一種氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同純化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運(yùn)用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜等傳統(tǒng)蛋白純化技術(shù)，制備胰激肽酶原。
【背景技術(shù)】
[0002]胰激肽酶原(kallikein)是從豬胰臟中分離純化制得的天然酶類藥物，臨床上又稱血管舒緩素，具有舒展毛細(xì)血管和小動(dòng)脈的作用，在臨床上常用來治療高血脂，防治脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心絞痛等多種疾病，它的開發(fā)具有重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)價(jià)值。在我國(guó)，胰激肽酶原生產(chǎn)還存在很大的發(fā)展空間。
[0003]現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)研究中，專家多采用離子交換層析、樹脂吸附層析等各種高端色譜分離技術(shù)提純得到各種酶類和蛋白。而選擇離子交換樹脂的主要依據(jù)是被分離物的性質(zhì)和分離目的，包括被分離物和主要雜質(zhì)的解離特性、分子量、濃度、穩(wěn)定性、所處介質(zhì)的性質(zhì)以及分離的具體條件和要求。其中最重要的一條是根據(jù)分離要求和分離環(huán)境保證分離目的物與主要雜質(zhì)對(duì)樹脂的吸附力有足夠的差異。被分離物中雜質(zhì)越多，這種差異性顯然會(huì)越不明顯。在實(shí)際大生產(chǎn)中，原料中都含有雜質(zhì)，如果在采用這些高端色譜技術(shù)之前，不對(duì)原料或者粗制品進(jìn)行預(yù)處理，勢(shì)必會(huì)因?yàn)樵现械碾s質(zhì)含量過多而減短離子交換介質(zhì)的壽命，降低樹脂吸附效率，且洗脫中會(huì)存在拖尾現(xiàn)象，延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，影響產(chǎn)品收率及比活。如李立桓等利用Amberlite-CG50從胰酶中分離純化胰激肽酶原,通過色譜分離技術(shù)得到的胰激肽酶原比活、純度更高。
[0004]胰激肽酶原是以的豬胰臟為原料，因此，必須對(duì)原料進(jìn)行預(yù)處理、提純得到粗制的胰激肽酶原，然后再采用離子交換層析技術(shù)進(jìn)行精制生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明是靈活運(yùn)用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂、脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜等傳統(tǒng)蛋白純化技術(shù)，從豬胰臟中制備胰激肽酶原，該技術(shù)不僅操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉，而且避免了胰激肽酶原降解失活，提高產(chǎn)品比活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是純化從合格的豬胰臟中提取胰激肽酶原。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運(yùn)用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜等傳統(tǒng)蛋白純化技術(shù)，制備胰激肽酶原。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)單、成本低廉的特點(diǎn)，非常適用于規(guī)模化大生產(chǎn)。包括如下步驟:
(O醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液；
(2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得胰激肽酶原粗品； (3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用45~55倍量的2~10°C氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH至7.5-8.5，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液冷至0~5°C，，加入2~10°C丙酮使溶液濃度達(dá)40%，攪勻，靜置10~14小時(shí)，離心，得上清液；將上清液中補(bǔ)加2~10°C丙酮至溶液濃度達(dá)60%，靜置4~8小時(shí)，離心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原。
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0009]實(shí)施例1
所述的以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運(yùn)用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰激肽酶原，包括如下步驟:
(I)醋酸提取:將豬胰臟1kg制成丙酮粉后，加入30倍量的醋酸溶液，攪拌提取，離心，得上清液30L。
[0010](2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀。沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得胰激肽酶原粗品96g。
[0011](3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用50倍量的8°C氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH至8.0，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液冷至2V，加入5°C丙酮使溶液濃度達(dá)40%，攪勻，靜置12小時(shí)，離心，得上清液；將上清液中補(bǔ)加5°C丙酮至溶液濃度達(dá)60%，靜置4小時(shí)，離心，收集沉淀。沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原64g。
[0012]實(shí)施例2
將實(shí)施例1制備的胰激肽原酶6000單位、預(yù)膠化淀粉21.7g置混合機(jī)內(nèi)，攪拌5分鐘，再加入糊精32.5g、糖粉20.1g于混合機(jī)內(nèi)，攪拌20分鐘后將預(yù)先配好的粘合劑(取L-羥丙基纖維素2.0g加75%乙醇20ml使溶解，即得)和潤(rùn)滑劑硬脂酸鎂0.0031g,緩緩均勻地加入混合機(jī)內(nèi)攪拌，至顆粒形成，放入制粒機(jī)中制粒，中間體檢驗(yàn)，合格后用壓片機(jī)制成1000片，片芯檢驗(yàn)合格后包腸溶衣。
[0013]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同純化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的藥物組合物，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)醋酸提取:將豬胰臟制成丙酮粉后，加醋酸溶液攪拌提取，離心，得上清液； (2)丙酮沉淀:收集上清液，加入丙酮沉淀，沉淀用丙酮、乙醚脫脂、脫水，干燥，得胰激肽酶原粗品； (3)氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜:將粗品用氯化鈉溶液溶解，用氨水調(diào)PH，攪拌混合，過濾，得濾液；將濾液中加入丙酮，攪勻，靜置，離心，得上清液；將上清液中補(bǔ)加丙酮，靜置，離心，收集沉淀； 沉淀用丙酮、乙醚洗滌，干燥，得胰激肽酶原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，胰激肽酶原粗品與氯化鈉溶液的比例為lKg:45~55L，氯化鈉溶液的溫度為:2~10°C，氯化鈉溶液的濃度為:0.1%~0.3%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，用氨水調(diào)節(jié)溶液的PH值為:7.5?8.5o
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，濾液的溫度應(yīng)冷至0~5°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，第一次加入丙酮的量為至溶液濃度達(dá)到40% ;補(bǔ)加丙酮的量為至溶液濃度達(dá)到60% ;丙酮的溫度為:2~10°C。
6.一種藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-5制備的胰激肽酶原作為活性成分，還含有預(yù)膠化淀粉、糊精、糖粉、L-羥丙基纖維素、硬脂酸鎂、75%乙醇。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同純化胰激肽酶原的方法及含有胰激肽酶原的藥物組合物。本發(fā)明的技術(shù)方案是以豬胰為原料提取、沉淀豬胰制成丙酮粉后，靈活運(yùn)用醋酸提取、丙酮沉淀，乙醚脫脂脫水，氯化鈉-氨水、丙酮協(xié)同除雜等傳統(tǒng)蛋白純化技術(shù)，制備胰激肽酶原。本發(fā)明具有生產(chǎn)周期短，操作簡(jiǎn)單，對(duì)化學(xué)和熱穩(wěn)定性好、成本低廉的特點(diǎn)，非常適用于規(guī)?；笊a(chǎn)。
【IPC分類】C12N9-64, A61P3-06, A61P9-12, A61P9-10, A61P1-16
【公開號(hào)】CN104531647
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410807820
【發(fā)明人】劉冠男, 林曉磊, 孫延年
【申請(qǐng)人】青島康原藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日