專利名稱：具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1(glp-1)類似物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前，全球約有3億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年將增加至5億。2010年，中國有9200萬糖尿病患者，中國已經(jīng)成為僅次于印度的糖尿病第二大國，其中2型糖尿病約占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%。現(xiàn)在治療2型糖尿病最有效的方法是注射胰島素。在臨床上采用胰島素強(qiáng)化治療的方法來延緩糖尿病進(jìn)程，胰島素治療在降低血糖的同時(shí)可以一定程度上逆轉(zhuǎn)胰島細(xì)胞功能損害。但是使用胰島素會(huì)出現(xiàn)低血糖的危險(xiǎn)。受到劑量大小、注射部位、注射途徑、個(gè)體差異或注射后未進(jìn)食等因素的影響，如果使用胰島素稍有不慎，就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的低血糖副作用。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)是一種葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，GLP-1刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖，這種葡萄糖依賴性的促胰島素分泌特性，避免了糖尿病治療中常存在的產(chǎn)生低血糖癥的危險(xiǎn)，這些生理功能使開發(fā)GLP-1作為一種2型糖尿病治療藥物具有廣闊的前景。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸的L細(xì)胞所分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖多肽激素，在體內(nèi)有多種存在形式。胰高血糖素原基因位于2號(hào)染色體長臂，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成，在胰腺和腸道L細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，生成由160個(gè)氨基酸組成的胰高血糖素原(progluca gon, PG)。胰高血糖素原在胰腺和腸道中裂解后轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物不同。PG在腸道中主要裂解為:腸高血糖素(Glicentin:PG1 69),腸高血糖素分子繼續(xù)裂解為GRPP (PGl 30)和胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin:PG33 69);插入肽-2(IP_2:PGlll 123);胰高血糖素樣肽-2(GLP-2:PG126 158);和 GLP-1 (I 37)_0H(PG 72 108)。GLP-Ul 37)-0H是無活性的肽鏈，需酶解切除N端6肽，成為具有生理活性的GLP-1 (7 37)-0H，其C末端甘氨酸可以作為酰胺化酶的底物，因此GLP-1 (7 37)-OH的C末端酰胺化后即生成具有高度活性的GLP-1 (7 36)-N ，氨基酸序列是HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGR-NH2 ；GLP-1 (7 37)-OH 的氨基酸序列是 HAEGTFTSDVSSLEGQAAKEFIAWLVKGRG-COOHo GLP-1 (7 36) -NH2是人體內(nèi)GLP-1主要的天然形式，約占80%，其促進(jìn)胰島素分泌的作用在GLP-1肽中最強(qiáng)。另外GLP-1 (7 37) -OH約占20%，兩者具有相同的生理功倉泛。GLP-1通過作用于胰島β -細(xì)胞膜上的受體GLP-1受體(GLP-1R)，促進(jìn)胰島素的分泌。GLP-1R在胰腺β -細(xì)胞膜上高度表達(dá)，是由463個(gè)氨基酸組成，屬于七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體家族，與GLP-1高度特異性結(jié)合。GLP-1與其受體結(jié)合后可以增加胰島細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶的活性，刺激細(xì)胞內(nèi)的第二信使cAMP的增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜K+通道關(guān)閉，細(xì)胞去極化，誘發(fā)電壓依賴性的Ca2+通道開放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞漿Ca2+濃度升高觸發(fā)胰島素的釋放。此外cAMP水平升高，又激活cAMP依賴的蛋白激酶A和磷酸化酶，進(jìn)而刺激β-細(xì)胞胰島素基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，刺激β -細(xì)胞的增值和分化。胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)具有多種生物學(xué)效應(yīng)。如下:1、具有血糖依賴性的腸促胰島素分泌作用；2、阻止胰腺β -細(xì)胞退化，刺激β -細(xì)胞的增值和分化；3、誘導(dǎo)前胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)前胰島素的生物合成；4、增加胰島素的敏感性；5、增加生長抑素分泌，抑制胰高血糖素的產(chǎn)生(此作用也是血糖依賴性)；6、抑制胃酸分泌，延遲胃排空；7、通過作用于丘腦下部的中樞抑制食欲，降低食物攝取量等作用。然而，雖然天然GLP-1在治療糖尿病上有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但它在體內(nèi)卻會(huì)被二肽基肽酶 IV(dip^tidyl peptidase IV，DPP_IV)快速降解。DPP-1V 可特異性識(shí)別 GLP-1 的N末端第二位丙氨酸(Ala)殘基，從肽鏈N末端第2位丙氨酸(Ala)處切除二肽，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的形式，其體內(nèi)半衰期僅5分鐘左右。GLP-1分子N端是與GLP-1受體的結(jié)合部位，其組氨酸殘基喪失，導(dǎo)致GLP-1完全失去生物活性。另外天然的GLP-1會(huì)被腎臟快速濾過代謝，所以這需要我們對(duì)天然GLP-1進(jìn)行改造，以期望尋找到能夠抵抗DPP-1V降解，避免腎臟快速濾過代謝的GLP-1類似物。這里，我們?cè)O(shè)計(jì)了一類具有長效化作用GLP-1類似物，將8位的Ala替換，使其不易被DPP-1V快速降解，同時(shí)改變肽 鏈的側(cè)鏈，引入脂肪鏈修飾的半胱氨酸，增加肽鏈與血清白蛋白的結(jié)合，避免了 GLP-1的腎臟快速濾過和代謝失活，從而顯著延長半衰期及體內(nèi)降糖作用時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一類胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物，其序列為:His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Tyr-Leu-Glu-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-1Ie-Xaa9-Trp-Leu~Val-XaaIO-Gly-Arg-Xaa11(SEQ.1DNO:1)其中:Xaal:Ala, Leu, Val, Met, He, Tyr, Phe, Arg, Asn, Lys, Thr, Asp, His, Trp, Gin,Glu, Ser 或 Gly ；Xaa2:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ；Xaa3:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ；Xaa4:脂肪鏈修飾的Cys或Gln ；Xaa5:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；Xaa6:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；Xaa7:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ；Xaa8:脂肪鏈修飾的Cys或Glu ；Xaa9:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ；
XaalO:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ；Xaal1:脂肪鏈修飾的 Cys-NH2 或-NH2 ；前提是所述序列不是His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Gly-Arg-NH2 ο其中脂肪鏈修飾的Cys選自
權(quán)利要求
1.種含有式I(SEQ.1D NO:1)結(jié)構(gòu)的胰高血糖素樣肽_1 (GLP-1)類似物，其序列為:His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Xaa2-Xaa3-Tyr-Leu-Glu-Gly-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-1le-Xaa9-Trp-Leu-Val-XaalO-Gly-Arg-Xaall(SEQ.1D NO:1) 其中:Xaal:Ala，Leu, Val，Met，He, Tyr, Phe, Arg，Asn, Lys，Thr, Asp，His，Trp, Gin, Glu，Ser 或 Gly ； Xaa2:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ； Xaa3:脂肪鏈修飾的Cys或Ser ； Xaa4:脂肪鏈修飾的Cys或Gln ； Xaa5:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； Xaa6:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； Xaa7:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ； Xaa8:脂肪鏈修飾的Cys或Glu ； Xaa9:脂肪鏈修飾的Cys或Ala ； XaalO:脂肪鏈修飾的Cys或Lys ； Xaall:脂肪鏈修飾的Cys-NH2或-NH2 ；前提是所述序列不是 His-Xaal-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Gly-Arg-NH2 ο
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中脂肪鏈修飾的Cys選自
3.據(jù)權(quán)利要求2所述，其中優(yōu)選的脂肪鏈修飾的Cys結(jié)構(gòu)為
4.據(jù)權(quán)利要求1所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物，優(yōu)選的序列為:
5.種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽。
6.種藥物組合物，包括治療有效量的權(quán)利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)類似物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
7.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于糖尿病的藥物中的運(yùn)用。
8.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑在制備用于糖尿病的藥物中的運(yùn)用。
9.利要求1中所述的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物的制備方法，包括生物表達(dá)、液相合成和固相合成制備方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有長效化作用的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)類似物及其合成方法。通過對(duì)天然的GLP-1的17，26，34，37位氨基酸進(jìn)行替換修飾得到具有更長藥理作用時(shí)間的GLP-1類似物，目標(biāo)多肽的合成是通過微波促進(jìn)固相合成方法快速實(shí)現(xiàn)，粗品經(jīng)純化，凍干得到GLP-1類似物。
文檔編號(hào)C07K14/605GK103087180SQ20121051326
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者黃文龍, 錢海, 韓京, 孫李丹, 李政, 褚瑩瑩 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)