一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法
【專(zhuān)利摘要】一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法，其工藝過(guò)程為：將魚(yú)膠原蛋白水溶液上樣至以多肽DECEDSETRTFYQIGDSWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL或包含該序列的多肽為配基的親和層析柱，使用淋洗劑將未吸附的多肽淋洗出，使用洗脫劑將與親和層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽洗脫出，將洗脫液濃縮，冷凍干燥后所得白色粉末即魚(yú)膠原蛋白中的功能多肽。該方法具有過(guò)程簡(jiǎn)單和分離獲得的多肽特征性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種以魚(yú)鱗膠原蛋白肽為原料分離功能多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是動(dòng)物細(xì)胞合成的一種天然生物高分子，作為細(xì)胞外基質(zhì)中的重要成分幾乎存在于所有組織內(nèi)，約占動(dòng)物總蛋白的30%，膠原蛋白具高度抗延伸能力，使得皮膚等結(jié)締組織得以維持一定的結(jié)構(gòu)并具有特殊的機(jī)械力學(xué)性質(zhì)以實(shí)現(xiàn)支撐和保護(hù)細(xì)胞、組織和機(jī)體功能，對(duì)細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)與性能等方面十分關(guān)鍵。膠原蛋白肽是以膠原為原料采用熱處理、酸/堿處理、酶法降解或結(jié)合多種方式降解獲得的多肽混合物，其主要成份是膠原降解后形成的分子量不均一的多肽。
[0003]魚(yú)膠原蛋白肽是一種功能食品或保健品原料，許多研究表明魚(yú)膠原蛋白肽中存在大量的生物活性組分，包括具有抗氧化、抑制ACE活性、抗?jié)?、抑制關(guān)節(jié)炎、提高免疫力、增強(qiáng)骨密度以及預(yù)防骨質(zhì)疏松等生物活性的多肽。膠原蛋白肽的生物活性與其組成多樣性密切相關(guān)，從魚(yú)膠原蛋白中有效識(shí)別并分離出具有生物活性的多肽組份是近年來(lái)魚(yú)鱗膠原蛋白肽研發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
[0004]傳統(tǒng)的魚(yú)鱗膠原蛋白產(chǎn)品研發(fā)的重點(diǎn)主要集中于魚(yú)鱗膠原蛋白制備工藝對(duì)產(chǎn)品整體生物活性的影響以及對(duì)產(chǎn)品分子量范圍的影響等。韓國(guó)Hee-Guk Byun利用離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜的方法從膠原蛋白中分離出具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的多肽(Process Biochemistry, 2001, 36: 1155-1162);日本 Maruyama 等從膠原蛋白中分離出可抑制血小板活性的多妝(Biochimica et Biophysica Acta, 1993, 1164:215-223)；韓國(guó)Kim等人采用凝膠過(guò)濾色譜結(jié)合離子交換和反相色譜的方法從魚(yú)皮明膠中分離出具有抗氧化功能的組份(Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4):1984-9)。傳統(tǒng)的魚(yú)膠原蛋白中不同多肽的分離方法主要基于分子量范圍、帶電荷狀態(tài)等性質(zhì)進(jìn)行分離，獲得的多肽特征性不強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種采用親和層析的方法從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離可與親和層析的配基進(jìn)行特異性結(jié)合的多肽。本發(fā)明涉及一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法具有分辨率聞和分尚特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容如下:
(I)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽溶于水制成的水溶液，濃度控制在fl0mg/ml，溶液pH控制在6.5~8.00
[0007](2)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽溶液上樣至親和層析柱，上樣量控制在層析柱體積的10%到 16%。
[0008](3)使用淋洗液將未與層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽淋洗出。[0009](4)使用洗脫溶液將與親和層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽洗脫出，獲得洗脫液，洗脫過(guò)程的溫度可控制在4°C 一 25°C。
[0010](5)將洗脫液進(jìn)行濃縮至固含量為10%~25%。
[0011](6)將濃縮液冷凍干燥，所得白色粉末即為魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離出的功能多肽。
[0012]本發(fā)明一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法中，如果待分離的膠原蛋白原料是水溶液，則省去(I)所述的膠原蛋白溶解過(guò)程，直接將膠原蛋白溶液的pH值調(diào)制6.5~8.00
[0013]優(yōu)選地，所述方法中層析介質(zhì)的配基是一種多肽，其氨基酸序列可以是一種多肽，其氨基酸序列為DECEDSETRTFYQI⑶SWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL或包含該序列的多肽。
[0014]優(yōu)選地，所述方法中使用的淋洗液可以是乙酸-乙酸鈉緩沖液，也可以是碳酸鈉緩沖液。
[0015]優(yōu)選地，所述方法中使用的淋洗液可以是濃度時(shí)5-50% (v/v)乙醇或甲醇的水溶液。
[0016]優(yōu)選地，所述方法中洗液液的濃縮方法可以是凝膠過(guò)濾層析法、膜超濾法或減壓濃縮法。
[0017]如果采用5 - 50% (v/v)的乙醇水溶液作為洗脫劑，則省去步驟(5)所述濃縮過(guò)程，洗脫液直接進(jìn)行冷凍干燥。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1
原料:魚(yú)鱗膠原蛋白肽粉末。
[0019](I)將原料魚(yú)鱗膠原蛋白肽配成水溶液，pH控制在7.0，濃度控制在3mg/ml。
[0020](2)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽水溶液上樣至親和層析柱(體積為50L)，親和層析介質(zhì)的配基是多肽 DECEDSETRTFYQI⑶SWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL ;上樣量為 5L ;親和層析介質(zhì)的粒徑:80 - 180微米，層析柱溫度控制在10°C。
[0021](3)使用80L濃度為0.2mol/L的碳酸氫銨作為淋洗劑淋洗層析柱。
[0022](4)使用50L濃度為20%的乙醇水溶液在10°C條件下洗脫層析柱，洗脫組分全部收集。
[0023](5)使用減壓濃縮法將洗脫液濃縮到固含量為20%。
[0024](6)將收集到的濃縮液噴霧干燥，獲得的白色粉末即為魚(yú)鱗膠原蛋白肽中的功能多肽。
[0025]實(shí)施例2
原料:魚(yú)鱗膠原蛋白肽水溶液。
[0026](I)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽水溶液pH調(diào)制7.0，濃度調(diào)整為2mg/mL。
[0027](2)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽水溶液上樣至親和層析柱(體積為10L)，親和層析介質(zhì)的配基是多肽 DECEDSETRTFYQI⑶SWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL ;上樣量為 IL ;親和層析介質(zhì)的粒徑:80 - 180微米，層析柱溫度控制在20°C。
[0028](3)使用20L 0.2mol/L乙酸鈉-乙酸緩沖液(pH7.0)作為淋洗劑淋洗層析柱。
[0029](4)使用IOL濃度為25%的乙醇水溶液在20°C下洗脫層析柱，收集全部洗脫液。[0030](5)將收集到的洗脫液使用減壓濃縮法濃縮至固含量至18%。
[0031](6)將濃縮液直接冷凍·干燥，獲得的白色粉末即為魚(yú)鱗膠原蛋白肽中的功能多肽。
【權(quán)利要求】
1.一種從魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離功能多肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟: (1)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽溶于水制成的溶液，濃度控制在fiomg/ml，將溶液pH值控制在 6.5-8.0 ； (2)將魚(yú)鱗膠原蛋白肽溶液上樣至親和層析柱，上樣量控制在層析柱體積的10%到16% ； (3)使用淋洗液將未與層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽淋洗出； (4)使用洗脫溶液將與親和層析介質(zhì)配基結(jié)合的多肽洗脫出，獲得洗脫液，洗脫過(guò)程的溫度控制在4°C -25 °C ； (5)將洗脫液進(jìn)行濃縮至固含量為109T25%(w/w)，得到濃縮液； (6)將濃縮液干燥，所得白色粉末即為魚(yú)鱗膠原蛋白肽中分離出的功能多肽。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)使用的親和層析介質(zhì)的配基可以是一種多肽，其氨基酸序列為DECEDSETRTFYQI⑶SWEKYLQGVRYQCYCYGRGIGEWACEPL或包含該序列的多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)采用的洗脫液是乙酸-乙酸鈉緩沖液。
4.如權(quán)利要求1所述的方 法，其特征在于，步驟(4)使用的洗脫液是濃度時(shí)5-50%(v/V)的乙醇或甲醇的水溶液。
【文檔編號(hào)】C07K1/22GK103626835SQ201310630745
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】白義化 申請(qǐng)人:威海市宇王集團(tuán)海洋生物工程有限公司