專利名稱：重組人胰島素原的復性與純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用高效體積排阻色譜(HPSEC或SEC)法復性與純化重組人胰島素原的方法，屬于生物醫(yī)藥中變性蛋白復性技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
胰島素原(ProinSUlin，PI)是由86個氨基酸組成的單鏈肽，其C肽的兩端各自通過兩個堿性氨基酸殘基與胰島素A鏈的N末端和B鏈的C末端相連。胰島素原分子的折疊卷曲保證了三對二硫鍵的正確對接。在胰島素制備中，采用胰島素原法直接酶切后獲得有活性的胰島素已經(jīng)是一種成熟的方法。因此，獲得高質(zhì)量回收率的具有活性重組人胰島素原(簡稱:rhPI)是制備重組人胰島素的前提。Robert B.M 等[Robert B.M, et al, Protein Expres Purif, 1999, 15:308-313]曾利用離子交換色譜(IEC)法和親和色譜(AFC)法對rhPI包涵體蛋白進行純化，之后用稀釋法復性、酶切獲得產(chǎn)物用RPLC法分析。而Gusarova V等[Gusarova V, et al,J Chromatogr A.2007, 1176: 157-162]報道了先利用稀釋法復性rhPI，再分別用IEC法和SEC法進行兩步純化后，通過酶切轉(zhuǎn)換為胰島素。上述方法均利用稀釋法復性，難于大規(guī)模進行蛋白藥物的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的一種高效、快速的復性與純化重組人胰島素原的方法，能夠提高重組人胰島素原的質(zhì)量回收率和純度，并可直接用于酶切為胰島素，適用于胰島素的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明實現(xiàn)過程如下: 重組人胰島素原的復性與純化方法，包括以下步驟:
(1)在大腸桿菌(疋co7i)中表達的重組人胰島素原(rhPI)的菌體細胞經(jīng)離心、超聲破碎后分別用緩沖液I和II洗滌、離心溶解于強變性緩沖液中得到含有重組人胰島素原的變性抽提液；
所述緩沖液 I 為 10 20 mmol/L PBS,0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ;
所述緩沖液 II 為 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ;
所述的強變性緩沖液為6.0 8.0 mol/L脲，10 20 mmol/LDTT，0.5 I mmol/LEDTA,pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ；
(2)將含有重組人胰島素原的變性抽提液直接進樣到流動相A(20 40 mmol/LPBS,O 8.0 mol/L脲，pH6.0 7.0)平衡的色譜柱，然后用含20 40 mmol/LPBS, pH6.0 7.0的流動相B線性梯度洗脫，流速為0.3 0.7mL/min，收集目標峰色譜餾分得到復性與純化含重組人胰島素原的色譜餾分；(3)將步驟(2)含人胰島素原的色譜餾分直接進樣，用O 10 mmol/LPBS, pH6.0
7.0的流動相平衡的色譜柱進一步脫鹽,持續(xù)洗脫20 40 min,流速0.5 I mL/min,得到
重組人胰島素原。上述步驟(2)中色譜柱為TSK gel 620005' 0^型(7.811111^300111111)或5即61(^\20010/300GL 型(10 mmX300 mm)。上述步驟(2)中所述洗脫方式可以采用流動相A平衡后，用流動相B線性梯度洗脫20 40 min,延長5 10 min。上述步驟(3)中所述色譜柱為HiTrap Desalting column。本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明提供的利用脲濃度梯度體積排阻色譜對重組人胰島素原復性與純化的方法，解決了蛋白分子直接從高濃度變性劑擴散到與流動相中，而不能提供一個緩和的蛋白再折疊環(huán)境的問題，同時也克服了其他色譜方法成本高，難于放大的缺點。本發(fā)明在流動相中添加了小分子脲之后，在洗脫過程中，為蛋白再折疊提供了一個溫和的環(huán)境，促進蛋白折疊成緊密的結(jié)構(gòu)，保留時間延長，復性效率和質(zhì)量回收率也得到提高。并且經(jīng)過脫鹽柱后更加利于后續(xù)酶切而得到胰島素，操作簡單成熟、穩(wěn)定，固定相成本較低，易于控制和放大


圖1復性與純化前后rhPI的SDS-PAGE分析
條帶M:蛋白質(zhì)分子量標準；條帶1:未誘導表達的重組人胰島素原；條帶2:重組人胰島素原誘導表達5 h后；條帶3:8.0 m ol/L urea抽提液；條帶4:脲濃度梯度SEC法對rhPI的純化與復性；條帶5:對一步餾分脫鹽的二次純化；條帶6:標準胰島素；條帶7:酶切轉(zhuǎn)化的胰島素；
圖2添加不同的脲濃度時對rhPI的復性與純化色譜圖(A )和質(zhì)量回收率(B)
圖(A)中橫坐標為保留時間(time)，縱坐標為波長280nm處紫外吸收值(mAU);
圖(B)中橫坐標為添加脲濃度(Urea concentration),縱坐標為質(zhì)量回收率(Massrecovery)；
曲線 1: 0.0 mol/L 脲；曲線 2: 2.0 mol/L 脲；曲線 3: 4.0 mol/L 脲；曲線 4:6.0 mol/L 服；曲線 5: 8.0 mol/L 服；
圖3為不同洗脫模式下對rhPI的復性與純化
圖中橫坐標為保留時間(time )，縱坐標為波長280nm處紫外吸收值(mAU);
曲線1:在流動相A中添加0.0 mol/L脲等度洗脫；曲線2:在流動相A中添加2.0mol/L脲等度洗脫；曲線3:在流動相A中添加2.0 mol/L脲梯度洗脫。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但保護范圍不被此限制。實施例中所用設(shè)備或原料皆可從市場獲得。實施例1
(O重組人胰島素原變性抽提液的準備
用萬作為宿主細胞表達重組人胰島素原(rhPI)蛋白，再將發(fā)酵菌液經(jīng)離心、細胞破碎和分別用緩沖液 I (20 mmol/L PBS, I mmol/L EDTA，pH 7.4)和 II (2.0 mol/L 脲，
1mmol/L EDTA, 1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS, pH 7.4)洗滌、并離心的粗純化后，得到的包涵體溶于 8.0moI/L 脲，20 mmol/LDTT, 1.0 mmol/LEDTA, pH 8.0 (或 6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0)的變性劑中，變性抽提液濃度為9.92 mg/mL, rhPI純度為65.7 %以上，電泳見圖1中條帶3。(2)高效體積排阻色譜復性與純化重組人胰島素原
用流動相A(20 mmol/ LPBS,4.0moI/L 脲，ρΗ6.5)平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL,300 X 7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進樣200 μ L，在流速0.3 mL/min下進行30 min的線性梯度洗脫，直至流動相B (20 mmol/L PBS, pH 6.5)為100%,延長10 min。rhPI質(zhì)量回收率為42.5%，純度達到95%以上，色譜圖見圖2 (A)的曲線3，質(zhì)量回收率見圖2 (B)中。(3)用脫鹽色譜柱二次純化重組人胰島素原
用0-10 mmol/LPBS, pH6.0-7.0的流動相平衡的脫鹽色譜柱(HiTrap Desaltingcolumn)，對復性與純化得到的含人胰島素原的色譜餾分I直接進樣，持續(xù)洗脫30 min，流速1.0ml/min。rhPI的純度達到了 99%以上。見圖1中條帶5。實施例2
與實施例1類似，不同的是步驟(2)用未添加脲100%流動相A平衡TSK gel G2000SWXL型HPSEC柱(300 X7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進樣200 μ L，在流速0.5 mL/min下進行30 min線性梯度洗脫，直至流動相B(20.0 mmol/L PBS,pH 6.5)為100%，延長lOmin。rhPI質(zhì)量回收率為39.7%，純度可達到95%以上。色譜圖見圖2 (A)的曲線1，質(zhì)量回收率見圖2 (B)。實施例3
與實施例1類似，不同的是步驟(2)在流動相中脲濃度和色譜條件優(yōu)化的條件下，用100% 流動相 A(20.0 mmol/ LPBS, 2.0 mol/L 脲，ρΗ7.0)平衡 TSK gel G2000SWXL 型 HPSEC柱(300 X 7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進樣200 μ L，在流速0.5 mL/min下進行30 min脲濃度線性梯度洗脫，直至流動相B (20.0 mmol/L PBS,pH 7.0)為100%，延長10 min。rhPI質(zhì)量回收率為56.8%，純度可達到96%以上。色譜圖見圖2 (A)的曲線2，質(zhì)量回收率見圖2 (B)。實施例4
與實施例1類似，不同的是步驟(2)在流動相中脲濃度和色譜條件優(yōu)化的條件下，用100% 流動相 A (20.0 mmol/ LPBS,2.0 mol/L 脲，ρΗ7.0)平衡 SuperdeX200 10/300GL型的SEC柱(10 X 300 mm 1.D.)，變性抽提液直接進樣200 yL，在流速0.5 mL/min下進行30 min脲濃度線性梯度洗脫，直至流動相B (20.0 mmol/L PBS, pH 7.0)為100%，延長IOmin0 rhPI質(zhì)量回收率為51.7%，純度可達到96%以上。實施例5
與實施例1類似，不同的是步驟(2)用100%流動相A (20.0 mmol/ LPBS，2.0 mol/L脲，pH7.5)平衡 TSK gel G2000SWXL 型 HPSEC 柱(300 X7.8 mm 1.D.)，變性抽提液直接進樣200 μ L，改變流速為0.5 mL/min時，分別進行脲濃度等度洗脫或脲濃度線性梯度洗脫，后者rhPI質(zhì)量回收率可以提高10%。色譜圖見圖3曲線2和曲線3。
實施例6胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素
將得到的高純度重組人胰島素原在37°C溶液中或控制HPSEC柱37°C柱溫的條件下，用胰蛋白酶和羧肽 酶B協(xié)同酶切30 min，使rhPI轉(zhuǎn)化為hi。電泳見圖1中條帶7。
權(quán)利要求
1.重組人胰島素原的復性與純化方法，其特征在于包括以下步驟: (1)在大腸桿菌中表達的重組人胰島素原的菌體細胞經(jīng)離心、超聲破碎后分別用緩沖液I和II洗滌、離心溶解于強變性緩沖液中得到含有重組人胰島素原的變性抽提液；所述緩沖液 I 為 10 20 mmol/L PBS, 0.5 I mmol/L EDTA, pH 7.0 7.5 ; 所述緩沖液 II 為 0.5 2.0 mol/L脲，0.5 I mmol/L EDTA，0.5 1.0 mol/L NaCl，10 20 mmol/L PBS, pH 7.0 7.5 ; 所述的強變性緩沖液 為6.0 8.0 mol/L脲，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0;或6 7 mol/L 鹽酸胍，10 20mmol/LDTT，0.5 lmmol/LEDTA，pH7.0 8.0 ； (2)將含有重組人胰島素原的變性抽提液直接進樣到流動相A平衡的色譜柱，然后用含20 40 mmol/LPBS,pH6.0 7.0的流動相B線性梯度洗脫，流速為0.3 0.7mL/min,收集目標峰色譜餾分得到復性與純化含重組人胰島素原的色譜餾分；流動相 A 為:20 40 mmol/LPBS, O 8.0 mol/L 脲，ρΗ6.0 7.0 ; (3)將步驟(2)含重組人胰島素原的色譜餾分直接進樣，用O 10mmol/LPBS，pH6.0 7.0的流動相平衡的色譜柱進一步脫鹽,持續(xù)洗脫20 40 min,流速0.5 I mL/min,得到重組人胰島素原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復性與純化方法，其特征在于: 步驟(2)中色譜柱為 TSK gel G2000SWXL 型或 SuperdeX200 10/300GL 型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復性與純化方法，其特征在于:步驟(2)中所述洗脫方式采用流動相A平衡后，用流動相B線性梯度洗脫20 40 min,延長5 10min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人胰島素原的復性與純化方法，其特征在于:步驟(3)中所述色譜柱為 HiTrap Desalting column。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效體積排阻色譜(HPSEC)復性與同時純化重組人胰島素原的方法。包括(1)將含有胰島素原的菌體細胞經(jīng)超聲波細胞破碎，緩沖液洗滌和溶解于強變性劑(如8mol/L或6-7mol/L鹽酸胍)，由此得到粗分離的重組人胰島素原；(2)在優(yōu)化的色譜條件下含有胰島素原的變性抽提液直接進樣，采用脲濃度線性梯度洗脫一步色譜所得的目標餾分rhPI的純度可達到96%以上，質(zhì)量回收率為56.8%；(3)將含有胰島素原餾分進一步脫鹽，由此得復性與純化更高純度和活性的餾分。本發(fā)明所述的方法得到的重組人胰島素原可以經(jīng)色譜柱上的酶切或溶液中酶切轉(zhuǎn)換為胰島素，并且該色譜過程操作簡單，重復性高，易于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07K1/16GK103172727SQ20131006581
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者王驪麗, 吳溪, 周慧芳, 袁潔 申請人:西北大學