用于合成卟啉-磷脂結(jié)合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了一種包括卟啉-磷脂結(jié)合物雙層的納米囊泡。每個卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-1或sn-2位中的一個。另外，該納米囊泡具有限定的sn-1∶sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
【專利說明】用于合成卟啉-磷脂結(jié)合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于合成和提純η卜啉-磷脂結(jié)合物(porphyrin-phospholipidconjugate)的方法，且更具體地涉及具有限定的異構(gòu)體純度的卟啉_磷脂結(jié)合物組合物的合成和提純。該卟啉-磷脂結(jié)合物組合物特別適合用來形成納米囊泡。
【背景技術(shù)】
[0002]近來，在W011/044671中描述了卟啉體(Porphysome);是由卟啉-磷脂結(jié)合物形成的納米囊泡，其是具有固有多模態(tài)的用于生物光子成像和治療的生物相容的納米顆粒。I修飾的磷脂已被證實可用于不同的生物技術(shù)應(yīng)用，包括核酸遞送(陽離子脂質(zhì))、診斷成像(放射性同位素-螯合脂質(zhì))、生物現(xiàn)象研究(熒光脂質(zhì))、以及藥代動力學(xué)調(diào)制(PEG化脂質(zhì))和結(jié)構(gòu)(可聚合脂質(zhì))。2_4磷脂可在其首基(head group)或側(cè)鏈上的各個位置被標(biāo)記。5使用磷脂酰乙醇胺的伯氨基團可以容易地實現(xiàn)首基修飾。側(cè)鏈修飾不太容易，但在保持磷脂兩性分子特性的同時，適合用于結(jié)合更疏水的配體。近年來，用膽固醇、視黃酸和卟啉側(cè)鏈修飾的磷脂已被研發(fā)，其具有用于給藥、免疫學(xué)和生物光子應(yīng)用的有用性能。
[0003]單側(cè)鏈修飾的磷脂的合成通常受酰基轉(zhuǎn)移的影響。所得的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體(參見圖1A)有相似的結(jié)構(gòu)，這使得使用如HPLC、NMR和質(zhì)譜技術(shù)使它們無法分離且使它們的檢測很難或不可能。1(1結(jié)構(gòu)選擇性磷脂側(cè)鏈修飾已使用多種技術(shù)實現(xiàn)。修飾的磷脂的合成已使用修飾的甘油基骨架以多 步反應(yīng)進行，有時需要保護基。6’9’n根據(jù)方法和催化劑，溶血磷脂與脂肪酸酰氯、咪唑、酸酐和硫代吡啶酯的?；饔靡呀?jīng)實現(xiàn)了不同的異構(gòu)體純度(70%至99% )和產(chǎn)率(40%至90% )。12’13然而，這些反應(yīng)中間體的產(chǎn)生可引起降解反應(yīng)且可能無法產(chǎn)生滿意的產(chǎn)率和異構(gòu)體純度。羧酸用標(biāo)準(zhǔn)的偶聯(lián)劑對溶血磷脂的直接酰化是方便的合成路線，且已報道了旨在減少?；D(zhuǎn)移如用玻璃珠聲波處理(sonication)的實驗方案。14

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]一方面，提供了包括卟啉-磷脂結(jié)合物雙層的納米囊泡，其中，每個卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個,該納米囊泡具有限定的sn_l: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率(regioisomeric ratio)。
[0005]另一方面，提供了卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物，其中，葉啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-1或sn-2位中的一個，其中該組合物有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
[0006]另一方面，提供了由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用酶溫育結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物直到達到所限定的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該酶選擇性裂解sn-Ι或sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個。
[0007]根據(jù)另一方面，提供了用于從包含卟啉-磷脂結(jié)合物sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體混合物的組合物中除去卟啉-磷脂結(jié)合物sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個的方法，該方法包括酶催化裂解卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個。
[0008]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括改變卟啉和磷脂結(jié)合反應(yīng)的原料比。
[0009]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用有機萃取提純該混合物并接著使用硅膠層析法提純。
[0010]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用有機萃取提純該混合物并接著使用二醇基硅膠提純。
【專利附圖】

【附圖說明】
·[0011]本發(fā)明優(yōu)選實施方式的這些和其他特征將在參考附圖的以下【具體實施方式】中變得更明顯，其中:
[0012]圖1示出了 A)?；D(zhuǎn)移的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)(pyro-lipid)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的合成；B)使用HPLC檢測異構(gòu)體；以及C)對應(yīng)于原料比的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體產(chǎn)物的比率。
[0013]圖2示出了選擇性裂解各個焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的兩種酶的鑒別。A)用不同酶溫育sn-Ι和sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)溶液(未處理的)后的異構(gòu)體含量。使用的縮寫為:PL:磷脂酶；H.B.V:蜜蜂毒液；T.L:疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus) ;R.M:米黑根毛酶(Rhizomucor miehei) ；P.C.:洋蔥假單胞菌；C.R.:皺裙念珠菌(Candida rugosa) ;LPL，P:脂蛋白脂肪酶，假單胞菌；PLD，P:磷脂酶D，花生；B.S.:嗜熱脂肪芽孢桿菌。sn-2和sn-Ι異構(gòu)體的量的差別分別用藍色和紅色示出。B)在可以分解各個結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的酶篩選中鑒別出的兩個目標(biāo)的動力學(xué)分析。
[0014]圖3示出了兩種焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體形式的卟啉體。卟啉體用指定比率的sn-2或sn-Ι焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)形成且經(jīng)受TEM (左)。所示比例尺為lOOnm。相應(yīng)卟啉體的熒光光譜在右側(cè)示出，完好卟啉體的光譜用虛線示出以及洗滌劑破壞后的光譜用實線示出。
[0015]圖4示出了幾百毫克級的sn-2焦脫鎂葉綠酸_脂質(zhì)的制備。星號表示?；D(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。[0016]圖5示出了 sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)卟啉體用于光熱治療的用途。帶有KB異種移植(xenograft)的裸鼠靜脈注射40mg/kg的sn_2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)卟啉體或鹽水，24小時后，用700mW激光(0.8cm2光點大小)使癌癥經(jīng)受激光治療60秒。當(dāng)腫瘤直徑達到Icm時裸鼠死亡。每組N = 5。
[0017]圖6是卟啉-磷脂結(jié)合物異構(gòu)體構(gòu)成的卟啉體的示意圖。
[0018]圖7示出了兩種焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體的質(zhì)譜和吸收光譜。
[0019]圖8示出了焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體(在d-DMSO中)的NMR特征。具有斷裂的?；湹膕n-1 (A)和sn-2⑶焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的HPLC蹤跡、結(jié)構(gòu)和IH NMR光譜。光譜上標(biāo)記了被標(biāo)示的甘油的氫的化學(xué)位移。(C)標(biāo)示的?；湐嗔训慕姑撴V葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體的COSY光譜。(Di)示出了具有指定質(zhì)子的sn-Ι焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體的NOSEY光譜。(Dii)示出了具有指定質(zhì)子的sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體的NOSEY光譜。
[0020]圖9示出了卟啉體的動態(tài)光散射粒度分布。
[0021]圖10示出了光熱治療過程中腫瘤的溫度。帶有KB腫瘤的裸鼠靜脈注射卟啉體(黑色)或鹽水(灰色)。24小時后，裸鼠被麻醉并暴露到67 Inm的激光。數(shù)據(jù)表示對于每組η = 5的最大腫瘤溫度的+/-S.D.平均值。
【具體實施方式】
[0022]具有卟啉側(cè)鏈的磷脂可自組裝形成卟啉體，一類新的光學(xué)活性的納米囊泡。溶血磷脂的sn-2羥基的?；瘜Υ祟悅?cè)鏈修飾的磷脂是有吸引力的路線，但會產(chǎn)生?；D(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體且感興趣的配體連接到sn-l位。這里，我們報告了通過酰基轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的酶催化選擇制備異構(gòu)的純卟啉-脂質(zhì)結(jié)合物。酶篩選從蜜蜂毒液鑒別磷脂酶A2來選擇性裂解sn-Ι卟啉-結(jié)合脂質(zhì)以及從疏綿狀嗜熱絲孢菌鑒別脂肪酶來選擇性裂解sn-2卟啉-結(jié)合脂質(zhì)。兩種純化的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體產(chǎn)生卟啉體納米囊泡。Sn-2結(jié)合卟啉體易于制備且在體內(nèi)作為有效的光熱劑對抗異種移植腫瘤。`
[0023]存在這里描述的“卟啉體”;由磷脂-卟啉結(jié)合物亞單元自組裝的有機納米顆粒，其呈現(xiàn)出脂質(zhì)體樣結(jié)構(gòu)和載荷能力、結(jié)構(gòu)相關(guān)的納米級光傳導(dǎo)性能、優(yōu)異的生物相容性，并具有多樣化的生物光子應(yīng)用的前景。已經(jīng)描述了其他卟啉囊泡和二嵌段共聚物，其包含卟啉亞單元，但低卟啉密度導(dǎo)致較低的消光系數(shù)和特征明顯的熒光自猝滅的缺乏，其產(chǎn)生卟啉體的新型特征。
[0024]在一些實施方式中，卟啉體包括卟啉-脂質(zhì)結(jié)合雙層，該卟啉-脂質(zhì)結(jié)合雙層每個卟啉體包括約100，000個卟啉分子。由于它們通過卟啉亞單元形成和穩(wěn)定，卟啉體可使用一系列細胞靶向部分靶標(biāo)細胞。卟啉體是高度有用的，具有形成不同類型卟啉的能力，具有螯合不同類型金屬的能力，以及具有形成不同大小的能力。另外，卟啉體顯示了納米級特性，且在活化前具有高猝滅和光熱傳導(dǎo)效率。
[0025]本文中描述的納米囊泡是小的，通常小于200nm，囊泡(即泡或囊)由包括磷脂或其衍生物的雙層的膜形成。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)技術(shù)也能夠產(chǎn)生更大的雙層如大單層囊泡或平面脂質(zhì)雙層。
[0026]一方面，提供了包括卟啉-磷脂結(jié)合物雙層的納米囊泡，其中，每個卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、卟啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-1或sn-2位中的一個,該納米囊泡具有限定的sn_l: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
[0027]優(yōu)選地,納米囊泡基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的(regioisomerically pure)。更優(yōu)選地，納米囊泡中卟啉-磷脂結(jié)合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的純度>97%。
[0028]在優(yōu)選的實施方式中，以增加的優(yōu)選度，該納米囊泡包括至少15mol%、25mol%、34mol % >45mol % >55mol % >65mol % >75moI %、85mol %和 95mol % 的卟琳-憐脂結(jié)合物。
[0029]構(gòu)造本發(fā)明納米囊泡的卟啉-磷脂結(jié)合物包括卟啉、葉啉衍生物和卟啉類似物。示例性卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性卟啉衍生物包括焦脫鎂葉綠酸、細菌葉綠素、葉綠素a、苯并卟啉衍生物、四羥基苯基二氫卟酚、紅紫素、苯并二氫卟酹、萘并二氫卟酌.(napthochlorins)、維爾丁(verdin)、玫紅素(rhodin)、酮二氫口卜酌.(keto chlorin)、氮雜二氫卟酌.、菌綠素、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)、和苯并菌綠素(benzobacteriochlorin)。卟啉類似物包括擴展的卟啉族成員(如泰薩卟啉(texaphyrin)、薩普卟啉(sapphyrin)、六兀卟啉(hexaphyrin)),和卟啉異構(gòu)體(如卟啉烯(porphycene)、反轉(zhuǎn)卟啉(inverted porphyrin)、酞菁、和萘酞菁)。
[0030]優(yōu)選地，擴展卟啉為泰薩卟啉、薩普卟啉或六元卟啉，且卟啉異構(gòu)體為卟啉烯、反轉(zhuǎn)卟啉、酞菁、或萘酞菁。
[0031]如文中所使用的，“磷脂”是具有帶有磷酸基的親水首基和疏水脂質(zhì)尾端的脂質(zhì)。
[0032]在一些實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或磷脂酰肌醇。
[0033]優(yōu)選地，磷脂包括12至22個碳的?；鶄?cè)鏈。
[0034]在一些實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉是焦脫鎂葉綠酸_a酸。在另一個實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物中的卟啉是細菌葉綠素衍生物。
[0035]在一些實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物中的磷脂是1-十六酰基-2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。
[0036]在一些實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物是焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)。
[0037]在其他實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物為氧基細菌葉綠素-脂質(zhì)。
[0038]在一些實施方式中，葉啉通過O至20個碳的碳鏈連接基團結(jié)合到磷脂上的甘油基基團。
[0039]在一些實施方式中，納米囊泡進一步包括PEG,優(yōu)選PEG-脂質(zhì)，且進一步優(yōu)選PEG-DSPE。優(yōu)選地，PEG或PEG-脂質(zhì)以約5mol %的量存在。
[0040]在一些實施方式中，納米囊泡基本為球形且直徑為約30nm至約200nm之間,優(yōu)選地，直徑為約IOOnm或直徑為約30nm。
[0041]在一些實施方式中，葉啉-磷脂結(jié)合物包括螯合在其中的金屬，可選地為金屬的放射性同位素，優(yōu)選Zn、Cu、Pd或Pt。
[0042]多種生物活性或治療劑、藥劑物質(zhì)、或藥物可包封在卟啉體內(nèi)部中。
[0043]在一些實施方式中，納米囊泡進一步包括包封在其中的活性劑，優(yōu)選治療劑或診斷劑，優(yōu)選化療劑如多柔比星(doxorubicin)。
[0044]術(shù)語“治療劑”是本領(lǐng)域公認的且是指生物學(xué)上、生理學(xué)上或藥理學(xué)上的活性物質(zhì)的任何化學(xué)部分。在熟知的參考文獻中描述了治療劑(還稱為“藥物”)的實例，如the Merck Index、the Physicians Desk Reference、和 The Pharmacological Basis ofTherapeutics，并且它們包括但不限于藥物；維生素；礦物質(zhì)補充劑；用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或緩解病或疾病的物質(zhì)；影響身體結(jié)構(gòu)或功能的物質(zhì)；或在它們已經(jīng)置于生理環(huán)境后變?yōu)樯锘钚缘幕蚧钚愿鼜姷那绑w藥物?？墒褂酶鞣N形式的治療劑，其能夠在給予受試者時從受試者組合物釋放到鄰近組織或液體。
[0045]“診斷的”或“診斷劑”是可用于診斷的任何化學(xué)部分。例如，診斷劑包括成像劑，例如，包含放射性同位素的那些如銦或锝；包含碘或釓的對比劑；酶如辣根過氧化物酶、GFP、堿性磷酸酶、或β-半乳糖苷酶；熒光物質(zhì)如銪衍生物；發(fā)光物質(zhì)如N-甲基吖啶鎗(N-methyIacrydium)衍生物等。
[0046]在一些實施方式中，納米囊泡進一步包括祀向分子,優(yōu)選抗體、肽、適體或葉酸。
[0047]“靶向分子”是可引導(dǎo)納米囊泡到特定目標(biāo)的任何分子，例如，通過結(jié)合至靶細胞表面上的受體或其他分子。靶向分子可為蛋白質(zhì)、肽、核酸分子、糖類或多糖、受體配體或其他小分子。特異性程度可通過靶向分子的選擇調(diào)整。例如，抗體通常表現(xiàn)高特異性。這些可以是多克隆的、單克隆的、片段、重組體、或單鏈，其中許多是市售的或使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)易于獲得。
[0048]在一些實施方式中，納米囊泡的雙層進一步包括膽固醇,優(yōu)選在30_50mol%之間的膽固醇。
[0049]另一方面，提供了卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物，其中，葉啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-1或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn_2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
[0050]優(yōu)選地，該組合物·基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的。進一步優(yōu)選地，該組合物中卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的純度>97%。
[0051]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用酶溫育結(jié)構(gòu)異構(gòu)體混合物直到達到所限定的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該酶選擇性裂解sn-Ι或sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個。
[0052]優(yōu)選地，該組合物基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的。
[0053]根據(jù)另一方面，提供了用于從包括卟啉-磷脂結(jié)合物sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體混合物的組合物中除去卟啉-磷脂結(jié)合物sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個的方法，該方法包括酶催化裂解卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個。
[0054]在一些實施方式中，所得的組合物基本上是異構(gòu)體純的sn-Ι卟啉-磷脂結(jié)合物組合物(因此除去sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物)且酶優(yōu)選來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶(LTL)。
[0055]在一些實施方式中，所得的組合物基本上是異構(gòu)體純的sn-Ι卟啉-磷脂結(jié)合物組合物(因此除去sn-Ι卟啉-磷脂結(jié)合物)且酶優(yōu)選來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2(PLA2HBV)。
[0056]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括改變卟啉和磷脂結(jié)合反應(yīng)的原料比。
[0057]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用有機萃取提純該混合物并接著使用硅膠層析法提純。
[0058]另一方面，提供了用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，該脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中該組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，該方法包括用有機萃取提純該混合物并接著使用二醇基硅膠提純。
[0059]本發(fā)明的優(yōu)點進一步通過以下實施例說明。本文中闡述的實施例和其它具體細節(jié)僅是為了說明呈現(xiàn)且不應(yīng)解釋為對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0060]實施例
[0061]材料和方法
[0062]焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的合成
[0063]如前所述(Zheng等人，Bioconjugate Chemistry, 13-392, 2002)，焦脫鎂葉綠酸(Pyro)衍生自 pacifica 螺旋藻(spirulina pacifica algae) (Cyanotech)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中，107mg的焦脫鎂葉綠酸(200umol)在5mL戍烯穩(wěn)定的氯仿中與98.7mg的16: O溶血磷脂酰膽堿(1-十六?；?2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿，Avanti PolarLipids#855675)、76.3mg EDC(Si`gma)和 48.7mgDMAP (Sigma)混合。反應(yīng)混合物在室溫氬氣下攪拌24小時。使用2695HPLC/MS Micromass ZQ2000系統(tǒng)(Waters)反向HPLC和質(zhì)譜法分析所得的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體產(chǎn)物。使用4.6mmX 75mm、3.5 μ m的SunfireC8HPLC色譜柱(Waters)，色譜柱以從處于0.1% TFA中的15%乙腈到處于0.1% TFA中的95%的乙腈的梯度以0.5mL/min流速在60°C加熱15分鐘。焦脫鎂葉綠酸_脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體經(jīng)受進一步分析，或可替代地，在加熱到40°C使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓下除去氯仿并進行進一步的酶催化的結(jié)構(gòu)選擇。
[0064]酶催化的結(jié)構(gòu)選擇及隨后的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)純化
[0065]為了酶篩選，使用來自Sigma的以下酶:來自落花生(花生)的磷脂酶D-1I型(P0515);來自伯克氏菌屬(Burkholderia)的脂蛋白脂肪酶(L9656);來自褶皺念珠菌的脂肪酶，II型(L1754);來自產(chǎn)氣莢膜梭菌的磷脂酶C，I型(P7633);來自豬肝的酯酶(E3019);來自豬胰腺的磷脂酶A2(P6534);來自豬胰腺的脂肪酶(L3126);來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的磷脂酶A1(L3295);嗜熱脂肪芽孢桿菌酯酶，重組體(69509);來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶(62309);來自米黑根毛酶的脂肪酶(L4277);來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶(L0777);來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2(P9279)。為了酶篩選，每次反應(yīng)酶添加2nmol焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)，且在50uL的0.025% Triton XlOO和5mM Tris pH8和IOug的干酶(磷脂酶D、磷脂酶C、脂蛋白脂肪酶、來自褶皺念珠菌的脂肪酶、來自豬肝的酯酶、磷脂酶A2、豬肝脂肪酶)或以液體或懸浮液形式獲得的酶(全部其它酶)中在37°C溫育3小時。溫育后，樣品與50uL的DMSO混合，離心以除去任何沉淀的蛋白質(zhì)并經(jīng)受如上述的HPLC/MS。在確定來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2和來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶分別為用于裂解sn-Ι和sn-2結(jié)合的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體的最佳酶后，每次反應(yīng)使用2nmol焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)重新評估這兩種酶并在指示的時間點溫育。對于具有連接在sn-2位的焦脫鎂葉綠酸的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)純化，混合物的干燥的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)直接懸浮在5mg/mL的在 ImM CaCl2, 50mM Tris pH8，0.5% TritonX-100 和 10% MeOH 中的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)中。接著以0.lmg/mL濃度加入來自蜜蜂毒液的PLA2，且將溶液在37°C溫育24小時。對于具有連接在sn-Ι位的焦脫鎂葉綠酸的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的制備，先純化sn-Ι和sn_2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體混合物，接著在2.5mg/mL的在0.5% Triton X-100和ImM CaC12中的焦脫鎂葉綠酸_脂質(zhì)中溫育，并通過加入制備的每IOmL焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)含200uL來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶溶液消化。反應(yīng)狀態(tài)用HPLC/MS探測并進行多天，且每天加入另外IOOuL的脂肪酶。在使用HPLC/MS通過確認不需要的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體消失證實反應(yīng)完成。加入另外2體積的氯仿和1.25體積的甲醇并從有機層萃取焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)并在減壓40°C下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，除去溶劑。接著焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)再懸浮在DCM中，并裝載到裝載有二醇基硅膠(Sorbtech，#52570)的快速層析柱中，每IOOmg焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)大約IOg干二氧化硅粉末。對焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)使用Solera快速層析系統(tǒng)(Biotage)，使用處于DCM中的O至10%甲醇梯度。合并被洗脫的部分并在減壓下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶劑。最后，將焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)溶解在IOmL的20%水和80%的叔丁醇中，在液氮中冷凍，并凍干2-3天。對于Sn-1焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)，NMR特征如下:
[0066]1H NMR(CDCl3,400MHz): δ 9.22 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.89 (dd, J =
18.0,11.6Hz, 1H)，6.21 (dd, J = 18.0, 1.2Hz, 1Η)，6.11 (dd, J = 11.6，1.2Hz, 1Η)，5.21 (m,1Η)，5.19 (d, J = 19.6Hz, 1Η)，4.99 (d, J = 19.6Hz, 1Η)，4.45 (d, J = 17.2Hz, 1Η)，4.39 (q,J = 7.2Hz, 1Η)，4.29 (m, 2Η)，4.19-4.11 (m, 2Η)，3.94 (m, 2Η)，3.73 (m, 2Η)，3.45 (q, J = 9.6,2Η)，3.35(s，3H)，3.30(s，3H)，3.26(s，9H)，3.12(s，3H)，2.66-2.55(m，3H)，2.35-2.27 (m,1Η)2.14 (t，J = 7.6Ηζ，3Η)，1.77 (d, J = 7.6Ηζ，3Η)，1.55 (t, J = 7.6，3Η)，1.33 (m, 2Η)，
1.33-0.93(m，31H)，0.85 (t, J = 6.8Ηζ，3Η)，0.23 (br, 1Η)，-1.84 (br, 1Η)；
[0067]13C 匪R(CDC13，100MHz): δ 196.1，173.1，172.9，171.3，160.2，155.1, 150.6，148.8，144.8，141.4，137.5，136.1, 135.9，135.7, 131.5,130.1, 129.1, 127.8，122.4，105.8，103.7,97.0,93.0,70.4,70.3,68.3,66.5,63.5,63.3,59.2,54.5,51.6,49.9,48.0,34.2,32.9,30.9,29.7,29.6,29.6,29.6,29.6,29.5,29.4,29.3,29.1,28.9,24.7,23.1，22.6，19.2，19.0,17.3，14.1，12.0 ；
[0068]對于Sn-2焦脫鎂葉綠酸_脂質(zhì)，NMR特征如下:
[0069]1H 匪R (CDCl3, 400MHz): δ 9.08(s, 1H) ,8.89 (s, 1H) ,8.45 (s, 1H), 7.78 (dd, J=18.0,11.6Hz, 1H) ,6.14 (d, J = 18.0Hz, 1H) ,6.04 (dd, J = 11.6Hz，1H)，5.31 (m，1H)，5.13(d，J= 19.6Hz，lH)，4.97(d，J= 19.6Hz，1H)，4.41 (m，3H)，4.24(m，2H)，4.18(m，2H)，4.00 (t, J = 6.4Hz，2H)，3.66 (m，2H)，3.34 (q, J = 7.5Hz，2H)，3.29 (s，3H)，3.21 (s，12H)，3.03(s,3H),2.81(s,lH),2.64 (q, J = 6.8Hz, 2H), 2.41 (m, 1H), 2.16 (t, J = 7.lHz，2H)，
2.05 (m, 1H)，1.75 (d, J = 7.2Hz,3H)，1.49 (t, J = 7.6Hz,3H)，1.41 (p, J = 6.9Hz,2H)，1.29-0.89(m，31H)，0.85 (t, J = 6.8Hz，3H)，_0.07 (br, 1H)，-1.97 (br, 1H)；
[0070]13C 匪R(CDC13，100MHz): δ 196.4，173.5，172.6，171.4，160.3，154.9，150.4，148.7，141.4，137.4，136.0，135.8，135.6，131.4，122.3，105.7，103.6,96.9,93.0,72.9，41.2,41.2,66.3,66.2,63.9,63.6,63.5,62.8,59.3,51.5,49.9,48.0,43.0,39.1,31.9，31.1,29.8,29.6,29.6,29.6,29.5,29.4,29.3,29.3,29.1,29.0,24.7,23.1,22.6，19.2，17.3 ；
[0071]為了確認異構(gòu)體的身份，在0.5% Triton-XlOO和ImM CaCl2中，sn_l焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)用來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2消化且sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)用來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶消化。在37°C溫育過夜后，使用2體積氯仿和1.25體積甲醇萃取裂解產(chǎn)物。有機溶劑通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去，并將裂解部分再懸浮在處于DCM中的1%的MeOH中，并用小二醇基二氧化硅柱純化，裂解部分在比焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)更高濃度的MeOH中(約8% )洗脫。干燥溶劑并經(jīng)受d-DMS0400MHz NMR。NMR光譜在支持圖2中示出。
[0072]卟啉體的形成和表征
[0073]將異構(gòu)體純的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)、膽固醇(Avanti Polar Lipids)以及二硬脂?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基(聚乙二醇)(PEG-2000-PE，Avanti PolarLipids)溶解在氯仿中。為了表征研究，在硅酸硼試管中分散形成0.5mg的95%焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)(標(biāo)示的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體組合物的)和5% PEG-2000-PE的薄膜，在氮氣流下干燥，接著在真空下除去剩余的氯仿。將脂質(zhì)薄膜用磷酸鹽緩沖溶液(150mM NaCl, IOmM磷酸鹽PH7.4)再水化，并使用液氮冷凍接著在65°C水浴中融解經(jīng)受5個凍融循環(huán)。然后卟啉體用微型擠出機(Min1-Extruder) (Avanti Polar Lipids)通過IOOnm的聚碳酸酯膜擠出15次。在納米粒度儀(Nanosizer) (Malvem)上進行尺寸測量。使用Fluoroxmax突光計(HoribaJobin Yvon)記錄熒光的自猝滅。將卟啉體溶液在PBS中稀釋到2.5ug/mL，并在2nm狹縫寬度在420nm下激發(fā)。測量發(fā)射并在Inm狹縫寬度從600nm整合至800nm。用相同濃度的IOOnm卵磷脂(egg phosphat·idyl choline):膽固醇(3: 2摩爾比)脂質(zhì)體進行背景消除。使用由I %的醋酸鈾負染色的卟啉體使用H-7000透射式電子顯微鏡(Hitachi)進行透射式電子顯微。對于體內(nèi)的光熱研究，通過混合βδηιοΙ^Ρ卜啉-磷脂和3011101%膽固醇及5mol %溶解在氯仿中的PEG-2000-PE制備5mg脂質(zhì)薄膜，且在氮氣流下漸漸干燥，并進一步在真空下干燥I小時。然后將脂質(zhì)薄膜在ImL PBS中再水化并經(jīng)受5個凍融循環(huán)以獲得卟啉體懸浮液。使用 lOmLLIPEX? 熱筒擠出機(Thermobarrel Extruder) (Catalogue#!1.005，Northen Lipids公司，CA)將懸浮液通過IOOnm孔徑聚碳酸酯膜(Avanti Polar Lipids)在700psi (4826kPa)氮氣下擠出10次。用循環(huán)水浴將溫度精確控制在70°C。光熱治療
[0074]對于光熱治療，通過注射2xl06個細胞(cell)到鼠右翼，KB腫瘤在雌性裸鼠內(nèi)生長。當(dāng)腫瘤直徑達到4~5mm時,通過鼠尾靜脈注射42mg kg-1的含30mol %膽固醇和5mol %PEG-2000DSPE的卟啉體。注射后24h，用2% (v/v)異氟烷(isofIuorane)麻醉鼠，且用在671nm下具有700mW輸出的光點直徑為8mm的激光(671nm2W DPSS激光器，LaserGlowTechnologies)照射腫瘤,用紅外攝像機(Mikeospec)記錄腫瘤溫度。每天測量腫瘤體積，一旦腫瘤直徑達到10mm，對鼠實行安樂死。
[0075]結(jié)果與討論
[0076]在酰化反應(yīng)中使用1:1: 2: 2摩爾比的焦脫鎂葉綠酸:脂質(zhì):DMAP: EDC將焦脫鎂葉綠酸-a(pyr0)結(jié)合到溶血磷脂1-十六?；?2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。雖然該反應(yīng)進行完全要過夜，但它產(chǎn)生兩種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體，一個是在sn-2位的焦脫鎂葉綠酸，一個是在sn-Ι位的焦脫鎂葉綠酸，分別稱作sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)和sn_l焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)(圖1)。使用具有在60°C加熱的柱的HPLC-MS，異構(gòu)體的存在被顯示為兩個緊密洗脫的兩個峰(圖1B)。這些峰均表現(xiàn)出同樣預(yù)期的焦脫鎂葉綠酸-結(jié)合的脂質(zhì)的分子量吸收光譜(圖7)。通過檢測酶裂解結(jié)合物中甘油基骨架中心碳上的氫的IH的化學(xué)位移確認了異構(gòu)體的身份，其連接到酯或伯醇(酶催化裂解在下文描述且裂解產(chǎn)物的NMR光譜和未消化的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體在圖8中示出)。焦脫鎂葉綠酸與磷脂的原料比的調(diào)整導(dǎo)致所得的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體產(chǎn)物比的改變。當(dāng)使用1:1的比率時，超過80%的產(chǎn)物為sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體(即焦脫鎂葉綠酸結(jié)合到sn-2羥基)。當(dāng)該比率增加到1: 7時，sn-2焦脫鎂葉綠酸異構(gòu)體產(chǎn)物減少到35%且sn-Ι焦脫鎂葉綠酸異構(gòu)體增加到65%。這個觀察的一個解釋是小部分的溶血磷脂在與焦脫鎂葉綠酸反應(yīng)前經(jīng)歷了?；D(zhuǎn)移。由于?；D(zhuǎn)移的溶血磷脂包含反應(yīng)性更強的伯醇，其在反應(yīng)中被迅速消耗，以使得溶血磷脂更大的原料比導(dǎo)致更多sn-Ι焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的產(chǎn)生。因此，可通過改變反應(yīng)條件實現(xiàn)一些結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的選擇度，但需要替代的方法來實現(xiàn)改善的異構(gòu)體純度。
[0077]酶已經(jīng)用于制備或確認磷脂的身份。例如，磷脂酶A2可用來裂解磷脂sn-2位的取代基用于制備溶血磷脂或用于分析裂解產(chǎn)物和側(cè)鏈性能。然而，據(jù)我們所知，酶還未綜合地用來消除不需要的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。我們假設(shè)焦脫鎂葉綠酸的疏水的、平面特性以異構(gòu)體特異性方式干擾磷脂結(jié)合物的酶識別。為了驗證該假設(shè)，集合了 15種市售的脂肪酶和酯酶組并用幾乎等摩爾的sn-Ι和sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)溶液溫育。各種酶的異構(gòu)裂解在圖2A中示出，sn-Ι焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的具體增加用紅色示出且sn-2焦脫鎂葉綠酸_脂質(zhì)的具體的增加用藍色示出。在試驗條件下，大多數(shù)酶在裂解焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體上是效率低的。考慮到由焦脫鎂葉綠酸引入的龐大的空間干擾，這并不奇怪。然而，識別了在篩選條件下作用于焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的一些酶。來自嗜熱脂肪芽孢桿菌的酯酶將兩種焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體有效裂解為質(zhì)荷比為848的產(chǎn)物，其對應(yīng)于磷脂膽堿首基裂解的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)。然而，沒有檢測到任何結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的優(yōu)先裂解。一些酶確實選擇性裂解sn-Ι或sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。雖然這些酶裂解大量的兩種異構(gòu)體，但來自米黑根毛酶和洋蔥假單胞菌的脂肪酶優(yōu)選裂解sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體。來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶(`LTL)選擇性裂解sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)異構(gòu)體，且極少改變sn-Ι異構(gòu)體。反之，來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2 (PLA2HBV)選擇性裂解sn_l結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。再次檢查這兩種酶證實了它們對消除各單獨焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的特異性(圖2B)。因此，該篩選方法識別了可選擇性裂解各結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的兩種酶。
[0078]接著PLA2HBV和LTL被用來制備異構(gòu)體純的卟啉-磷脂來組裝入卟啉體?；贖PLC, sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體均為超過97%的異構(gòu)體純的。在薄膜中制備各種純化的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和二者的組合，連同5mol %的PEG-2000-磷脂酰乙醇胺，在磷酸鹽緩沖溶液中再水化，并用IOOnm聚碳酸酯膜擠出以形成卟啉體。動態(tài)光散射顯示生成物的尺寸是約120nm單分散的(圖9)。透射電子顯微鏡確認了用于各種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的組裝體的納米囊泡結(jié)構(gòu)，其包括包封水性內(nèi)部的球形卟啉雙層(圖3，左列)。卟啉體的另一個特性來自卟啉雙層內(nèi)焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)亞單元的相互作用，其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)驅(qū)動的自猝滅。所有卟啉體均高度猝滅，且超過99%的焦脫鎂葉綠酸卟啉的正常熒光發(fā)射在完好的卟啉體中猝滅(圖3，右列)。這些結(jié)果表明兩種焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和二者的組合在形成高度猝滅的卟啉雙層的納米囊泡上的行為相似。
[0079]雖然焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體可互換且極少影響產(chǎn)生的卟啉體的物理特性，但是大部分應(yīng)用更加需要異構(gòu)體純的材料。如果批與批的比例改變且對體內(nèi)環(huán)境不同異構(gòu)體有望顯示不同代謝降解產(chǎn)物，多種異構(gòu)體的組合將增加重復(fù)能力的問題。Sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)合成路線更有效，不僅由于該路線避免了酰基轉(zhuǎn)移(即結(jié)合如預(yù)期地發(fā)生在溶血磷脂sn-2醇上)，還由于最優(yōu)反應(yīng)不需要過量溶血磷脂(不像sn-Ι焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)-參見圖1C)，其還使下游溶血磷脂污染風(fēng)險最小化。sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)的合成可簡單地增加到IOOmg級(圖4)且由3個步驟組成:將焦脫鎂葉綠酸結(jié)合到脂質(zhì)，用酶消化以及在二醇基二氧化硅柱上純化。該簡單的實驗方案是有效的并產(chǎn)生高純度的異構(gòu)體純的焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)。接著sn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)形成為卟啉體并用于光熱切除腫瘤。由于它們是熒光猝滅的，將吸收光能轉(zhuǎn)化為熱且已經(jīng)證明卟啉體是用于光熱治療的有效對比劑。1帶有KB腫瘤的裸鼠靜脈注射卟啉體且24小時后用671nm激光治療。在激光治療進程中，腫瘤溫度迅速達到60°C而單激光組仍低于40°C (圖10)。接收卟啉體和激光治療的腫瘤形成兩周后消失的表面焦痂。如圖5所示，僅接受激光治療或僅接受卟啉體治療的鼠由于腫瘤繼續(xù)生長不得不被處死。相比之下，在卟啉體和激光組中，所有鼠存活超過150天且永久消滅所有腫瘤。
[0080]綜上所述，在篩選(PLA2HBV和LTL)中確認了用于產(chǎn)生異構(gòu)體純的sn_l和sn_2卟啉-磷脂結(jié)合物的酶。兩種結(jié)構(gòu)異構(gòu)體均組裝為卟啉體。Ssn-2焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)被有效合成并可用來使用卟啉體光熱治療切除腫瘤。該酶篩選方法和可能識別的兩種酶可用來產(chǎn)生其它類型的異構(gòu)體純的磷脂結(jié)合物。
[0081]雖然本文已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不背離本發(fā)明精神或附加 權(quán)利要求范圍的情況下可對其做修改。本文中公開的所有參考，包括以下清單中的那些，通過援引并入本文。
[0082]參考文獻
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【權(quán)利要求】
1.一種納米囊泡，包括卟啉-磷脂結(jié)合物的雙層，其中，每個所述卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的Sn-1或sn-2位中的一個,所述納米囊泡具有限定的sn_l: sn_2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米囊泡，其中，在所述納米囊泡中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純度>97%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的納米囊泡，以增加的優(yōu)選度包括至少15m0l%、25mol % >35mol % >45mol %的卟琳-憐脂結(jié)合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米囊泡，包括至少55m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的納米囊泡，包括至少65m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的納米囊泡，包括至少75m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米囊泡，包括至少85m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米囊泡，包括至少95m0l%的卟啉-磷脂結(jié)合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，在所述卟啉-磷脂結(jié)合物中，所述卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物選自由以下組成的組中:血卟啉、原卟啉、四苯基卟啉、焦脫鎂葉綠酸、細菌葉綠素、葉綠素a、苯并卟啉衍生物、四羥基苯基二氫卟酹、紅紫素、苯并二氫卟酚、萘并二氫葉酚、韋爾丹、玫紅素、酮二氫葉酚、氮雜二氫葉酚、菌綠素、甲苯基卟啉、苯并菌綠素、擴展卟啉和卟·啉異構(gòu)體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的納米囊泡，其中，所述擴展卟啉是泰薩卟啉、薩普卟啉、或六元卟啉，且所述卟啉異構(gòu)體是卟啉烯、反轉(zhuǎn)卟啉、酞菁、或萘酞菁。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的所述磷脂包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸或磷脂酰肌醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的納米囊泡，其中，所述磷脂包含12至22個碳的?；鶄?cè)鏈。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的所述卟啉是焦脫鎂葉綠酸_a酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的所述卟啉是細菌葉綠素衍生物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物中的所述磷脂是1-十六?；?2-羥基-sn-甘油基-3-磷酸膽堿。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物是焦脫鎂葉綠酸-脂質(zhì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物為氧基細菌葉綠素_脂質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉通過O至20個碳的碳鏈連接基團結(jié)合到所述磷脂上的甘油基基團。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的納米囊泡，進一步包括PEG。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的納米囊泡，進一步包括PEG-脂質(zhì)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項所述的納米囊泡，進一步包括PEG-DSPE。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項所述的納米囊泡，其中，所述PEG或PEG-脂質(zhì)以約5mol%的量存在。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，且直徑為約30nm至約200nm之間。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，且直徑為約lOOnm。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項所述的納米囊泡，其中，所述納米囊泡基本為球形，且直徑為約30nm。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的納米囊泡，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包含螯合在其中的金屬，可選地為金屬的放射性同位素。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的納米囊泡，其中，所述金屬選自由Zn、Cu和Pd所組成的組中。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的納米囊泡，進一步包括包封在其中的活性劑，優(yōu)選治療劑或診斷劑，優(yōu)選化療劑如多柔比星。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項所述的納米囊泡，進一步包括靶向分子，優(yōu)選抗體、肽或適體。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的納米囊泡，其中，所述靶向分子為葉酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-3·1中任一項所述的納米囊泡，其中，所述雙層進一步包括膽固醇，優(yōu)選在30-5011101%之間的膽固醇。
33.一種卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、葉啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈處于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中，所述組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中，所述組合物基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的組合物，其中，在所述組合物中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純度>97%。
36.一種用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、口卜啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中，所述組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，所述方法包括用酶溫育所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物直到達到所限定的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，所述酶選擇性裂解所述sn-Ι或所述sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體中的一個。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述組合物基本上是結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述卟啉-磷脂結(jié)合物的純度>97%。
39.根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項所述的方法，其中，所述組合物是sn-Ι卟啉-磷脂結(jié)合物的基本上結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的組合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，所述酶是來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶。
41.根據(jù)權(quán)利要求36-38中任一項所述的方法，其中，所述組合物基本上是所述sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純的組合物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，所述酶是來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2。
43.一種用于從包含卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物的組合物中除去所述卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體之一的方法，所述方法包括酶催化裂解所述卟啉-磷脂結(jié)合物的所述sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體之一。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中，所得到的組合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體純度>97%。
45.根據(jù)權(quán)利要求43和44中任一項所述的方法，其中，所述sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物被除去。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中，來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的脂肪酶用于進行所述酶催化裂解。
47.根據(jù)權(quán)利要求43和44中任一項所述的方法，其中，所述sn-Ι卟啉-磷脂結(jié)合物被除去。
48.根據(jù) 權(quán)利要求47所述的方法，其中，來自蜜蜂毒液的磷脂酶A2用于進行酶催化裂解。
49.一種用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、口卜啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中，所述組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，所述方法包括改變卟啉和磷脂結(jié)合反應(yīng)的原料比。
50.一種用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、口卜啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中，所述組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，所述方法包括用有機萃取提純所述混合物并接著使用硅膠層析法提純。
51.一種用于由卟啉-磷脂結(jié)合物的sn-Ι和sn-2結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的混合物生產(chǎn)卟啉-磷脂結(jié)合物的組合物的方法，每個所述結(jié)構(gòu)異構(gòu)體包括共價連接到脂質(zhì)側(cè)鏈的一個卟啉、口卜啉衍生物或卟啉類似物，所述脂質(zhì)側(cè)鏈位于一個磷脂的sn-Ι或sn-2位中的一個，其中，所述組合物具有限定的sn-1: sn-2卟啉-磷脂結(jié)合物的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體比率，所述方法包括用有機萃取提純所述混合物并接著使用二醇基硅膠提純。
【文檔編號】C07F9/6561GK103857384SQ201280038728
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月6日
【發(fā)明者】鄭崗, 喬納森·洛弗爾 申請人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò)