一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，通過(guò)采用獨(dú)特的工藝條件，無(wú)需進(jìn)行突變等處理，來(lái)達(dá)到單修飾的效果，工藝簡(jiǎn)單，成本低，且得到的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子活性損失小，純度高等，本發(fā)明還涉及由該方法制得的產(chǎn)品。
【專利說(shuō)明】一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法 及其產(chǎn)品

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的聚乙二醇修飾領(lǐng)域，特別是指一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì) 胞集落刺激因子的制備方法，本發(fā)明還涉及由該方法制得的聚乙二醇修飾的人粒細(xì)胞集落 刺激因子。

【背景技術(shù)】
[0002] 粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)是刺激骨髓細(xì)胞集落形成的集落刺激因子之一，能 夠特異性的刺激和調(diào)節(jié)粒細(xì)胞系統(tǒng)的增殖、分化、存活和活化，主要用于各種原因引起的 中性粒細(xì)胞減少癥，天然人粒細(xì)胞集落刺激因子（hG-CSF)含有174個(gè)氨基酸，分子量約為 19KDa，其中含有5個(gè)半胱氨酸（Cys)，Cys36與Cys42, Cys74與Cys64之間形成兩對(duì)二硫 鍵，Cysl7為不配對(duì)半胱氨酸，而重組表達(dá)的人粒細(xì)胞集落刺激因子由于增加了一個(gè)起始密 碼子，因此為175個(gè)氨基酸，相應(yīng)的，未配對(duì)的半胱氨酸成為Cysl8。由于G-CSF在代謝過(guò)程 中易由腎小球?yàn)V過(guò)，在通過(guò)腎小管時(shí)又被其中的蛋白酶部分降解并從尿中排出，臨床表現(xiàn) 為半衰期短，易被酶水解和腎臟清除，因此，臨床應(yīng)用時(shí)需要對(duì)患者進(jìn)行多次注射以維持一 定的療效，這樣會(huì)給患者帶來(lái)很大的不便于痛苦，而且重復(fù)注射也會(huì)引起一些不良反應(yīng)。
[0003] 蛋白質(zhì)或者多肽的聚乙二醇（PEG)修飾即PEG化，是將活化的PEG通過(guò)化學(xué)方法 以共價(jià)鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多肽分子上，自1977年Davis首次采用PEG修飾BSA (牛血清白 蛋白）以來(lái)，PEG修飾技術(shù)迅速發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)和多肽的化學(xué)修飾。PEG修 飾能賦予蛋白質(zhì)和多肽多種優(yōu)良性能，具體表現(xiàn)為循環(huán)半衰期延長(zhǎng)、免疫原性降低或消失、 毒副作用減少以及物理、化學(xué)、生物穩(wěn)定性增強(qiáng)等，在很大程度上擴(kuò)寬了蛋白質(zhì)和多肽的應(yīng) 用范圍，其機(jī)理可能為：蛋白質(zhì)PEG修飾后，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr )增大，當(dāng)修飾后的蛋白質(zhì)Mr 達(dá)到或超出腎小球?yàn)V過(guò)閥值時(shí)，蛋白質(zhì)隨血液循環(huán)進(jìn)入腎臟后就可以逃避腎小球的濾過(guò) 作用；由于PEG的屏蔽效應(yīng)，使得修飾后的蛋白質(zhì)或多肽不易受到各種蛋白酶的攻擊，降解 速率明顯降低，穩(wěn)定性提高；PEG在溶液中呈無(wú)規(guī)則卷曲，作為一種屏障，能掩蓋蛋白質(zhì)表 面的抗原決定簇，使蛋白質(zhì)不能與各種細(xì)胞表面受體結(jié)合，不被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別，降低 了蛋白質(zhì)的免疫原性；PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后能將其優(yōu)良的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，如能改善 蛋白質(zhì)的生物分布和溶解性能。
[0004] 但是傳統(tǒng)的PEG修飾多為隨機(jī)修飾，存在修飾劑呈現(xiàn)多種聚合度、選擇性不夠高、 修飾后蛋白質(zhì)分子Mr分布寬、活性降低、穩(wěn)定性有時(shí)不夠理想等問(wèn)題，對(duì)于hG-CSF的修飾， 不同的PEG修飾劑能夠與hG-CSF上N-端的氨基、賴氨酸上的氨基，半胱氨酸上的巰基進(jìn) 行反應(yīng)，因此得到的為多種修飾產(chǎn)物的混合物，且每種產(chǎn)物的產(chǎn)量多少、活性高低均不同， 這對(duì)于應(yīng)用帶來(lái)很多不便，因此，我們需要對(duì)傳統(tǒng)的修飾進(jìn)行處理，已達(dá)到定點(diǎn)單修飾的效 果，傳統(tǒng)的定點(diǎn)單修飾的方法主要從三個(gè)方面入手：蛋白質(zhì)方面，如蛋白質(zhì)的定點(diǎn)突變、蛋 白質(zhì)可逆性位點(diǎn)定向保護(hù)、非天然氨基酸的引入等；PEG的活化形式，如修飾氨基的PEG-醛 和修飾巰基的PEG-乙烯基砜等；反應(yīng)條件的控制，如PH值、金屬離子或酶的催化等。發(fā)明 專利（專利申請(qǐng)?zhí)枮?0130974. 9)公開(kāi)了 N-端化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)組合物及方法，所采用的 PEG-醛定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)N端，但得到的產(chǎn)物仍然含多修飾產(chǎn)物的混合物。中國(guó)發(fā)明專利(專 利申請(qǐng)?zhí)枮?00810062516. 3)公開(kāi)了一種聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突 變體的制備方法，所采用的就是將重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的第18位半胱氨酸突變?yōu)?絲氨酸，從而將突變后的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體與帶有氨基反應(yīng)基團(tuán)的PEG反 應(yīng)，再分離純化，得到聚乙二醇單修飾重組人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體，由于此方法需要 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行突變，而突變之后對(duì)蛋白質(zhì)的影響未知，所以，采用這種方法，一方面操作復(fù) 雜，另一方面，容易對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、活性等產(chǎn)生影響，因此，適用范圍有限。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有高生物活性的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集 落刺激因子。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備高生物活性的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞 集落刺激因子的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的純 化方法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，包括以下步驟：
[0010] ①在hG-CSF溶液中加入0· 5-10m〇l/L的變性劑，在變性劑的存在下，hG-CSF中的 巰基便暴露出來(lái)，易于與所述特異性巰基修飾劑發(fā)生反應(yīng)；
[0011] ②加入特異性巰基修飾劑，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來(lái)酰亞胺、 PEG-鄰-吡啶-二硫醚、PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的一種，用量為hG-CSF摩爾量 的1-50倍，所述特異性巰基修飾劑能夠特異的同hG-CSF種未配對(duì)的Cys上的巰基進(jìn)行結(jié) 合；
[0012] ③在無(wú)氧條件下，25-40°C反應(yīng)1-24小時(shí)后，去除所述變性劑，從而使hG-CSF復(fù) 性；
[0013] ④將步驟③中的反應(yīng)物上樣，經(jīng)離子交換層析及凝膠過(guò)濾層析得到單修飾的 PEG-hG-CSF 純品。
[0014] 優(yōu)選的：
[0015] 步驟①中，在hG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍或者尿素作為變性劑；
[0016] 步驟②中，加入hG-CSF摩爾量10倍的PEG-鄰-吡啶-二硫醚作為所述特異性巰 基修飾劑；
[0017] 步驟③中，為在無(wú)氧條件下，室溫反應(yīng)4小時(shí)后，通過(guò)超濾將反應(yīng)液置換至 10-100mmol/L、PH4. 0-5. 0 的醋酸緩沖液中；
[0018] 步驟④中，將步驟③中的反應(yīng)物上樣，經(jīng)10-100mmol/L、pH4. 0-5. 0的醋酸緩沖 液平衡過(guò)的陽(yáng)離子交換柱，上樣后，用0-100%的含lmol/L氯化鈉、濃度為10-100mm〇l/L、 PH4. 0-5. 0的醋酸緩沖液線性洗脫，收集主峰為PEG-hG-CSF，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾柱柱脫鹽，并更 換緩沖液為l〇-l〇〇mM醋酸緩沖液PH4. 0-5. 0,即得到單修飾PEG-hG-CSF。
[0019] 根據(jù)上述方法制得的一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子，由人粒細(xì)胞 集落刺激因子Cysl7上的巰基結(jié)合聚乙二醇構(gòu)成。
[0020] 優(yōu)選的，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來(lái)酰亞胺、PEG-鄰-吡啶-二硫醚、 PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的任一種。
[0021] 優(yōu)選的，所述特異性巰基修飾劑的Mr為lKDa至60KDa，性狀為直鏈狀或分支狀。
[0022] 更優(yōu)選的，所述特異性巰基修飾劑是Mr為lOKDa的PEG-鄰-吡啶-二硫醚。
[0023] 對(duì)于重組的人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF)，由于其于天然人粒細(xì)胞集落刺激 因子（hG-CSF)的區(qū)別僅在于多了一個(gè)自由氨基酸，未配對(duì)的半胱氨酸由第17位排到第18 位，因此，其也可以采用本發(fā)明提供的方法進(jìn)行同hG-CSF的操作，并得到相應(yīng)的單修飾的 PEG-rhG-CSF (聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子)，即由重組人粒細(xì)胞集落刺 激因子Cysl8上的巰基結(jié)合聚乙二醇構(gòu)成。
[0024] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過(guò)采用所述特異性巰基修飾劑以及特殊的反 應(yīng)條件控制、反應(yīng)步驟設(shè)定等，得到的所述聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子 (PEG-hG-CSF)，具有活性高，操作簡(jiǎn)單，成本低的特點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0026] 圖1為采用本發(fā)明提供的方法制備的聚乙二醇單修飾的重組人粒細(xì)胞集落刺激 因子的電泳圖譜，其中，數(shù)字1表示蛋白maker，2為市售藥品，3為采用本發(fā)明方法制得的單 修飾PEG-rhG-CSF，4為反應(yīng)液；
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中，根據(jù)單修飾PEG-rhG-CSF活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)制得修 飾PEG-rhG-CSF的曲線圖；
[0028] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中，采用單修飾PEG-rhG-CSF活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)未進(jìn)行 休書(shū)的rhG-CSF的曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；?本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他 實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明提供的方法，我們進(jìn)行下述操作：
[0031] ①在rhG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍作為變性劑，本實(shí)施例中，該rhG-CSF 由我公司自行純化，在變性劑的存在下，rhG-CSF的巰基便暴露出來(lái)，易于與所述特異性巰 基修飾劑發(fā)生反應(yīng)；
[0032] ②加入hG-CSF摩爾量10倍的PEG-鄰-吡啶-二硫醚作為所述特異性巰基修飾 劑；
[0033] ③在無(wú)氧條件下，本實(shí)施中，采用的是氮?dú)鈼l件下，室溫反應(yīng)4小時(shí)后，通過(guò)超濾 將反應(yīng)液置換至10mm〇l/L、PH4. 0的醋酸緩沖液中，使hG-CSF復(fù)性；
[0034] ④將步驟③中的反應(yīng)物上樣，經(jīng)10mmol/L、pH4. 0的醋酸緩沖液平衡過(guò)的陽(yáng) 離子交換柱，陽(yáng)離子交換柱的種類很多，如MacroCap SP，SP Sepharose Fast Flow, SP Sepharose High Performance等陽(yáng)離子交換介質(zhì)，本實(shí)施例中，我們采用的是SP Sepharose High Performance，上樣后，用 100% 含 lmol/L 氣化納、濃度為 10mmol/L、PH4. 0 的醋酸緩沖液線性洗脫，收集主峰為PEG-rhG-CSF，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾柱脫鹽，凝膠過(guò)濾柱有多 種，包括Sephadex G10、G15、G25等，本實(shí)施例中，采用的是Sephadex G25柱，并更換緩沖液 為10mM醋酸緩沖液pH4. 0,得到單修飾PEG-rhG-CSF。
[0035] 我們對(duì)得到的單修飾的PEG-rhG-CSF進(jìn)行活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，如下：
[0036] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簻y(cè)定采用本發(fā)明得到的單修飾PEG-rhG-CSF的活性；
[0037] 2、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備：
[0038] 2. 1RPMI1640 培養(yǎng)液：每 1L 添加 2. 2g 碳酸氫鈉、5. 9g HEPES，4°C保存。
[0039] 2. 2基礎(chǔ)培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液+15%馬血清（v/v) +0. 03%谷氨酰胺+0. 011%丙 酮酸鈉+ l〇〇U/ml雙抗(青、鏈霉素)，4°C保存。
[0040] 2. 3完全培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ PEG-rhG-CSF至終濃度20ng(3000IU/ml)。4°C保 存。
[0041] 2. 4測(cè)活培養(yǎng)液：RPMI1640培養(yǎng)液+7. 5%馬血清（v/v) +0. 03%谷氨酰胺+0. 011% 丙酮酸鈉+ l〇〇U/ml雙抗(青、鏈霉素)，4°C保存。
[0042] 2· 5MTT :用 PBS(0. 01mol/L ρΗ7· 2)配成 5mg/ml。
[0043] 2. 6裂解液：含1%濃鹽酸，10%Triton X-100的異丙醇溶液，室溫避光保存。
[0044] 2. 7PEG-rhG-CSF生物學(xué)活性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：使用rhG-CSF，購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定 所。
[0045] 2. 8NFS-60細(xì)胞培養(yǎng)物：應(yīng)為偏酸性、略微混濁液體，上次傳代后48?60小時(shí)用 于PEG-rhG-CSF活性測(cè)定。
[0046] 3、實(shí)驗(yàn)步驟
[0047] 以下3. 1?3. 7項(xiàng)各步驟應(yīng)于無(wú)菌條件下進(jìn)行。
[0048] 3. 1準(zhǔn)備：將實(shí)驗(yàn)所用溶液預(yù)溫至37°C。
[0049] 3. 2制備細(xì)胞懸液：取足量NFS-60細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集NFS-60細(xì)胞，用 RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3次，然后重懸于測(cè)活培養(yǎng)液配成1. 0X 105?2. 0X 105個(gè)細(xì)胞/ml 的細(xì)胞懸液，每孔50 μ 1細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板中，置37°C備用。
[0050] 3. 3標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取標(biāo)準(zhǔn)品或企業(yè)生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品，用測(cè)活培養(yǎng)液稀釋至 500IU/ml 左右。
[0051] 3. 4樣品溶液：將待檢樣品按標(biāo)不量溶解后，用測(cè)活培養(yǎng)液稀釋成500IU/ml左右。
[0052] 3. 5在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μ 1測(cè)活培養(yǎng)液，每孔加入50 μ 1標(biāo)準(zhǔn)品 溶液或樣品溶液，然后以3倍稀釋度做梯度稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品同做7?8個(gè)稀釋度， 取50ul加入96孔細(xì)胞板中，每個(gè)梯度做2?3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)做空白對(duì)照。37°C，5%C02培養(yǎng) 40?48小時(shí)。
[0053] 3. 6加入MTT溶液并培養(yǎng)：每孔加入20μ 1MTT溶液，37°C，5%C02培養(yǎng)4?5小時(shí)。
[0054] 3. 7加入裂解液并測(cè)定結(jié)果：每孔加入200 μ 1裂解液，混勻后在酶標(biāo)儀上比色，測(cè) 定波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)630nm，記錄測(cè)定結(jié)果。
[0055] 3. 8稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，A570/630值為縱坐標(biāo)，做四參數(shù)回歸方程曲線圖。
[0056] 4.結(jié)果計(jì)算：
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： ① 在hG-CSF溶液中加入0· 5-10mol/L的變性劑； ② 加入特異性巰基修飾劑，用量為hG-CSF摩爾量的1-50倍； ③ 在無(wú)氧條件下，25-40°C反應(yīng)1-24小時(shí)后，去除所述變性劑； ④ 將步驟③中的反應(yīng)物上樣，經(jīng)離子交換層析得到單修飾的PEG-hG-CSF純品。
2. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征 在于：步驟①中，在hG-CSF中加入濃度為4mol/L的鹽酸胍或尿素作為變性劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特 征在于：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑為PEG-馬來(lái)酰亞胺、PEG-鄰-吡啶-二硫醚、 PEG-乙烯基砜和PEG-碘乙酰胺中的任一種。
4. 如權(quán)利要求3所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征 在于：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑的Mr為lKDa至60KDa，性狀為直鏈狀或分支狀。
5. 如權(quán)利要求4所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征 在于：步驟②中，所述特異性巰基修飾劑是Mr為lOKDaPEG-鄰-吡啶-二硫醚，加入量為 hG-CSF摩爾量10倍。
6. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征 在于：步驟③中，為在無(wú)氧條件下，室溫反應(yīng)4小時(shí)后，通過(guò)超濾或凝膠過(guò)濾層析將反應(yīng)液 置換至10-100mm〇l/L、PH4. 0-5. 0的醋酸緩沖液中。
7. 如權(quán)利要求1所述的聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特 征在于：步驟④中，將步驟③中的反應(yīng)物上樣，經(jīng)l〇-l〇〇mmol/L、pH4. 0-5. 0的醋酸緩沖 液平衡過(guò)的陽(yáng)離子交換柱，上樣后，用0-100%含lmol/L氯化鈉、濃度為10-100mm〇l/L、 PH4. 0-5. 0的醋酸緩沖液線性洗脫，收集主峰為PEG-hG-CSF，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾柱脫鹽，并更換 緩沖液為l〇-l〇〇mM醋酸緩沖液PH4. 0-5. 0,即得到單修飾PEG-hG-CSF。
8. -種聚乙二醇單修飾的人粒細(xì)胞集落刺激因子，由人粒細(xì)胞集落刺激因子Cysl7上 的巰基結(jié)合聚乙二醇構(gòu)成，其特征在于：采用如權(quán)利要求1所述的方法制得。
【文檔編號(hào)】C07K14/53GK104109199SQ201310130804
【公開(kāi)日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月16日
【發(fā)明者】王軍, 張靜, 張楠, 慕彩梅 申請(qǐng)人:深圳新鵬生物工程有限公司