專利名稱：一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種應(yīng)用吸附柱層析法來制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定的烏司他丁的方法。
背景技術(shù)：
烏司他丁(Ulinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約37000 43000，屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)
坐寸ο1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。本發(fā)明人自2008年 開始對(duì)UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到60%以上，總效價(jià)不低于4000iu/mg，生產(chǎn)工
藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過低、效價(jià)不高不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，采用吸附柱層析來純化烏司他丁，從而提高烏司他丁收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):—種吸附柱層析純化烏司他丁的方法，其特征在于:選用樹脂吸附、特異洗脫液解吸來純化烏司他丁，可以將總收率提高到60%以上，總效價(jià)不低于4000iu/mg。在發(fā)明技術(shù)方案中，還具有以下技術(shù)特征:所述吸附柱層析包括如下步驟:I)烏司他丁粗加工稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；2.2)陰離子交換柱用洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120 130mL/min左右；2.3)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120 130mL/min，得洗脫液；2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液。3)沉淀超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。4)凍干將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達(dá)60%以上，按中國(guó)藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá) 4000iu/mg 以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:·
選用吸附柱層析純化烏司他丁，可以更有效的去除其中的多種雜蛋白，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過工藝的不斷改進(jìn)和完善，使得烏司他丁總收率達(dá)到60%以上，總效價(jià)不低于4000iu/mg,帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而不以任何方式限制。實(shí)施例1I)烏司他丁粗加工稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)，并用精密pH試紙測(cè)定，調(diào)節(jié)尿液PH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于置用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；2.2)陰離子交換柱用2.5L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120mL/min左右；2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。3)沉淀超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。4)凍干
將沉淀物裝入盤進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率為66%，按中國(guó)藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)4312iu/mg。實(shí)施例2I)烏司他丁粗加工稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)，并用精密pH試紙測(cè)定，調(diào)節(jié)尿液PH到6.0 ;吸附完全后用氨水洗脫lh，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。2)吸附柱層析工序(以0.25L柱體為例)2.1)稱取烏司他丁粗品1kg，用8.5L的洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；2.2)陰離子交換柱用3.0L的洗脫液B平衡，將上述離心液流經(jīng)平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130mL/min左右；2.3)用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液；2.4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。3)沉淀超濾液中按1: 6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時(shí)，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。4)凍干將沉淀物裝入盤放進(jìn)進(jìn)凍干機(jī)，凍干即得烏司他丁。經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率為63%，按中國(guó)藥典所示方法測(cè)定，總效價(jià)高達(dá)4123iu/mg。 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種純化烏司他丁的方法，該方法包括:將烏司他丁粗品通過吸附柱層析、超濾液沉淀、沉淀物凍干步驟進(jìn)行純化，所得純化后的烏司他丁的總收率提高到60%以上，總效價(jià)不低于 4000iu/mg。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述烏司他丁粗品是通過以男性尿液為原料，將原料依次經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析制備得到的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述吸附柱層析包括如下步驟:(1)用洗脫液A溶解烏司他丁粗品，攪拌、離心，留取離心液，所述洗脫液A為.0.01-0.3mol/L的醋酸鹽緩沖液；(2)用洗脫液B平衡吸附柱，將上述離心液上柱，洗脫液B為，0.01-0.5mol/L醋酸鈉和.0.l-5mol/L NaCl 的緩沖液；(3)用洗脫液B洗脫吸附柱，收集洗脫液；(4)將洗脫液經(jīng)超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復(fù)超濾，得超濾液。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01-0.5mol/L。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述吸附柱為陰離子交換柱。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述陰離子交換柱包括:強(qiáng)陰離子交換柱Q-Sephadex A-25,Q-Sephadex A-50,Q-Sephadex C-25,Q-S印hadex C-50 ;弱陰離子交換柱DEAE-Cellulose DE-22，DEAE-Cellulose DE-23，DEAE-Cellulose DE-51，DEAE-CelluloseDE-52, DEAE-Cellulose DE-53。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述超濾液沉淀步驟包括:超濾液中加入乙醇沉淀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種吸附柱層析純化烏司他丁的方法。具體的說，就是以健康成年男性新鮮尿液為原料，經(jīng)過甲殼質(zhì)吸附、氨水洗脫、硫酸銨鹽析以及吸附柱層析等現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)來制備高純度的烏司他丁，可以將總收率提高到60％以上，總效價(jià)不低于4000iu/mg。
文檔編號(hào)C07K14/81GK103073637SQ20121059795
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者林曉磊, 孫建, 劉翠珍, 孫延年 申請(qǐng)人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司