專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用蛋白a的高密度包被磁珠純化抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗體純化的方法，具體涉及一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法。
背景技術(shù)：
單克隆抗體是B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞雜交形成的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，其重鏈和輕鏈所形成的結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別和結(jié)合特異抗原。1997年FDA批準(zhǔn)第一個(gè)治療淋巴癌的嵌合單克隆抗體藥物Rituxan Anti-⑶20抗體上市，至2007年，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)了 20多種治療性單克隆抗體藥物，約一半用于治療癌癥，多個(gè)已成為年銷(xiāo)售額超十億美元的“炸彈藥物”。全球單克隆抗體藥物的市場(chǎng)增長(zhǎng)十分迅猛，約有200多種單抗處于臨床實(shí)驗(yàn)階段，占整個(gè)臨床生物技術(shù)藥品總數(shù)的三分之一多，其中四分之一在臨床三期或等候批準(zhǔn)。單抗藥物已成為全球生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的主旋律?！慰顾幬锏难该桶l(fā)展對(duì)抗體純化工業(yè)提出了新的挑戰(zhàn)。目前，主流的抗體純化生產(chǎn)主要包括以下步驟1、發(fā)酵液澄清；2、抗體捕獲；3、抗體精細(xì)純化；4、抗體濃縮洗濾；5、抗體過(guò)濾除菌/制劑。在抗體捕獲階段，主要應(yīng)用蛋白A親和層析技術(shù)從發(fā)酵上清液中提取抗體。蛋白A是一種從金黃葡萄球菌細(xì)胞膜上提取的蛋白，具有5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能特異性地與抗體Fe端結(jié)合?，F(xiàn)階段最常用的蛋白A親和層析介質(zhì)是通過(guò)將蛋白A用化學(xué)偶聯(lián)的方法固定在瓊脂糖凝膠表面制成親和填料，然后裝填成層析柱。將含有抗體的發(fā)酵上清液用泵加壓注入層析柱中，抗體被層析填料上固定的蛋白A捕獲，被捕獲的抗體可以通過(guò)洗脫溶液的沖洗從蛋白A親和填料上解離，達(dá)到純化及濃縮的目的。然而，以上抗體純化過(guò)程存在以下缺點(diǎn)I、發(fā)酵溶液需進(jìn)行澄清操作。單抗通常采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行制備，發(fā)酵液中存在大量細(xì)胞，容易對(duì)層析系統(tǒng)造成堵塞。因此在層析操作之前需經(jīng)過(guò)離心或過(guò)濾操作，去除發(fā)酵液中的細(xì)胞。工業(yè)上大規(guī)模的澄清操作通常需要流式離心機(jī)或是超濾系統(tǒng)，耗時(shí)長(zhǎng)、價(jià)格高昂而且日常維護(hù)復(fù)雜。2、層析操作耗時(shí)長(zhǎng)，儀器昂貴。由于填料可承受的壓力及流速有限，因此單位時(shí)間內(nèi)可處理的樣品量受限于層析柱的大小及填料性質(zhì)。大型的層析設(shè)備及蛋白A親和純化填料非常昂貴，且基本依賴(lài)進(jìn)口，是抗體純化工業(yè)的瓶頸。3、層析系統(tǒng)不能處理高粘度樣品。由于受限于填料可承受的壓力，因此高粘度的樣品(如血清或高蛋白濃度樣品)均需要經(jīng)過(guò)稀釋及過(guò)濾才能應(yīng)用于層析操作，造成樣品體積的放大及目標(biāo)產(chǎn)物的稀釋。4、蛋白A親和層析填料在反復(fù)沖洗的過(guò)程中容易發(fā)生蛋白A配體的脫落。蛋白A在瓊脂糖基質(zhì)上是通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)固定。比較先進(jìn)的填料為實(shí)現(xiàn)蛋白A配基朝向的一致性而達(dá)到提高配基利用率的目的，均采用單點(diǎn)定向固定法，即蛋白A與瓊脂糖之間只通過(guò)一個(gè)共價(jià)鍵進(jìn)行連接，但這種單點(diǎn)固定的方法使蛋白A容易在反復(fù)的層析柱沖洗過(guò)程中發(fā)生脫落。而蛋白A是高致敏原，容易在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，美國(guó)食品及藥品監(jiān)督管理局(FDA)對(duì)單抗藥物中蛋白A配基的殘留量有嚴(yán)格的限定。蛋白A脫落現(xiàn)象也影響了親和填料的有效載量及使用壽命。近年來(lái)，隨著磁性分離技術(shù)的發(fā)展，蛋白A包被的超順磁性磁珠越來(lái)越多地應(yīng)用于免疫檢測(cè)及小規(guī)模的免疫親和純化領(lǐng)域。蛋白A包被磁珠純化技術(shù)無(wú)需復(fù)雜的層析設(shè)備，對(duì)樣品的澄清度沒(méi)有限制，只需要簡(jiǎn)單的磁性吸附步驟即可很方便快捷地從單抗表達(dá)產(chǎn)物中分離單抗，有效解決了傳統(tǒng)層析技術(shù)的不足之處。但由于目前市面上出現(xiàn)的蛋白A包被磁珠的抗體結(jié)合效率相對(duì)于傳統(tǒng)的瓊脂糖填料仍有很大的差距，因此仍未能大規(guī)模地應(yīng)用于抗體純化工業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述的現(xiàn)有抗體純化方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，包括以下步驟(I)將蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗體的表達(dá)產(chǎn)物加入到反應(yīng)容器中，攪勻，室溫下孵育5 15min，磁珠在溶液中呈均勻分布狀態(tài)；在該過(guò)程中磁珠與抗體結(jié)合；(2)在反應(yīng)容器外部或內(nèi)部施加磁場(chǎng)，使磁珠沿磁場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng)并貼在容器壁上(見(jiàn)圖I)或磁體上(見(jiàn)圖2)；(3)從反應(yīng)容器中轉(zhuǎn)移出上清液；在該過(guò)程中，抗體隨磁珠貼在容器壁上或磁體上，其余成分被轉(zhuǎn)移出反應(yīng)容器；(4)將洗滌緩沖液加入反應(yīng)容器中，撤去磁場(chǎng)，使磁珠重新均勻分散于洗滌緩沖液中；重復(fù)步驟(2) (3)，完成一次磁珠洗滌；(5)重復(fù)步驟(4)洗滌磁珠2 4次，徹底洗去磁珠上的非特異吸附物質(zhì)；(6)將洗脫緩沖液加入反應(yīng)容器中，撤去磁場(chǎng)，使磁珠重新均勻分散于洗滌緩沖液中，室溫下孵育5 15min ;該操作是將磁珠上的抗體洗脫下來(lái)；(7)施加磁場(chǎng)使磁珠貼壁，轉(zhuǎn)移反應(yīng)容器中的溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值至中性，得到純化后的抗體。步驟(I)中的蛋白A的高密度包被磁珠已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利，即是中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201210107107. 7 (申請(qǐng)?zhí)?實(shí)施例I得到的交聯(lián)有固定化SL-PA融合蛋白的磁珠。步驟(I)所述的含有抗體的表達(dá)產(chǎn)物可以是血清、細(xì)胞表達(dá)液或腹水。步驟(2)和(7)所述的施加磁場(chǎng)，其磁通量為100(Γ10000高斯，作用時(shí)間為l-5min。步驟(4)所述的洗滌緩沖液含有O. 0Γ0. 5Μ的磷酸緩沖液、I 500mM的NaCl，余量為水，pH值6 9。步驟(6)所述的洗脫緩沖液含有O. 0Γ4Μ的氨基酸，pH值I. 9飛；所述的氨基酸為甘氨酸、賴(lài)氨酸或精氨酸中的一種以上。步驟(7)所述的調(diào)節(jié)pH值是用IM的三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液調(diào)節(jié)。使用后的磁珠重復(fù)步驟(4)，洗滌至pH值為中性后可重復(fù)用于抗體純化。本發(fā)明的機(jī)理是
磁性材料的磁性隨溫度的變化而變化，在低溫時(shí)材料的磁性很難被改變；而當(dāng)溫度升高時(shí)，材料將變成“順磁體”，其磁性很容易隨周?chē)拇艌?chǎng)改變而改變。如果溫度進(jìn)一步提高，或者磁性顆粒的粒度很小時(shí)，即便在常溫下，磁體的極性也呈現(xiàn)出隨意性，難以保持穩(wěn)定的磁性能，這種現(xiàn)象就是超順磁效應(yīng)。超順磁性磁珠能在外部磁場(chǎng)的作用下迅速聚集，當(dāng)磁場(chǎng)撤離后即可重新分散而不帶有剩磁。本發(fā)明即利用磁珠的這一特性使其作為一種新型的分離純化基質(zhì)用于生物活性物質(zhì)的分離純化技術(shù)上。
本發(fā)明基于利用SLP將功能蛋白定向固定的方法，獲得具有固定化蛋白A配基的超順磁性磁珠(見(jiàn)專(zhuān)利201210107107. 7實(shí)施例I)。利用該磁珠對(duì)抗體的高效特異性結(jié)合，從血清或抗體表達(dá)產(chǎn)物中捕獲抗體，然后利用磁性分離器將磁珠-抗體復(fù)合物從混合液中分離，經(jīng)過(guò)對(duì)磁珠復(fù)合物的多次洗滌，去除磁珠表面的非特異吸附物質(zhì)，最后用洗脫緩沖液使抗體與磁珠解離并釋放到洗脫緩沖液中，達(dá)到純化抗體的目的。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果I、本發(fā)明使用磁珠親和分離技術(shù)進(jìn)行抗體純化，比傳統(tǒng)的抗體親和層析技術(shù)具有更快的抗體捕獲速度(〈15分鐘)；此外，純化操作無(wú)需復(fù)雜的層析系統(tǒng)，樣品無(wú)需進(jìn)行澄清處理，可以直接對(duì)粘度較大的樣品進(jìn)行純化操作。2、與現(xiàn)有的磁珠親和分離技術(shù)相比，本發(fā)明由于使用了獨(dú)特的SLP固定化技術(shù)制備的蛋白A包被磁珠，抗體結(jié)合效率大幅提高，蛋白A配基的脫落率達(dá)到極低水平，使磁珠分離技術(shù)在單克隆抗體大批量純化中的應(yīng)用成為可能。3、本發(fā)明的純化方法節(jié)省了發(fā)酵液澄清步驟。本發(fā)明采用磁珠與樣品直接混合孵育的方式從樣品中捕獲抗體，對(duì)樣品的澄清度及粘度沒(méi)有特殊要求，可以省去傳統(tǒng)抗體層析純化工藝中樣品澄清過(guò)濾的步驟，節(jié)省了相應(yīng)的生產(chǎn)時(shí)間及設(shè)備需求。4、本發(fā)明的純化方法解決了傳統(tǒng)抗體純化層析工藝耗時(shí)長(zhǎng)，儀器昂貴的問(wèn)題。本發(fā)明的純化方法無(wú)需昂貴的進(jìn)口層析設(shè)備，只需要簡(jiǎn)單的磁場(chǎng)(由永磁體或電磁體提供均可)即可進(jìn)行磁珠的分離及收集。由于磁珠具有納米級(jí)的直徑，因此能提供極大的捕獲面積，在15分鐘內(nèi)即可達(dá)到與抗體的飽和吸附。5、本發(fā)明的純化方法解決了現(xiàn)有抗體親和磁珠載量低的問(wèn)題。本發(fā)明采用以SLP功能蛋白固定化技術(shù)制備的具有納米級(jí)直徑的蛋白A包被磁珠為原料，具有數(shù)倍于一般蛋白A磁珠產(chǎn)品的抗體結(jié)合效率，每毫克磁珠抗體結(jié)合量高達(dá)250 μ g，使磁珠純化技術(shù)的大規(guī)模使用更經(jīng)濟(jì)更高效。


圖I是利用反應(yīng)容器外部的磁場(chǎng)進(jìn)行磁珠固液分離的示意圖。圖2是利用反應(yīng)容器內(nèi)部的磁場(chǎng)進(jìn)行磁珠固液分離的示意圖。圖3是實(shí)施例I的純化方法中各步驟產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖；其中，humanIgG-人源IgG標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，S-純化前的人血清，F(xiàn)-純化后的人血清，WUW2-磁珠與人血清反應(yīng)后的兩次洗滌上清，El-洗脫產(chǎn)物。圖4是實(shí)施例I磁珠純化產(chǎn)物的western blot驗(yàn)證結(jié)果圖，左圖為SDS-PAGE電泳圖，右圖為對(duì)應(yīng)的Western blot熒光顯色圖；其中，M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，I-人血清樣品，2 5_磁珠從人血清中純化的洗脫產(chǎn)物，6-人源IgG標(biāo)準(zhǔn)品。
圖5是實(shí)施例2中兩種純化方法得到的人IgGl的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M-蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量，f 2-SL-PA磁珠純化產(chǎn)物，3-親和層析純化產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例I利用SL-PA磁珠從人血清中提取人源IgG，包括以下步驟SL-PA磁珠制備方法見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)《一種利用SLP將功能蛋白定向固定的方法》(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?201210107107. 7)實(shí)施例I。
(I)取SL-PA磁珠IOOmg,加入5ml離心管中，再加入5ml洗漆緩沖液(pH值7. 5,含有50mM磷酸緩沖液和150mM NaCl ;下同),振蕩重懸,放置于磁性分離器上2min,待固液分離后吸去上清液。重復(fù)此步驟一次；(2)將洗滌后的磁珠與3ml人血清(購(gòu)自廣州蕊特生物科技有限公司)(即純化前的人血清S)混合均勻，室溫孵育lOmin，期間不時(shí)震蕩以保持磁珠與血清的均勻混合；(3)將離心管放置于磁性分離器上2min，待固液分離后吸去上清液(F)；(4)加入5ml洗滌緩沖液，振蕩重懸，放置于磁性分離器上2min，待固液分離后吸去上清液(Wl)。重復(fù)此步驟2次(第二次洗滌上清液為W2)；(5)加入3ml洗脫緩沖液(含有O. IM甘氨酸，pH值2. 5)，混合均勻，室溫孵育IOmin,期間不時(shí)震蕩以保持磁珠與溶液的均勻混合；(6)將離心管放置于磁性分離器上2min，待固液分離后收集上清液，此上清液為含有人IgG的純化產(chǎn)物。上清液中馬上加入100 μ I IM Tris溶液(pH 8. O)調(diào)節(jié)溶液pH值至中性，即為洗脫產(chǎn)物El ；(7)將步驟(6)的純化產(chǎn)物用超純水進(jìn)行透析或超濾，收集透析或超濾產(chǎn)物，用真空冷凍干燥機(jī)制成凍干粉。純化產(chǎn)物可用于進(jìn)一步精細(xì)純化操作。人源IgG的純化效果(I)磁珠純化各步驟產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)如圖3。從圖3可以看出，SL-PA磁珠從人血清中的純化產(chǎn)物電泳條帶(El)與人源IgG標(biāo)準(zhǔn)品的電泳條帶一致，純度與標(biāo)準(zhǔn)品一致。通過(guò)測(cè)定280nm處光吸收值計(jì)算洗脫產(chǎn)物中人IgG總量為23. 14mg,即每毫克磁珠結(jié)合人IgG的量為231. 4 μ g。整個(gè)純化流程耗時(shí)少于40min，樣品血清無(wú)需進(jìn)行稀釋及過(guò)濾，純化操作無(wú)需層析系統(tǒng)。而采用傳統(tǒng)的抗體親和層析法處理相同體積的血清樣品，需要將血清原液稀釋5^10倍，經(jīng)過(guò)O. 22 μ m孔徑濾膜過(guò)濾，由層析系統(tǒng)將樣品加壓，使樣品流入蛋白A親和純化層析柱，樣品中的人IgG與蛋白A配基結(jié)合，然后再經(jīng)過(guò)沖洗層析柱去除未結(jié)合的雜蛋白，最后用洗脫緩沖液將結(jié)合在層析柱上的抗體洗脫而得到純化后的抗體，全過(guò)程耗時(shí)超過(guò)3小時(shí)，需要昂貴的層析系統(tǒng)及過(guò)濾裝置。(2)純化產(chǎn)物的驗(yàn)證以小鼠抗人IgG單克隆單體(購(gòu)自美國(guó)ABcam公司)為一抗，以羊抗小鼠IgG-HRP (購(gòu)自武漢博士德公司)為二抗，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)(Westernblot)，驗(yàn)證SL-PA磁珠純化產(chǎn)物是否為人IgG，結(jié)果如圖4。
從圖4可以看出，磁珠從人血清中純化的洗脫產(chǎn)物與人源IgG標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的免疫印跡顯色結(jié)果，證明此純化產(chǎn)物為人源IgG。(3)純化產(chǎn)物中蛋白A殘留量測(cè)定取SL-PA磁珠從人血清中純化的人IgG產(chǎn)物，并以蛋白A親和純化層析柱(HiTrapMabSelect Iml ;美國(guó)GE Iifesciences公司)從人血清中純化的人IgG產(chǎn)物為對(duì)照組,用蛋白AELISA檢測(cè)試劑盒(ProteinAELISAKit，美國(guó)R印IiGen公司)檢測(cè)產(chǎn)物中蛋白A殘留量。結(jié)果如下表
權(quán)利要求
1.ー種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將蛋白A的高密度包被磁珠、含有抗體的表達(dá)產(chǎn)物加入到反應(yīng)容器中，攪勻，室溫下孵育5 15min ； (2)在反應(yīng)容器外部或內(nèi)部施加磁場(chǎng)； (3)從反應(yīng)容器中轉(zhuǎn)移出上清液； (4)將洗滌緩沖液加入反應(yīng)容器中，撤去磁場(chǎng)；重復(fù)步驟(2) (3)一次； (5)重復(fù)步驟(4)洗滌磁珠2 4次； (6)將洗脫緩沖液加入反應(yīng)容器中，撤去磁場(chǎng)，室溫下孵育5 15min； (7)施加磁場(chǎng)使磁珠貼壁，轉(zhuǎn)移反應(yīng)容器中的溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值至中性，得到純化后的抗體； 步驟(4)所述的洗滌緩沖液含有O. ΟΓΟ. 5Μ的磷酸緩沖液、r500mM的NaCl，余量為水，pH值6 9 ； 步驟(6)所述的洗脫緩沖液含有O. 0Γ4Μ的氨基酸，pH值I. 9 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特征在于步驟(6)所述的洗脫緩沖液所含的氨基酸為甘氨酸、賴(lài)氨酸或精氨酸中的ー種以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特征在于步驟(I)所述的含有抗體的表達(dá)產(chǎn)物是血清、細(xì)胞表達(dá)液或腹水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，其特征在于步驟(2)和(7)所述的施加磁場(chǎng)，其磁通量為100(Γ10000高斯，作用時(shí)間為l_5min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用蛋白A的高密度包被磁珠純化抗體的方法，該方法包括以下步驟將磁珠和含有抗體的表達(dá)產(chǎn)物加入到反應(yīng)容器中，在反應(yīng)容器外部或內(nèi)部施加磁場(chǎng)，然后轉(zhuǎn)移出上清液；將洗滌緩沖液加入反應(yīng)容器中，撤去磁場(chǎng)；重復(fù)洗滌磁珠2~4次；然后加入洗脫緩沖液，撤去磁場(chǎng)，室溫下孵育5~15min；施加磁場(chǎng)使磁珠貼壁，轉(zhuǎn)移出溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值至中性，得到純化后的抗體。本發(fā)明使用磁珠親和分離技術(shù)進(jìn)行抗體純化，比傳統(tǒng)的抗體親和層析技術(shù)具有更快的抗體捕獲速度；此外，純化操作無(wú)需復(fù)雜的層析系統(tǒng)，樣品無(wú)需進(jìn)行澄清處理，可以直接對(duì)粘度較大的樣品進(jìn)行純化操作；再者，使用了獨(dú)特的蛋白A包被磁珠，抗體結(jié)合效率大幅提高，蛋白A配基的脫落率達(dá)到極低水平。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102838674SQ20121035228
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者任輝, 張曙光, 韓藍(lán)青, 烏韋·斯萊泰, 安德烈亞斯·布韋特萊瑟, 劉藹珊 申請(qǐng)人:海貍納米科技(蘇州)有限公司