專利名稱：新型生物活性綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及把具有治療效用的蒽環(huán)類化合物與諸如天然來源或合成來源的多克隆抗體、單克隆抗體、蛋白或多肽綴合的綴合物;涉及這類綴合物的制備方法、含有這類綴合物的制劑配方，以及在一些哺乳類腫瘤治療中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及新型蒽環(huán)衍生物及其制備。
近年來，已經(jīng)合成了許多高細胞毒性蒽環(huán)化合物。例如，分子中含有與糖環(huán)的c-3′位相連接的嗎啉代或取代嗎啉代環(huán)的那些蒽環(huán)化合物在鼠實驗?zāi)[瘤模型上，就顯示了令人鼓舞的抗腫瘤活性。(見于Bioaetive mokecukes，55-101，vol6，Edi-ted by J.William Lown，Elveiser 1988)。
本發(fā)明與新型連接體有關(guān)。這類連接體用于從生物活性劑中釋放具有治療效用的藥物，以便在人體用藥過程中，提高藥物的療效，降低藥物毒性。特別要指出，該類生物活性劑包含的藥物上連有游離一級羥基或二級羥基、屬于諸如抗菌素、抗癌或抗病毒類化療劑，并且綴合到能夠與選擇的細胞群作用的抗體上，或者綴合到天然來源或合成來源，可與受體組織作用的蛋白、多肽或高聚物上。
每種藥物至少含一個一級羥基或二級羥基，在該一級或二級羥基部位通過一對酸敏感的縮醛鍵與連接臂結(jié)合，再通過連接臂以共價鍵的方式結(jié)合到載體上。本發(fā)明的生物活性劑中酸敏感的縮醛鍵，使之在靶組織的酸性外環(huán)境或酸性內(nèi)環(huán)境中釋放出活性藥物。
據(jù)上所述，本發(fā)明提供通式1所代表的綴合物，其中A-O-基為通式是A-O-H的藥物殘基，
而A-O-H中的-O-H為一級或二級羥基;a是從1到30的整數(shù);W是通式2代表的基團
在通式2中，b是從1到4的整數(shù)，B代表含1至3個碳原子的亞烷基，R1和R2分別獨立表示氫、鹵素、烷基、苯基或取代苯基;Z為一間隔基團;T為載體部分。
a最好是從1到5的整數(shù)。B恰切地表示-(CH2)2-。在R1和R2的定義中，鹵素為氯、溴或碘較為典型，烷基則可含1至4個碳原子，比如為甲基或乙基。取代苯基可以是鹵素取代苯基或烷基取代苯基，在此情況下，鹵素和烷基與上面的定義相同。Z基團最好是(ⅰ)-NH-;
(ⅱ)-NH-(CH2)c-S-S-，其中c是從1到4的整數(shù);
(ⅲ)-NH-〔C〕d-N＝CH-，其中a)d等于零，b)d等于1，〔C〕代表-NH-CO(CH2)e-O-(CH2)e-，該式中的e是從2到4的整數(shù)，c)d是從1到4的整數(shù)，〔C〕代表-(CH2)f-O-(CH2)f-，該式中的f等于1或2，或者d)d是從2到6的整數(shù)，〔C〕為CH2;
(ⅳ)-NH-〔C〕d-NH-CO-，其中〔C〕和d的定義同上;
(ⅴ)-〔D〕-NH-，其中〔D〕代表-NH-〔CH2〕g-CO-，該式中的g是從2到6的整數(shù);
(ⅵ)-〔E〕-CO-，其中〔E〕代表-NH-(CH2)g-NH-，該式中g(shù)是從2到6的整數(shù)，或者(ⅶ)通式為
的哌嗪基羰基。
在前面的通式1中，藥物A-O-H最好代表屬于蒽環(huán)族的抗腫瘤藥，例如阿霉素和它的3′-去氨基-3′-嗎啉基衍生物，該衍生物中的嗎啉代環(huán)選擇在2″位以諸如含2到4個碳原子的烷氧基取代;代表嘧啶類似物，例如5-氟去氧尿苷或阿糖胞苷;代表長春花屬生物堿的衍生物，例如4-去乙酰長春花堿;或代表其它抗腫瘤藥，例如鬼臼脂素或隱陡頭菌素族。藥物A-O-H亦可選擇為抗病毒藥，例如3′-疊氮基-3′-去氧-胸腺嘧啶核苷(AZT)、溴乙烯基去氧尿苷(BVDU)，9-〔(2-羥乙基)甲基〕鳥嘌呤(acyclovir)或者9-〔(1，3-二羥基-2-丙氧基)甲基〕鳥嘌呤(gancyclovir)，或者選擇為抗菌素，例如硫霉素或我們的新型青霉烯(penem)衍生物，比如(5R，6S)-2-Carbamcyloxymethyl-6-〔(1R)-hydroxyeth-yl〕-2-penem-3-Carboxylic acld和acetoxy-methyl(5R，6S)-2-Carbamoyloxymethyl-6-〔(1R)-hydroxyethyl〕-2-penem-3-carb-oxylate。
若A-O-部分衍生自蒽環(huán)A-O-H，那么A-O-典型地表示
其中R10為氬原子、羥基、或甲氧基;R11和R12中的一個為氫原子，另一個為羥基，或者R11為氬原子或碘原子而R12為氫原子;R13為氨基，或代表包含在嗎啉代環(huán)中的氮原子。嗎啉代環(huán)可以是，例如嗎啉代(MO)環(huán)、3-氰基-4-嗎啉代(CM)環(huán)，或2-甲氧基-4-嗎啉代(MM)環(huán)，環(huán)中氮原子按下述方式連接于C-3′位
載體部分T典型地是從多克隆抗體或來自多克隆抗體的包含抗原結(jié)合部位的片段選擇，它們能夠結(jié)合到與腫瘤關(guān)聯(lián)的抗原上;或從單克隆抗體或來自單克隆抗體的包含抗原結(jié)合部位的片段選擇，它們能夠優(yōu)先結(jié)合到抗原上，或選擇性地表達在腫瘤細胞群上;或者從能夠優(yōu)先或選擇性地與腫瘤細胞相結(jié)合的多肽或蛋白中選擇;以及從高聚載體選擇。
最好是從可以表示為T-〔NH2〕x(其中x表示可用于縮合的氨基數(shù)目)的化合物中衍生的載體部分，能夠從多克隆抗體中選擇，該多克隆抗體能夠產(chǎn)生抗腫瘤抗原;或者從單克隆抗體中選擇，該單克隆抗體能夠優(yōu)先與抗原結(jié)合，或選擇性地在腫瘤細胞群上表達;或者從天然的或重組的多肽、蛋白或生長因子中選擇，它們能優(yōu)先地或選擇性地結(jié)合于腫瘤細胞;或者從天然的或合成的高聚載體，例如從聚賴氨酸中選擇。該載體部分也可以從上面提取的載體的某一部分衍生。例如從上述抗體的Fab或F(ab′)2片段衍生，或者從上面提到肽或通過重組體DNA技術(shù)得到的蛋白質(zhì)的部分衍生的。
上述抗體和相關(guān)治療應(yīng)用的代表例是抗T細胞抗體，如抗體T101〔Royston，I.等人，J.Immunol.1980，125，725〕，抗CD5抗體，如抗體OKT1(Ortho)ATCC CRL 8000(Chronic lymphocytic leukaemias)，抗鐵傳遞蛋白抗體，如抗體OKT9(Ortho)ATCC CRL 8021(ovaric和其它腫瘤)，抗黑素瘤抗體，如抗體MAb 9.2.27(Bumol，T.F等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1982，79，1245)(melanomas)，抗癌制造抗體，如抗CEA1116 NS-3d ATCC CRL 8019，抗α-甲胎蛋白OM 3-1.1 ATCC HB 134，791T/36〔Embleton M.J.等人，Br.J.Cancer 1981，43，582)(Osteogenic sarcoma)，B72.3〔US-A-4，522，918(1985〕(Colorectal carcinomas和其它腫瘤)，抗卵巢癌抗體，如抗體OVB 3 ATCC HB 9147，抗乳房癌抗體，如抗體(HMGF抗原)〔Aboud-Priak，E.等人，Cancer Res.1988，48，3188〕，抗骨癌抗體，如抗體1G3.10〔Yu，D.S.等人，Eur.J.Urol.1987，13，198〕
上面提到的天然或重組來源的生長因子和蛋白的象征性范例是，F(xiàn)GF、EGF、PDGF、TGF-α、α-MS、interleukineS、干擾素、TNF、黑色素(MSH)等。
從可表示為T-〔sH〕X1(其中x1代表可用來縮合的硫羥基數(shù))的化合物衍生的載體部分最好從例如使用N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；虼宜狨?SATA)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基硫代)丙酸酯(SPDP)、D.L-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、N-乙?；?D，L-高半胱氨酸硫代內(nèi)酯，或者2-亞氨基硫代內(nèi)酯獲得的硫羥化多克隆抗體或單克隆抗體衍生。
從可表示為7-〔CHO〕X2(其中x2代表可用來縮合的甲酰基總數(shù))的化合物衍生的載體部分最好從那些具有糖基的多克隆或單克隆抗體衍生，糖基最好位于其FC區(qū)，并能象US-A-4，671，958中描述的那樣，可經(jīng)化學(xué)或酶學(xué)方法選擇性氧化為醛基。T-〔CHO〕X2載體也可以從適宜的高聚載體甲酰化或氧化衍生，或者從適宜的糖蛋白的糖基氧化成醛基制備。
從可以表示為T-〔COOH〕x3(其中x3代表可用來縮合的羧基總數(shù))的化合物衍生的載體部分最好從聚天冬氨酸或聚谷氨酸衍生;或者從那些衍生自具有下面結(jié)構(gòu)的N-(2-羥丙基)異丁烯酰胺
(HMPA)的可溶性和可生物降解的合成共聚物衍生，HMPA中的〔X〕為-Gly-Phe-Leu-Gly、-NH-(CH2)n-CO-(n為1到5的整數(shù))，〔P〕為OH、O-C6H4PNO2，X/Y為(90/10÷95/5mol/mol%)，分子量為10000至40000，最好是12000至20000〔見于J.Kopecek“Biodegradation of polymers for biomedical use”in IUPAC Macromolecules，H.Benoit and P.Rempp，Ed.505-520(1982)，Pergamon Press.Oxford.England〕;或者從聚(氨基酸)共聚物，例如聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)共聚物或分子量為25000至50000道爾頓可用作肺組織靶藥的載體(結(jié)構(gòu)見后)〔R.Duncan et al.，Journal of Bioactive and Compatible Polymers，vol.4，July1989〕衍生;或從天然存在于單克隆或多克隆抗體之上的羧基衍生，或從使用雙功能基酸酐(例如馬來酸酐)處理抗體，用化學(xué)方法引入的羧基衍生。
聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)共聚物的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明進一步提供制備通式1綴合物的程序，該程序包括把通式3的衍生物與能提供所述通式1綴合物中間隔基Z和載體部分T的一種或數(shù)種化合物縮合，借以生成所說的通式1綴合物。
3中A-O-和W與前面的定義相同?？s合反應(yīng)可以通過活潑衍生物。例如通式3的混合酸酐、疊氮或活潑酯來實施，或者在縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺的存在下直接進行。一個適宜的程序包括將通式3的衍生物轉(zhuǎn)化成通式4的衍生物，在通式
4中，A-O-及W與前面的定義相同，L代表用于形成酰胺鍵的活潑基團，例如N-氧琥珀酰亞胺基、它的水溶性衍生物N-氧磺基琥珀酰亞胺基，或者2，4-二硝基苯氧基、2，3，4，5，6-五氟苯氧基，或者叔丁氧羰氧基;和(ⅰ′)把生成的通式4化合物與前面定義過的通式T-〔NH2〕X的化合物縮合，以便提供具有酰胺鍵的通式1的生物活性化合物;或者(ⅱ′)把通式4的化合物與通式為NH2-(CH2)c-SH的硫醇衍生物，例如2-氨基乙硫醇(C＝2)，縮合，生成通式5的化合物其中A-O-，W和C的定義與前面相同;再把通式5的生成物與前面定義過的通式T-〔SH〕X1化合物反應(yīng)，以便制得具有二硫醚鍵的通式1綴合物;或者(?！?把通式4的化合物與肼、丁二酸或己二酸的雙肼衍生物，或二氨基化合物反應(yīng)，生成通式6的化合物，該化合物中的A-O-、W、〔C〕和d的定義與前面相同;再把通式6的生成物與前面定義過的通式T-〔CHO〕X2化合物縮合，以便制得具有肟鍵的通式1生物活性化合物。
一個有用的程序包括(ⅳ′)把上面描述的通式為6的化合物與通式為7的化合物在縮合劑的存在下縮合，以便生成通式1的綴合物。通式為7的化合物通過包含前面定義的通式為T-〔COOH〕X3的載體的反應(yīng)制備，7式中的y是從1到30的整數(shù)，并代表活潑羧基的總數(shù)，T是生成的通式1綴合物中的載體部分，L′代表形成酰胺鍵的羥基或活潑基。反應(yīng)中隨意存在的尚未反應(yīng)的活化了的羧基，可以用藥物上可以接受的氨，比如，1-氨基-2-丙醇，加以封閉。
其它有用的程序包括(ⅴ′)把通式4的化合物與通式為H2N-〔CH2〕g-COOH的氨基衍生物(其中g(shù)的定義同前)縮合，借以生成通式8的衍生物
8式中，A-O-、W和〔D〕的定義同前;通式8的化合物隨意地轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?的活潑衍生物
其中A-O-、W、〔D〕和L的定義同前，而且把生成的通式9的化合物或通式8的化合物在縮合劑的存在下，與前面定義的通式T-〔NH2〕x的化合物縮合，以便生成通式1的生物活性化合物。
其它程序包括(ⅵ′)將通式4的化合物與通式H2N-(CH2)g-NH2(其中g(shù)的定義同前)的氨基衍生物反應(yīng)，借以生成通式10的衍生物
其中〔E〕的定義同前，或者(ⅶ′)把通式4的化合物與哌嗪反應(yīng)，生成通式11的衍生物，并把上面描述的通式10或11的化合物與前面描述的通式7的化合物縮合，以便生成通式1的綴合物。
例如，把通式3或8的化合物轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?或9衍生物的活化方法是，在乙酸乙酯或N，N-二甲基甲酰胺一類的溶劑中，在N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺的存在下，將通式3或8的化合物與N-羥基琥珀酰亞胺或它的水溶性3-取代磺酸鈉鹽反應(yīng)。在這種情形下，通式4和9中的L代表下面的殘基
其中Ra代表氫原子或磺酸鈉基。
把T-〔COOH〕X3類型的載體轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?的化合物的活化方法是，這種載體在N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺的存在下，在二甲基甲酰胺一類的溶劑中。與對硝基苯酚反應(yīng)，在這種情形下，L′代表PNO2C6H4-O-;或者在四氫呋喃或二甲基甲酰胺一類的溶劑中，與N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氬苯醌(EEDQ)反應(yīng)〔見B.Belleau et al.，JACS，90，1651(1968)〕，在這種情形下，7式中的L′代表下面的殘基
另一種程序包括載體T-〔COOH〕X3的堿金屬鹽，比如鈉鹽，與烷基-鹵素-碳酸酯，例如含1至4個碳的烷基-鹵素-碳酸酯，最好是氯代碳酸乙酯(C2H5O-COCl)，在水或二甲基甲酰胺一類的溶劑中反應(yīng)。在這種情形下，式7中的殘基L′代表-COOC2H5。
以通式3或8的化合物及具有式T-〔NH2〕x結(jié)構(gòu)的載體為原料，制備通式1的綴合物的縮合反應(yīng)，是在能夠生成酰胺類型共價鍵以及與載體的結(jié)構(gòu)和諧的條件下進行的。根據(jù)載體在水中或有機溶劑中的化學(xué)穩(wěn)定性，可以采用不同的程序進行與通式4、5、6、9、10和11中間體的偶聯(lián)反應(yīng)。若載體對有機溶劑敏感，建議的反應(yīng)條件包括使用PH7至9.5的緩沖水溶液，在4至37℃的溫度下，反應(yīng)數(shù)小時至數(shù)日。
通過衍生物5和通式T-〔SH〕X1載體縮合，制備通式1綴合物，是在包括使用PH6至7的緩沖水溶液、溫度為4℃、反應(yīng)時間為數(shù)小時至數(shù)日等條件下進行的。
通過衍生物6與通式T-〔CHO〕X2載體縮合，制備通式1綴合物。是在能夠生成肟或腙類型的共價鍵的條件下進行的，而且該條件與載體的結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)一致。建議采用的條件包括，使用PH為4至7.5的緩沖水溶液，反應(yīng)溫度4至37℃，反應(yīng)時間數(shù)小時至數(shù)日。
通過衍生物6、10或11與通式T-〔CO-L′〕y載體縮合，制備通式1綴合物，是在能夠生成酰胺式共價鍵的條件下進行的，而且該條件與載體的結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)一致。建議采用的條件包括，使用PH為7至9.5的緩沖水溶液，反應(yīng)溫度4至37℃，反應(yīng)時間數(shù)小時至數(shù)日。
其它條件包括使用無水二甲基亞砜或無水二甲基甲酰胺，室溫反應(yīng)1至3小時。
這里提到的“數(shù)小時至數(shù)日”的反應(yīng)周期，可以從4小時至5天。
例如，通式4和9的化合物與抗體T-〔NH2〕x之間進行縮合反應(yīng)的適宜條件是含1mg/ml單克隆抗體，PH為8的0.1M磷酸鈉水溶液和0.1M氯化鈉水溶液，與過量30倍摩爾的4或9的10%(w/v)N，N-二甲基甲酰胺溶液，在20℃反應(yīng)24小時。綴合物在sephadex G-25柱(pharmacia Fine Chemical.Piscataway.N.J.)上通過凝膠過濾純化，用PBS(磷酸鹽-緩沖鹽水)洗脫。
通式5的化合物與含硫羥基的功能基化的抗體偶合的適宜條件是，含1mg/ml單克隆抗體，PH為6的0.1M醋酸鈉水溶液和0.1M氯化鈉水溶液，與過量30倍摩爾濃度為5%(w/v)的相同緩沖液在4℃下反應(yīng)24小時。生成的綴合物用前面敘述過的凝膠過濾法純制。
通式6的化合物與T-〔CHO〕x2型載體間的偶合的適宜條件是，含1mg/ml單克隆抗體，PH6至7的0.1M醋酸鈉和0.1M氯化鈉水溶液，與過量30倍摩爾，濃度為5%(w/v)的6的相同緩沖溶液，在20℃下反應(yīng)24小時。生成的綴合物用前面敘述過的凝膠過濾法純制。
通式6、10和11的化合物與通式7的活潑載體縮合的適宜條件是，含5至50mg/ml化合物6、10或11的二甲基甲酰胺一類無水極性溶劑的反應(yīng)液，與等摩爾的化合物7在20℃下反應(yīng)24小時。
通式3的化合物，以及通式4、5、6、9、10和11的活化化合物，均為新化合物，因而包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
化合物3、5、6、10和11具有作為反應(yīng)中間體和/或作為活性治療劑的雙重功效。應(yīng)當(dāng)特別指出，通式3的中間體是通式A-O-H化合物有用的前藥。這在前面已經(jīng)敘述過。通式3的衍生物能用

圖1所示的程序制備。該程序包括，把通式A-O-H的藥物與諸如通式12之一的帶有保護羧基的適宜的烯醇醚衍生物縮合，通式12
中的B、b、R1和R2的定義同前，R3表示一保護基，例如甲基或乙基;然后脫去生成物中的保護基。
圖1
抗腫瘤蒽環(huán)類表示用于制備通式1的生物活性衍生物的適宜羥基化藥物(A-OH)，所以沒有限制本發(fā)明。
在蒽環(huán)化合物的類型中，通式(13)的3′-去氨基-3′-嗎啉基衍生物，例如3′-去氨基-3′-(4-嗎啉基)阿霉素(13a)，或3′-去氨基-3′-(2-甲氧基-4-嗎啉基)阿霉素(13b)〔見E.M.Acton et al.，Morpholin-yl Anthracyclines，in Bioactive Mokecules，vol 6，Edt.by J.W.Lown，Elsevier，1988〕，代表了選擇的化合物。
欲將通式13a，b的蒽環(huán)轉(zhuǎn)化為前面定義過的通式3的新型酸敏感衍生物，可以這樣進行按J.A.Landgrebe等在文獻J.Org.Chem.43，1244(1975)中描述的方法，將帶有酮基的適宜化合物與重氮基乙酸乙酯反應(yīng)，制備前面表述過的通式12化合物，其中Rx為乙基一類的殘基;然后再用12去處理13a，b。蒽環(huán)類及其它含一級或二級羥基的化合物與化合物12反應(yīng)時，優(yōu)先選擇的反應(yīng)條件是，用磺酸，比如對甲苯磺酸或樟腦磺酸作催化劑，在二甲基甲酰胺一類的極性溶劑中，室溫反應(yīng)數(shù)小時至數(shù)日。通式3的化合物中蒽環(huán)上連接的酸敏感殘基的保護羧基轉(zhuǎn)化為通式4化合物的活潑羰基，再由它與適宜的載體偶合，制備新的生物活性劑。通式4的蒽環(huán)衍生物，可隨意地轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?、6、8、9、10和11的衍生物，并能與適宜的載體反應(yīng)用以制備通式1的生物活性化合物。具有治療價值的藥物，例如前面描述過的那些藥物，也能按蒽環(huán)中描述的相同風(fēng)格，與通式12的化合物反應(yīng)，并轉(zhuǎn)化為治療一些乳房疾患的生物活性化合物。
本發(fā)明的通式1生物活性化合物由于含有縮醛鍵，在水合氫離子的催化下水解或“在體內(nèi)”酶解。便能釋放出母體藥物A-OH，所以是有用的化療劑。例如，眾所周知，與正常組織比較，惡性腫瘤中的糖基化比率要高。這就導(dǎo)致腫瘤內(nèi)乳酸產(chǎn)物增加并降低PH值〔見H.M.Rauen et al.，Z.Naturforsch，Teil B 23(1968)，1461〕。
按照描述的方法制備的綴合物，采用不同的化學(xué)-物理方法檢定。例如，在不同波長下使用色譜凝膠過濾操作(Yu，D.S.et al.，J.Urol.，140，415，1988)和凝膠電泳法，分別或同時檢測蒽環(huán)和抗體，估算出它保持原分子量不變，且不形成聚集體。獲得的化合物的總電荷分布，是通過離子交換色譜法估定的。蒽環(huán)濃度是采用分光光度滴定，并參照由母體蒽環(huán)繪制的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線估算的。蛋白濃度是通過比色測定，比如bicinconic acid測定(Smith，P.K.et al.，Anal.Biochem.，150，76，1985〕或Bradford染料測定〔Bradford，M.M.，Anal.Biochem.，72，248，1976〕來估算的。綴合操作之后，抗體的抗原結(jié)合活性的保持，是通過FLISA方法〔Yu，D.S.et al.，J.Urol.，140，415，1988〕和細胞熒光法〔Gallego，J.et al.，Int.J.Cancer，33，737，1984〕評價的。與母體藥物比較，綴合物的細胞毒性度的評價。是在培養(yǎng)時間長到足以說明極大細胞毒性效應(yīng)之后〔Dillmann，R.O.，et al.，Concer Res.，48，6097，1988〕，測定靶細胞的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷抑制敏度而確定的。
與抗原陰性細胞族相比較，綴合物對抗原陽性細胞族的選擇性細胞毒性度，是通過短時間培養(yǎng)后〔Dillmann，R.O.et al.Cancer Res.，48，6096，1988〕，測定抗原陽性細胞族對比抗原陰性細胞族的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷抑制敏度而確定的。
綴合物的酸敏感度，是將該化合物在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中培養(yǎng)之后，用前面提到的色譜法進行評價的。
另外，綴合物的抗體部分(125I)和/或蒽環(huán)部分(14C)放射性標(biāo)記。和HPLC分析法，用來評價綴合物在血漿中的穩(wěn)定性。
生物學(xué)活性化合物3′(按例1制備)在體外進行了抗Lovo(人體結(jié)腸腺癌)和Lovo-Doxo-耐藥(Lovo/Dx)細胞測定，處理4小時后使用單細胞覆蓋技術(shù)(溶菌測定)，同時與阿霉素及3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素(136)進行比較。50%抑制濃度(IC50)，根據(jù)濃度-效應(yīng)曲線計算。表1中報道的數(shù)據(jù)說明，化合物3′對敏感和耐藥兩類細胞的毒性均高于阿霉素，但比它的母體化合物136的毒性低15至20倍。
化合物3′在患P388-阿霉素-耐藥白血病(P388/DX Johnson)的CDF-1鼠上進行了體內(nèi)試驗，并與阿霉素及化合物136進行了比較。表2中報道的數(shù)據(jù)表明，化合物3′在腫瘤接種后第一天按0.22mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給藥，顯示很高的活性(T/C% 184)。
通式1′、1″、1ⅴ、1ⅵ和1ⅶ的綴合物(分別按例5、6、11和12制備)在P388/DX Johnson白血病模型上進行了體內(nèi)試驗，并與阿霉素和游離藥物13b進行了比較。這些綴合物中的細胞毒藥物3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素殘基，是通過酸敏感連接體連接的。表3中報道的數(shù)據(jù)說明，在腫瘤接種后第一天靜脈給藥，所有新化合物保持的活性都等于游離藥物13b的活性。以LD50-100和最佳劑量間的比值表征的治療指數(shù)，所有綴合物都比游離藥物13b高。
表4中報道了在pH3(醋酸鹽緩沖液)和37℃下，從綴合物釋放3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素(13b)的t50%。
表1治療4小時后的細胞毒性度IC50＝ng/ml(1)
表2P388/DX Johnson白血病的抗腫瘤活性，第一天腹膜內(nèi)給藥
(3)平均存活時間;高出非治療對照組的%。
(4)依據(jù)對死鼠尸解所進行評價。
表3對P388/DX Johnson白血病的抗腫瘤活性，第一天靜脈給藥
＊最佳劑量(5)劑量(ng/kg)以綴合物中13b的含量表示表4在PH5，37℃，醋酸鹽緩沖液(7)中，從綴合物中釋放13b
(6)釋放50%游離藥13b所需要的時間。通過HPLC法，用化合物13b的校正曲線測定。
(7)離子強度0.05M。
化合物的療效，以及與它們的母體比較療效的改善，在人體移植腫瘤的動物模型上進行評估?；加腥梭w腫瘤異種移植癌的裸鼠，用適宜劑量的綴合物，游離藥、抗體、藥物和抗體的機械性混合物，在同劑量下進行治療，記錄腫瘤生長情況，并在不同的治療組間進行比較。
按照藥劑處方將綴合物與可以藥用的載體或稀釋劑進行配方。任何合適的載體或稀釋劑均可使用。適用的載體和稀釋劑包括，生理鹽水和Ringers右旋糖苷溶液。
現(xiàn)用下述范列說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受它們的限制。
例114-O-(1-羧甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素〔3′;A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H〕的制備
按UK Application No.8928654.6中描述的方法制備的3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素(13b)(0.68g，1mmole)，溶于無水二甲基甲酰胺(20ml)中，并在熔融過的對甲苯磺酸(50mg)存在下用2-(環(huán)己烯-1-基)-氧乙酸乙酯〔12′b＝1，R3＝C2H5，B＝-(CH2)2-，R1＝R2＝H〕(6g，32mmole)處理?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時，然后注入碳酸氫鈉水溶液中，用二氯甲烷萃取。有機層用水洗，無水硫酸鈉干燥并過濾。減壓下蒸除溶劑。殘留物在閃式硅膠柱上分離。二氯甲烷/甲醇(98/2 V/V)混合液洗脫，得到標(biāo)題化合物3′的酯衍生物(R3＝C2H5)。
該化合物在0℃、攪拌下，氮氣保護，用0.1N氯氧化鈉水溶液(200ml)處理1小時。然后用醋酸將混合物的PH調(diào)至8.2，並用正丁醇萃取。有機層用水洗，減壓下濃縮至小體積，用閃式硅膠柱層析分離，二氯甲烷/甲醇(80/20，V/V)混合液洗脫，得到標(biāo)題化合物3′(0.35g，收率43%)，3′是用等當(dāng)量鹽酸水溶液處理，冷凍干燥后的游離酸衍生物。
TLC用硅膠板(Merck)F254，展開系統(tǒng)的二氯甲烷/甲醇(95/5 V/V)，Rf＝0.13;
MS-FDm/e783(M+);
1H NMR(200MHF，DMSO d6)δ1.12(d，J＝6.4Hz，3H，CH3-5′);1.3-1.9(m，12H，
，CH2-2′);2.0-2.7(m，7H，CH2-8，O-CH2CH2-N，O-CH-CH2-N，H-3′);2.94(s，2H，CH2-10);3.24(s，3H，CH-OHC3);3.40，3.73(two m，2H，NCH2CH2O);3.57(m，1H，H-4′);3.91(s，2H，OCH2COOH);3.97(s，3H，OHC3-4);4.04(dq，J＝6.4，1.0Hz，1H，H-5′);4.35(dd，J＝2.2，5.2Hz，1H，OCH-OCH3);4.61(s，2H，CH2-14);4.92(m，1H，H-7);5.24(m，1H，H-1′);7.6-7.9(m，3H，H-1，H-2，H-3);13.20(bs，1H，OH-11);14.02(s，1H，0H-6).
例214-O-(1-羧甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素的N-氧琥珀酰亞胺基衍生物〔4′∶A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、L＝-O-
〕的制備
按例1所述制備的化合物3′(0.2g，0.25mmol)溶于8ml無水二甲基甲酰胺中，冷至0℃，用N-羥基琥珀酰亞胺(0.2g)和二環(huán)己基碳二亞胺(0.4g)處理?；旌衔?℃放置2小時，然后在室溫下放置過夜。此后，反應(yīng)混合物在減壓下濃縮至小體積，殘留物在閃式硅膠柱上分離，二氯甲烷/甲醇混合溶劑(97/3.V/V)洗脫。含標(biāo)題化合物的餾分減壓濃縮至干，殘留物溶入乙酸乙酯中，過濾並在減壓下濃縮至小體積。最后加乙醚並在垂熔玻璃漏斗上收集標(biāo)題化合物4′(0.130g)，用乙醚洗、並在氮氣保護下保存。
TLC用硅膠板(Merck)F254，展開系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(95/5.V/V)，Rf＝0.37。
MS-FDm/e864(M+)。
例314-O-(1-肼基羰基甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素〔6′A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、d＝O〕的制備
按例2所述制備的化合物4″(20mg)溶入5ml四氫呋喃中，并加入1M的水合肼的異丙醇溶液。混合物在0℃放置70分鐘，然后加二氯甲烷，混合物用冷水洗三次。分出有機層、無水硫酸鈉干燥，過濾、減壓蒸除溶劑。殘留物在閃式硅膠柱上分離，用二氯甲烷/甲醇混合溶劑(99/1，v/v)洗脫。化合物6′，20mg，用乙醚沉淀出來。
TLC用硅膠板(Merck)F254，展開系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(95/5，v/v)，Rf＝0.25。
MS-FDm/e 797(M+)1HNMR(200MHz，DMSO d6)δ1.36(d，J＝6.6Hz，3H，CH3-5′);1.4-1.7(m，10H，
);1.76(m，2H，CH2-2′);2.30(m，2H，CH2-8);2.50(m，1H，H-3′);2.55(m，4H，N-CH2-CH(OCH3)，N-CH2-CH2-O);2.98(d，J＝18.8Hz，1H，H-10ax);3.22(dd，J＝1.0，18.8Hz，1H，H-10e);3.39(s，3H，CH(OCH3));3.55，3.95(two m，2H，NCH2CH2O);3.70(m，1H，H-4′);3.95(m，1H，H-5′);4.09(s，3H，CH3-O-4);4.10(m，2H，O-CH2CONH);4.50(m，1H，NCH2-CH(OCH3));4.67(s，2H，CH2-14);5.28(m，1H，H-7);5.54(m，1H，H-1′);7.64(bs，1H，CONHNH2);7.78(t，J＝7.9Hz，1H，H-2);8.04(d，J＝7.9Hz，1H，H-1);13.32(s，1H，OH-11);13.98(s，1H，OH-6).
例414-O-〔1-(4-羧基-1-正丁基)氨基甲?；谆?1-環(huán)己基)〕-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素〔8′A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、g＝4〕的制備
r-氨基丁酸(15mg，0.15mmol)溶于PH為716的2.5ml 0.05M的磷酸鹽緩沖液中，並加入按例2所述制備的化合物4′(30mg，0.033mmol)與3ml乙腈配成的溶液?；旌衔锸覝胤胖眠^夜，然后用醋酸調(diào)PH至6，並用正丁醇萃取。分出有機層並減壓濃縮。殘留物用硅膠柱層析分離，二氯甲烷/甲醇(95/5，V/V)混合溶液洗脫，得到20mg標(biāo)題化合物8′。
TLC用硅膠板(Merck)F254，展開系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(95/1，V/V).Rf＝0.55。
MS-FDm/e884(M+)。
例5通式1′的聚谷氨酸綴合物〔1′A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝-NH-NH-CO-、a＝2T＝聚-L-谷氨酸〕的制備分子量為2000至15000的聚-L-谷氨酸(Sigma)(85mg)、按例3所述制備的化合物6′(20mg)，溶于2ml二甲基甲酰胺中，并攪拌3小時。然后加入25mgN-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉。反應(yīng)混合物攪拌過夜。然后倒入乙醚和石油醚的混合液中。在重熔玻璃漏斗上收集沉淀，用乙醛洗，并溶入到8ml2.5%的碳酸氫鈉水溶液中。所得溶液通過-40至63μm(Merck)(30×1.8cm)的RP-8反相柱，并用水和乙腈的混合液洗脫，乙腈從0遞增至20%。含綴合物的餾分冷凍干燥并收集于重熔玻璃漏斗上，用甲醇和乙醚洗，得到45mg標(biāo)題化合物1′。用光譜進行估算，該綴合物含13%通式13b的甲氧嗎啉代。
例6通式1″的聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)-綴合物〔1″A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝-NH-NH-CO-、a＝2、T＝聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)〕的制備按照例5中描述的相同程序，分子量為25000至50000的聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)(1∶1∶1)(Sigma)60mg和按例3所述制備的化合物6′20mg溶于2毫升二甲基甲酰胺中，攪拌3小時并用N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氧喹啉(25mg)處理，經(jīng)反相柱純化后得35mg標(biāo)題化合物1″。
例7通式1 的抗黑素瘤綴合物〔1 A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝-NH-、T＝EPl〕的制備取1ml PH為8，由0.1M NaH2PO4，0.1M NaCl及純化的小鼠單克隆抗人體黑素瘤抗體EP1〔Giacomini，P.et al.，Int.J.Cancer，39，729(1978)〕的溶液，該黑素瘤抗體溶液濃度為2mg/ml，在攪拌下室溫緩慢加例2中描述的10-2M的化合物4′的N，N-二甲基甲酰胺(37.5mcl)溶液。反應(yīng)混合物在室溫下，于黑暗處攪拌過夜，并離心分離。在Sephadex-G25(PD-10，pharmacia)柱上凝膠色譜過濾分離綴合物，用PH為7.3的PBS(Gibco，10X，Cat.N.042-04200M)洗脫。收集洗脫下來的峰(1.5ml)，在48nm波長用分光光度計方法檢測蒽環(huán)組分。用比色蛋白分析(BCA，Pierce)檢測蛋白組分。該綴合物含1.27mg/ml抗體，蒽環(huán)/蛋白比為11.4/1.0。產(chǎn)物的化學(xué)-物理外觀，通過HPLC-凝膠過濾分析(Biosil SEC-250柱，0.1M NaH2PO4，0.1M NaCl，PH7.0)，雙波長(280和480nm)檢測，以及SDS-PAGE確定。HPLC表明，有50%的蛋白發(fā)生了聚集，從柱的間隙容積流出。SDS-PAGE表明，蒽環(huán)吸附和Coomassie-染料蛋白反應(yīng)二者都定位在160KD分子量，從而證實了共價鍵的形成，也指出由于非共價鍵相互作用而形成的聚集。
例8通式1ⅳ的抗結(jié)腸癌綴合物〔1ⅳA-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝-NH-NH-、T＝B7213〕的制備1ml由PH為6，0.1M NaH2PO4的緩沖溶液和B7213抗體〔US-A-4，522，918〕組成的溶液，抗體濃度為2.6mg/ml，用0.1ml 0.1M NaIO4的水溶液4℃下，在黑暗中處理。1小時后，產(chǎn)品在Sephadex G25柱(PD-10pharmacia)上用凝膠過濾色譜純化。用0.1M pH為6的NaH2PO4洗脫。
含蛋白的餾分(1.7mg，2ml)用按例3所述制得的化合物6′的相同緩沖液的溶液處理，6′溶液濃度為10%w/v，用量為30摩爾當(dāng)量。在37℃下，黑暗中反應(yīng)24小時后，反應(yīng)混合物按例7中描述的程序純化。
該綴合物含0.48mg/ml抗體，蒽環(huán)/蛋白比率為2.4/1，而且85%為單體。
例93-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和14-O-｛1-〔4-(N-異丁烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰)肼基〕-羰甲氧-環(huán)己基｝-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧-4-嗎啉基〕阿霉素共聚物(1ⅴ)〔1ⅴA-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝-NH-NH-CO-、T＝HPMA、X＝Gly-PHe-Leu-Gly〕的制備
按〔J.Kopecek et al.，Makromol.Chem.，177，2833-2848(1976)〕中描述的程序，由3-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和N-異丁烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸對硝基苯酯的游離基聚合反應(yīng)，制備的共聚物HPMA〔X＝Gly-Phe-Leu-Gly，P＝OC6H4PNO2且含量為4.2%(mol/mol %)〕0.58g溶到含衍生物6′(0.1g)的15ml無水二甲基亞砜溶液中，其中6′按例3所述制備。室溫反應(yīng)2天后，加入0.4ml1-氨基-2-丙醇，而且將反應(yīng)混合物注入300ml丙酮和乙醚1∶1(V/V)的混合液中。收集沉淀，再溶于10ml 95%的乙醇中，用80ml丙酮從該溶液中沉淀出，標(biāo)題化合物1ⅴ，收集沉淀并用乙醚洗。
產(chǎn)量0.51g。
按3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素的鹽酸鹽(13a)計算的蒽環(huán)的含量(w/w%)為3.3%。通式1ⅴ中的百分摩爾比(r∶s∶t)＝(95.7∶0.79∶3.52)例1014-O-(1-哌嗪基羰甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素〔11′A-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H〕的制備
按例2所述制備的化合物4(100mg)溶于20ml無水四氫呋喃中，冷至0℃，并加由50mg哌嗪與2ml無水四氫呋喃配制成的溶液。反應(yīng)混合物0℃下攪拌15分鐘，然后用100ml二氯甲烷稀釋，用3×50ml水洗。分出有機層，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸除溶劑。粗產(chǎn)品用硅膠層析柱分離，用二氯甲烷/甲醇(80/20，V/V)混合溶液洗脫。用乙醚沉淀出80mg化合物11′。
TLC用硅膠板(Merck)F254，展開系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(70/30，V/V)，Rf＝0.60。
FD-MSm/z868(100，〔M+H〕+)。
1HNMR(200HMZ，CDCl3)δ
1.35(d，J＝6.6Hz，3H，5′-CH3);1.3-1.9(m，12H，2′-CH2，cyclohexane);2.11(dd，J＝4.2，14.6Hz，1H，8ax-H);2.3-2.5(m，5H，8eq-H，3′-H.3″ax-H，5″-CH2);2.60(dd，J＝3.9，11.2Hz，1H，3″eq-H);2.86(m，4H，CH2-NH-CH2);3.00(d，J＝18.9Hz，1H，10ax-H);3.23(dd，J＝1.2，18.9Hz，1H，10eq-H);3.37(s，3H，2″-OCH3);3.4-3.6(m，5H，CON(CH2)2;6″ax-H);3.90(m，1H，6″eq-H);3.98(q，J＝6.6Hz，1H，5′-H);4.07(s，3H，4-OCH3);4.18(s，2H，OCH2CON);4.48(dd，J＝2.5，3.9Hz，1H，2″eq-H);4.79(m，2H，14-CH2);5.24(m，1H，7-H);5.53(m，1H，1′-H);7.37(d，J＝7.7Hz，1H，3-H);7.76(dd，J＝7.7，6.8Hz，1H，2-H);8.02(d，J＝6.8Hz，1H，1-H);13.30(bs，1H，11-OH);13.98(s，1H，6-OH).
例113-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和14-O-｛1-〔4-(N-異丁烯酰甘氨?；?哌嗪-1-基〕羰甲氧基-環(huán)己基｝-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素共聚物(1ⅵ)〔1ⅵA-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、Z＝〔1，4-哌嗪基〕-CO-，T＝HPMA、X＝-HN-CH2-CO-〕的制備
按〔J.Kopecek et al.，Makromol.Chem.，177，2833-2848(1976)〕中描述的程序，由3-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和N-異丁烯酰甘氨酸對硝基苯酯的游基聚合反應(yīng)，制備的共聚物HPMA〔X＝HN-CH2-CO-，P＝OC6H4PNO2且含量為7.6%(mol/mol %〕0.42g溶到2.2ml無水二甲基亞砜中，并與按例10所述制備的衍生物11′(0.07g)反應(yīng)。室溫反應(yīng)2小時后，加入0.05ml 1-氨基-2-丙醇，反應(yīng)混合物注入到200ml丙酮和乙醚1∶1(V/V)的混合液中。收集沉淀，并再加入10ml95%乙醇中，用80ml丙酮從其中沉淀出標(biāo)題化合物1ⅵ，收集產(chǎn)物并用乙醚洗。
產(chǎn)量0.39g。
按3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素鹽酸鹽(13a)計算的蒽環(huán)含量(w/w%)為，9.74%。
通式1ⅵ中的摩爾百分比(r∶s∶t)＝(92.4∶2.15∶5.45)。
例123-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和14-O-｛1-〔4-(6-異丁烯酰胺基己?；?哌嗪基〕-羰甲氧-環(huán)己基｝-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素共聚物(1ⅶ)〔1ⅶA-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、I＝〔1，4-哌嗪基〕-CO-、T＝HPMA、X＝HN-(CH2)5-CO-〕的制備
按〔J.Kopecek et al.，Makromol.Chem.，177，2833-2848(1976)〕中描述的程序，由3-異丁烯酰胺基-2-羥基-丙烷和N-異丁烯酰胺基己酸對硝基苯酯的游離基聚合反應(yīng)，制備的共聚物HPMA〔X＝HN-(CH2)5-CO-、P＝OC6H4PNO且含量為5.3%(mol/mol %)0.6g溶入3ml無水二甲基亞砜中，并與0.1g按例10所述制備的衍生物11′反應(yīng)。室溫反應(yīng)2小時后，加入0.1ml 1-氨基-2-丙醇。反應(yīng)混合物注入到200ml丙酮和乙醚1/1(V/V)的混合溶液中。按照例11中描述的相同程序，得0.58g標(biāo)題化合物1ⅶ。
按3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素鹽酸鹽(13a)計算，蒽環(huán)的百分含量(w/w%)為9.2%，通式1ⅶ中的摩爾百分比(r∶s∶t)＝(94.7∶2.05∶3.31)。
例13聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)(1∶1∶1)和14-O-(1-哌嗪基羰基甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素綴合物(1ⅷ)〔1ⅷA-O-＝13b′、b＝1、B＝-(CH2)2-、R1＝R2＝H、I＝〔1，4-哌嗪基〕-CO-、T＝聚〔谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)〕的制備
室溫攪拌下將分子量為25000至40000的聚(谷氨酸鈉、丙氨酸、酪氨酸)(1∶1∶1)(Sigma)0.2g溶入5ml水中。用0.1N鹽酸將該溶液酸化至PH3，使對應(yīng)的游離酸從水溶液中沉淀出來。所得聚(谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸)0.17g，真空干燥后溶入10ml無水二甲基甲酰胺中。往該溶液中加入0.035g14-O-(1-哌嗪基羰甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素(11′)，11′按例10所述制備，和0.08gN-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)。三小時后再加另一批EEDQ(0.08g，反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜，然后傾入300ml乙醚中。所得沉淀混懸于10ml水中并用14ml 0.1N氫氧化鈉處理;用0.1N鹽酸調(diào)pH至8.5，用Sephadex G10柱分離。水溶液冷凍干燥，得0.16g標(biāo)題化合物1ⅷ。
按3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素鹽酸鹽(13a)計算，蒽環(huán)的百分含量(w/w%)為10%。
通式1ⅷ化合物中的百分摩爾比(r∶s∶t∶u)＝(31.33∶2.01∶33.33∶33.33)。
權(quán)利要求
1.通式1的綴合物其中A-O-代表通式為A-O-H的藥物殘基，這里的-O-H為一級或二級羥基，a是1至30的整數(shù)；W為通式2的基團
通式2中，b是1至4的整數(shù)，B代表含1至3個碳原子的亞烷基。R1和R2各自獨立表示氫原子、鹵素、烷基、苯基、或取代苯基；Z為間隔基，T為載體部分。
2.依據(jù)權(quán)利要求1的綴合物，其中A-O-部分自通式為A-O-H的蒽環(huán)衍生。
3.依據(jù)權(quán)利要求2的綴合物，其中A-O-部分代表
其中R10為氫原子、羥基或甲氧基，R11和R12中之一為氫原子，另一個為羥基，或者R11為氫原子或碘原子而R12為氫原子，R13為氫原子或代表嗎啉代環(huán)中的氮原子。
4.依據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的組合物，其中a為1至5的整數(shù)。
5.依據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的綴合物，其中B表示-(CH2)2-。
6.依據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的綴合物，其中Z為(ⅰ)-NH-;(ⅱ)-NH-(CH2)c-S-S-，該式中的c是1到4的整數(shù);(ⅲ)-NH-〔C〕d-N＝CH-，在該式中，(a)d等于O，(b)d等于1，〔C〕表示-NH-CO(CH2)e-CO-NH-，其中的e是2至4的整數(shù)，(c)d為1至4的整數(shù)，〔C〕代表-(CH2)f-O-(CH2)f-，其中f等于1或2，或者(d)d為2至6的整數(shù)，〔C〕代表CH2;(ⅳ)-NH-〔C〕d-NH-CO-，其中〔C〕和d的定義同上;(ⅴ)-〔D〕-NH-，其中〔D〕代表-NH-〔CH2〕g-CO-，該式中的g為2至6的整數(shù);(ⅵ)-〔E〕-CO-，其中〔E〕代表-NH-〔CH2〕g-NH-，該式中的g為2至6的整數(shù)，或者(ⅶ)通式如下的哌嗪羰基
7.依據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的綴合物，其中載體部分T從多克隆抗體，或者由此而來的包括抗原結(jié)合部位能與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的它們的片段;從單克隆抗體、或者由此而來的包括抗原結(jié)合部位，能優(yōu)先與抗原結(jié)合或在腫瘤細胞群選擇性表達的它們的片段;從能優(yōu)先或選擇性地與腫瘤細胞結(jié)合的多肽或蛋白;以及從高聚載體中選擇。
8.依據(jù)權(quán)利要求7的綴合物，其中載體部分T從抗T細胞抗體、抗CD5抗體、抗鐵傳遞蛋白受體抗體、抗黑素瘤抗體、抗瘤標(biāo)記抗體、抗卵巢癌抗體、抗乳腺癌抗體和抗膀胱癌抗體中選擇。
9.依據(jù)權(quán)利要求7的綴合物，其中載體部分T是生長因子。
10.如同權(quán)利要求1中定義的通式1綴合物的制備方法，該方法包括把通式3的衍生物與一種或多種能夠提供所述間隔基Z和載體部分T的化合物縮合，借以生成所述的綴合物，在通式3中，A-O-和W的定義與權(quán)利要求1同。
11.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中縮合反應(yīng)通過通式3的衍生物的活化衍生物進行，或在縮合劑的存在下直接進行。
12.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，包括把所述通式3的衍生物轉(zhuǎn)化為通式4的活潑衍生物，4中的A-O-和W的定義同權(quán)利要求10，L代表形成酰胺鍵的活潑基團，而且(ⅰ′)生成的通式4化合物與通式為T-〔NH2〕X的化合物縮合，該式中T為載體部分，X表示可用來縮合的氨基數(shù)，或者(ⅱ′)通式4化合物與通式為NH2-(CH2)c-SH的硫醇衍生物縮合，該式中C是1至4的整數(shù)，并將生成的縮合產(chǎn)物通式5化合物與通式為T-〔SH〕Xi的化合物縮合，通式5中A-O-、W和c的定義同前，而T-〔SH〕X1中T的定義同前，x1表示能用來縮合的硫羥基數(shù)，或者(?！?通式4化合物與肼、丁二酰二肼衍生物、己二酰二肼衍生物或二氨基化合物反應(yīng)，生成通式6的產(chǎn)物其中A-O-和W的定義與權(quán)利要求1同，〔C〕和d的定義同權(quán)利要求6。生成物6與通式T-〔CHO〕X2的化合物縮合，該通式中T為載體部分，x2表示可用來縮合的甲酰基數(shù)。
13.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，包括(ⅳ′)按權(quán)利要求12制備的通式6化合物與通式7的化合物縮合其中T為載體部分，y為1至30的整數(shù)并代表載體上的羧基總數(shù)，L′表示羥基或形成酰胺鍵的活潑基團，縮合反應(yīng)隨意地在縮合劑的存在下進行。
14.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，包括(ⅴ′)通式3的化合物與通式為H2N-〔CH2〕g-COOH的氨基衍生物縮合，該氨基衍生物通式中的g是2至6的整數(shù)，借以生成通式8的衍生物其中A-O-和W的定義同權(quán)利要求1，〔D〕的定義同權(quán)利要求6;通式8的化合物隨意地轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄊ?的活潑衍生物其中A-O-、W和〔D〕的定義同前，L為形成酰胺鍵的活潑基團;在縮合劑的存在下。生成的通式9化合物或通式8化合物與通式為T-〔NH2〕X的化合物縮合，T-〔NH2〕X已在權(quán)利要求12中定義。
15.依據(jù)權(quán)利要求10的方法，包括(ⅵ′)通式4的化合物與權(quán)利要求6定義的通式為H2N-(CH2)g-NH2的氨基衍生物反應(yīng)，借以生成通式10的衍生物其中A-O-和W的定義同權(quán)利要求10，〔E〕的定義同權(quán)利要求6，或者(ⅶ′)通式4的化合物與哌嗪反應(yīng)，以便生成通式11的衍生物按照前面敘述的，把通式10或11的化合物與按權(quán)利要求13中敘述的通式7的化合物反應(yīng)。
16.包括可以藥用的載體或稀釋劑，依據(jù)從權(quán)利要求1至9中任一項的作為活性組分的綴合物，或者依據(jù)權(quán)利要求10至15中任一項中的程序已經(jīng)制備的作為活性組分的綴合物的藥劑配方。
17.權(quán)利要求10中，定義的通式3的衍生物。
18.依據(jù)權(quán)利要求17的衍生物14-O-(1-羧甲氧基-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素。
19.制備權(quán)利要求17中聲明了的通式3的衍生物的程序，該程序包括把其中的A-O-的定義與權(quán)利要求1中相同的通式A-O-H藥物與通式12的化合物綴合
其中B、b、R1和R2的定義同權(quán)利要求1，R3代表保護基;從這樣制得的化合物上脫去保護基。
20.權(quán)利要求12定義的通式4的衍生物。
21.依據(jù)權(quán)利要求20的衍生物，14-O-(1-羧甲氧-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基)阿霉素N-氧琥珀酰亞胺酯。
22.權(quán)利要求20中要求的通式4的衍生物的制備方法，該方法包括把權(quán)利要求19中要求的通式3的衍生物轉(zhuǎn)變成所說的通式4的衍生物。
23.權(quán)利要求12中定義的通式5的衍生物。
24.制備權(quán)利要求23中要求的通式5衍生物的方法，該方法包括使用權(quán)利要求10中詳述過的方法，從通式3的衍生物制備所述衍生物。
25.權(quán)利要求12中定義的通式6的衍生物。
26.依據(jù)權(quán)利要求25的衍生物，14-O-(1-肼基羰基甲氧-環(huán)己基)-3′-去氨基-3′-〔2(S)-甲氧基-4-嗎啉基〕阿霉素。
27.權(quán)利要求25中要求的通式6的衍生物的制備方法，該方法包括按權(quán)利要求12中詳述過的方法從通式3的衍生物，制備所述衍生物。
28.權(quán)利要求14中定義的通式9的衍生物。
29.權(quán)利要求28中要求的通式9衍生物的制備方法，該方法包括按照權(quán)利要求14中詳述的方法，從通式3的衍生物制備所述衍生物。
30.權(quán)利要求15中定義的通式10或11的衍生物。
31.權(quán)利要求30中要求的通式10或11的衍生物的制備方法，該方法包括按照權(quán)利要求15中詳述過的方法，從通式4的衍生物制備所述衍生物。
全文摘要
通式1的綴合物，其中A-O-為通式A-O-H藥物的殘基，[A-O-W-I]A-O-H中的-O-H為一級或二級羥基；a為1至30的整數(shù)；W為通式2基團
文檔編號C07H17/00GK1058598SQ91105270
公開日1992年2月12日 申請日期1991年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1990年8月3日
發(fā)明者弗朗西斯科·安格魯思, 勞拉·波薩尼, 米切爾·卡司, 馬利納·力帕莫迪, 達尼拉·盧基里, 安托尼諾·蘇拉多 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責(zé)任公司