一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，包括：對(duì)rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中，制得包涵體；將包涵體進(jìn)行變性處理，然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性，得rhG-CSF復(fù)性液；最后進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。采用柱層析復(fù)性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的復(fù)性收率高于70%；復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達(dá)到99%以上，RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上，比活性6.6×107IU/mg。
【專利說明】一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 (recombinant human granulocyte colony stimulating factor, rhG-CSF)的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人粒細(xì)胞集落刺激因子（human granulocyte colony stimulating factor， hG-CSF)屬于造血生長因子家族。內(nèi)毒素、TNF-a和IFN-γ可活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn) 生G-CSF。此外，成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞等在LPS、IL-1或TNF- α 刺激活化后也可分泌G-CSF。某些白血病細(xì)胞以及CHu-2人口腔癌細(xì)胞、5637人膀胱癌細(xì) 胞、MIAPa Ca-2胰腺癌細(xì)胞可組成性地表達(dá)G-CSF。
[0003] 1986年G-CSF cDNA克隆成功，C-CSF基因全長2. 5kb，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含 子。人類有兩種不同的G-CSF cDNA，分別編碼含207和204氨基酸的前體蛋白，均有30個(gè) 氨基酸的先導(dǎo)序列，成熟蛋白分子分別為177和174個(gè)氨基酸，前者除了在成熟分子N端35 位處插入了 3個(gè)氨基酸外，其余的序列與174氨基酸分子相同，人G-CSF分子量為19. 6kDa， PI6. 1，0-糖基化，對(duì)酸堿（pH2?10)、熱以及變性劑等相對(duì)較穩(wěn)定。G-CSF有5個(gè)半胱氨 酸，Cys36與Cys42, Cys74與Cys64之間形成兩對(duì)二硫健，Cysl7為不配對(duì)半胱氨酸，二硫 鍵對(duì)于維持G-CSF生物學(xué)功能是必須的因素。
[0004] 人粒細(xì)胞集落刺激因子（hG-CSF)是一種在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)粒細(xì)胞(尤其是中性粒 細(xì)胞)成熟與生長的造血生長因子。它通過刺激粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM)向 粒細(xì)胞集落形成單位（CFU-G)的分化和成熟，動(dòng)員成熟中性粒細(xì)胞向外周血的釋放，從而促 進(jìn)中性粒細(xì)胞的生長。在臨床上用來治療各種原因引起的中性粒細(xì)胞減少癥，有很大的經(jīng) 濟(jì)意義和社會(huì)意義。
[0005] hG-CSF的天然來源有限，產(chǎn)量甚微，還不能滿足臨床應(yīng)用的需要。利用基因工程技 術(shù)生產(chǎn)是獲取大量hG-CSF的一條途徑。天然hG-CSF雖是一種糖蛋白，但文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，未經(jīng)糖 基化和利用大腸桿菌表達(dá)的重組hG-CSF具有與天然hG-CSF同樣的生物活性。
[0006] 利用基因工程手段構(gòu)建的表達(dá)外源目的基因的菌株常采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，目 的蛋白多以包涵體形式表達(dá)于菌體內(nèi)。在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生 物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié) 構(gòu)稱為包涵體。包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、夕卜 膜蛋白、環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0. 5-lum，難溶于水，只溶于變 性劑如尿素、鹽酸胍等。包涵體的形成主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì) 折疊的輔助因子或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。
[0007] 包涵體是以表達(dá)產(chǎn)物為主，聚集形成的蛋白性質(zhì)顆粒，目的蛋白具有正確的一級(jí) 結(jié)構(gòu)順序，但缺乏正確的構(gòu)象，因而不具備其生物活性。表達(dá)蛋白必須經(jīng)過變性和復(fù)性的過 程，使包涵體折疊成為正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，才能具有生物活性。包涵體在蛋白變性劑的作用 下，成為可溶性的伸展?fàn)顟B(tài)，通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù) 到正常的折疊結(jié)構(gòu)，形成具有天然生物活性的天然結(jié)構(gòu)。在去除變性劑的同時(shí)，分子內(nèi)部的 二硫鍵、疏水鍵等往往來不及形成，從而導(dǎo)致分子間存在大量錯(cuò)誤的折疊和聚合，以至蛋白 沉淀。復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，很大程度上與蛋白 質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋 白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶 劑和其他添加劑的存在與否等。
[0008] 目前，蛋白質(zhì)的復(fù)性方法主要有稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性等方法。但這些方 法存在設(shè)備要求高、收率低、操作繁瑣、易產(chǎn)生蛋白沉淀等諸多問題。因此，把rhG-CSF包涵 體復(fù)性為有生物活性的蛋白質(zhì)，并盡可能提高復(fù)性收率，是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法， 采用柱層析復(fù)性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的復(fù)性收率高于 70% ;復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純度達(dá)到 99%以上，RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。
[0010] 本發(fā)明的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，包括：
[0011] (1)對(duì)rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中，經(jīng)超 聲破碎和離心處理，制得包涵體；
[0012] (2)將上述包涵體經(jīng)洗滌和溶解后，進(jìn)行變性處理，得到變性蛋白溶液；
[0013] (3)將所得變性蛋白溶液進(jìn)行稀釋，然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性處理，得rhG-CSF復(fù)性 液；
[0014] (4)將復(fù)性液直接進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細(xì)胞集落 刺激因子。
[0015] 所述步驟（1)中的裂解液為 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0 ;
[0016] 所述步驟（2)中用溶液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4對(duì)包涵體進(jìn)行變性 處理；
[0017] 所述步驟（3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀 釋到1?2mg/ml ;
[0018] 所述步驟（3)中的柱層析，所用層析介質(zhì)為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine ；
[0019] 所述步驟（3)中的柱層析，層析柱直接在5_20cm，柱床高度60-100cm ;
[0020] 所述步驟（3)中的柱層析，層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml，上樣體積小于柱床 體積的20%，上樣和洗脫流速為5-lOcm/h ;
[0021] 所述步驟（3)中的柱層析，所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
[0022] 本發(fā)明的柱層析復(fù)性主要是使用脫鹽的原理，變性劑是高濃度的鹽，在層析過 程中，被緩慢的脫去，rhG-CSF隨著變性劑濃度逐漸降低，而重新折疊變成具有活性的 rhG-CSF 分子。
[0023] 有益效果
[0024] 本發(fā)明采用柱層析復(fù)性的方法，簡化了操作方式，使重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 的復(fù)性收率高于70%。柱層析所收獲的復(fù)性液無沉淀，溶液澄清透明，可以直接進(jìn)行下一步 的純化分離。復(fù)性液經(jīng)過陽離子交換和分子篩層析后制備成rhG-CSF的原液。原液電泳純 度達(dá)到99%以上，RP-HPLC的純度達(dá)到98%以上，比活性6. 6X 107IU/mg。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為RP-HPLC空白對(duì)照?qǐng)D譜；
[0026] 圖2為柱層析復(fù)性后收集的洗脫峰RP-HPLC純度檢測(cè)圖譜；
[0027] 圖3為rhG-CSF原液RP-HPLC純度檢測(cè)圖譜；
[0028] 圖4為rhG-CSF原液的純度非還原性SDS-PAGE圖譜；
[0029] 圖5為rhG-CSF原液的還原性SDS-PAGE圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0031] 實(shí)施例
[0032] rhG-CSF包涵體的獲取
[0033] rhG-CSF基因工程菌(工程菌株pBVQG8/MM294,由中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供）按常 規(guī)的高密度發(fā)酵(采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)方式進(jìn)行工程菌發(fā)酵，當(dāng)菌體密度達(dá)0D值到達(dá)30時(shí)， 對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，表達(dá)外源蛋白；其中，補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為：酵母浸出粉450g/L、葡 萄糖500g/L ;發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油4ml/L、葡萄糖20g/L、 磷酸二氫鉀2. 31g/L、磷酸氫二鉀12. 54g/L、硫酸鎂0. 75g/L)后，采用8000g離心力收集菌 體。
[0034] 收集后的濕菌體，放置于_20°C，凍融一次。取400克凍融后的菌體，按固液比1:10 (g/ml)比例混懸于裂解液中（20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTTl. 5g/L，pH8. 0)，混合成均一的懸 液后，使用大功率超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)混懸液進(jìn)行破菌及勻漿處理，l〇〇〇〇g離心力離心收 集包涵體60克。離心機(jī)為Avanti J-25, Beckman公司。
[0035] rhG-CSF包涵體的洗滌和溶解
[0036] 收集的包涵體60g依次用注射用水、A液（ImM EDTA，0. 1M NaCl)、B液 (50mMTris-HCl，5mM DTT，5mM EDTA，1% 脫氧膽酸鈉，ρΗ9·0)進(jìn)行洗滌，采用 10000g 離心力 離心收集包涵體70g ;然后將收集的包涵體70g用C液（50mMTris-HCl，2%十二烷基肌氨酸 鈉，PH8. 0)溶解，室溫?cái)嚢柽^夜，用丙酮沉淀蛋白，獲得高純度的包涵體50g。
[0037] rhG-CSF包涵體的變性處理
[0038] 取上述包涵體，用D液（6M鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 4)溶液進(jìn)行變性，室溫 溫和攪拌2-3小時(shí)，采用33000g離心力離心收集上清液，即為rhG-CSF蛋白變性溶液。采 用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，用D溶液（6M鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，pH5. 4)將其蛋白 濃度稀釋至1. 5mg/ml，準(zhǔn)備進(jìn)行柱上復(fù)性。
[0039] rhG-CSF包涵體的柱層析復(fù)性
[0040] 使用XK50/100柱子，柱床高度80cm，層析介質(zhì)為Sephadex G_25media。先用 0. 2MNa0H清洗1個(gè)柱體積，注射用水沖洗3個(gè)柱體積，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液 平衡柱子至少3個(gè)柱體積，待電導(dǎo)和pH值穩(wěn)定后上樣。
[0041] 上樣體積200ml，流速5cm/h，上樣完畢后，用pH5. 420mM醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行 洗脫，洗脫流速5cm/h，收集洗脫峰，洗脫峰即為rhG-CSF復(fù)性液。洗脫峰進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè) (圖2)，如圖所示，正確構(gòu)象的rhG-CSF的含量高達(dá)95. 4%，異構(gòu)體雜質(zhì)含量為4. 6%。
[0042] rhG-CSF 的精純
[0043] 將復(fù)性后的rhG-CSF溶液，上樣于CM-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析介 質(zhì)，用pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡2個(gè)柱體積，用0. 3M NaCl溶液進(jìn)行洗脫，收集 洗脫峰。上樣、平衡和洗脫流速均為lOcm/h。
[0044] 離子交換洗脫峰進(jìn)行進(jìn)一步的分子篩凝膠過濾層析。層析介質(zhì)選用Sephacryl S200層析介質(zhì)，用pH4. OlOmM醋酸-醋酸鈉緩沖進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫峰合并即為 rhG-CSF原液。原液進(jìn)行非還原性SDS-PAGE電泳（圖4)和還原性SDS-PAGE電泳（圖5)電 泳純度均為100%。RP-HPLC檢測(cè)（圖3)，其純度為100%。
[0045] 按照中國藥典進(jìn)行活性檢測(cè)，其活性高達(dá)7. 6X 107IU/mg。
[0046] 雖然本發(fā)明已將較佳實(shí)施例揭示如上，然其并非用以限定本發(fā)明的內(nèi)容，任何熟 悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明的主要精神和內(nèi)容范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種更動(dòng)與潤飾，因此發(fā)明 的保護(hù)范圍應(yīng)以申請(qǐng)專利的實(shí)際權(quán)利要求范圍為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，包括： (1) 對(duì)rhG-CSF基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)菌體混懸于裂解液中，經(jīng)超聲破 碎和離心處理，制得包涵體； (2) 將上述包涵體經(jīng)洗滌和溶解后，進(jìn)行變性處理，得到變性蛋白溶液； (3) 將所得變性蛋白溶液進(jìn)行稀釋，然后用柱層析進(jìn)行復(fù)性處理，得rhG-CSF復(fù)性液； (4) 將復(fù)性液進(jìn)行陽離子層析和凝膠過濾層析，收集得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（1)中的裂解液為 20mMTris-HCl，EDTAlmM，DTT1. 5g/L，ρΗ8· 0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（2)中用溶液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4對(duì)包涵體進(jìn)行變性處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中用稀釋液6Μ鹽酸胍，20mM醋酸-醋酸鈉，ρΗ5. 4將變性蛋白溶稀釋到1? 2mg/ml〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，所用層析介質(zhì)為Sephadex G_25coarse、Sephadex G_25media、 Sephadex G_25fine 或 Sephadex superfine。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，層析柱直接在5-20cm，柱床高度60-100cm。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，層析上樣蛋白濃度1. 0?2. Omg/ml，上樣體積小于柱床體積的 20%，上樣和洗脫流速為5-10cm/h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的制備方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的柱層析，所用洗脫液為pH5. 4, 20mM醋酸-醋酸鈉緩沖液。
【文檔編號(hào)】C07K14/53GK104120159SQ201310150982
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】岑仡, 宋宏 申請(qǐng)人:上海三維生物技術(shù)有限公司