng)性，以確定其對(duì)乳腺癌的選擇性是否可得以保持。與1/15良性損傷血清相比，3/15乳腺癌血清是IgG反應(yīng)性的。與dbl的結(jié)合IgA＋I(xiàn)gG反應(yīng)性是6/15陽性乳腺癌血清對(duì)2/15良性損傷血清。使用FujiBAS2000激光掃描系統(tǒng)(FujiFilmCo.，Tokyo，Japan)我們可以定量每一種抗體/dbl相互作用的陽性反應(yīng)性的程度。如圖7所示，與良性乳腺損傷組僅2個(gè)弱陽性值相比，4/15乳腺癌病人血清對(duì)IgA＋I(xiàn)gG呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，并且2個(gè)為弱陽性的。實(shí)施例3用作乳腺癌特異性體液抗原的磷酸化形式的dbl純化了dbl的磷酸化和非磷酸化變體。Grazianietal.，的工作(GrazianiG，RonD，EvaA，SrivastavaSK.Thehumandbl-Proto-oncogeneproductisacytoplasmicphosphoproteinwhichisassociatedwiththecytoskeletalmatrix.Oncogene1989，4(7)823-9)表明，p66dbl癌基因產(chǎn)物較通常預(yù)料的p115dbl原癌基因產(chǎn)物更顯著地被磷酸化。不僅p66形式在乳腺癌中比在正常細(xì)胞中很可能被更多量地表達(dá)，而且與其正常的p115同系物有性質(zhì)上的不同。利用從如前所述的dbl轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的含水勻漿，以DEAE和SP離子交換HPLC分別純化p66dbl的兩種變體。在DEAE和SP離子交換層析后，分離流過部分中的最小磷酸化或未磷酸化的p66dbl。磷酸化程度高的dbl存在于DEAE離子交換以約13到21％NaCl洗脫的部分中。未磷酸化的dbl同樣地與乳腺癌血清和對(duì)照血清發(fā)生反應(yīng)。利用原來的30份血清板試驗(yàn)IgA抗體反應(yīng)性。其結(jié)果揭示出良性損傷病人血清和腫瘤病人血清間相同的反應(yīng)性(圖8)，15份乳腺癌血清中的10份和15份良性乳腺損傷血清中的8份是陽性的。磷酸化的dbl與乳腺癌血清反應(yīng)比與良性損傷血清反應(yīng)更顯著。15份乳腺癌血清中的8份是IgA反應(yīng)陽性的，而15份對(duì)照血清中只4份是陽性的(圖9)。最近的研究雖然所有6份原來的陽性乳腺癌血清仍為陽性，但又加入了最新研究得到的另外2個(gè)陽性結(jié)果。試驗(yàn)良性損傷血清時(shí)也增加了2個(gè)額外的陽性結(jié)果。這些后來的研究結(jié)果增加了我們正在使用的p66dbl抗原是異質(zhì)的，由7種變體組成的這種可能性某些變體可能是異常磷酸化的，而有的是正常磷酸化的；某些變體可能是有較高腫瘤特異性的，而另一些是有較低腫瘤特異性的；有些p66dbl變體可能是在與見于p115原致癌基因上相匹配的肽位點(diǎn)上磷酸化的有些具有p115磷酸化的位點(diǎn)加上重新異常磷酸化位點(diǎn)；或者有些僅具有重新磷酸化的位點(diǎn)。如果相應(yīng)于不涉及磷酸化的p66dbl肽表位的非特異性反應(yīng)可以被中和，那么與p115磷酸化位點(diǎn)(磷酸化的或未磷酸化的)匹配的和/或相當(dāng)于重新磷酸化的位點(diǎn)的，但其本身未被磷酸化的也許能獲得更多的腫瘤特異性結(jié)果。這種情況是可能發(fā)生的，因?yàn)槭Ｏ碌目乖砦豢梢允钱惓Ａ姿峄奈稽c(diǎn)。相應(yīng)于p115磷酸化的位點(diǎn)的反應(yīng)很可能不是磷酸化的。然而，相應(yīng)于不涉及磷酸化之dbl肽表位的那些反應(yīng)和與非磷酸化的p115和/或未重新磷酸化的p66磷酸化位點(diǎn)匹配的那些反應(yīng)可能被中和。向試驗(yàn)血清中加入未磷酸化的p66dbl很可能對(duì)那種目的有益。因此使用漸增量的非磷酸化的dbl重新試驗(yàn)這8份陽性癌癥病人血清和4份陽性良性損傷病人血清。當(dāng)每200μl稀釋的血清樣品中加入4μg非磷酸化的dbl時(shí)出現(xiàn)了最大信號(hào)抑制。這時(shí)，所有終止了對(duì)照血清IgA反應(yīng)性而4份乳腺癌血清仍然保持陽性。阻斷抗原漸增到10μg不能消除其余的陽性乳腺癌血清的IgA反應(yīng)性。在4份余留的IgA-陽性血清中，兩份是在初步dbl研究中呈現(xiàn)IgA陽性的血清。利用最佳化dblWestern印跡分析法試驗(yàn)大量乳腺癌病人血清和對(duì)照血清。將這種更特異的dbl檢測(cè)法用于檢驗(yàn)59份乳腺癌血清，27份患有良性乳腺損傷病人的血清和36份年齡相當(dāng)?shù)慕】蹬詫?duì)照者的血清。發(fā)現(xiàn)59份乳腺癌病人血清中的14份(24％)、27份良性乳腺損傷病人血清中的1份(4％)和36份健康女性對(duì)照血清中的1份(3％)是對(duì)磷酸化的dbl有陽性IgA或IgG抗體反應(yīng)性的。大多數(shù)dbl反應(yīng)性血清是IgA-陽性的(10/16)或者是IgG陽性的(4/16)。2份病人血清是IgA和IgG反應(yīng)性的。異常磷酸化的dbl等同地與來源于I期或II期小葉癌癥病人的血清發(fā)生反應(yīng)(圖9)。20份I期病人血清中的4份(20％)是dbl反應(yīng)性的29份II期病人血清中的7份(24％)是dbl反應(yīng)性的；3份III期血清中的1份是反應(yīng)性的2份IV期血清中的1份是反應(yīng)性的。而且，5份來源于患有小葉癌癥病人的血清中有1份也是反應(yīng)性的。從患有I期疾病的病人獲得陽性血清提示與乳腺癌密切相關(guān)的抗原刺激早期體液免疫反應(yīng)。如果能檢測(cè)對(duì)dbl的異常磷酸化的肽區(qū)域和/或其它致癌基因編碼的蛋白質(zhì)的IgG反應(yīng)，則也有可能檢測(cè)很早期的免疫反應(yīng)(也許在癌癥原位階段)。如在I期病人血清中觀察到強(qiáng)的IgA和/或IgG反應(yīng)，則很可能更早地檢測(cè)到前體同型IgM。所包含的實(shí)施例舉例說明本發(fā)明的何選方式。所附實(shí)施例的某些方面是從技術(shù)和方法角度描述的而這些技術(shù)和方法是由本發(fā)明人在實(shí)踐本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)或認(rèn)為是行之有效的。這些實(shí)施例是通過使用發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐舉出的。就發(fā)明的公開和本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般水平而言，技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到所附實(shí)施例僅意欲舉例說明本發(fā)明，并且可以進(jìn)行許多改動(dòng)，修飾和替換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。說明書中所引述的文獻(xiàn)在此一并作為參考，其作用是補(bǔ)充、解釋、提供背景，或教導(dǎo)方法學(xué)、技術(shù)和/或利用其組合。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人Calenoff，Emanuel(ii)發(fā)明名稱免疫原性腫瘤蛋白質(zhì)和肽及其使用方法(iii)序列數(shù)38(iv)通信地址(A)聯(lián)系人Arnold，White&Durkee(B)街道321NorthClarkStreet，Suite800(C)城市Chicago(D)州IL(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編60610(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)裝置類型Floppydisk(B)計(jì)算機(jī)IBNPCcompatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(vi)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S未知(B)申請(qǐng)日1994.1.12(C)分類(viii)代理人/代理機(jī)構(gòu)信息(A)姓名Northrup，ThomasE.(B)登記號(hào)33，268(C)參考/案卷號(hào)nwun002(ix)通訊信息(A)電話312-744-0090(B)傳真312-755-4489(2)SEQIDNO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO1GlnPheProPheGlyAlaGlyGluThr15(2)SEQIDNO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度477氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQIDNO2MetSerSerGlyArgArgArgGlySerAlaProTrpHisSerPheSer151015ArgPhePheAlaProArgSerProSerArgAspLysGluGluGluGlu202530GluGluArgProGlyThrSerProProProAlaProGlyArgSerAla354045AlaSerHisValLeuAsnGluLeuIleGlnThrGluArgValTyrVal505560ArgGluLeuTyrThrValLeuLeuGlyTyrArgAlaGluMetAspAsn65707580ProGluMetPheAspLeuMetProProLeuLeuArgAsnLysLysAsp859095IleLeuPheGlyAsnMetAlaGluIleTyrGluPheHisAsnAspIle100105110PheLeuSerSerLeuGluAsnCysAlaHisAlaProGluArgValGly115120125ProCysPheLeuGluArgLysAspAspPheGlnMetTyrAlaLysTyr130135140CysGlnAsnLysProArgSerGluThrIleTrpArgLysTyrSerGlu145150155160CysAlaPhePheGlnGluCysGlnArgLysLeuLysHisArgLeuArg165170175LeuAspSerTyrLeuLeuLysProValGlnArgIleThrLysTyrGln180185190LeuLeuLeuLysGluLeuLeuLysTyrSerLysAspCysGluGlySer195200205AlaLeuLeuLysLysAlaLeuAspAlaMetLeuAspLeuLeuLysSer210215220ValAsnAspSerMetHisGlnIleAlaIleAsnGlyTyrIleGlyAsn225230235240LeuAsnGluLeuGlyLysMetIleMetGlnGlyGlyPheSerValTrp245250255IleHisLytLysGlyAlaThrLytMetLysAspLeuAlaArgPheLys260265270ProMetGlnArgHisLeuPheLeuTyrGluLysAlaIleValPheCys275280285LysArgArgValGluSerGlyGluGlySerAspArgTyrProSerTyr290295300SerPheLysHisCysTrpLysMetAspGluValGlyIleThrGluTyr305310315320ValLysGlyAapAsnArgLysPheGluIleTrpTyrGlyGluLysGlu325330335GluValTyrIleValGlnAlaSerAsnValAspValLysMetThrTrp340345350LeuLysGluIleArgAsnIleLeuLeuLysGlnGlnGluLeuLeuThr355360365ValLysLysArgLysGlnGlnAspGlnLeuThrGluArgAspLysPhe370375380GlnIleSerLeuGlnGlnAsnAspGluLysGlnGlnGlyAlaPheIle385390395400SerThrGluGluThrGluLeuGluHisThrSerThrValValGluVal405410415CysGluAlaIleAlaSerValGlnAlaGluAlaAanThrValTrpThr420425430GluAlaSerGlnSerValGluIleSerGluGluProAlaGluTrpSer435440445SerAsnTyrPheTyrProThrTyrAspGluAsnGluGluGluAsnArg450455460ProLeuMetArgProValSerGluMetAlaLeuLeuTyr465470475(2)SEQIDNO3信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2..3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO3MetXaaXaaGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO4XaaProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO5信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO5AlaProGlyArgXaaAlaAla15(2)SEQIDNO6信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵Xaa(B)位置7(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO6CysGlnAsnLysProArgXaa15(2)SEQIDNO7信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置6(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO7GluLeuLeuLysTyrXaaLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO8信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置7(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置11(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO8CysLysArgArgValGluXaaGlyGluGlyXaaAspArg1510(2)SEQIDNO9信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO9XaaThrGluGluThrGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO1O信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置4(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO1OAlaXaaGlnXaaValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO11信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)膠數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置16(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO11SerProSerArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyXaa151015(2)SEQIDNO12信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度12氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO12LysLyaGlyAlaXaaLysMetLysAspLeuAlaArgl510(2)SEQIDNO13信息；(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置11(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO13ValLysLysArgLysGlnGlnAspGlnLeuXaaGluArgAspLysPhe151015(2)SEQIDNO14信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO14SerXaaGluGluXaaGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO15信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的酪氨酸(xi)序列描述SEQIDNO15GluLeuLeuLysXaaSerLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO16信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置16(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO16XaaProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyXaa151015(2)SEQIDNO17信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO17XaaXaaGluGluXaaGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO18信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的酪氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置6(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO18GluLeuLeuLysXaaXaaLysAspCysGluGly1510(2)SEQIDNO19信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO19MetXaaSerGlyArgArgGlySerl5(2)SEQIDNO2O信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2..3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO2OMetXaaXaaGlyArgArgGlySer15(2)SEQIDNO21信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO21MetSerXaaGlyArgArgGlySer15(2)SEQIDNO22信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO22MetSerXaaGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO23信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO23MetSerSerGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO24信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度8氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO24MetXaaSerGlyArgArgGlyXaa15(2)SEQIDNO25信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO25XaaProSerArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO26信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置3(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO26SerProXaaArgAspLysGluGluGluGluGluGluArgProGlyThr151015(2)SEQIDNO27信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置7(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO27CysLysArgArgValGluXaaGlyGluGlySerAspArg1510(2)SEQIDNO28信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵Xaa(B)位置7(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO28CysLysArgArgValGluSerGlyGluGlyXaaAspArg1510(2)SEQIDNO29信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO29AlaXaaGlnSerValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO30信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置4(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO30AlaXaaGlnXaaValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO31信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置4(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO31AlaSerGlnXaaValGluIleSerGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO32信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置4(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO32AlaSerGlnXaaValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO33信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO33AlaSerGlnSerValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO34信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度13氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置8(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(xi)序列描述SEQIDNO34AlaXaaGlnSerValGluIleXaaGluGluProAlaGlu1510(2)SEQIDNO35信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO35SerXaaGluGluThrGluLauGluHis15(2)SEQIDNO36信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO36SerThrGluGluXaaGluLeuGluHisl5(2)SEQIDNO37信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置2(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO37XaaXaaGluGluThrGluLeuGluHis15(2)SEQIDNO38信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9氨基酸(B)類型氨基酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置1(C)鑒定方法磷酸化的絲氨酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞Xaa(B)位置5(C)鑒定方法磷酸化的蘇氨酸(xi)序列描述SEQIDNO38XaaThrGluGluXaaGluLeuGluHis1權(quán)利要求1.一種鑒定腫瘤細(xì)胞的功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括鑒定存在于所說腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤病人是選擇性免疫原性的。2.按照權(quán)利要求1的方法，其中鑒定包括以下步驟(a)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清以確定那一種蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。3.按照權(quán)利要求3的方法，其中所說的抗體是IgA、IgE、IgG、或IgM免疫球蛋白。4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的腫瘤細(xì)胞是SCC細(xì)胞或乳腺癌細(xì)胞。5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所說的功能性蛋白質(zhì)對(duì)所說腫瘤細(xì)胞是選擇性功能性的。6.一種制造腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟(a)鑒定存在于所說腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤病人是選擇性免疫原性的，和(b)分離和純化所說的蛋白質(zhì)。7.一種按權(quán)利要求6的方法制得的蛋白質(zhì)。8.按照權(quán)利要求6的方法，進(jìn)一步包括以下步驟(c)測(cè)定分離和純化的蛋白質(zhì)的序列；(d)制備編碼已測(cè)序之蛋白質(zhì)的多核苷酸；(e)用包含所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞(f)在足以表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下維持被轉(zhuǎn)染的宿主；和(g)收集所述蛋白質(zhì)。9.一種按包含以下步驟的方法制備的腫瘤特異性抗原(a)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的選擇性免疫原性蛋白質(zhì)；和(b)分離和純化所述蛋白質(zhì)。10.一種按權(quán)利要求9的方法制備的腫瘤特異性抗原。11.按照權(quán)利要求10的抗原，該抗原是SCC抗原。12.按照權(quán)利要求11的抗原，該抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。13.按照權(quán)利要求10的抗原，該抗原是乳腺癌特異性抗原。14.按照權(quán)利要求13的抗原，該抗原是磷酸化的dbl。15.按照權(quán)利要求14的抗原，其中dbl包含SEQIDNO2的氨基酸殘基序列。16.按照權(quán)利要求14的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基。17.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上。18.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基。19.按照權(quán)利要求18的抗原，其中磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上。20.按照權(quán)利要求16的抗原.其中磷酸化的dbl包含至少三個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基。21.按照權(quán)利要求20的抗原，其中磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9、或者436、438和442上。22.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基。23.按照權(quán)利要求22的抗原，其中磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403或406上。24.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基。25.按照權(quán)利要求24的抗原，其中磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上。26.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基。27.按照權(quán)利要求26的抗原,其中磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。28.按照權(quán)利要求16的抗原，其中磷酸化的dbl包含至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基。29.按照權(quán)利要求28的抗原,其中a)兩個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38上b)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，且兩個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上或者c)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406上。30.按照權(quán)利要求16的抗原，其中的磷酸化的dbl包含至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基。31.按照權(quán)利要求30的抗原,其中一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202上，且一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。32.按照權(quán)利要求16的抗原,其中磷酸化的dbl包含SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸殘基序列。33.一種增加腫瘤相關(guān)抗原的免疫原性特異性的方法，該方法包括使腫瘤相關(guān)抗原磷酸化。34.按照權(quán)利要求33的方法，其中腫瘤抗原是乳腺癌抗原。35.按照權(quán)利要求34的方法，其中乳腺癌抗原是dbl。36.按照權(quán)利要求35的方法，其中dbl包含SEQIDNO2的氨基酸殘基序列。37.一種檢測(cè)與腫瘤特異性抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體存在的試劑盒，該試劑盒包含足夠量的至少用于一次試驗(yàn)的腫瘤特異性抗原。38.按照權(quán)利要求37的試劑盒，其中腫瘤特異性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。39.按照權(quán)利要求37的試劑盒，其中腫瘤特異性抗原是磷酸化的dbl。40.按照權(quán)利要求37的試劑盒，該試劑盒進(jìn)一步包含檢測(cè)與所說腫瘤特異性抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的所說抗體的工具。41.按照權(quán)利要求37的試劑盒，其中所說的抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。42.一種檢測(cè)在生物體液中是否存在與腫瘤特異性抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體的方法，該方法包括以下步驟(a)使體液樣品與腫瘤特異性抗原形成預(yù)混物；(b)在生物反應(yīng)條件下保持該預(yù)混物一段時(shí)間，足以使存在于樣品中的抗體與腫瘤特異性抗原形成結(jié)合物；和(c)檢測(cè)結(jié)合物的存在。43.按照權(quán)利要求42的方法，其中腫瘤特異性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。44.按照權(quán)利要求42的方法，其中腫瘤特異性抗原是磷酸化的dbl。45.按照權(quán)利要求42的方法，其中抗體是IgA、IgE、IgG或IgM免疫球蛋白。46.一種制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏化的T細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)分離含有純凈的非抗原敏化的T細(xì)胞的自體T細(xì)胞群體；(b)鑒定免疫原性腫瘤特異性抗原和(c)用免疫原性腫瘤特異性抗原敏化非抗原敏化的T細(xì)胞。47.按照權(quán)利要求46的方法，其中免疫原性腫瘤特異性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。48.按照權(quán)利要求46的方法，其中免疫原性腫瘤特異性抗原是磷酸化的dbl。49.按照權(quán)利要求46的方法，其中T細(xì)胞是T輔助淋巴細(xì)胞或特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。50.一種制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞群體的方法，該方法包括以下步驟(a)分離對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞；和(b)誘導(dǎo)致敏T細(xì)胞大量擴(kuò)增。51.按照權(quán)利要求50的方法，其中T細(xì)胞是從循環(huán)淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)或腫瘤中分離的。52.按照權(quán)利要求50的方法，其中誘導(dǎo)是在腫瘤特異性抗原存在下完成的。53.按照權(quán)利要求52的方法，其中誘導(dǎo)是在抗原呈現(xiàn)細(xì)胞存在下完成的。54.按照權(quán)利要求50的方法，該方法進(jìn)一步包括以下步驟(c)繼代培養(yǎng)T細(xì)胞，以鑒定對(duì)特定腫瘤特異性表位敏感的T細(xì)胞。55.按照權(quán)利要求50的方法，其中免疫原性腫瘤特異性抗原是SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。56.按照權(quán)利要求50的方法，其中免疫原性腫瘤特異性抗原是磷酸化的dbl。57.一種制備腫瘤特異性體液抗原的肽文庫的方法，該方法包括以下步驟a)從腫瘤細(xì)胞中分離一種或多種選擇性免疫原性肽；b)在每種所說選擇性免疫原性蛋白質(zhì)中鑒定一個(gè)或多個(gè)對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的表位；c)制備每一表位的含有所說表位的肽，其中單個(gè)肽不含有被非腫瘤受試者識(shí)別的表位和d)形成所說肽的文庫。58.權(quán)利要求57的方法，其中的分離包括以下步驟a)從腫瘤細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)；b)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清以確定哪一種所說蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；以及c)分離和純化所說的選擇性免疫原性蛋白質(zhì)。59.按照權(quán)利要求57的方法，其中的鑒定包括以下步驟a)限定所說蛋白質(zhì)中的潛在的表位；b)合成含有所說蛋白質(zhì)之部分的肽，該部分含有一個(gè)所說表位；c)篩選對(duì)照和腫瘤病人血清，以確定哪一種所說蛋白質(zhì)與腫瘤病人血清中的抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，并從而鑒定所說蛋白質(zhì)中對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的表位。60.一種由權(quán)利要求57的方法制得的肽文庫。61.按照權(quán)利要求57的方法，其中所說的選擇性免疫原性蛋白質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)。62.一種制備乳腺癌特異性體液抗原的肽文庫的方法，該方法包括以下步驟a)鑒定存在于乳腺癌細(xì)胞中的對(duì)乳腺癌病人為選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)；b)限定所說蛋白質(zhì)的潛在磷酸化位點(diǎn)；c)合成含有所說蛋白質(zhì)之部分的肽，這部分含有至少一個(gè)所說的磷酸化位點(diǎn)，且其中至少一個(gè)所說的磷酸化位點(diǎn)是被磷酸化的；d)篩選所說肽，以鑒定對(duì)乳腺癌病人為選擇性免疫原性的磷酸化的肽；以及e)形成所說的磷酸化的選擇性免疫原性肽的文庫。63.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的蛋白質(zhì)是dbl。64.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的潛在的磷酸化位點(diǎn)包括a)一個(gè)在SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3、9、23、25、47、151、202、295、299、402、436、438或442上的磷酸化的絲氨酸殘基b)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2和3、2和9、3和9、23和25、295和299、436和438、436和442或者438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基c)至少三個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)2、3和9、或者436、438和442上的磷酸化的絲氨酸殘基d)一個(gè)在SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)38、263、380、403或406上的磷酸化的蘇氨酸殘基e)至少兩個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上的磷酸化的蘇氨酸殘基f)至少一個(gè)位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上的磷酸化的酪氨酸殘基g)至少一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基，其中i)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)23和25上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于氨基酸殘基位置編號(hào)38上；ii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，目?jī)蓚€(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403和406上；或者iii)一個(gè)磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)402上，且一個(gè)磷酸化的蘇氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)403或406上；或者h(yuǎn))至少一個(gè)磷酸化絲氨酸殘基和至少一個(gè)磷酸化的酪氨酸殘基，其中所說的磷酸化的絲氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)202上，且所說的磷酸化的酪氨酸殘基位于SEQIDNO2的氨基酸殘基位置編號(hào)201上。65.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的部分包含SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38的氨基酸殘基序列。66.按照權(quán)利要求62的方法，其中所說的蛋白質(zhì)是一個(gè)致癌基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白、受體、轉(zhuǎn)錄因子或其他調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)或底物蛋白質(zhì)。67.按照權(quán)利要求62的方法制備的文庫。68.一種用于診斷受試者體內(nèi)是否存在腫瘤的檢測(cè)試劑盒，所說的試劑盒包含至少足夠用于一次試驗(yàn)量的腫瘤特異性體液抗原的肽文庫。69.按照權(quán)利要求68的試劑盒，其中所說腫瘤是SCC，且所說文庫包含兩種或多種SCC抗原3.3、16.1、16.3、16.4、27.3、35.1、37.1、37.2、39.1、39.2、39.4、40.1、40.3、40.4、47.2、47.3、47.4、49.2、49.3、50.1、50.2或50.3。70.按照權(quán)利要求68的試劑盒，其中所說腫瘤是乳腺癌，且所說的文庫包含兩種以上的由SEQIDNO3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38指定的肽。全文摘要本發(fā)明涉及腫瘤特異性抗原和腫瘤細(xì)胞功能性蛋白質(zhì)，所述抗原和蛋白質(zhì)可以經(jīng)鑒定存在于腫瘤細(xì)胞中的對(duì)腫瘤病人為選擇性免疫原性的蛋白質(zhì)而制得。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了制備腫瘤特異性體液抗原之肽文庫的方法，增加腫瘤相關(guān)抗原之免疫原性特異性的方法，檢測(cè)對(duì)腫瘤特異性抗原有免疫反應(yīng)性之抗體存在的檢測(cè)試劑盒，以及制備對(duì)腫瘤特異性抗原敏感的T細(xì)胞的方法。文檔編號(hào)C07K7/06GK1125399SQ94192460公開日1996年6月26日申請(qǐng)日期1994年4月12日優(yōu)先權(quán)日1993年4月16日發(fā)明者E·卡倫諾夫申請(qǐng)人:西北大學(xué)